Summary
Этот протокол описывает метод для быстрой обработки посмертных диффузных собственных образцов мостовое глиомы для создания моделей клеточных культур пациента, полученных или прямой характеристике опухолевых и микроокружения клеток.
Abstract
Диффузный искробезопасности Понцианские глиомы (DIPG) представляет собой опухоль ствола головного мозга в детстве, что влечет за собой универсально фатальный прогноз. Поскольку хирургическое удаление не является жизнеспособной стратегией лечения и биопсия обычно не выполняется, наличие клинических образцов для исследований ограничено. Следовательно, усилия по изучению этого заболевания была поставлена под сомнение скудность верных моделей заболеваний. Чтобы удовлетворить эту потребность, мы опишем здесь протокол для быстрой обработки посмертных образцов аутопсии ткани с целью создания прочных моделей культуры клеток пациента , полученных , которые могут быть использованы в анализах ин витро или ин виво ортотопических экспериментах ксенотрансплантатов. Эти модели могут быть использованы для скрининга потенциальных мишеней для лекарственных средств и изучения фундаментальных процессов в рамках pathobiological DIPG. Этот протокол может быть дополнительно расширен, чтобы анализировать и изолировать опухолевых и микроокружения клеток с использованием флуоресцентно-активированных клеток сортировки (FACS), что позволяет последующий анализ гена ехприжимное, экспрессия белка или эпигенетические модификации ДНК в объемном клетки или уровне одной клетки. И, наконец, этот протокол также может быть выполнен с возможностью генерации пациента, полученных культур для других опухолей центральной нервной системы.
Introduction
DIPG является агрессивной центральной нервной системы злокачественности , которая возникает в вентральной мосте, как правило , в течение середины детства 1, 2. Несмотря на десятилетия клинических испытаний, в настоящее время обработка ограничивается лучевой терапией, которая обеспечивает временное улучшение или стабилизация симптомов и только увеличивает медиану выживаемости в среднем на 3 месяца. Даже при лучевой терапии, медиана общей выживаемости составляет всего 9 месяцев с 90% детей, умирающих от этого заболевания в течение 2 лет первоначального диагноза. Из-за инфильтративного характера опухоли и критические функции ствола головного мозга, хирургическое удаление не представляется возможным. Кроме того, в Соединенных Штатах, получение хирургических биопсий для DIPG исторически не была выполнена 3, поскольку гистопатологическая анализ не имеет текущую роль в руководстве клинического лечения и диагностики , как правило , могут быть сделаны с помощью нейровизуализации в одиночку. Таким образом, наличие опухоли ткани Fили исследование ограничено, что ограничивает усилия по проведению исследований по защите кандидатских молекул лекарственного вещества и основной биологии опухоли. Следует отметить, что улучшения в нейровизуализации и стереотаксической техники позволили для разработки безопасных биопсий DIPG в последние годы 4, которые, в сочетании с достижениями в области молекулярной биологии, которые изменили наше представление о болезни. В настоящее время многочисленные клинические испытания с использованием авансовый биопсии и молекулярно - профилирование DIPG для индивидуализацию планов лечения продолжается (NCT01182350, NCT02274987) 5.
DIPG и другие педиатрические глиомы высокого класса представляют различные заболевания от своих взрослых коллег глиобластомы 6, 7, и , таким образом , верные экспериментальные модели DIPG необходимо понять его уникальный патофизиологии и открыть для себя эффективные терапевтические стратегии. В последние годы целенаправленные усилия по получению опухоли DIPG твопрос для исследования во время аутопсии или, реже, биопсия реконструировали наше понимание и способность к обучению DIPG. Всему геному усилия секвенирования выявили рецидив мутации в гистона Н3, семейство 3A (H3F3A) и гистонов кластера 1, H3b (HIST1H3B), представляющий собой первый пример человеческого заболевания , вызванного мутацией в гистона , кодирующих белки , 8, 9, 10, 11 , Кроме того, подмножество DIPGs выражает мутации в гене ACVR1, которые ранее не были сообщены в раке , но идентичные мутации найдены в врожденная детстве развития расстройства фибродисплазия 8, 9, 10, 11. Кроме того, первый пациент полученные клеточные культуры DIPG и ортотопической ксенотрансплантата модельс в настоящее время установлено , 1, 2, 12, 13, 14, а также мышиные модели , выработанные на основе прямой ксенотрансплантации опухолевых клеток в иммунодефицитных мышей для генерации серийных ксенотрансплантаты 3, 14, 15. Первоначальные усилия скрининга лекарственных препаратов с использованием этих моделей пациентов происхождения определили перспективные новые средства для клинического перевода 4, 14 и заложили основу для по меньшей мере одного клинического исследования (NCT02717455).
