Abstract
הזיהוי של אפיטופ אנטיגני על ידי המערכת החיסונית מאפשרת הבנה של מנגנון הגנה של נוגדנים מנטרלים שעשויים להקל על פיתוח של חיסונים ותרופות פפטיד. סריקת פפטיד היא שיטה פשוטה ויעילה הממפה את epitope ליניארי המוכר בצורה ישירה על ידי נוגדן חד-שבטי (מב). הנה, המחברים מציגים מתודולוגיה נחישות epitope המעורבת חלבונים רקומביננטיים קטומים סדרתי, עיצוב פפטיד סינטטי, כלת dot-כתם להכרה אנטיגני של חלבון מעייל וירוס עצבים נימקו באמצעות מב נטרול. טכניקה זו מסתמכת על הכלאה dot-כתם של פפטידים סינתטיים מבז על פלואוריד polyvinylidene הממברנה (PVDF). האזור אנטיגני מינימום של חלבון מעיל ויראלי מוכר על ידי מב RG-M56 יכול להיות הצטמצם אחר צעד-אחר-צעד גזוז מיפוי פפטיד גבי epitope פפטיד 6-mer. בנוסף, סריקה אלאנין תת mutagenesis שאריותstitution ניתן לבצע כדי לאפיין את המשמעות המחייבת של כל שאריות חומצת אמינו המרכיבות את epitope. שאריות איגוף באתר epitope נמצאו לשחק תפקידים קריטיים בתקנה קונפורמציה פפטיד. הפפטיד epitope זיהה ניתן להשתמש כדי ליצור גבישים של מתחמי פפטיד-נוגדן epitope עבור מחקר עקיף של קרני רנטגן ותחרות פונקציונלית, או רפוי.
Introduction
במערכת החיסונית, רקומבינציה של V, D, ומגזרי J מאפשרת נוגדנים ליצור מגוון גדול של אזורים בקביעת מידת השלמה (CDRs) לכריכה לאנטיגנים שונים שנועד להגן על המארח מזיהום פתוגניים. הגנת הנטרול של נוגדנים נגד אנטיגנים תלוי ההשלמה מרחבית בין CDRs של נוגדנים ואת אפיטופים של אנטיגנים. לכן, הבנה של אינטראקציה מולקולרית זה תסייע עיצוב חיסון מניעתי ופיתוח תרופות פפטיד טיפולי. עם זאת, אינטראקצית נטרול זה עשוי להיות מושפע הוא על ידי תחומים אנטיגני מרובים אנטיגן אחד ועל ידי מספר CDRs של נוגדנים, אשר כתוצאה מכך להפוך את תהליך קביעת epitope מורכב יותר. למרבה המזל, את הפיתוח של טכנולוגיית hybridoma, ממזגת תאי מייצרי נוגדני פרט עם תאי מיאלומה, מאפשר לאפיית חלוקת זמן של תאים שניים rete אחד נוגדן ספציפי, המכונה נוגדן חד-שבטי (מב) 1. תאי Hybridoma לייצר זיקה גבוהה טהור, אלה מבז להיקשר תחום אנטיגני יחיד של אנטיגן ספציפי. עם היחס של הנוגדן לאנטיגן הוקמה, מספר גישות, כולל סריקה פפטיד, שניתן להשתמש בהם כדי לקבוע את epitope של אנטיגן באמצעות מב המתאימה לו. ההתפתחויות האחרונות בתחום הטכנולוגיה פפטיד סינתטי הפכו את טכניקת הסריקה פפטיד נגיש יותר ונוח יותר לבצע. בקצרה, קבוצה של פפטידים סינתטיים חופפים מיוצרים על פי רצף אנטיגן היעד והן קשורות אל קרום מוצק נתמך הכלאה מב. סריקת פפטיד לא רק מציעה דרך פשוטה כדי למפות את הנוגדן מחייב באזור, אלא גם הופכת לפשוט חומצות אמיניות (AA) mutagenesis באמצעות סריקת שאריות או החלפה כדי להעריך את האינטראקציה מחייבת בין כל שאריות aa של הפפטיד epitope ואת CDRs של הנוגדן.
