Summary
Detta protokoll beskriver en metod för snabb behandling av post mortem-diffusa inneboende Pontine gliom prover för att upprätta patientgenererade cellodlingsmodeller eller direkt karakterisering av tumör och microenvironmental celler.
Abstract
Diffus Intrinsic Pontine Gliom (DIPG) är en barndom hjärnstammen tumör som bär en allmänt dödlig prognos. Eftersom kirurgisk resektion är inte en hållbar behandlingsstrategi och biopsi inte rutinmässigt, är begränsad tillgång till patientprover för forskning. Följaktligen har ansträngningar för att studera sjukdomen ifrågasatts av en brist på trogna sjukdomsmodeller. För att lösa detta behov, beskriver vi här ett protokoll för snabb behandling av post mortem-obduktion vävnadsprover för att generera hållbara patientgenererade cellodlingsmodeller som kan användas i in vitro eller in vivo orthotopic xenograft experiment. Dessa modeller kan användas för att screena för potentiella läkemedelsmål och studera grundläggande pathobiological processer inom DIPG. Detta protokoll kan vidare utvidgas till att analysera och isolera tumör och microenvironmental celler med användning av fluorescensaktiverad cellsortering (FACS), vilket möjliggör efterföljande analys av gen expres, proteinuttryck, eller epigenetiska modifieringar av DNA vid bulk cell eller enkelcellnivå. Slutligen kan detta protokoll också anpassas för att generera patientgenererade kulturer för andra centrala nervsystemet tumörer.
Introduction
DIPG är en aggressiv centrala nervsystemet malignitet som uppstår i de ventrala pons, typiskt under mitten av barndom 1, 2. Trots årtionden av kliniska prövningar, är nuvarande behandling begränsad till strålbehandling, vilket ger tillfällig förbättring eller stabilisering av symptom och endast sträcker sig medianöverlevnad med i genomsnitt 3 månader. Även med strålbehandling, är medianöverlevnaden endast nio månader med 90% av barn som dör av sjukdomen inom 2 år för diagnos. På grund av den infiltrativt naturen av tumören och de kritiska funktioner i hjärnstammen, är inte möjlig kirurgisk resektion. Dessutom i USA, få kirurgiska biopsier för DIPG har historiskt inte utförts 3, som histopatologisk analys har ingen nuvarande roll i att vägleda klinisk behandling och diagnos kan typiskt göras genom neuroradiologiska ensam. Således, tillgängligheten av tumörvävnad feller studier är begränsad, vilket begränsar ansträngningarna för att bedriva forskning om kandidatläkemedelsmolekyler och den underliggande tumörbiologin. Särskilt har förbättringar i neuroradiologiska och stereotaktiska tekniker möjliggjorde utvecklingen av säkra biopsier av DIPG under de senaste åren 4, som i kombination med framsteg inom molekylärbiologi, har förändrat vår förståelse av sjukdomen. För närvarande flera kliniska prövningar med förskott biopsi och molekylär profilering av DIPG för individualisering behandlingsplaner pågår (NCT01182350, NCT02274987) 5.
DIPG och andra pediatriska höggradig gliom representerar olika sjukdomar från sina vuxna glioblastom motsvarigheter 6, 7, och därmed trogna experimentella modeller av DIPG är nödvändiga för att förstå dess unika patofysiologi och upptäcka effektiva terapeutiska strategier. Under de senaste åren fokuserat insatser för att få DIPG tumör tfråga för forskning vid tidpunkten för obduktion eller, mer sällan, biopsi har revolutionerat vår förståelse för och förmåga att studera DIPG. Genomvid sekvense ansträngningar visade en återkommande mutation i H3 histon, familj 3A (H3F3A) och histon kluster 1, H3b (HIST1H3B), som representerar det första exemplet på mänskliga sjukdomar orsakas av mutationer i histon kodande proteiner 8, 9, 10, 11 . Vidare är en delmängd av DIPGs uttrycker mutationer i ACVR1 genen, som inte tidigare har rapporterats i cancer, men är identiska med mutationer som finns i den kongenitala barndom störning i utvecklingen fibrodysplasia ossificans progressiva 8, 9, 10, 11. Liksom de första patientgenererade DIPG cellkulturer och orthotopic xenograft models har nu fastställts 1, 2, 12, 13, 14, såväl som musmodeller etablerade genom direkt xenotransplantation av tumörceller i möss med immunbrist för att generera seriella xenotransplantat 3, 14, 15. Initiala drogscreening insatser med hjälp av dessa patientgenererade modeller har identifierat lovande nya medel för klinisk översättning 4, 14 och har lagt grunden för åtminstone en klinisk studie (NCT02717455).
