Summary
Denne protokollen beskriver en fremgangsmåte for hurtig behandling av post-mortem diffuse iboende pontin glioma prøver for etablering av pasientavledet cellekulturmodeller eller direkte karakterisering av tumorceller og microenvironmental.
Abstract
Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG) er en barndom hjernetumor som bærer et universelt dødelig prognose. Fordi kirurgisk fjerning er ikke en levedyktig behandlingsstrategi og biopsi er ikke rutinemessig utført, er tilgjengeligheten av pasientprøver for forskning begrenset. Derfor innsats for å studere denne sykdommen har blitt utfordret av en sparsomt med trofaste sykdomsmodeller. For å møte dette behovet, beskriver vi her en protokoll for hurtig behandling av post-mortem obduksjons vevsprøver for å frembringe holdbare pasient-avledet cellekulturmodeller som kan brukes i in vitro prøver eller in vivo ortotopiske xenograft eksperimenter. Disse modellene kan brukes til å screene for potensielle narkotika mål og å studere fundamentale pathobiological prosesser innen DIPG. Denne protokollen kan videre utvides til å analysere og isolere tumor og microenvironmental celler ved hjelp av fluorescens-aktivert cellesortering (FACS), som gjør det mulig for påfølgende analyse av genet expression, protein uttrykk, eller epigenetiske modifikasjoner av DNA på bulk celle eller celle-nivå. Endelig kan denne protokollen også være tilpasset til å generere pasient-avledet kulturer for andre sentralnervesystemet tumorer.
Introduction
DIPG er en aggressiv sentralnervesystemet malignitet som oppstår i ventral pons, vanligvis i midten av barndommen 1, 2. Til tross for flere tiår med kliniske studier, er nåværende behandling begrenset til strålebehandling, noe som gir midlertidig forbedring eller stabilisering av symptomer og bare forlenger median overlevelse med et gjennomsnitt på 3 måneder. Selv med strålebehandling, er median total overlevelse bare 9 måneder med 90% av barn som dør av sykdommen innen 2 år etter første diagnosen. På grunn av den infiltrerende arten av tumoren og de kritiske funksjoner av hjernestammen, er kirurgisk fjerning ikke mulig. Videre, i USA, skaffe kirurgiske biopsier for DIPG har historisk sett ikke utført tre, som histopatologiske analyser har ingen nåværende rolle i å veilede klinisk behandling og diagnose kan vanligvis gjøres ved neuroimaging alene. Således tilgjengeligheten av tumorvev feller studier er begrenset, noe som begrenser arbeidet med å gjennomføre forskning på legemiddelkandidat molekyler og den underliggende tumorbiologi. Spesielt, har forbedringer i bildediagnostiske og stereotaktisk teknikk tillot utvikling av sikre biopsier av DIPG i de senere år 4, som, når kombinert med fremskritt innen molekylær biologi, har revolusjonert vår forståelse av sykdommen. Foreløpig flere kliniske studier med upfront biopsi og molekylær profilering av DIPG for individualisering behandlingsplaner er pågående (NCT01182350, NCT02274987) 5.
DIPG og andre barne høy klasse hjernesvulst representerer forskjellige sykdommer fra sine voksne glioblastom kolleger 6, 7, og dermed trofaste eksperimentelle modeller av DIPG er nødvendig for å forstå dens unike patofysiologi og finne effektive terapeutiske strategier. I de siste årene fokusert innsats for å få DIPG svulst tproblem for forskning ved obduksjon eller mindre vanlig, biopsi har revolusjonert vår forståelse av og evne til å studere DIPG. Genomsekvensering innsats avslørte en tilbakevendende mutasjon i H3 histon, familie 3A (H3F3A) og histon klynge 1, H3b (HIST1H3B), som representerer den første eksempel på human sykdom forårsaket av mutasjoner i histon-kodende proteiner 8, 9, 10, 11 . Videre er en undergruppe av DIPGs uttrykker mutasjoner i ACVR1 genet, som ikke tidligere er blitt rapportert i kreft, men er identiske med mutasjoner som finnes i det medfødte barndommen utviklingsforstyrrelse fibrodysplasia ossificans progressiva 8, 9, 10, 11. I tillegg er de første pasient avledet DIPG cellekulturer og orthotopic xenograft moDet er nå etablert dels 1, 2, 12, 13, 14, samt musemodeller etableres gjennom direkte xenotransplantasjon av tumorceller i immundefekte mus for å generere serie xenotransplantater 3, 14, 15. Innledende narkotika screening innsats ved hjelp av disse pasient avledet modeller har identifisert lovende nye midler for klinisk oversettelse 4, 14 og har lagt grunnlaget for minst én klinisk studie (NCT02717455).