= ילדה "jove_content"> כאן, המחקר הנוכחי מתאר פרוטוקול לזיהוי יעיל של epitope ליניארי של הנגיף נמק צהוב לוקוס עצבים (YGNNV) חלבון מעיל באמצעות מב נטרול 2, 3, 4. הפרוטוקול כולל הכנת מב, בניית ביטוי של חלבונים רקומביננטיים קטומים סדרתי, עיצוב פפטיד סינטטי חופף, כלת dot-כתם, סריקת אלאנין, ו mutagenesis חילוף. בהתחשב בעלות הגבוהה של סינתזת פפטיד, הצעד של מקצץ את החלבונים רקומביננטי הסדרה של חלבון מטרה רצויה שונה, ואזור אנטיגני הצטמצם סביב 100 עד 200 שאריות aa לפני ניתוח dot-כתם מערך פפטיד הסינטטי בוצע.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנה חד שבטי הנוגדן
- התרבות התאים hybridoma חד שבטיים העכבר RG-M56 2 במדיום סרום ללא צלוחיות 175T ב 37 ºC עם 5% CO 2 תוספת. איסוף supernatant כאשר הצבע של המדיום הופך צהוב לאחר חמישה ימים של דגירה.
הערה: תאי Hybridoma היו בתרבית בינונית סרום ללא כדי למנוע זיהום נוגדנים בסרום שור עובר. - צנטריפוגה supernatant ב 4,500 XG במשך 30 דקות ב 4 ºC וזורקים את הכדור פסול תא.
- הוסף 2 מ"ל של agarose חלבון G (כפי שסופק slurry 50%) לעמודה 5 מ"ל ו לאזן עם 10 כרכים שרף (10 מ"ל) של PBS קר כקרח.
- טען 200 מ"ל של supernatant נוגדן (שלב 1.2) על הטור וזורקים את התמסורת.
- הוסף 10 מ"ל של PBS קר כקרח לעמודה לשטוף אותו. חזור פעמיים.
- הוסף 10 מ"ל של 50 מ"מ גליצין, pH 2.7 לעמודה כדי elute החלבון G הקשורים נוגדנים. Collect 900 שברים μL בצינור microcentrifuge המכיל 100 μL של 10x חיץ נטרול (1 M טריס, 1.5 M NaCl, ו 1 mM EDTA, pH 8.0).
- אחסן את הנוגדן המטוהר גליצרול 50% עם 0.03% NaN 3 ב -20 ºC.
2. בינוי ביטוי של חלבוני סדרה קטועים רקומביננטי
- הכינו תערובת התגובה PCR: 5 μL של 10x חיץ Pfu, 0.2 מ"מ של כל dNTP, 0.2 פריימר 3 מיקרומטר קדימה, 0.2 מיקרומטר פריימר 3 הפוכה, 2 מ"מ MgSO 4, 1 ננוגרם של DNA pET20b-1A59 3 פלסמיד, ו -2.5 U ( היחידה) של DNA פולימרז Pfu; להוסיף DDH 2 O לנפח סופי של 50 μL.
- דגימות לרוץ בתוך Cycler תרמית אוטומטית באמצעות הפרמטרים הבאים: מחזור 1 (94 ºC למשך 5 דקות); מחזורים 2-36 (94 ºC למשך 30 שניות, 63 ºC למשך 30 שניות, ו -72 ºC עבור 60 s); מחזור 37 (72 ºC עבור 7 דקות).
- חלץ את תגובת שרשרת פולימראז (PCR) מוצרים באמצעות ערכת 5 טיהור PCR כדי להקל על עיכול אנזים ההגבלה הבא.
- לעכל את שברי DNA PCR מוגבר עם חס"ם אני אנזימי הגבלה Xho שאני ולקשור כל קטעי דנ"א אלה לתוך חס"ם לי ואני Xho-ביקע אנזים PET-20b (+) וקטור. להפוך את המבנים לתאי coli Escherichia DH-5α מוסמך 6.