Dessa första steg mot utvecklingen är bara början, och många patientgenererade vävnadsprover och odlingsmodeller kommer att bli nödvändigt att definiera subtyper av sjukdomen och utveckla de mest effektiva behandlingsstrategier. genetiskt motornställda musmodeller av DIPG kommer också att underlätta studier som syftar till att främja vår grundläggande förståelse av sjukdomen. Ansträngningarna för att skapa genetiska modeller för DIPG kommer att med hjälp av de grundläggande iska studier som diskuterats ovan, men för närvarande ett begränsat antal alternativ är tillgängliga. En sådan modell, som genererar histologiskt liknande hög kvalitet hjärnstams gliom använder viral RCAS / tv-system för att driva PDGF-B uttryck och Ink4a-ARF förlust i nestin-positiva celler i den bakre fossa av neonatala möss 5, 16. Ett annat tillvägagångssätt involverar rekapitulera flera stora DIPG associerade mutationer (histon H3.3 K27M mutation, p53 förlust och PDGFRA aktivering) i neurala prekursorceller härledda från mänskliga embryonala stamceller, vilket är tillräckligt för att göra dessa celler tumörogena 6, 7, 17. Kombinationen av genetiska metoder och patient derived modeller gör det möjligt för preklinisk testning och främja utvecklingen av effektiva behandlingsmetoder.
Att ta itu med de utmaningar DIPG forskning beskrivs ovan, var detta snabb obduktion protokoll utvecklats för att generera patientgenererade cellkulturer för utredning 8, 9, 10, 11, 12, 14. Protokollet syftar till att skydda livskraft vävnaden och maximera sannolikheten för att generera hållbara kulturer trots utmaningarna i samband med utökade post mortem mellanrum och transporttid. När genererade framgångsrikt kan dessa DIPG kulturer användas i efterföljande in vitro manipulationer och in vivo xenograft-experiment, vilket möjliggör utvärdering av potentiella terapeutiska molekyler på patientgenererade celler.
Protocol
Detta protokoll har utförts med godkännande från vår Institutional Review Board med lämplig avidentifiering av alla patientuppgifter och i enlighet med alla institutionella, nationella och internationella riktlinjer för människors välfärd. Skaffa alla lämpliga Institutional Review Board godkännande och informerat samtycke från patientens familj före att arbeta med detta protokoll.
1. Skaffa vävnadsprover
OBS: En kritisk komponent i detta protokoll kräver korrekt hantering av vävnadsdonation startar omedelbart vid tidpunkten för obduktion. Den totala prov lönsamhet beror i hög grad på att minimera obduktion intervall (PMI), omedelbart överföra vävnaden i rätt kallt medium kompletterat med antibiotika / antimykotika, hålla provet på våt is under hela transporten, och upprätthålla steril teknik i hela protokollet.
- vid anmälanett överhängande donation, framställning av ett prov provtagningssats. Med hjälp av en transportlåda med en isolerad behållare som kan användas direkt för returtransport av vävnadsprovet, inkludera följande ämnen:
- Inkludera material för steril beredning, inklusive sterila handskar, draperier och skalpeller.
- Inkludera 8 - 10 sterila 50 ml koniska rör som innehåller 30 ml frakt media i den isolerade behållaren med is eller kallt förpackningar.
OBS: Även om någon standard cellodlingsmedier kan arbeta, är det bästa provet livskraft som erhållits med Hibernate-A kompletterat med antibiotika / antimykotika. - Inkludera ytterligare provrör för andra analyser (t.ex. fixativ).
- Om obduktionen inte kommer att utföras vid utredarens sajten inkluderar ett dokument som tydligt anger hur man samlar tumörprovet. Detta inkluderar information såsom bibehållande sterilitet, hålla provrör på våt is, och däribland prover från mellanhjärnan och förlängda märgen som tumor celler invaderar ofta dessa regioner.
- Upprätthålla sterilitet under obduktionen. Tänk på hjärnan sterila inuti kraniet, så observera steril teknik (inklusive förändrade handskar) när kraniet är öppen. Undvika kontaminering med hud och hår är kritisk.
- Dissekera tumören från den ventrala sidan (den "buk" av de pons, se Supple Figur 1). Med en steril skalpell, skär små 1 cm bitar från tumören och omedelbart överföra till kall frakt media (se OBS i steg 1.1.2) och sätta på våt is. Placera 10 ml av vävnad i varje rör, vilket resulterar i en slutlig volym av vävnad och media i varje rör 40 ml.