Disse første skritt mot fremgang er bare begynnelsen, og en rekke pasient avledet vevsprøver og kultur modeller vil være nødvendig å definere undergrupper av sykdommen og utvikle den mest effektive terapeutiske strategier. genetisk motorEred musemodeller av DIPG vil også legge til rette for studier som tar sikte på å fremme våre grunnleggende forståelse av sykdommen. Arbeidet er gjort for å generere genetiske modeller for DIPG vil bli hjulpet av de grunn genomiske studier omtalt ovenfor, men i dag et begrenset antall alternativer er tilgjengelige. En slik modell, som genererer histologisk lignende høyverdige hjernestammen hjernesvulst, bruker viral RCAS / tv-et system for å drive PDGF-B overekspresjon og Ink4a-ARF tap i nestin-positive celler i bakre skallegrop av neonatal mus 5, 16. En annen metode involverer recapitulating flere store DIPG-assosierte mutasjoner (histon H3.3 K27M mutasjon, p53 tap og PDGFRA aktivering) i neurale forløperceller avledet fra humane embryonale stamceller, noe som er tilstrekkelig til å gjøre disse cellene tumorigene 6, 7, 17. Kombinasjonen av genetiske metoder og pasient derived modellene vil gjøre det mulig preklinisk testing og videre utvikling av effektive behandlinger.
For å møte utfordringene til DIPG forskning beskrevet ovenfor, ble denne raske obduksjon protokoll utviklet for å generere pasient avledet cellekulturer for undersøkelse 8, 9, 10, 11, 12, 14. Protokollen er ment å beskytte levedyktigheten av vevet og maksimere sannsynligheten for å generere varige kulturer til tross for utfordringene knyttet til utvidede obduksjons intervaller og transporttid. Når ble generert, kan disse DIPG kulturene bli brukt i etterfølgende in vitro-manipuleringer og in vivo eksperimenter xenograft, slik at for evaluering av potensielle terapeutiske molekyler på pasient-avledede celler.
Protocol
Denne protokollen er utført med godkjenning fra vårt Institutional Review Board med passende de-identifikasjon av alle pasientdata og i henhold til alle institusjonelle, nasjonale og internasjonale retningslinjer for menneskelig velferd. Få alle aktuelle Institutional Review Board godkjenning og informert samtykke fra pasientens familie før arbeider med denne protokollen.
1. Innhenting vevsprøver
MERK: En viktig del av denne protokollen krever riktig håndtering av vev donasjon starter umiddelbart ved obduksjon. Den samlede prøve levedyktighet avhenger i betydelig grad på å minimalisere den post-mortem-intervall (PMI), øyeblikkelig overføring av vev inn i det riktige kalde medium supplert med antibiotika / antimykotika, holde prøven på våt is i hele transport, og å opprettholde sterile teknikk hele protokollen.
- Ved varselav en overhengende donasjon, utarbeide en prøvetaking kit. Ved hjelp av en eske med en isolert beholder som kan brukes direkte for retur transport av vevsprøve, omfatte følgende materialer:
- Inkluder materialer for steril forberedelse, herunder sterile hansker, gardiner, og skalpeller.
- Inkluder 8 - 10 sterile 50 ml koniske rør som inneholder 30 ml forsendelses media i isolert beholder med is eller kalde omslag.
MERK: Mens noen standard cellekultur medier kan fungere, er den beste prøven levedyktighet oppnådd med Hibernate-A supplert med antibiotika / antimycotic. - Inkluder ytterligere prøverør for andre analyser (f.eks Fiksativer).
- Hvis obduksjonen ikke vil bli utført av utprøver nettstedet inkluderer et dokument som tydelig angir hvordan å samle svulsten prøven. Dette inkluderer informasjon som for eksempel å opprettholde sterilitet, holde prøverør på våt is, og med prøver fra midthjernen og medulla som tumor celler ofte invadere disse regionene.
- Opprettholde sterilitet under obduksjonen. Tenk hjernen sterilt inne i kraniet, så observere steril teknikk (inkludert skiftende hansker) når kraniet er åpen. Unngå forurensning med hud og hår er kritisk.
- Dissekere svulsten fra ventral side ( "magen" av pons, se Supplemental Figur 1). Med en steril skalpell, skjære små 1 cm biter fra svulsten og umiddelbart overføre til kald frakt media (se merknad i trinn 1.1.2) og sette på våt is. Plassere 10 ml av vev inn i hvert rør, noe som resulterer i et endelig volum på vev og materiale i hvert rør på 40 ml.