Эти первые шаги в направлении прогресса являются только началом, а также многочисленные пациента полученные образцы тканей и модели культуры будут необходимы для определения подтипа заболевания и разработать наиболее эффективные терапевтические стратегии. Генетически двигательERed модели мыши DIPG будет также содействовать проведению исследований, направленных на дальнейшее наше понимание болезни. Усилия, предпринятые для создания генетических моделей для DIPG будет оказывать основополагающих геномных исследований, описанных выше, но в настоящее время ограниченное число опций доступны. Одной из таких моделей, которая генерирует гистологически аналогичные высокосортных ствола мозга глиомы, использует вирусный RCAS / TV-система для привода PDGF-B гиперэкспрессия и Ink4a-ARF потери в нестин-позитивных клеток в задней черепной ямке у новорожденных мышей 5, 16. Другой подход предполагает обобщал несколько крупных DIPG-ассоциированных мутаций (мутации K27M гистона H3.3, потеря p53 и активация PDGFRA) в нервных клеток - предшественников , полученных из человеческих эмбриональных стволовых клеток, что достаточно для визуализации этих клеток онкогенными 6, 7, 17. Сочетание генетических методов и пациента-, вытекающейМодели-е изд позволит доклинических испытаний и дальнейшее развитие эффективных методов лечения.
Для решения проблем в DIPG исследований подробно описано выше, этот быстрый протокол аутопсии был разработан для создания пациента , полученных клеточных культур для расследования 8, 9, 10, 11, 12, 14. Протокол предназначен для защиты жизнеспособности ткани и максимизировать вероятность формирования прочных культур, несмотря на трудности, связанные с увеличенными интервалами посмертных и времени транспортировки. Когда успешно генерироваться эти DIPG культуры могут быть использованы в последующих манипуляций в пробирке и в естественных условиях экспериментов ксенотрансплантатных, что позволяет для оценки потенциальных терапевтических молекул на клетках пациента происхождения.
Protocol
Этот протокол был выполнен с одобрения нашего этическими комитетами с соответствующими деидентификации всех данных пациента и в соответствии со всеми институциональными, национальных и международных руководящих принципов для благосостояния людей. Получить все соответствующие институциональные утверждения экспертным советом и информированного согласия со стороны семьи пациента до начала работы с этим протоколом.
1. Получение образцов тканей
Примечание: Одним из важнейших компонентов этого протокола требует надлежащего обращения с донорства тканей сразу, начиная с момента вскрытия. Общая жизнеспособность образца существенно зависит от минимизации посмертного интервала (PMI), немедленно передавая ткани в соответствующую холодной среде , дополненной антибиотиками / противогрибковых, держа образец на мокром льду на протяжении транспортировки, а также поддержание стерильной техники на протяжении всего протокола.
- После получения уведомленияо неизбежном пожертвования, подготовить комплект для сбора образца. Используя транспортную коробку с изолированным контейнером, который может быть непосредственно использован для обратной перевозки образца ткани, включают в себя следующие материалы:
- Включить материалы для стерильного препарата, в том числе стерильные перчатки, драпировки и скальпелей.
- Включите 8 - 10 стерильных 50 мл конические пробирки, содержащие 30 мл транспортные средства массовой информации в изолированном контейнере со льдом или холодные компрессы.
Примечание: В то время как любой стандартной среды для культивирования клеток может работать, лучшая жизнеспособность образец получают с Hibernate-A с добавлением антибиотика / противогрибкового. - Включите любые дополнительные пробирки с образцами для других анализов (например, фиксаторов).
- Если вскрытие трупа не будет выполняться на месте следователя, включают в себя документ, в котором четко говорится, как собрать образец опухоли. Это включает в себя детали, такие как поддержание стерильности, сохраняя образцы труб на мокром льду, и в том числе образцы из среднего мозга и продолговатого мозга как TuМор клетки часто вторгаются эти регионы.
- Поддержание стерильности во время вскрытия. Рассмотрим мозг стерильный внутри черепа, поэтому наблюдать стерильной техники (в том числе смена перчаток) один раз череп открыт. Во избежание загрязнения с кожи и волос имеет решающее значение.
- Рассеките опухоль с брюшной стороны (далее «брюшке» мосте см Дополнительный рисунок 1). С стерильным скальпелем, нарезать небольшими кусками 1 см от опухоли и немедленно передать в холодную СМИ судоходства (смотри примечание в шаге 1.1.2) и поставить на мокром льду. Поместите 10 мл ткани в каждую пробирку, в результате чего в конечном объеме ткани и среды в каждую пробирку 40 мл.