OBS: Vid DIPG, tumören infiltrerar diffust de pons och ofta resten av hjärnstammen. Som sådan, samla in så mycket av provet som möjligt, typiskt inklusive 3 - 4 rör (30-40 ml vävnad) från pons och 1 - 2 rör (10-20 ml vävnad) vardera från mellanhjärnan och förlängda märgen. - samla samperna från mitthjärnan och förlängda märgen juxtaposed till de pons, som ofta innehåller många tumörceller.
- Efter provtagning, skickar proverna O / N på våt is i den isolerade behållaren. Sänder inte provet på torris, som frysning kommer att döda cellerna.
2. Förberedelse för provbearbetning
- Innan du påbörjar provberedning, sterilisera vävnadsodlingskåpor tillsammans med rakblad, böjda peanger, och andra icke-sterila verktyg under UV-ljus under 1 timme. Utföra alla de följande stegen under sterila förhållanden för att förhindra kontaminering av kulturerna.
- Förbered och sterila filterlösningar.
- För att framställa 1,8 M sackaroslösning, lös 308,07 g sackaros i 300 ml destillerat vatten. Tillsätt 50 ml 10x Hank's-buffrad saltlösning (HBSS) utan kalcium eller magnesium och föra den totala volymen till 500 ml med hjälp av destillerat vatten. Lagra vid 4 ° C.
- För att förbereda enzymatisk spjälkning lösning, ta 50 ml HBSS med kalcium och magnesium för varje 10 ml av malet vävnad och tillsätt 500 | il 5 mg / ml deoxiribonukleas I (slutlig koncentration 50 | ig / ml), 500 | il 2,5 mg / ml kollagenas I / II och dispas-lösning (slutkoncentration 25 | ig / ml) och 500 mikroliter 1 M HEPES-buffert. Förvärm digestion lösning i en 37 ° C vattenbad.
- För att framställa tumörstammen media (TSM) bas, blanda 250 ml Neurobasal-A, 250 ml Dulbeccos Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F12 (DMEM / F12), 5 ml 100x antibiotika-antimykotika, 5 ml 200 mM L-alanyl-L- glutamin dipeptid (GlutaMAX-A), 5 ml HEPES-buffert, 5 ml 100 mM natriumpyruvat, och 5 ml 100x MEM icke-essentiella aminosyror.
- För att förbereda komplett TSM med tillväxtfaktorer, lägga till följande tillägg till TSM bas: 50x B27 Supplement Minus Vitamin A (01:50), human epidermal tillväxtfaktor (H-EGF, 20 ng / ml), human fibroblasttillväxtfaktor (H- FGF, 20 ng / ml), human trombocytrelaterad tillväxtfaktor AA (H-PDGF-AA, 10 ng / ml),human plätthärledd tillväxtfaktor BB (H-PDGF-BB, 10 ng / ml), och heparinlösning (2 | ig / ml).
- Förkyla en laboratoriecentrifug utrustad med en swinging-bucket rötor till 4 ° C.
3. Mekanisk Dissociation
- Överför vävnaden i en hög-väggar 100 mm x 20 mm cellodlingsskål. Ta bort materialet överblivet material från sjöfarten och ersätt med 10 - 15 ml kall odlingsmedier.
- Med hjälp av böjda peanger att förstå ett rakblad, finhacka vävnaden fint när du tar bort uppenbara fartyg eller hjärnhinnorna blod.
OBS: De slutliga vävnadsfragment bör vara mindre än 1 mm (se figur 1 B). - Överför vävnaden i en ren 50 ml koniska rör. Tvätta cellodlingsskål med ytterligare 5 ml kallt odlingsmedia och överföra till det koniska röret. Upprepa detta tvättsteg som krävs för att överföra återstående vävnad.
- Med hjälp av en 10 ml serologisk pipett, finfördela försiktigt (4 - 5 gånger). Tillåta större tissUE fragment sedimentera till botten av röret. Om nödvändigt, centrifugera kort provet under 1 min (350 xg, 4 ° C).
- Samla upp dissocierades mekaniskt fraktionen.
- Avlägsna supernatanten och filtrera den genom ett 100 pm filter in i en ny 50 ml koniska rör märkt "Mekanisk Dissociation." Vänd filtret över den ursprungliga koniska rör och tvätta med odlingsmedia för att återställa vävnadsfragment.
- Centrifugera "Mekanisk Dissociation" fraktion i 5 min (350 xg, 4 ° C).