MERK: I tilfelle av DIPG, svulsten diffust infiltrerer pons og ofte resten av hjernestammen. Som sådan, samle så mye av prøven som mulig, typisk inkludert 3 - 4 rørene (30 - 40 ml vev) fra pons og 1 - 2 rør (10 - 20 ml vev) hver fra midthjernen og medulla. - samle samsipper fra midthjernen og medulla stilt til pons, som ofte inneholder mange kreftceller.
- Etter prøvetaking, sende prøvene O / N på våt is i isolert beholder. Ikke sende prøven på tørris, som frysing dreper cellene.
2. Forberedelse til prøvebehandling
- Før du begynner prøveopparbeidelse, sterilisere vev kultur hoods sammen med barberblad, buede hemostats og alle andre ikke-sterile verktøy under UV-lys i 1 time. Utføre alle de følgende trinnene under sterile forhold for å hindre forurensning av kulturer.
- Forbered og sterile filterløsninger.
- For å fremstille 1,8 M sukrose-løsning, oppløse 308,07 g sukrose i 300 ml destillert vann. Tilsett 50 ml 10x Hank's-bufret saltoppløsning (HBSS) uten kalsium eller magnesium og bringe totalvolumet til 500 ml ved hjelp av destillert vann. Oppbevar ved 4 ° C.
- For å forberede enzymatisk fordøyelse løsning, ta 50 ml HBSS med kalsium og magnesium for hver 10 ml av hakket vev og tilsett 500 ul 5 mg / ml deoksyribonuklease I (endelig konsentrasjon 50 pg / ml), 500 ul 2,5 mg / ml collagenase I / II og dispase oppløsning (sluttkonsentrasjon 25 ug / ml), og 500 ul 1 M HEPES-buffer. Prewarm fordøyelse oppløsning i et 37 ° C vannbad.
- For å fremstille tumor stem media (TSM) base, bland 250 ml Neurobasal-A, 250 ml Dulbeccos modifiserte Eagle-medium: Nutrient Blanding F12 (DMEM / F12), 5 ml 100x antibiotika-antimykotisk, 5 ml 200 mM L-alanyl-L- glutamin dipeptid (Glutamax-A), 5 ml HEPES-buffer, 5 ml 100 mM natriumpyruvat, og 5 ml 100 x MEM ikke-essensielle aminosyrer.
- For å forberede komplett TSM med vekstfaktorer, legger følgende tillegg til TSM basen: 50x B27 Supplement Minus Vitamin A (01:50), human epidermal vekstfaktor (H-EGF, 20 ng / ml), human fibroblast vekstfaktor (H- FGF, 20 ng / ml), human blodplateavledet vekstfaktor AA (H-PDGF-AA, 10 ng / ml)human blodplateavledet vekstfaktor BB (H-PDGF-BB, 10 ng / ml) og heparin-oppløsning (2 ug / ml).
- Forhåndskjøling av en laboratorie-sentrifuge utstyrt med en svingende spannrotor-til 4 ° C.
3. Mekanisk Dissosiasjon
- Overfør vevet inn i en høy vegger 100 mm x 20 mm cellekultur parabolen. Fjern media leftover fra skipsfart og erstatte med 10 - 15 ml kald kulturmedier.
- Ved hjelp av de buede hemostats å forstå et barberblad, hakke vevet fint mens du fjerner åpen blodkar eller hjernehinnene.
MERK: De endelige vev fragmenter bør være mindre enn 1 mm (se figur 1B). - Overfør vevet inn i en ren 50 ml konisk rør. Vask cellekulturskål med ytterligere 5 ml kaldt kulturmedium og overføres til den koniske tube. Gjenta dette vasketrinn som er nødvendig for å overføre gjenværende vev.
- Ved hjelp av en 10 ml serologisk pipette, triturer forsiktig (4 - 5 ganger). Tillate større tissUE fragmenter fikk sette seg på bunnen av røret. Hvis det er nødvendig, kort sentrifuger prøven i 1 min (350 xg, 4 ° C).
- Samle mekanisk dissosiert fraksjonen.
- Fjern supernatanten og filtrere det gjennom et 100 um filter inn i en ny 50 ml konisk rør som er merket "mekanisk dissosiasjon." Snu filteret over den opprinnelige konisk rør og vask med kulturmedier til å gjenopprette vev fragmenter.
- Sentrifuger "Mekanisk dissosiasjon" fraksjonen i 5 minutter (350 xg, 4 ° C).
- Fjern supernatanten fra pelletert "Mekanisk dissosiasjon" fraksjon og resuspender vev i kaldt kulturmedium. Hvis det er mer enn 5 ml av vev i "Mechanical dissosiasjon" konisk rør, delt vevet inn i andre 50 ml koniske rør, slik at ikke røret har mer enn 5 ml vev.