- מכינים את תערובת העיכול חיץ העיכול (20 מ"מ טריס-אצטט, 10 Mg מ"מ (COO CH 3) 2, 50 מ"מ KCH 3 COO, ו 1 מ"מ DTT, pH 7.9) עם 1 מיקרוגרם של ה- DNA PCR מוגבר או PET-20b (+) וקטור DNA, ו -2 U של חס"ם אני הגבלה Xho שאני אנזימים בנפח סופי של 20 μL.
- מערבבים את התערובת העיכול בעדינות ובמהירות ספין למטה. לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 2 ח באמבט יבש כדי להבטיח את החיתוך המלא של ההגבלה לשבתes.
- חלץ את שברי DNA אנזים מתעכל הגבלה באמצעות ערכת 5 טיהור PCR כדי להקל על הבנייה פלסמיד הבאה.
- מכינים את תערובת קשירת במאגר קשירת (66 מ"מ טריס, 5 מ"מ MgCl 2, 1 mM ATP, ו -5 מ"מ DTT, pH 7.5) עם 100 ננוגרם של DNA predigested, PCR מוגבר, 10 ng של PET-20b מעוכל מראש (+) DNA וקטור, ו -5 U של T4 האנזים דנ"א בנפח סופי של 10 μL.
- מערבבים את תערובת קשירת בעדינות ובמהירות ספין למטה. לדגור על 16 מעלות צלזיוס במשך 18 שעות בתוך אמבט מים.
- שים 10 μL של דגימות קשירת לתוך 100 μL של תאים DH-5α המוסמכת ומערבבים בעדינות לפני הנחת צינור microcentrifuge על קרח למשך 30 דקות. שים את הצינור microcentrifuge באמבט יבש ב -42 ºC למשך 90 שניות כדי לגרום חום הלם 7. מיד להעביר את הצינור על קרח במשך 2 דקות.
- להוסיף 900 μL של לוריא- Bertani (LB) מרק (1% Bacto tryptone, 0.5% Bacto שמרים extract, ו -0.5% NaCl, pH 7.0) אל הצינור. לדגור על 37 מעלות צלזיוס עם 150 סל"ד רעדו במשך 45 דקות. גלולה התאים על ידי צנטריפוגה ב 4000 x ז במשך 10 דקות וזורקים supernatant.
- Resuspend גלולה עם 50 μL של מרק LB ומרחו על כל שינוי לצלחות מחומם מראש LB המכיל אמפיצילין 100 מיקרוגרם / מ"ל. דגירת הצלחות ב 37 ºC עבור 16 שעות.
- תרימי מושבה אחת באמצעות טיפ 200 μL ומניחים אותו לתוך 3 מ"ל של מרק LB המכיל אמפיצילין 100 מיקרוגרם / מ"ל בתוך שפופרת 15 מ"ל כתרים רופף. לדגור על 37 מעלות צלזיוס עם 150 סל"ד רעדו במשך 12 שעות.
- חלץ את ה- DNA פלסמיד 8 מכל תרבות ורצף אותו באמצעות האמרגן T7 ו פריימרים terminator T7 כדי לאשר את רצף 9.
- לאחר אישור רצף, להפוך 10 ng של DNA מ PET-20b אלה (+) פלסמידים עם משתנים אורכי של הגן חלבון מעיל YGNNV לתוך BL-21 (DE3) זן של החיידק על ידינוing השיטה-הלם החום 7. בצע את השלבים 2.3.6-2.3.8 לבצע את השינוי.
- העבר מושבה אחת מכל החיידק טרנספורמציה תא BL-21 ל 3 מ"ל של מרק LB המכיל אמפיצילין 100 מיקרוגרם / מ"ל ב 15 צינור מ"ל כתרים רופף. דגירת התרבות ב 37 ºC עם 150 סל"ד רועד.
- מצננים את התרבות ל -25 ºC כאשר OD 600 של התרבות הוא כ 0.6 ולהוסיף IPTG לריכוז סופי של 0.4 מ"מ כדי להשרות את הביטוי של חלבון רקומביננטי. דגירת ההתרבות עבור ג 4 תוספת של 25 ºC עם 200 סל"ד רועד.
- העבר 1 מ"ל של תרבות לתוך צינור microcentrifuge. גלולה התאים על ידי צנטריפוגה ב XG 12,000 במשך 1 דקות וזורקים supernatant.