Примечание: В случае DIPG опухоль диффузно проникает в Понс и часто остальной части ствола головного мозга. Таким образом, собрать как можно больше образца, насколько это возможно, как правило, в том числе 3 - 4 пробирки (30 - 40 мл ткани) из Понс и 1 - 2 пробирки (10 - 20 мл ткани) каждый из среднего мозга и продолговатого мозга. - Собирают СэмуПлес от среднего мозга и мозговом сопоставляется мосте, которые часто содержат много опухолевых клеток.
- После взятия пробы, отправить образцы O / N на мокром льду в изолированном контейнере. Не грузите образец на сухом льду, как замораживание убивает клетки.
2. Подготовка к обработке образцов
- До начала подготовки образца, стерилизовать культуры ткани, капюшоны наряду с лезвиями, изогнутыми кровоостанавливающих, а также любых других нестерильных инструментов под УФ-светом в течение 1 ч. Выполните все следующие шаги в стерильных условиях, чтобы предотвратить загрязнение культур.
- Подготовить и стерильные растворы фильтров.
- Для приготовления 1,8 М раствора сахарозы, растворить 308.07 г сахарозы в 300 мл дистиллированной воды. Добавить 50 мл 10х Hank's-солевом буферном растворе (HBSS) без кальция или магния и довести общий объем до 500 мл с помощью дистиллированной воды. Хранить при температуре 4 ° С.
- Для приготовления раствора ферментативного пищеварения, принимают 50 мл HBSS , с кальцием и магнием на каждые 10 мл измельченной ткани и добавляют 500 мкл 5 мг / мл ДНК - аза I (конечная концентрация 50 мкг / мл), 500 мкл 2,5 мг / мл коллагеназы I / II и диспаза раствора (конечная концентрация 25 мкг / мл), и 500 мкл 1 М HEPES-буфера. раствор пищеварения Prewarm в C водяной бане при 37 °.
- Для подготовки стволовых носителя (TSM) основание опухоли, смешайте 250 мл Neurobasal-A, 250 мл Дульбекко в модификации Дульбекко: питательной смеси F12 (DMEM / F12), 5 мл 100x антибиотик-противогрибковое, 5 мл 200 мМ L-аланил-L глутамин-дипептид (GlutaMAX-а), 5 мл HEPES-буфера, 5 мл 100 мМ пирувата натрия, и 5 мл 100x MEM заменимых аминокислот.
- Для получения полной TSM с факторами роста, добавьте следующие дополнения к TSM базе: 50x B27 Дополнение Минус Витамин А (1:50), эпидермальный фактор роста человека (H-ЭФР, 20 нг / мл), человеческий фактор роста фибробластов (Н- FGF, 20 нг / мл), человеческий тромбоцитарный фактор роста АА (Н-PDGF-AA, 10 нг / мл),человеческий тромбоцитарный фактор роста ВВ (Н-PDGF-BB, 10 нг / мл), и раствор гепарина (2 мкг / мл).
- Предварительно охлаждать лабораторной центрифуге, оснащенный бакет-роторе до 4 ° С.
3. Механическая диссоциация
- Передача ткани в высокочастотную стенками 100 мм х 20 мм для культивирования клеток блюдо. Удалить медиа пережиток от судоходства и заменить 10 - 15 мл холодной культуральной среды.
- Используя изогнутые кровоостанавливающих схватить лезвие бритвы, фарша мелко ткани, удаляя очевидные кровеносные сосуды или мозговых оболочек.
Примечание: Фрагменты конечные ткани должны быть меньше , чем 1 мм (см рисунок 1В). - Передача ткани в чистую 50 мл коническую трубку. Вымойте клеток культуры блюдо с дополнительными 5 мл среды холодной культуры и переносят в коническую трубку. Повторите этот шаг для стирки по мере необходимости передавать оставшиеся ткани.
- С помощью серологической пипетки на 10 мл, растереть аккуратно (4 - 5 раз). Разрешить большие TissУЭ фрагменты оседают на дно пробирки. В случае необходимости, кратко центрифуги образца в течение 1 мин (350 XG, 4 ° C).
- Собрать механически диссоциированной фракции.
- Удалить супернатант и фильтровать ее через фильтр с диаметром 100 мкм в новый 50 мл коническую трубку с надписью "Механическое диссоциацией." Переверните фильтр по оригинальной конической трубе и промывают культуральной среды для восстановления фрагментов тканей.
- Центрифуга "Механическая диссоциация" фракции в течение 5 мин (350 мкг, 4 ° C).