- Oppbevar mekanisk dissosiert fraksjon på is inntil sukrosegradient sentrifugeringstrinnet (Stes 5). Alternativt kan den mekanisk dissosiert fraksjonen fortsette til trinn 5 i løpet av den enzymatiske dissosiasjon inkubasjonsperioden (trinn 4.4).
4. Enzymatisk Dissosiasjon
- Hvis det er mer enn 5 ml av vev i rør inneholdende de gjenværende større vevfragmenter, delt vevet inn i andre nye 50 ml koniske rør, slik at ikke røret har mer enn 5 ml vev.
- Sentrifuger konisk rør (e) inneholdende de resterende vevfragmenter i 5 minutter (350 xg, 4 ° C).
- Fjern supernatanten og tilsett forvarmet enzymatisk fordøyelse løsning, slik at det er 5 ml fordøyelse løsning for hver 1 ml vev (for eksempel, 25 ml fordøyelse oppløsningen i 5 ml vev).
- Forsegle de koniske tubelokk med laboratoriefilm og inkuberes reaksjonen på en rotator ved 37 ° C i 30 minutter.
- Etter inkuberingen triturer prøvene forsiktig (se figur 1C).
- Ved hjelp av en 10 ml serologisk pipettepipette prøven opp og ned 6 - 8 ganger. Unngå genererer for store luftbobler.
- Legg til en 1000 mL pipettespiss til enden av pipetten og triturer ytterligere 6 - 8 ganger.
- Tillate eventuelle gjenværende biter for å sette seg på bunnen av røret. Ta ut og filtrere supernatanten med cellene fortsatt suspendert gjennom et 100 um filter inn i en ny 50 ml konisk rør som er merket "Enzymatic dissosiasjon" og lagres på is.
- Hvis betydelige vev fragmenter forbli, legge til en ekstra 10 ml HBSS med kalsium og magnesium til fragmentene og gjenta trinn 3.5.1 og 3.5.2. Filtrer denne siste løsningen gjennom et 100 um filter til "Enzymatic dissosiasjon" rør.
- Sentrifuger "Enzymatic dissosiasjon" rør i 5 minutter (350 xg, 4 ° C) og fortsetter å sukrosegradient sentrifugering.
5. Sukrose gradientsentrifugering
- Hvis prøvene er fortsatt suspendert i løsning, centrifuge i 5 minutter (350 xg, 4 ° C).
- Fjern supernatanten og resuspender vev i 20 ml kald HBSS uten kalsium og magnesium. Ta med volum opp til 25 ml totalt med kaldt HBSS.
- Sakte legger 25 ml 1,8 M sukrose løsning og Snu røret for å blande. Dette resulterer i en 0,9 M sukrose gradient.
- Sentrifuger uten brems i 10 minutter (800 xg, 4 ° C). Ved hjelp av en sentrifugeringsbremsen vil forstyrre gradienten og redusere utbyttet (se figur 1D for et eksempel på en prøve før og etter sentrifugering).
- aspirere nøye myelin rusk og så mye sukroseløsning som mulig. Vask prøven ved tilsetning av 30 ml kald HBSS uten kalsium og magnesium, og bland forsiktig. Sentrifuger i 5 min (350 xg, 4 ° C).
6. ACK Red Blood Cell Lysis
- Fjern vaske supernatant. Tilsett 5 ml ACK lyseringsbuffer og forsiktig cellepelleten suspenderes, virvlende røret i 1 min ved RT.
- Slukke lysis ved tilsetning av 30 ml kald HBSS uten kalsium og magnesium.
- Sentrifuger i 5 min (350 xg, 4 ° C).
7. Initial Kultur Vedlikehold
- Resuspender de endelige cellepelletene i 10 - 15 ml varm komplett TSM med vekstfaktorer og kvantifisere levedyktig celledensitet på et hemocytometer ved hjelp av trypanblått-eksklusjon.
MERK: Utvalget av levedyktige celler varierer mye avhengig av omstendighetene rundt vev donasjon, og kvantifisering kan være vanskelig på dette tidlige stadiet grunn leftcellerester. I en ideell sak, tar sikte på å ha en million levende celler per prøve. I tilfeller hvor overdreven rusk forblir, plate til en lavere tetthet i en T175 kolbe. - Overfør den endelige cellesuspensjoner i en ny T75 kulturflaske. Topp i ytterligere vekstfaktorer annenhver dag for å opprettholde generelle vekstfaktornivåer, og overvåke utvikling av tumorcelle neurosfærer (se figur 1E og figur 2).