- Resuspend התא גלולה ב 100 μL של חיץ denaturation (8 אוריאה M, סודיום פוספט 20 מ"מ, ו 0.5 M NaCl, pH 7.4) על ידי pipetting למעלה ולמטה עם micropipette. מערבבים על ידי vortexing נמרץ.
הערה: סול המדגםutions צריך להיות עכשיו שקוף למחצה, קצת דביק, ומוכן עבור assay כלת dot-הכתם.
3. עיצוב וסינתזה של פפטידים חופפים
- עיצוב וסינתזה 3 פפטידים סדרתי 20-mer שכל חפיפה עם מחליפו ב -10 שאריות aa מאזור 195-338 aa של חלבון מעיל YGNNV כדי לצמצם את האזור אפיטופ של מב RG-M56 ידי סופג נקודה.
- עיצוב וסינתזה 3 שלושה פפטידים 8-mer (195 VNVSVLCR 202, 197 VSVLCRWS 204, ו -199 VLCRWSVR 206) עם חפיפה של 6 שאריות aa על פפטיד סינתטי הבא כדי לצמצם את האזור אפיטופ של 195-206 aa על ידי סופג נקודה.
- עיצוב וסינתזה 3 7-mer (196 NVSVLCR 202 ו 195 VNVSVLC 201), 6-mer (195 VNVSVL 200, 196 NVSVLC 201, ו 197 VSVLCR 202), ו -5 mer פפטידים (195 VNVSV 199, 196 NVSVL 200, 197 VSVLC 201, ו 198 SVLCR 202) עם חפיפה של 6, 5, ו -4 שאריות aa, בהתאמה, על פפטידים השכנות שלהם כדי למזער את באזור epitope על ידי סופג נקודה.
כלת Dot-כתם 4.
- ממיסים פפטיד מסונתז sulfoxide דימתיל (DMSO) לריכוז סופי של 10 מ"ג / מ"ל.
הערה: כדי להתגבר על מסיסות מגוונת של פפטידים סינתטיים, כל פפטידים סינתטיים צריך להיות מומס DMSO. DMSO הוא ממיס טוב לפזר פפטידים הידרופובי או הידרופילי לחלוטין. - משרים את פלואוריד polyvinylidene (PVDF) קרום עם מתנול למשך 2 דקות.
הערה: קרום PVDF הוא עד 100% עמידים בפני DMSO; אחרים עשויים שלא להיות כך. - לאזן את הממברנה PVDF עם חיץ-טובין שונה (25 מ"מ טריס, 192 מ"מ גליצין, ו -0.1% SDS, pH 8.3) עבור2 דקות.
הערה: 10-20% (v / v) של מתנול ניתן להוסיף למאגר טובין שונה כדי לשפר את תוצאות ההעברה. - לשטוף פיסת נייר כרומטוגרפיה עם חיץ-טובין שונה. מניחים את קרום PVDF לנייר כרומטוגרפיה. המתן עד חיץ-טובין שונה נעלם מפני השטח קרום PVDF לפני שתמשיך לשלב הבא.
- הוסף 2 μL של כל דגימה פפטיד הממברנה עם טיפ 10 μL. אוויר יבש הממברנה PVDF על נייר כרומטוגרפיה במשך 10 דקות. להוסיף כל דגימה פפטיד לאט ובהדרגה על הממברנה כדי למנוע דיפוזיה יותר מדי.
- חסום את הממברנה במאגר TBST (0.05% (v / v) Tween-20, 20 מ"מ טריס, ו -150 מ"מ NaCl, pH 7.4) עם חלב ללא שומן 5% למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר עם רעד עדין.
- להוסיף מב RG-M56 בדילול סופי של 1: 1,000 במאגר TBST עם חלב ללא שומן 5% עד הממברנה. דגירה הממברנה ב 37 ºC עבור H 1 עם רעד עדין.
- הסר את הנוגדן כךlution. לשטוף את הממברנה במאגר TBST במשך 5 דקות עם רעד עדין. חזור פעמיים.