- Avlägsna supernatanten från pellet "Mechanical Dissociation" fraktion och suspendera vävnaden i kallt odlingsmedier. Om det finns mer än 5 ml av vävnad i "Mekanisk Dissociation" koniskt rör, dela vävnaden in i andra 50 ml koniska rör så att ingen rör har mer än 5 ml vävnad.
- Lagra det mekaniskt dissocierad fraktionen på is tills sackarosgradient centrifugeringssteg (Stes 5). Alternativt kan den mekaniskt dissocierade fraktionen vidare till steg 5 under den enzymatiska dissociation inkubationstiden (steg 4,4).
4. Enzymatisk Dissociation
- Om det finns mer än 5 ml av vävnad i röret innehållande de återstående större vävnadsfragment, dela vävnaden i andra nya 50 ml koniska rör så att ingen rör har mer än 5 ml vävnad.
- Centrifugera det koniska röret (er) som innehåller de återstående vävnadsfragment i 5 min (350 xg, 4 ° C).
- Avlägsna supernatanten och tillsätt den förvärmda enzymatisk spjälkning lösning, så att det finns 5 ml digestion lösning för varje 1 mL vävnad (t.ex., 25 ml uppslutningslösning för 5 ml vävnad).
- Försegla det koniska röret lock med laboratoriefilm och inkubera reaktionen på en rotator vid 37 ° C under 30 min.
- Efter inkuberingen triturera proverna försiktigt (se figur 1C).
- Med hjälp av en 10 ml serologisk pipett,pipett provet upp och ner 6 - 8 gånger. Undvika att skapa alltför luftbubblor.
- Lägga till en 1000 mikroliter pipettspets till änden av pipetten och triturera ytterligare 6 - 8 gånger.
- Låt alla återstående bitar att sjunka till botten av röret. Ta bort och filtrera supernatanten med cellerna fortfarande suspenderade genom ett 100 pm filter in i en ny 50 ml koniska rör märkt "Enzymatisk Dissociation" och förvara på is.
- Om betydande vävnadsfragment kvar, lägga till ytterligare 10 ml HBSS med kalcium och magnesium till fragmenten och upprepa steg 3.5.1 och 3.5.2. Filter denna slutliga lösningen genom ett 100 pm filter i "Enzymatisk Dissociation" rör.
- Centrifugera "Enzymatisk Dissociation" rör under 5 min (350 xg, 4 ° C) och fortsätter att sackarosgradientcentrifugering.
5. sackarosgradientcentrifugering
- Om proverna fortfarande suspenderade i lösning, centrifugeGE för 5 min (350 xg, 4 ° C).
- Avlägsna supernatanten och återsuspendera vävnad i 20 ml kall HBSS utan kalcium och magnesium. Bringa volymen upp till 25 ml totalt med kall HBSS.
- Tillsätt långsamt 25 ml 1,8 M sackaroslösning och invertera röret för att blanda. Detta resulterar i en 0,9 M sackarosgradient.
- Centrifugera utan någon broms under 10 min (800 xg, 4 ° C). Med användning av en centrifugeringsbromsen kommer att störa gradienten och minska utbyte (se figur 1D för ett exempel på ett prov före och efter centrifugering).
- aspirera noggrant myelin skräp och så mycket sackaroslösning som möjligt. Tvätta provet genom att tillsätta 30 ml kall HBSS utan kalcium och magnesium och blanda försiktigt. Centrifugera i 5 min (350 xg, 4 ° C).
6. ACK röda blodkroppar Lysis
- Ta bort tvättvätskan. Tillsätt 5 ml ACK lyseringsbuffert och försiktigt resuspendera cellpelleten, virvlande röret i 1 min vid RT.
- Släck llys genom tillsats av 30 ml kall HBSS utan kalcium och magnesium.
- Centrifugera i 5 min (350 xg, 4 ° C).
7. Initial Culture Underhåll
- Resuspendera slutliga cellpelletarna i 10 - 15 ml varm komplett TSM med tillväxtfaktorer och kvantifiera livskraftiga celltäthet på en hemocytometer med användning av trypanblått uteslutning.
OBS: Utbudet av levande celler varierar mycket beroende på omständigheterna i det vävnadsdonation, och kvantifiering kan vara svårt i detta tidiga skede på grund av överblivna celldebris. I ett idealfall, siktar på att ha en miljon levande celler per prov. I de fall där överdriven skräp fortfarande, platta vid en lägre densitet i en T175 kolv. - Överför slutliga cellsuspensioner till en ny T75 odlingskolv. Spike i ytterligare tillväxtfaktorer varannan dag för att upprätthålla övergripande tillväxtfaktornivåer och övervaka utvecklingen av tumörcellsneuro (se figur 1E och Figur 2).