- Alternativt prosess enzymatisk dissosierte celler for videre analyse, inkludert flowcytometri og fluorescens-aktivert cellesortering.
- Etter utviklingen av neurosfærer (som i gjennomsnitt tar 3 - 4 uker, men varierer fra noen få dager til så lenge som 2 måneder), omvendt filter prøven ved anvendelse av en 100 pm nylon mesh filter for å redusere mengden av avfall.
MERK: Filtratet bør opprettholdes i kultur i tilfelle levedyktige enkle celler eller små kuler er til stede. - Sikre integriteten og renhet av kulturen ved å utføre DNA fingerprinting mens aging, sammenligne med den første pasientprøve.
Representative Results
Protokollen er beskrevet er oppsummert som en fem-trinns arbeidsflyt med bilder av vev ved forskjellige trinn av behandlingen i figur 1. Prøven første oppnås ved hurtig sterilt obduksjon. Under mekanisk dissosiasjon, blir vevet kvernet under fjerning av blodårer og hjernehinnene fra prøven, og filtrert gjennom en 100 pm nylon mesh filter. Gjenværende vev fragmenter enzymatisk dissosiert i en oppvarming ovn. Deretter blir avfall reduseres gjennom sukrosegradient sentrifugering, isolere et distinkt lag av myelin fra prøven. I tillegg ACK lyse synlig reduserer mengden av røde blodlegemer som er tilstede i prøven. Til slutt blir cellene sådd ut i serumfritt medium supplert med vekstfaktorer.
Supplemental Figur 1 er et eksempel på tumoren ved obduksjon. Svulsten vokser som en diffus infiltrering av en ponsd tilstøtende regioner i hjernestammen. Under prøvepreparater, bør små ~ 1 cm x 1 cm biter kuttes og umiddelbart plassert i kald frakt medier på is.
Figur 2 viser forskjellige eksempler på hvordan prøvene kan vises fra de tidlige stadiene av dyrking til en holdbar kultur. Utgangspunktet belagt og tidlige kulturer (A, B) ofte ikke ut til å inneholde mange overlevende celler. Videre tidlige cellegrupper (C, D) ofte ikke vise graden av kontrast vanligvis forbundet med neurosfærer. Spesielt, kan varigheten av tid i kultur før fremkomsten av cellegruppene ta uker til et par måneder. Imidlertid kan den første passeringen av disse cellegrupper, kombinert med omvendt filtrering av cellegrupper, isolere friske tumorceller som er i stand til å danne kuler (F). Filtratet (E) inneholder typisk restene rester; Vi anbefaler imidlertid plating og vedlikehold av filtratet og overvåking for utvikling av cellegrupper. Disse pasientavledet prøver kan deretter bli opprettholdt i kultur i flere passasjer (G, H).
Figur 3 viser evnen av disse cellene å være xenopodet i mus. I hvert av disse tilfellene ble DIPG-celler transfektert med et GFP-luciferase reporter for å overvåke utviklingen av svulster ved bioluminescens (A). Tumorene kan også bli undersøkt histologisk, for eksempel for å observere tumor innpoding (B) eller ekspresjon av spesifikke markører (C). Disse in vivo-modeller kombinert med in vitro-analyser kan anvendes for å vurdere virkningene av forskjellige medikamenter eller gen-manipulering (f.eks, 8, 9, 10, 11, 14).