- מוסיפים את נוגדנים משני (עז נגד העכבר IgG, Fc, phosphatase אלקליין מצומדות) בדילול סופי של 1: 5,000 במאגר TBST עם חלב ללא שומן 5% עד הממברנה. דגירה הממברנה ב 37 ºC עבור H 1 עם רעד עדין.
- מחק את פתרון הנוגדן. לשטוף את הממברנה במאגר TBST במשך 5 דקות עם רעד עדין. חזור על השלב לשטוף פעמיים.
- לפתח את הממברנה עם פתרון המצע BCIP / NBT בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות בחושך. עצור את הפיתוח על ידי שטיפת הממברנה עם DDH 2 O כאשר האות מופיעה.
- האוויר יבש הממברנה ללכוד את תמונת dot-הכתם באמצעות מערכת תמונה.
- מדוד את העוצמה של כל כתם נקודה באמצעות ניתוח תמונה תוכנה 3.
סריקת אלנין 5. חילוף
- עיצוב לסנתז 3 אלאנין ו methiפפטידים החלפה onine. החלף כל שאריות aa עם אלאנין לייצור הפפטיד 8-mer 195 VNVSVLCR 202 לסנתז פפטידים 195 ANVSVLCR 202, 195 VAVSVLCR 202, 195 VNASVLCR 202, 195 VNVAVLCR 202, 195 VNVSALCR 202, 195 VNVSVACR 202, 195 VNVSVLAR 202, ו -195 VNVSVLCA 202 . החלף aa שאריות לאוצין 200 עד מתיונין ליצור הפפטיד epitope גנוטיפ SJNNV 195 VNVSVMCR 202.
- עקוב סעיף 4 כדי לבצע סריקת אלאנין ו mutagenesis החלפת dot סופגים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
מטרת ניסוי זה הייתה לזהות אפיטופ דרך נקודה סופגת באמצעות מב. כדי במהירות וביעילות לצמצם באזור אנטיגני מוכר על ידי מב, אורך-מלא מקוצץ סדרתי חלבונים מעיל YGNNV רקומביננטי עם תג היתוך 6xHis בבית C- הסופית באו לידי ביטוי מתוך מערכת ביטוי E. coli PET 10 (איור 1 א). החלבונים רקומביננטי וכתוצאה נראו על הממברנה PVDF באמצעות RG-M56 מב ואנטי 6xHis נוגדן עבור הכלאה dot-כתם. סופג נקודה גילה אותות חיוביים נגד 1-338 aa (באורך מלא), 51-338 aa, ו 195-338 aa, אבל לא 1-100 aa או 1-200 aa חלבונים רקומביננטיים (איור 1B). מערך נקודת הכלאה נגד הנוגדן אנטי 6xHis ואשר את הביטוי של כל החלבונים רקומביננטי. נתונים אלו מעידים כי epitope ההכרה מב RG-M56 ממוקם Nea חלבון רקומביננטי 144-AAr C- הסופית של YGNNV חלבון מעיל (195-338 aa).
בהמשך לכך, פפטידים 20-mer סדרו עם 10 aa-שאריות-ארוכים חופפים על שכנם תוכננו מסונתז מתוך הרצף של חלבון רקומביננטי 144-aa לסריקת פפטיד כדי לצמצם את אזור epitope. פפטידים סינתטיים אלה נראו על קרום PVDF נתון הכלאה dot-כתם באמצעות מב RG-M56. התוצאה הראתה אותות חיוביים רק על aa פפטיד 195-214 ואת הבקרה החיובית, 195-338 aa חלבון רקומביננטי (איור 2 א). ככל epitope ממוקם בתוך פפטיד 195-214 aa באזור אך לא באזור aa פפטיד 205-224, שלושה פפטידים 8-mer סדרתי עם 6-aa שאריות חופפים מערימת שאריות 195-206 (פפטידים 195-202 aa, 197- 204 aa, ו 199-206 אא) תוכננו מסונתז. Dot-כתם תוצאות הכלאה הראו אותות חיוביים על aa פפטיד 195-202 ואת 195-214 aa פפטיד חיובית השליטה באמצעותRG-M56 מב (איור 2 ב).