- Alternativt, process enzymatiskt dissocierade celler för vidare analys, inklusive flödescytometri och fluorescensaktiverad cellsortering.
- Efter utvecklingen av neurosfärer (som i genomsnitt tar 3 - 4 veckor, men varierar från några dagar till så länge som två månader), omvänd filtrering provet med användning av en 100 | im nylonnät filter för att minska mängden skräp.
OBS: Filtratet bör bibehållas i odling i fall livskraftiga enstaka celler eller små sfärer är närvarande. - Säkerställa integriteten och renheten av kulturen genom att utföra DNA-fingeravtryck medan passage, att jämföra med det ursprungliga patientprovet.
Representative Results
Protokollet som beskrivs sammanfattas som en fem-steg arbetsflöde med bilder av vävnad i olika stadier av bearbetning i figur 1. Provet först erhålls genom snabb steril obduktion. Under mekanisk dissociation vävnaden malet när du tar bort blodkärl och hjärnhinnorna från provet, och filtreras genom ett 100 pm nylonnät filter. Återstående vävnadsfragment enzymatiskt dissocierade i en värmande ugn. Därefter skräp minskas genom sackarosgradientcentrifugering, isolera en distinkt skikt av myelin från provet. Dessutom ACK lysis minskar synbart mängden röda blodkroppar som är närvarande i provet. Slutligen är cellerna på platta i serumfria media kompletterade med tillväxtfaktorer.
Supplementär Figur 1 är ett exempel av tumören vid obduktion. Tumören växer som en diffus infiltration av pons end de angränsande regionerna i hjärnstammen. Under förberedelserna prov, bör små ~ 1 cm x 1 cm bitar skäras och placerades omedelbart i kallt frakt media på is.
Figur 2 visar olika exempel på hur proverna kan framgå av de tidiga stadierna av odlingen till en varaktig kultur. Initialt pläterade och tidiga kulturer (A, B) ofta inte verkar innehålla många överlevande celler. Dessutom tidiga kluster cell (C, D) ofta inte uppvisa den grad av kontrast vanligtvis förknippas med neuro. Notably, kan varaktigheten för tiden i odling före uppkomsten av cellkluster ta veckor att ett par månader. Däremot kan den initiala passagen av dessa cellkluster, i kombination med omvänd filtrering av cellkluster, isolera friska tumörceller som kan bilda sfärer (F). Filtratet (E) innehåller vanligtvis överblivet skräp; dock rekommenderar vi plätering och underhålla filtratet och övervakning för utvecklingen av cellkluster. Dessa patienthärledda prov kan sedan upprätthållas i odling under flera passager (G, H).
Figur 3 visar förmågan hos dessa celler att vara xenotransplanterat i möss. I vart och ett av dessa fall var DIPG celler transfekterade med en GFP-luciferas reporter att följa utvecklingen av tumörerna genom bioluminiscens (A). Tumörerna kan också undersökas histologiskt, till exempel för att observera tumör engraftment (B) eller uttryck av specifika markörer (C). Dessa in vivo-modeller, i kombination med in vitro-analyser kan användas för att utvärdera effekterna av olika läkemedel eller genprodukter manipulationer (t.ex., 8, 9, 10, 11, 14).