les / ftp_upload / 55360 / 55360fig1.jpg "/>
Figur 1. vevsprøver på ulike stadier av behandling. (A) Skaff prøven gjennom sterile obduksjons prosedyrer og overnatting frakt på våt is. (B) Fra venstre til høyre: (rad 1) rør som inneholder svulstvev i shipping media; friskt vev i en 100 mm x 20 mm cellekulturskål; innledende hakking av vev; (Rad 2) delvis hakket vev; fjernelse av hjernehinnene og blodårer; endelige størrelsen hakket vev stykker. (C) Fra venstre til høyre: (rad 1) vev inkubert på et roterende bord i en 37 ° C ovn; (Rad 2) triturering av vev gjennom en 1000 ul pipettespiss festet til en 10 ml pipette; filtrering av dissosiert vev gjennom en 100 pm nylon mesh filter. (D) Fra venstre til høyre: dissosiert vev suspenderes i 0,9 M sukrose-løsning før sentrifugering; dissosiert vev skilt over en sukrose gradient etter sentrifugering; et synlig lag of myelin rusk på toppen av sukrose gradient; en endelig celle pellet etter ACK lyse og vask. (E) Den endelige prøven kan plasseres i kultur eller benyttes i andre nedstrøms analyser. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Bilder av primærkulturer og tidlig Passage celler. (A - B) kulturer belagt umiddelbart etter dissosiasjon (SU-DIPG-XXX, A), eller som ikke har vokst Neurosfærene ennå (SU-DIPG-XXIX, B). (C - D) Tidlig utseende neurosfærer i primærkulturer av SU-DIPG-XXVIII (C) og SU-DIPG-XXIX (D). (EF) Første passasje av den primære kultur fra D ved anvendelse av en 100 pm nylonfilter, med det filtrate (E) og omvendt filtratet (F) belagt. (G - H) Eldre neurosfærer fra den første passering av SU-DIPG-XXVII (G) og den tredje passasje av SU-DIPG-XXV (H) som vokser i kultur. Scale bar = 200 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Pasient-avledet cellekulturer kan innpode og Form Svulster i Mus. (A) bioluminescens bilder av fire forskjellige pasient-avledet cellekulturer transfektert med et GFP-luciferase reporter. (B) sagittal avsnitt fra en mus xenograft, viser tumorceller innpodet i musen pons. Grønn: GFP, Rød: myelinbasisprotein. Scale bar = 1 mm. (C) Eksempel immunofluorescence bilde som viser GFP tumorceller podet i en musehjerne. Blå: DAPI, Grønn: GFP, Rød: IGF2R. Scale bar = 40 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Supplemental Figur 1. Autopsy Eksempel på en Pontine Tumor. Umiddelbar post-mortem utseendet til en diffus indre Pontine glioma. Svulsten vises som en stor, myelin-rike masse på den ventrale overflaten av pons. Klikk her for å laste ned dette bildet.
Discussion
Denne protokollen beskriver en fremgangsmåte for hurtig behandling av post-mortem tumorvev donasjoner for å utvikle pasient-avledet cellekulturer, som kan brukes i en rekke in vitro eller in vivo-forsøk. På grunn av naturen av å jobbe med obduksjonsprøver, opprettholde prøven levedyktighet utgjør en betydelig utfordring. Flere grunner, blant annet post-mortem intervall for å obduksjon eller den tid som kreves for transportering av vev, bør minimaliseres så mye som mulig, men ofte er vanskelig å kontrollere. I vår erfaring, en post mortem intervall på mindre enn 6 - 8 timer (fra tidspunktet for dødsfallet til den tiden at vevet er plassert i iskald skipsfart og transport media) har gitt den beste muligheten for å etablere en varig cellekultur. Det er best å motta deretter vevet i laboratoriet i løpet av 24 timer, og behandler det for kulturen umiddelbart etter mottak.
Siden plasseringen av disse sjeldne tilfeller varierer mye, ogkvaliteten på vevet henting steg sterkt påvirker sjansen for å lykkes, kan logistikken av å utføre obduksjon være utfordrende. I mange tilfeller, for å oppnå den 6-8 timers rammen, er det ikke mulig å gjennomføre vev avling på et akademisk senter. I stedet har en vev utvinning tjenesten på vakt for å gjenopprette svulstvev i begravelsen hjemme under en IRB-godkjent protokoll er ofte mer hensiktsmessig for vev utvinning. Innhenting av informert samtykke i forkant av døden er anbefalt og letter logistikkplanlegging. Forbereder selvstendige obduksjons kits med klare og grundige instruksjoner og sterile forsyninger for vev gjenfinning (hansker, gardiner, skalp) anbefales sterkt. I tillegg etablere klare punkter for kommunikasjon blant de etterforsker, patolog, og begravelsesbyrået er kritisk. For eksempel bør etterforsker diskutere protokollen med patologen før obduksjonen og markere vanlige feil. Disse feilene inkluderer mikroBIAL forurensning (vanligvis gjær) i løpet av vev henting, unnlatelse av å sende gjennom natten / rask levering og unnlatelse av å sende prøven på tilstrekkelig våt is i en thermoinsulated container. Til slutt anbefaler vi å bruke en dør-til-dør budtjeneste for forsendelse av prøven for å redusere transporttiden.
Forsiktighet bør også tas i løpet av vev dissosiasjon å bevare celle levedyktighet. For eksempel, bruk av media designet bevare nervevev helse for transport (Hibernate-A supplert med antibiotika / antimycotic) vil øke sjansen for å generere en vellykket kultur. Det er også viktig å holde prøven ved en kald temperatur i hele protokollen ved alltid å overføre prøvene på is. Innsamling av både mekaniske og enzymatiske dissosiasjon fraksjoner sammen med minimere triturering kan forbedre protokoll suksess, som begge trinnene traumatisk til celler. I vår erfaring, mens de fleste vellykkede kulturer vokse ut av begge fraksjonerVi har hatt tilfeller hvor bare en av de to preparatene er etablert en holdbar kultur, eventuelt gjenspeiler den skjøre natur av disse prøvene. En annen traumatisk skritt i protokollen er finmaling; en strategi som kan redusere graden av finmaling nødvendig er at prøvene er grundig hakket helt i begynnelsen av preparatet. Andre eksempler på aspekter ved protokoll utviklet for å forbedre prøven levedyktighet inkluderer legge buffere (f.eks HEPES) i hele protokollen, noe som er spesielt viktig ved enzymatisk dissosiasjon.