סריקה אלאנין ו mutagenesis החלפה בוצעו כדי להעריך את הספציפיות של כל שאריות aa של epitope 8-mer, 195 VNVSVLCR 202. כל שאריות aa של הפפטיד 8-mer הוחלפו בנפרד עם אלאנין. מערך פפטיד המוטציה אלאנין מכן הוצב על קרום PVDF באמצעות aa פפטיד 195-202 כביקורת חיובית. Dot-כתם ניתוח עולה כי שלוש המוטציות להחליפם, V197A, V199A, ו C201A, בטל את הזיקה המחייבת של מב RG-M56 (איור 3 א). למרות aa שאריות 200 epitope גנוטיפ SJNNV הוא מתיונין, להבדיל לאוצין ב אפיטופים גנוטיפ ארבעה Betanodavirus אחרים, רצף גנוטיפ SJNNV, 195 VNVSVMCR 202, הראה זיקה מחייבת חיובי נגד מב RG-M56, כמו זה של בקרה חיובית (איור 3 א). תוצאה זו מעידה כי אפיטופים of כל גנוטיפים Betanodavirus יכול להיות מוכר על ידי RG-M56 מב. הזיקה המחייבת של כל שאריות aa המשתתפות לאתר epitope הייתה לכמת עוד יותר על ידי מדידת עוצמת האות של כתם הנקודה של כל החלפת אלאנין באמצעות תוכנת ניתוח תמונה (איור 3). עוצמות של V197A, V199A, והחלפות C201A הופחתו ל -10.2%, 18.6%, ו -8.5%, בהתאמה, בהשוואה לאלה של שליטה חיובית (100%), ואילו V195A, S198A, L200A, R202A, ו החלפות L200M הראה בעוצמות גבוהות או דומה לזה של בקרה חיובית. ראוי לציין כי כוח המשפיעים של החלפת N196A הוא דו משמעי, עם ירידה של 37.4% בביקורת החיובית. תוצאות אלו מצביעות כי V197, V199, ו C201 הן שאריות חיוניות עקידת מב RG-M56.
תוצאות mutagenesis סריקת אלאנין עולות כי שאריות aa V195, N196, ו R202 יכולותלהיות מוחלף עם אלאנין, מה שמרמז כי יכול להיות הצטמצם באזור epitope נוסף בשני טרמיני. לכן, צעד-אחר-צעד גזוז מיפוי פפטיד באמצעות 7-mer, 6-mer, צעד פפטידים סינתטיים 5-mer נועד למזער באזור אנטיגני. האיתות החיובי נכח על פפטיד סינתטי 6-mer 196 NVSVLC 201, אבל לא על פפטידים סינתטיים 7-mer ו -5 mer (איור 4). נתונים אלו מעידים כי epitope מינימלית של חלבון מעיל NNV מוכר על ידי RG-M56 מב הוא פפטיד 6-mer, 196 NVSVLC 201.
איור 1: הפחתת באזור epitope באמצעות חלבונים נוגדן מונוקלונאלי רקומביננטי מקוצץ באופן סדרתי. (א) מפת NNVCPs רקומביננטי קטום סדרתי. NNVCP 1-338 aa הוא החלבון מעיל באורך מלא. (ב) Dot-bloניתוח t של NNVCPs רקומביננטי. משמאל: מפת החלבונים YGNNV רקומביננטי מעיל מקוצץ באופן סדרתי על הממברנה PVDF. תיכון: ניתוח הנקודה הכתם בוצע באמצעות נוגדן אנטי 6xHis. משמאל: ניתוח dot-כתם בוצעה באמצעות RG-M56 מב. NNVCP: חלבון מעיל וירוס נמק העצבים; aa: חומצת אמינו; PVDF: פלואוריד polyvinylidene; N: N הסופית-; C: C- סופי; מב: נוגדן חד-שבטי. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2: מיפוי פיין האזור epitope באמצעות פפטידים סינתטיים. (א) משמאל: רצפים של חומצות אמינו של פפטידים סינתטיים 20-mer היו מיושרים aa NNVCP 195-338; היה כל פפטיד שקדם חפיפה 10 aa-שאריות-ארוכה עם הפפטיד הבא. מימין: מפת היםפפטידים ynthetic על הממברנה PVDF. רקומביננטי NNVCP 195-338 aa שימש כביקורת חיובית. ניתוח הנקודה הכתם בוצע באמצעות מב RG-M56. (ב) משמאל: רצפים של חומצות אמינו של פפטידים סינתטיים 8-mer, 195-202 aa, 197-204 aa, ו 199-206 aa; היה כל פפטיד שקדם חפיפה 6 aa-שאריות-ארוכה עם הפפטיד הבא. 195-214 aa פפטיד סינתטי שימש כביקורת חיובית. משמאל: ניתוח dot-כתם בוצעה באמצעות RG-M56 מב. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3: אלאנין סריקה mutagenesis החלפה של epitope 195 VNVSVLCR 202. (א) רצפי חומצת אמינו של mutagenesis החלפה וניתוח dot-כתם. כל aa residue אזור epitope, 195-202 aa, הוחלף בנפרד עם אלאנין. L200M החלפה הוא רצף גנוטיפ SJNNV לעבר אזור epitope חלבון מעיל Betanodavirus. 195-202 aa פפטיד סינתטי שימש כביקורת חיובית. שאריות aa החליף מודגשות. (ב) כימות של אות כתם נקודת הזיקה המחייבת. עוצמת האות של הבקרה החיובית (195-202 אא) נקבעה לסך 100%. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4: קביעת epitope מינימום. 7-mer (א), 6-mer (B), ו -5 mer (C) פפטידים סינתטיים בעזרת 195-202 aa שימשו כדי לזהות את epitope מינימום מוכר על ידי RG-M56 מב. pepti סינתטידה 195-202 aa שימש כביקורת חיובית. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פרוטוקול זה מציע טכניקה מהירה וישירה לזהות epitope ליניארי מוכר-מב. אם ניקח בחשבון את העלות של סינתזה פפטיד ואת יעילות הייצור של פפטידים וסינתזה, באזור אנטיגני של חלבון מעיל וירוס הופחת על ידי הבעת חלבונים רקומביננטיים קטום סדרתי לפני ניתוח סריקה פפטיד. ככזה, מערכת הביטוי האמינה ויעילה E. coli PET שמשה לייצר באופן סדרתי אלה חלבונים רקומביננטיים הקטומים, חלבונים רקומביננטיים עם משקל מולקולרי בין 10 עד 50 kDa יכול לבוא לידי הביטוי בקלות דרך מערכת זו. בדרך זו, את epitope ניתן לצמצם בקלות לאזור aa 100 יותר לניהול 200. חייתי מחמד-20b (+) הווקטור נבחר במכוון, כפי שהוא מכיל רצף מקודד בעת 6xHis-תגים, המאפשר חלבוני היתוך 6xHis-תג היוצר להיות immunodetected באמצעות נוגדן אנטי 6xHis כדי לאשר את הביטוי של p רקומביננטיroteins. החלבונים מעיל רקומביננטי המיוצר היו אז ונותחו באמצעות RG-M56 מב באמצעות assay הכלאה dot-כתם. שיטה חלופית של נחישות epitope חלבון רקומביננטי היא לטהר את החלבונים רקומביננטי הביע באמצעות כרומטוגרפיה זיקה יון המתכת משותקת 10, להפריד בין חלבונים רקומביננטיים עם SDS-polyacrylamide ג'ל אלקטרופורזה, ולבצע ניתוח כתם המערבי 3.