- Удалить супернатант из осажденной фракции "Механический" и диссоциации ресуспендируют ткани в холодной культуральной среде. Если есть больше чем 5 мл ткани в "Механический" диссоциации конической трубки, расколоть ткани в другие 50 мл конические пробирки таким образом, что трубка не имеет более 5 мл ткани.
- Храните механически диссоциированных фракции на льду до стадии центрифугирования в градиенте сахарозы (Steр 5). В качестве альтернативы, механически диссоциированной фракция может перейти к шагу 5 в течение периода ферментативной диссоциации инкубации (стадия 4.4).
4. Ферментативная диссоциация
- При наличии более чем 5 мл ткани в пробирку, содержащую оставшиеся крупные фрагменты ткани, расколоть ткани в другие новые 50 мл конические пробирки таким образом, что трубка не имеет более 5 мл ткани.
- Центрифуга коническую трубку (ы), содержащий оставшиеся фрагменты ткани в течение 5 мин (350 мкг, 4 ° C).
- Удалить супернатант и добавьте предварительно подогретую ферментативного раствора пищеварение, таким образом, что существует 5 мл раствора переваривание на каждый 1 мл ткани (например, 25 мл раствора переваривание в течение 5 мл ткани).
- Уплотнение конические крышки пробирок лабораторной пленкой и инкубировать реакции на ротатор при 37 ° С в течение 30 мин.
- После инкубации образцы растирать осторожно (см рисунок 1c).
- С помощью серологической пипетки на 10 мл,пипетка образец вверх и вниз по 6 - 8 раз. Избегайте чрезмерного генерирования пузырьков воздуха.
- Добавьте 1000 мкл пипеткой наконечник к концу пипеткой и растирать еще 6 - 8 раз.
- Разрешить все оставшиеся куски, чтобы осесть на дно пробирки. Удалить и фильтруют супернатант с клетками все еще подвешенных через фильтр с диаметром 100 мкм в новый 50 мл коническую трубку с надписью "Ферментативная диссоциация" и хранить на льду.
- Если значительные фрагменты ткани остаются, добавьте еще 10 мл HBSS с кальцием и магнием до фрагментов и повторите шаги 3.5.1 и 3.5.2. Фильтр на этот конечный раствор через фильтр с размером 100 мкм в трубу "Ферментативный" диссоциации.
- Центрифуга "Ферментативная диссоциация" трубку в течение 5 мин (350 XG, 4 ° С) и продолжают центрифугированием в градиенте сахарозы.
5. Сахароза градиентное центрифугирование
- Если образцы по-прежнему приостановлено в растворе, centrifuGE в течение 5 мин (350 XG, 4 ° C).
- Удалить супернатант и ресуспендируют ткани в 20 мл холодной HBSS без кальция и магния. Довести объем до 25 мл общего с холодным HBSS.
- Медленно добавляют 25 мл 1,8 М раствора сахарозы и инвертировать трубку для смешивания. Это приводит к градиенте 0,9 М сахарозы.
- Центрифуга с не обеспечивает торможение в течение 10 мин (800 XG, 4 ° C). Использование центрифугирование тормоз нарушит градиент и уменьшить выход (рис 1D для примера образца до и после центрифугирования).
- Тщательно аспирата миелина мусора и столько же раствор сахарозы, как это возможно. Отмывки образца путем добавления 30 мл холодного HBSS без кальция и магния и смешивание мягко. Центрифуга в течение 5 мин (350 XG, 4 ° C).
6. ACK эритроцит Лизис
- Удалите промывочный супернатант. Добавьте 5 мл ACK лизирующего буфера и осторожно ресуспендируют осадок клеток, закрученной пробирку в течение 1 мин при комнатной температуре.
- Гасят ллиз путем добавления 30 мл холодного HBSS без кальция и магния.
- Центрифуга в течение 5 мин (350 XG, 4 ° C).
7. Начальное техническое обслуживание Культура
- Ресуспендируют конечные гранулы клеток в 10 - 15 мл теплой полная TSM с факторами роста и количественной оценки жизнеспособной плотности клеток на гемоцитометра с использованием трипанового синего.
Примечание: Диапазон жизнеспособных клеток колеблется в широких пределах в зависимости от обстоятельств донорства тканей, и количественное определение может быть трудно на этой ранней стадии из-за оставшегося клеточного мусора. В идеальном случае, стремиться иметь один миллион живых клеток в образце. В тех случаях, когда чрезмерное остатки мусора, пластины при более низкой плотности в Т175 колбу. - Перенести финальные клеточные суспензии в новую Т75 колбе для культивирования. Шип в дополнительных факторов роста каждый день , чтобы поддерживать общий уровень фактора роста, а также мониторинг развития опухолевых клеток нейросферах (рис 1E и рисунок 2).