En mulig modifikasjon av denne protokollen for ytterligere å øke cellelevedyktigheten er fjerning av ACK røde blodcellelysetrinn. Men i dette tilfellet, er det ofte er da nødvendig å utføre en ACK-lyseringstrinn i løpet av den første uke i kultur for å fjerne røde blodceller. Et annet aspekt av denne protokoll som kan modifiseres er elimineringen av myelin og cellerester ved hjelp av en sukrose Polyetyleny gradient. Nærmere bestemt, andre strategier som har blitt rapportert å forbedre celle-levedyktighet mikrogliale celler er også mulig ved dette trinn, slik som en diskontinuerlig Percoll tetthetsgradient 18 eller magnetiske myelin fjerning kuler.
Til slutt, varighet mellom innledende vev dissosiasjon og utseendet neurosfærer varierer mellom prøvene og kan ta alt fra en uke til en måned eller mer. Ettersom de innledende kulturene inneholder typisk en betydelig grad av døde celler og cellerester, det kan være vanskelig å fastslå om levedyktige celler forblir; kulturen bør opprettholdes i minst 4 - 8 uker (figur 2). En strategi for å isolere voksende celler fra de gjenværende rusk er presentert her (dvs. omvendt filtrering cellegrupper og re-plating i frisk media). Avgjørelsen om man skal fortsette å opprettholde en kultur er i siste instans en sak-til-sak avgjørelse basert på forhold rundt the obduksjon (f.eks en lengre post mortem intervall, problemer under vev transport), vevet dissosiasjon (for eksempel overdreven blod eller rusk), og hvordan prøven vises i kultur. Når en kultur er etablert, bør identiteten valideres ved DNA fingerprinting hjelp av korte tandem gjentagelse analyse eller en lignende metode, å sammenligne kulturen til en prøve av den opprinnelige tumor beholdt for dette formål. Vi anbefaler rutinemessig validering kulturer ved DNA fingerprinting for å sikre at ingen forurensning av andre kulturer har oppstått, for eksempel hver 3. - 6 måneder.
Den generasjonen av disse pasient avledet DIPG kulturer representerer et viktig skritt i den vellykkede utviklingen av effektive behandlinger. Utvidelsen av de tilgjengelige pasient avledet DIPG kulturer og xenograft modeller vil være avgjørende for å identifisere de mest effektive terapeutiske strategier og til slutt overvinne denne ødeleggende sykdommen.
Disclosures
Forfatterne har ikke noe å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å takke for støtten fra McKenna Claire Foundation, Nasjonalt institutt for nevrologiske lidelser og hjerneslag (ninds K08NS070926 og R01NS092597), Department of Defense (NF140075), California Institute for Regenerative Medicine (CIRM RB4-06093 og RN3-06510), Alex Lemonade Stand Foundation, The Cure Starter nå Foundation og DIPG Collaborative, Lyla Nsouli Foundation, Unravel Pediatric Cancer, oppvekst hjernesvulst Foundation, Matthew Larson Foundation, V Foundation, Godfrey Family Fund i Memory of Fiona Penelope, den Wayland Villars DIPG Foundation, Dylan Jewett Connor Johnson, Zoey Ganesh, Dylan Frick, Abigail Jensen, og Jennifer Kranz Memorial Funds, N8 Foundation, Virginia og DK Ludwig fond for kreftforskning, Child Health Research Institute ved Stanford Anne T. og Robert M. Bass Velsignet fakultet stipend i Pediatric kreft og blodsykdommer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hibernate-A | Gibco | A12475-01 | |
| HBSS with Calcium/Magnesium | Gibco | 24020-117 | |
| HBSS | Corning | 21-022-CV | |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| Liberase DH (Collagenase/Dispase) | Roche | 5401054001 | |
| DNAse I | Worthington Biochemical | LS002007 | |
| Sucrose | Sigma | S0389 | |
| Antibiotic/Antimycotic | Gibco | 15240-096 | |
| Neurobasal-A | Gibco | 10888-022 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11330-032 | |
| GlutaMAX-I (100x) | Gibco | 35050-061 | |
| Sodium Pyruvate (100 mM) | Gibco | 11360-070 | |
| B27 Supplement Minus Vitamin A | Gibco | 12587-010 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids (100x) | Gibco | 11140-050 | |
| Human PDGF-AA | Shenandoah Biotechnology | 100-16 | |
| Human PDGF-BB | Shenandoah Biotechnology | 100-18 | |
| Human EGF | Shenandoah Biotechnology | 100-26 | |
| Human FGF | Shenandoah Biotechnology | 100-146 | |
| Sterile scalpel blades | Bard Paker | 372610 | |
| Curved hemostats | Fine Science Tools | 13013-14 | |
| Razor blades | VWR | 55411-050 | |
| 100 x 20 mm cell culture dish | Corning | 353003 | |
| Sterile forceps | TWD Tradewinds | DF8988-5 | |
| Sterile drapes | 3M | 2037 | |
| Sterile gloves | Kimberly Clark | 1182307 | |
| ACK Lysis Buffer | Gibco | A1049201 | |
| 100 micron mesh filter | Fisher | 352360 | |
| 50 mL conical tube | Fisher | 1495949A |
References
- Fisher, P. G., et al. A clinicopathologic reappraisal of brain stem tumor classification. Identification of pilocystic astrocytoma and fibrillary astrocytoma as distinct entities. Cancer. 89 (7), 1569-1576 (2000).