les / ftp_upload / 55360 / 55360fig1.jpg "/>
Figur 1. vävnadsprover i olika skeden av bearbetningen. (A) Skaffa provet genom sterila obduktions förfaranden och övernattning sjöfart på våt is. (B) Från vänster till höger: (rad 1) rör innehållande tumörvävnad inom sjöfarten media; färsk vävnad i en 100 mm x 20 mm cellodlingsskål; inledande malningen av vävnad; (Rad 2) delvis malet vävnad; avlägsnande av hjärnhinnor och blodkärl; slutlig storlek av malet vävnadsbitar. (C) Från vänster till höger: (rad 1) vävnad inkuberades på ett roterande bord i en ugn 37 ° C; (Rad 2) triturering av vävnad genom en 1000 mikroliter pipettspets fäst till en 10 ml pipett; filtrering av dissocierade vävnaden genom en 100 pm nylonnät filter. (D) Från vänster till höger: dissocierad vävnad suspenderades i 0,9 M sackaroslösning före centrifugering; dissocierade vävnaden separeras över en sackarosgradient efter centrifugering; en synlig lager of myelin skräp ovanpå den sackarosgradient; en slutlig cellpellet efter ACK lys och tvätt. (E) Det slutliga urvalet kan placeras i kultur eller användas i andra nedströms analyser. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Bilder av primära kulturer och tidig passage celler. (A - B) Kulturer pläterade omedelbart efter dissociation (SU-DIPG-XXX, A), eller som inte har vuxit neuro ännu (SU-DIPG-XXIX, B). (C - D) Tidig utseende neuro i primärkulturer av SU-DIPG-XXVIII (C) och SU-DIPG-XXIX (D). (EF) Första passage av primärkulturen från D med användning av en 100 | im nylonfilter, med filtrate (E) och omvänt filtratet (F) pläteras. (G - H) Mogna neurosfärer från den första passagen av SU-DIPG-XXVII (G) och den tredje passagen av SU-DIPG-XXV (H) som växer i kultur. Skalstreck = 200 | j, m. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Patient härledda cellkulturer ympas och bilda tumörer hos möss. (A) mareld bilder av fyra olika patientgenererade cellkulturer transfekterade med en GFP-luciferas reporter. (B) Sagittal avsnitt från en mus xenograft, visar tumörceller ympats i musen pons. Grön: GFP, Red: myelinbasprotein. Skalstreck = 1 mm. (C) Exempel immunofluoresscens bild som visar GFP tumörceller ympats i en mushjärna. Blå: DAPI, Grön: GFP, Red: IGF2R. Skalstreck = 40 | im. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande Figur 1. Autopsy Exempel på en Pontine tumör. Omedelbar obduktions uppkomsten av en diffus inneboende Pontine gliom. Tumören visas som en stor, myelin rik massa på den ventrala ytan av pons. Klicka här för att ladda ner bilden.
Discussion
Detta protokoll beskriver en metod för snabb behandling av post mortem-tumörvävnads donationer för att utveckla patienthärledda cellkulturer, som kan användas i en mängd olika in vitro eller in vivo experiment. På grund av den typ av arbete med obduktionsprover, upprätthålla prov livskraft utgör en stor utmaning. Flera bidragande faktorer, inklusive post-mortem-intervallet till obduktion eller den tid som krävs för transport av vävnad, bör minimeras så mycket som möjligt men ofta är svåra att kontrollera. I vår erfarenhet, en obduktion intervall på mindre än 6 - 8 h (från tidpunkten för dödsfallet till den tidpunkt då vävnaden placeras i iskall sjöfart och transportmedia) har gett den bästa chansen att skapa en varaktig cellkultur. Det är bäst att sedan få vävnaden i labbet inom 24 timmar, och bearbeta det för kultur omedelbart vid mottagandet.
Eftersom placeringen av dessa sällsynta fall varierar brett, ochkvaliteten på vävnads hämtning steg påverkar starkt chans att lyckas, kan logistiken att utföra obduktionen vara utmanande. I många fall, i syfte att uppnå det 8/6 timme tidsram, är det inte genomförbart att utföra vävnads skörden vid en akademisk centrum. I stället har en vävnad återhämtning tjänst i beredskap för att återhämta sig tumörvävnaden vid begravningen hemma under en IRK-godkända protokoll är ofta mer ändamålsenligt för vävnads återhämtning. Erhålla informerat samtycke före döden rekommenderas och underlättar logistisk planering. Förberedelse fristående obduktions kit med tydliga och noggranna instruktioner och sterila leveranser för vävnads hämtning (handskar, draperier, skalpeller) rekommenderas starkt. Dessutom, fastställa tydliga punkter kommunikation mellan utredaren, patologen, och begravning hem är kritisk. Till exempel bör utredaren diskutera protokoll med patologen före obduktionen och markera vanliga fel. Dessa fel inkluderar microBIAL förorening (oftast jäst) under vävnads hämtning, underlåtenhet att leverera genom natten / snabbare leverans och underlåtenhet att leverera provet på tillräckligt våt is i en thermoinsulated behållare. Slutligen rekommenderar vi att du använder en dörr till dörr budfirma för transport av provet för att minimera transporttiden.
Man bör också tas under vävnadsdissociering att bevara cellviabilitet. Till exempel, användningen av media utformade bevara nervvävnad hälsa för transport (Hibernate-A kompletterat med antibiotika / antimykotika) ökar risken för att generera en framgångsrik kultur. Det är också viktigt att hålla provet vid en kall temperatur genom protokollet genom att alltid överföra proverna på is. Samla både mekaniska och enzymatiska dissociation fraktioner tillsammans med att minimera sönderdelning kan förbättra protokoll framgång, eftersom båda stegen är traumatisk för celler. I vår erfarenhet, medan de flesta framgångsrika kulturer växer ur båda fraktionernaHar vi haft fall där endast en av de två preparaten är etablerade ett varaktigt kultur, potentiellt avspeglar den känsliga naturen av dessa prover. En annan traumatisk steg i protokollet är rivning; en strategi som kan minska graden av finfördelning krävs är att säkerställa att proven noggrant malet i början av beredningen. Andra exempel på aspekterna av protokollet för att förbättra prov lönsamheten inkluderar lägga buffertar (t.ex. HEPES) I hela protokollet, vilket är särskilt viktigt under enzymatisk dissociation.