- В другом варианте способ ферментативно диссоциированных клеток для дальнейшего анализа, в том числе проточной цитометрии и флуоресцентной активированный сортировки клеток.
- После разработки нейросферах (который в среднем занимает от 3 - 4 недели, но находится в пределах от нескольких дней до тех пор, как 2 месяца), обратный фильтр образец с использованием фильтра нейлоновой сетки 100 мкм, чтобы уменьшить количество мусора.
Примечание: Фильтрат следует поддерживать в культуре в случае жизнеспособные отдельные клетки или небольшие сферы присутствуют. - Обеспечение целостности и чистоты культуры путем проведения ДНК-дактилоскопии в то время как пересева, по сравнению с исходным образцом пациента.
Representative Results
Протокол , описанный в обобщенном виде пятиступенчатой процесса с изображениями ткани на различных этапах обработки на рисунке 1 а. Образец сначала получают путем быстрого стерильного аутопсии. При механической диссоциации, ткань измельчают, удаляя кровеносные сосуды и мозговые оболочки из образца, и фильтруют через фильтр с нейлоновой сеткой 100 мкм. Остальные фрагменты ткани ферментативно диссоциированных в согревающей печи. Затем мусор снижается через центрифугированием в градиенте сахарозы, выделение отдельного слоя миелина из образца. Кроме того, АСК лизис заметно уменьшает количество красных кровяных клеток, присутствующих в образце. Наконец, клетки высевают в бессывороточной среде, дополненной факторами роста.
Справочная Рисунок 1 является примером опухоли после аутопсии. Опухоль растет как диффузная инфильтрация Ан Ponsг прилегающие к нему районы мозга. Во время подготовки образцов, малых ~ 1 см х 1 см кусками следует вырезать и немедленно помещают в холодную доставки СМИ на льду.
На рисунке 2 показаны различные примеры того , как образцы могут появиться на ранних стадиях культивирования к прочному культуры. Первоначально гальваническим и ранние культуры (А, В) часто не по всей видимости, содержат много живых клеток. Кроме того, ранние клеточные кластеры (C, D) часто не демонстрируют степень контраста, обычно связанных с нейросферах. Следует отметить, что продолжительность времени, в культуре до появления клеточных кластеров может занять несколько недель до нескольких месяцев. Тем не менее, начальный период прохождения этих кластеров клеток, в сочетании с обратной фильтрации кластеров клеток, могут изолировать здоровые клетки опухоли, которые способны образовывать сферы (F). Фильтрат (Е) обычно содержит остатки мусора; Тем не менее, мы рекомендуем покрытие и поддержание фильтрата и мониторинга развитие клеточных кластеров. Эти пациента полученные образцы затем можно поддерживать в культуре в течение многих пассажей (G, H).
Рисунок 3 демонстрирует способность этих клеток , предназначенных для ксенотрансплантированной в организм мышей. В каждом из этих случаев DIPG клетки трансфицировали с GFP-люциферазы, чтобы следить за развитием опухолей с помощью биолюминесценции (A). Опухоли также могут быть исследованы гистологически, например для наблюдения опухоли приживление (В) или экспрессии специфических маркеров (С). Эти in vivo на модели, в сочетании с анализами в пробирке могут быть использованы для оценки влияния различных лекарственных средств или манипуляции (генных например, 8, 9, 10, 11, 14).