- Johung, T. B., Monje, M. Diffuse Intrinsic Pontine Glioma: New Pathophysiological Insights and Emerging Therapeutic. Curr. Neuropharmacol. , (2016).
- Cage, T. A., et al. Feasibility, safety, and indications for surgical biopsy of intrinsic brainstem tumors in children. Child Nerv. Syst. 29 (8), 1313-1319 (2013).
- Puget, S., et al. Biopsy in a series of 130 pediatric diffuse intrinsic Pontine gliomas. Child Nerv. Syst. 31 (10), 1773-1780 (2015).
- Kieran, M. W. Time to rethink the unthinkable: Upfront biopsy of children with newly diagnosed diffuse intrinsic pontine glioma (DIPG). Pediatr. Blood Cancer. 62 (1), 3-4 (2014).
- Sturm, D., et al. Paediatric and adult glioblastoma: multiform (epi)genomic culprits emerge. Nat. Rev. Cancer. 14 (2), 92-107 (2014).
- Jones, C., Baker, S. J. Unique genetic and epigenetic mechanisms driving paediatric diffuse high-grade glioma. Nat. Rev. Cancer. , (2014).
- Taylor, K. R., et al. Recurrent activating ACVR1 mutations in diffuse intrinsic pontine glioma. Nat. Genet. 46 (5), 457-461 (2014).
- Wu, G., et al. The genomic landscape of diffuse intrinsic pontine glioma and pediatric non-brainstem high-grade glioma. Nat. Genet. 46 (5), 444-450 (2014).
- Fontebasso, A. M., et al. Recurrent somatic mutations in ACVR1 in pediatric midline high-grade astrocytoma. Nat. Genet. 46 (5), 462-466 (2014).
- Buczkowicz, P., et al. Genomic analysis of diffuse intrinsic pontine gliomas identifies three molecular subgroups and recurrent activating. Nat. Genet. 46 (5), 451-456 (2014).
- Monje, M., et al. Hedgehog-responsive candidate cell of origin for diffuse intrinsic pontine glioma. Proc. Natl. Acad. Sci. 108 (11), 4453-4458 (2011).
- Aoki, Y., et al. An experimental xenograft mouse model of diffuse pontine glioma designed for therapeutic testing. J. Neuro-Oncol. 108 (1), 29-35 (2012).
- Grasso, C. S., et al. Functionally defined therapeutic targets in diffuse intrinsic pontine glioma. Nat. Med. , 1-10 (2015).
- Shu, Q., et al. Direct Orthotopic Transplantation of Fresh Surgical Specimen Preserves CD133 +Tumor Cells in Clinically Relevant Mouse Models of Medulloblastoma and Glioma. Stem Cells. 26 (6), 1414-1424 (2008).
- Becher, O. J., et al. Preclinical evaluation of radiation and perifosine in a genetically and histologically accurate model of brainstem glioma. Cancer Res. 70 (6), 2548-2557 (2010).
- Funato, K., Major, T., Lewis, P. W., Allis, C. D., Tabar, V. Use of human embryonic stem cells to model pediatric gliomas with H3.3K27M histone mutation. Science. 346 (6216), 1529-1533 (2014).
- Olah, M., et al. An optimized protocol for the acute isolation of human microglia from autopsy brain samples. Glia. 60 (1), 96-111 (2012).