En eventuell ändring av detta protokoll för att ytterligare öka cellviabilitet är avlägsnandet av ACK röda blodkroppar lys steg. Men i detta fall är det ofta då nödvändigt att utföra en ACK lyssteget under den inledande veckan i odling för att avlägsna röda blodkroppar. En annan aspekt av detta protokoll som kan modifieras är elimineringen av myelin och cellrester med hjälp av en sackaros Density-gradient. Specifikt andra strategier som har rapporterats för att förbättra cellviabilitet av mikrogliaceller är också möjligt i detta steg, såsom en diskontinuerlig Percoll densitetsgradient 18 eller magnetiska myelin borttagning pärlor.
Slutligen, tiden mellan första vävnadsdissociering och uppkomsten av neuro varierar mellan prov och kan ta allt från en vecka till en månad eller mer. Eftersom de initiala kulturerna innehåller vanligen en betydande grad av döda celler och cellrester, kan det vara svårt att avgöra om livskraftiga celler förblir; kulturen bör bibehållas under åtminstone 4 - 8 veckor (Figur 2). En strategi för att isolera växande celler från den kvarvarande skräp presenteras här (dvs. reverse filtrera cellkluster och åter plätering i färskt medium). Beslutet om huruvida att fortsätta att upprätthålla en kultur är i slutändan en från fall till fall beslut baserat på faktorer som omger the obduktion (t.ex. en förlängd obduktion intervall, problem under transport vävnad), vävnads dissociation (t.ex. överdriven blod eller skräp), och hur provet visas i kultur. När en kultur är etablerad, bör identiteten valideras av DNA-fingeravtryck med användning av kort tandemupprepningsanalys eller en liknande metod, jämförelse av kulturen till ett prov av den ursprungliga tumören kvarhålls för detta ändamål. Vi rekommenderar att rutinmässigt validera kulturer genom DNA-fingeravtryck för att säkerställa att ingen förorening av andra kulturer har inträffat, till exempel var 3 - 6 månader.
Genereringen av dessa patientgenererade DIPG kulturer är ett viktigt steg i den framgångsrika utvecklingen av effektiva behandlingar. Utbyggnaden av de tillgängliga patientgenererade DIPG kulturer och xenograft-modeller kommer att vara avgörande för att identifiera de mest effektiva behandlingsstrategier och slutligen övervinna denna förödande sjukdom.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Författarna erkänner tacksamt stöd från McKenna Claire Foundation, National Institute of neurologiska sjukdomar och stroke (NINDS K08NS070926 och R01NS092597), Department of Defense (NF140075), California Institute för regenerativ medicin (CIRM RB4-06093 och RN3-06510), Alex Lemonade Stand Foundation, The Cure börjar nu Foundation och DIPG Collaborative, Lyla Nsouli Foundation, Avslöja Pediatric Cancer, Childhood hjärntumör Foundation, Matthew Larson Foundation, V Foundation, Godfrey Family Fund i minne av Fiona Penelope, den Wayland Villars DIPG Foundation, Dylan Jewett Connor Johnson, Zoey Ganesh, Dylan Frick, Abigail Jensen, och Jennifer Kranz Memorial fonderna N8 Foundation, Virginia och DK Ludwig fonden för cancerforskning, barnhälsovård Research Institute vid Stanford Anne T. och Robert M. Bass Begåvad fakulteten stipendium i Pediatric cancer och blodsjukdomar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hibernate-A | Gibco | A12475-01 | |
| HBSS with Calcium/Magnesium | Gibco | 24020-117 | |
| HBSS | Corning | 21-022-CV | |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| Liberase DH (Collagenase/Dispase) | Roche | 5401054001 | |
| DNAse I | Worthington Biochemical | LS002007 | |
| Sucrose | Sigma | S0389 | |
| Antibiotic/Antimycotic | Gibco | 15240-096 | |
| Neurobasal-A | Gibco | 10888-022 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11330-032 | |
| GlutaMAX-I (100x) | Gibco | 35050-061 | |
| Sodium Pyruvate (100 mM) | Gibco | 11360-070 | |
| B27 Supplement Minus Vitamin A | Gibco | 12587-010 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids (100x) | Gibco | 11140-050 | |
| Human PDGF-AA | Shenandoah Biotechnology | 100-16 | |
| Human PDGF-BB | Shenandoah Biotechnology | 100-18 | |
| Human EGF | Shenandoah Biotechnology | 100-26 | |
| Human FGF | Shenandoah Biotechnology | 100-146 | |
| Sterile scalpel blades | Bard Paker | 372610 | |
| Curved hemostats | Fine Science Tools | 13013-14 | |
| Razor blades | VWR | 55411-050 | |
| 100 x 20 mm cell culture dish | Corning | 353003 | |
| Sterile forceps | TWD Tradewinds | DF8988-5 | |
| Sterile drapes | 3M | 2037 | |
| Sterile gloves | Kimberly Clark | 1182307 | |
| ACK Lysis Buffer | Gibco | A1049201 | |
| 100 micron mesh filter | Fisher | 352360 | |
| 50 mL conical tube | Fisher | 1495949A |
References
- Fisher, P. G., et al. A clinicopathologic reappraisal of brain stem tumor classification. Identification of pilocystic astrocytoma and fibrillary astrocytoma as distinct entities. Cancer. 89 (7), 1569-1576 (2000).