ле / ftp_upload / 55360 / 55360fig1.jpg "/>
Рисунок 1. Образцы тканей на различных этапах обработки. (A) Получение образца с помощью стерильных аутопсии процедур и ночь судоходства на мокром льду. (B) Слева направо: (строка 1) пробирки , содержащие опухолевые ткани в области морских перевозок средств массовой информации; свежей ткани в х 20 мм для культивирования клеток блюдо 100 мм; первоначальный мясорубки ткани; (Строка 2) частично измельченной ткани; удаление мозговых оболочек и кровеносных сосудов; Окончательный размер измельченных кусочков ткани. (C) Слева направо: (строка 1) ткани инкубировали на вращающемся столе в 37 ° С печи; (Строка 2) После растирания ткани через кончик пипетки 1000 мкл, прикрепленного к пипеткой 10 мл; фильтрация диссоциированных ткани через фильтр с нейлоновой сеткой 100 мкм. (D) Слева направо: диссоциированы ткань суспендировали в 0,9 М растворе сахарозы перед центрифугированием; диссоциированного ткани разделенных через градиент сахарозы после центрифугирования; видимый слой OF миелин мусора на верхней части градиента сахарозы; окончательный осадок клеток после лизиса ACK и промывки. (Е) Конечный образец может быть помещен в культуру или использовать в других последующих анализов. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2. Изображения первичных культур и ранних клеток проход. (A - B) Культуры высевают сразу после диссоциации (SU-DIPG-XXX, А), или которые не выросли еще нейросферы (SU-DIPG-XXIX, B). (C - D) Раннее появление нейросферах в первичных культурах SU-DIPG-XXVIII (C) и SU-DIPG-XXIX (D). (EF) Первый канал первичной культуры из D, используя нейлоновый фильтр 100 мкм, с фиФильтрат (Е) и обратный фильтрат (F) высевают. (G - H) Зрелые нейросферы из первого прохождения СУ-DIPG-XXVII (G) и третьего прохода SU-DIPG-XXXV (H) , растущих в культуре. Шкала бар = 200 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3. Пациент полученных клеточных культур Можно прививать и Форма Опухоли у мышей. (A) биолюминесценции изображения четырех различных культур клеток пациента , полученных трансфицированных GFP-репортера люциферазы. (B) Саггитальная участок от ксенотрансплантата мыши, показывая опухолевые клетки вживляют в мосте мыши. Зеленый: GFP, красный: основной белок миелина. Шкала бар = 1 мм. (C) Пример immunofluoresпоказывая опухолевых клеток GFP привиты в головном мозге мыши ценция изображение. Синий: DAPI, зеленый: GFP, Красный: Igf2r. Шкала бар = 40 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Справочная Рисунок 1. Вскрытие Образцы Понтийской опухолью. Немедленное появление некропсический диффузной внутренней глиомы мостовой. Опухоль выглядит как большой, миелиновой богатой массы на вентральной поверхности мосте. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы скачать этот файл.
Discussion
Этот протокол описан способ быстрой обработки посмертных пожертвования опухолевой ткани для развития пациента , полученных клеточных культур, которые могут быть использованы в различных в пробирке или в экспериментах естественных условиях. Из-за характера работы с образцами аутопсии, поддержание жизнеспособности образца представляет собой значительную проблему. Несколько факторов, влияющих, в том числе интервал посмертном аутопсии или время, необходимое для транспортировки ткани, следует свести к минимуму, насколько это возможно, но часто трудно контролировать. По нашему опыту, посмертным интервалом менее 6 - 8 ч (от момента смерти до момента, что ткань помещают в лед холодной доставки и транспортировки средств массовой информации) дала наилучшие шансы установления прочного клеточной культуры. Лучше всего, чтобы затем получить ткани в лаборатории в течение 24 часов, и обрабатывать его для культуры сразу после получения.
Поскольку расположение этих редких случаев колеблется в широких пределах, икачество на этапе поиска информации ткани сильно влияет на шансы на успех, материально-техническое обеспечение выполнения вскрытие трупа может быть сложной задачей. Во многих случаях для достижения сроки 6-8 часа, это не представляется возможным провести урожай ткани в академическом центре. Вместо того, чтобы, имея в службу восстановления тканей по вызову для восстановления ткани опухоли в похоронном доме под IRB утвержденных протоколом часто является более целесообразным для восстановления тканей. Получение информированного согласия в преддверии смерти рекомендуется и облегчает материально-технического планирования. Подготовка комплектов аутопсии самодостаточные с четкими и подробные инструкции и стерильных принадлежностей для извлечения тканей (перчатки, портьеры, скальпели) настоятельно рекомендуется. Кроме того, установление четких точек связи между исследователем, патологоанатомом и похоронный дом имеет решающее значение. Например, исследователь должен обсудить протокол с патологоанатомом до вскрытия и выделить наиболее распространенные ошибки. Эти ошибки включают в себя микроЗагрязнение BIAL (как правило, дрожжи) во время извлечения ткани, неспособность корабль через ночной / ускорено судоходства и отказа отгружать образца на достаточном мокром льду в контейнере теплоизоляция. И, наконец, мы рекомендуем использовать от двери до двери курьерской службы для доставки образца, чтобы минимизировать время транспортировки.
Следует также принимать во время диссоциации ткани, чтобы сохранить жизнеспособность клеток. Например, использование средств массовой информации, направленных на сохранение здоровья нервной ткани для транспортировки (Hibernate-A с добавлением антибиотика / противогрибкового) увеличит вероятность формирования успешной культуры. Кроме того, важно, чтобы держать образец при низкой температуре в течение всего протокола, всегда передавая образцы на льду. Сбор как механические, так и ферментативные фракции диссоциации наряду с минимизации растирание может улучшить успех протокола, поскольку оба шага являются травматический к клеткам. По нашему опыту, в то время как большинство успешных культур растут из обеих фракций, Мы имели случаи, когда только один из двух препаратов, создала прочную культуру, потенциально отражающие нежную природу этих образцов. Еще один травматический шаг в протоколе является растирание; одна стратегия, которая может уменьшить степень растиранием необходимой является обеспечение образцы тщательно измельченная в самом начале подготовки. Другие примеры аспектов протокола , разработанных для повышения жизнеспособности образца включают в себя добавление буферов (например, HEPES) на протяжении всего протокола, который является особенно критично при ферментативном диссоциации.