- Johung, T. B., Monje, M. Diffuse Intrinsic Pontine Glioma: New Pathophysiological Insights and Emerging Therapeutic. Curr. Neuropharmacol. , (2016).
- Cage, T. A., et al. Feasibility, safety, and indications for surgical biopsy of intrinsic brainstem tumors in children. Child Nerv. Syst. 29 (8), 1313-1319 (2013).
- Puget, S., et al. Biopsy in a series of 130 pediatric diffuse intrinsic Pontine gliomas. Child Nerv. Syst. 31 (10), 1773-1780 (2015).
- Kieran, M. W. Time to rethink the unthinkable: Upfront biopsy of children with newly diagnosed diffuse intrinsic pontine glioma (DIPG). Pediatr. Blood Cancer. 62 (1), 3-4 (2014).
- Sturm, D., et al. Paediatric and adult glioblastoma: multiform (epi)genomic culprits emerge. Nat. Rev. Cancer. 14 (2), 92-107 (2014).
- Jones, C., Baker, S. J. Unique genetic and epigenetic mechanisms driving paediatric diffuse high-grade glioma. Nat. Rev. Cancer. , (2014).
- Taylor, K. R., et al. Recurrent activating ACVR1 mutations in diffuse intrinsic pontine glioma. Nat. Genet. 46 (5), 457-461 (2014).
- Wu, G., et al. The genomic landscape of diffuse intrinsic pontine glioma and pediatric non-brainstem high-grade glioma. Nat. Genet. 46 (5), 444-450 (2014).
- Fontebasso, A. M., et al. Recurrent somatic mutations in ACVR1 in pediatric midline high-grade astrocytoma. Nat. Genet. 46 (5), 462-466 (2014).
- Buczkowicz, P., et al. Genomic analysis of diffuse intrinsic pontine gliomas identifies three molecular subgroups and recurrent activating. Nat. Genet. 46 (5), 451-456 (2014).
- Monje, M., et al. Hedgehog-responsive candidate cell of origin for diffuse intrinsic pontine glioma. Proc. Natl. Acad. Sci. 108 (11), 4453-4458 (2011).
- Aoki, Y., et al. An experimental xenograft mouse model of diffuse pontine glioma designed for therapeutic testing. J. Neuro-Oncol. 108 (1), 29-35 (2012).
- Grasso, C. S., et al. Functionally defined therapeutic targets in diffuse intrinsic pontine glioma. Nat. Med. , 1-10 (2015).
- Shu, Q., et al. Direct Orthotopic Transplantation of Fresh Surgical Specimen Preserves CD133 +Tumor Cells in Clinically Relevant Mouse Models of Medulloblastoma and Glioma. Stem Cells. 26 (6), 1414-1424 (2008).
- Becher, O. J., et al. Preclinical evaluation of radiation and perifosine in a genetically and histologically accurate model of brainstem glioma. Cancer Res. 70 (6), 2548-2557 (2010).
- Funato, K., Major, T., Lewis, P. W., Allis, C. D., Tabar, V. Use of human embryonic stem cells to model pediatric gliomas with H3.3K27M histone mutation. Science. 346 (6216), 1529-1533 (2014).
- Olah, M., et al. An optimized protocol for the acute isolation of human microglia from autopsy brain samples. Glia. 60 (1), 96-111 (2012).