Возможное изменение этого протокола для дальнейшего повышения жизнеспособности клеток является удаление красных кровяных телец стадии клеточного лизиса ACK. Тем не менее, в этом случае, часто бывает тогда необходимо выполнить шаг ACK для лизиса в течение начальной недели в культуре, чтобы удалить эритроциты. Другой аспект этого протокола, который может быть модифицирован является устранение миелина и клеточных остатков с использованием DENSIT сахарозыу градиента. В частности, другие стратегии , которые были зарегистрированы , чтобы улучшить жизнеспособность клеток микроглии клеток, также возможно на этом этапе, например, прерывистой Percoll градиент плотности 18 или магнитных шариков удаление миелина.
Наконец, длительность между начальной диссоциации ткани и появление нейросферах варьируется между образцами и может занять от недели до месяца и более. Так как начальные культуры, как правило, содержат значительную степень мертвых клеток и клеточных остатков, она может быть сложной задачей, чтобы определить, остается ли жизнеспособных клеток; культура должна поддерживаться в течение по крайней мере 4 - 8 недель (рисунок 2). Одна из стратегий для выделения клеток , растущих от остального мусора представлена здесь (т.е. обратной фильтрации клеточных кластеров и повторное покрытие в свежей среде). Решение о том, следует ли продолжать поддерживать культуру, в конечном счете решение от случая к случаю на основании факторов, окружающих тысе вскрытие трупа (например, длительный интервал посмертных, проблемы во время транспортировки ткани), диссоциация ткани (например, чрезмерная кровь или мусор), и как образец появляется в культуре. После того, как культура установлено, личность должна быть подтверждена с помощью ДНК-дактилоскопии с помощью краткого анализа тандемной дупликации или подобный метод, сравнивая культуру к образцу исходной опухоли сохраняется для этой цели. Мы рекомендуем регулярно проверки культур с помощью ДНК-дактилоскопии, чтобы гарантировать, что никакого загрязнения другими культурами не произошло, например, через каждые 3 - 6 месяцев.
Поколение этих пациентов происхождения DIPG культур представляет собой важный шаг в успешном развитии эффективных методов лечения. Расширение имеющихся моделей пациентов происхождения DIPG культуры и ксенотрансплантатных будет иметь решающее значение для определения наиболее эффективных терапевтических стратегий и в конечном счете преодолеть эту разрушительную болезнь.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Acknowledgments
Авторы выражают благодарность поддержку от McKenna Клэр фонда, Национального института неврологических расстройств и инсульта (NINDS K08NS070926 и R01NS092597), Министерства обороны (NF140075), Калифорнийский институт регенеративной медицины (CIRM RB4-06093 и RN3-06510), лимонад Алекса Stand Foundation, The Cure начинается сейчас Фонд и DIPG Collaborative, Lyla Nsouli Фонд Распутайте педиатрического рака, Фонд Опухоль мозга у детей, Мэтью Larson Фонд, V Фонд, Фонд Семья Годфри в память Фиона Пенелопы, в Wayland Виллар DIPG Фонда, Dylan Jewett Коннор Джонсон, Зои Ганеш, Дилан Фрик, Эбигейл Йенсен, и Дженнифер Кранц фонды, Меморандум n8 фонда, Вирджиния и Д. К. Людвига Фонд исследований рака, Научно-исследовательский институт здоровья ребенка при Стэнфордском Энн Т. и Роберт М. Басса наделенный факультета Стипендия в педиатрии Рак и крови Болезни.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hibernate-A | Gibco | A12475-01 | |
| HBSS with Calcium/Magnesium | Gibco | 24020-117 | |
| HBSS | Corning | 21-022-CV | |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| Liberase DH (Collagenase/Dispase) | Roche | 5401054001 | |
| DNAse I | Worthington Biochemical | LS002007 | |
| Sucrose | Sigma | S0389 | |
| Antibiotic/Antimycotic | Gibco | 15240-096 | |
| Neurobasal-A | Gibco | 10888-022 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11330-032 | |
| GlutaMAX-I (100x) | Gibco | 35050-061 | |
| Sodium Pyruvate (100 mM) | Gibco | 11360-070 | |
| B27 Supplement Minus Vitamin A | Gibco | 12587-010 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids (100x) | Gibco | 11140-050 | |
| Human PDGF-AA | Shenandoah Biotechnology | 100-16 | |
| Human PDGF-BB | Shenandoah Biotechnology | 100-18 | |
| Human EGF | Shenandoah Biotechnology | 100-26 | |
| Human FGF | Shenandoah Biotechnology | 100-146 | |
| Sterile scalpel blades | Bard Paker | 372610 | |
| Curved hemostats | Fine Science Tools | 13013-14 | |
| Razor blades | VWR | 55411-050 | |
| 100 x 20 mm cell culture dish | Corning | 353003 | |
| Sterile forceps | TWD Tradewinds | DF8988-5 | |
| Sterile drapes | 3M | 2037 | |
| Sterile gloves | Kimberly Clark | 1182307 | |
| ACK Lysis Buffer | Gibco | A1049201 | |
| 100 micron mesh filter | Fisher | 352360 | |
| 50 mL conical tube | Fisher | 1495949A |
References
- Fisher, P. G., et al. A clinicopathologic reappraisal of brain stem tumor classification. Identification of pilocystic astrocytoma and fibrillary astrocytoma as distinct entities. Cancer. 89 (7), 1569-1576 (2000).
- Johung, T. B., Monje, M. Diffuse Intrinsic Pontine Glioma: New Pathophysiological Insights and Emerging Therapeutic. Curr. Neuropharmacol. , (2016).
- Cage, T. A., et al. Feasibility, safety, and indications for surgical biopsy of intrinsic brainstem tumors in children. Child Nerv. Syst. 29 (8), 1313-1319 (2013).
- Puget, S., et al. Biopsy in a series of 130 pediatric diffuse intrinsic Pontine gliomas. Child Nerv. Syst. 31 (10), 1773-1780 (2015).
- Kieran, M. W. Time to rethink the unthinkable: Upfront biopsy of children with newly diagnosed diffuse intrinsic pontine glioma (DIPG). Pediatr. Blood Cancer. 62 (1), 3-4 (2014).
- Sturm, D., et al. Paediatric and adult glioblastoma: multiform (epi)genomic culprits emerge. Nat. Rev. Cancer. 14 (2), 92-107 (2014).
- Jones, C., Baker, S. J. Unique genetic and epigenetic mechanisms driving paediatric diffuse high-grade glioma. Nat. Rev. Cancer. , (2014).
- Taylor, K. R., et al. Recurrent activating ACVR1 mutations in diffuse intrinsic pontine glioma. Nat. Genet. 46 (5), 457-461 (2014).
- Wu, G., et al. The genomic landscape of diffuse intrinsic pontine glioma and pediatric non-brainstem high-grade glioma. Nat. Genet. 46 (5), 444-450 (2014).
- Fontebasso, A. M., et al. Recurrent somatic mutations in ACVR1 in pediatric midline high-grade astrocytoma. Nat. Genet. 46 (5), 462-466 (2014).
- Buczkowicz, P., et al. Genomic analysis of diffuse intrinsic pontine gliomas identifies three molecular subgroups and recurrent activating. Nat. Genet. 46 (5), 451-456 (2014).
- Monje, M., et al. Hedgehog-responsive candidate cell of origin for diffuse intrinsic pontine glioma. Proc. Natl. Acad. Sci. 108 (11), 4453-4458 (2011).
- Aoki, Y., et al. An experimental xenograft mouse model of diffuse pontine glioma designed for therapeutic testing. J. Neuro-Oncol. 108 (1), 29-35 (2012).
- Grasso, C. S., et al. Functionally defined therapeutic targets in diffuse intrinsic pontine glioma. Nat. Med. , 1-10 (2015).
- Shu, Q., et al. Direct Orthotopic Transplantation of Fresh Surgical Specimen Preserves CD133 +Tumor Cells in Clinically Relevant Mouse Models of Medulloblastoma and Glioma. Stem Cells. 26 (6), 1414-1424 (2008).
- Becher, O. J., et al. Preclinical evaluation of radiation and perifosine in a genetically and histologically accurate model of brainstem glioma. Cancer Res. 70 (6), 2548-2557 (2010).
- Funato, K., Major, T., Lewis, P. W., Allis, C. D., Tabar, V. Use of human embryonic stem cells to model pediatric gliomas with H3.3K27M histone mutation. Science. 346 (6216), 1529-1533 (2014).
- Olah, M., et al. An optimized protocol for the acute isolation of human microglia from autopsy brain samples. Glia. 60 (1), 96-111 (2012).