כדי להמשיך ויותר דק למפות את מיקום epitope שקבע את תוצאות הניתוח הכלאה dot-כתם באמצעות חלבונים רקומביננטיים קטום סדרתי, פפטידים סינתטיים חופפים עם בגדלים שונים נועדו. בין האורכים אפשריים השונים של פפטיד הסינטטי לסנתז, 20-mer עם 10 aa-שאריות-ארוך פפטידים חופפים נבחרו ראשון סריקת פפטיד, הוא לטוהר הסינתזה הגבוה שלהם (בסביבות 90%) ועל אורך הפפטיד שלהם, מספיק עבור בחיפוש אחר הדואר הרציףpitope מוכר על ידי נוגדן B-cell 11. יש לשים לב שהדיוק והטוהר של פפטידים מסונתזים להתדרדר כפי הפפטיד המסונתז ארוך. בדרך זו, באזור epitope הופחת במהירות סביב 10 שאריות aa באורך. לאחר פפטידים חופפים סדרתי 8-mer נסקרו, באזור epitope ליניארי הוגדר פפטיד 195-202 aa. בהמשך לכך, סריקה אלאנין של פפטיד epitope 8-mer זה חושף את כוח הזיקה המחייב הקריטי של כל שאריות aa, המאפשרת חיפוש עבור epitope המינימאלי. התפקידים החיוניים של V197, V199, ושאריות aa C201 מרמז על כך שהאזור epitope ליניארי מכסה לפחות 5 שאריות aa, מ -197 ל 201. יתר על כן, aa שאריות V195, N196, ו R202 יכול להיות מוחלף עם אלאנין בלי לחלוטין לאבד מחייב זיקה, המציין כי באזור epitope עשוי להיות מופחת עד 7, 6, או אפילו 5 שאריות aa באורך. רצפי פפטיד קטנים ניתן בקלות וכלכלית מסונתזים עבור בחיפוש ליניארי (שיתוףאפיטופים ntinuous). עם זאת, טכניקת הסריקה פפטיד סינתטי זה אינו מתאים להגדרה של epitope רציפה של נוגדן, אלא אם כן הוא משולב עם כריתה epitope ו ספקטרומטריה מנתח 12.
בפרוטוקול זה, טכניקת כלת dot-כתם שמשה לחפש את epitope ליניארי של מב. כלת Dot-כתם היא שיטה פשוטה אך יעילה. בתחילת החיפוש, כאשר אזור epitope הוא הצטמצם מ נוף בקנה מידה גדולה, הדאגה העיקרית היא להתבונן גם איתות חיובית או שלילית לאחר הכלאה של הנוגדן לחלבון כבול-קרום יעד, כמו רוב מהבז רק להיקשר epitope ספציפי של חלבון אנטיגני (איורים 1 ו -2). עם זאת, בעת שימוש כלת dot-כתם לחקור את הזמינות המחייבת של כל שאריות aa בתוך אזור epitope נגד הנוגדן, כגון על ידי mutagenesis החלפת אלאנין,את עוצמת האות של כל שאריות aa להחליף שקבעו סופג נקודה צריכה להיות בחשבון את המשמעות המחייבת הכוללת. עוצמת האות שניתן לכמת בקלות באמצעות תוכנת ניתוח התמונה (איור 3B) או densitometer. לחלופין, assay אנזים צמוד החיסונית sorbent (ELISA) ניתן לבצע כדי לכמת את מידת מחייב זיקה ואת האות שהתקבל כוח 3.
במחקר הקודם, החלבון המעייל הבלעדי של וירוס נימק עצבים הלא מעטפה היה חיסוני מוכר על ידי 10 מבז עם ערך מדד נטרול גבוה בין 6.5 כדי 4.5 (יומן 10 NI) 2. היכולת הכרה ספציפית מאוד של מבז שימשו נוסף לפיתוח של ערכת אבחון חד-שלבית, מהירה immunochromatographic לצורך זיהוי של דגים NNV נגועים 13. את epitope אנטיגני של חלבון מעיל וירוס נמק העצבים הוכר על ידי RG-M18מב כקובץ פפטיד 8-mer, 195 VNVSVLCR 202 3, שדרכו קולטן הרומן NNV זוהה (נתונים שלא פורסמו). במחקר הנוכחי, את epitope של חלבון מעיל וירוס העצבים נמק הצטמצם עוד יותר פפטיד 6-mer, 196 NVSVLC 201, על ידי מב האחר, RG-M56.
זה לא צפוי כי שני פפטידים 7-mer (196 NVSVLCR 202 ו 195 VNVSVLC 201) המכיל פפטיד 6-mer 196 NVSVLC 201 אינם מוכרים על ידי RG-M56 מב (איור 4 א). פרשנות סבירה היא כי, למרות השאריות שמסביב V195 ו- R202 לא יכולות לתרום ישירות האינטראקציה המחייבת בין epitope הנוגדנים, שאריות האיגוף להשפיע על ההיווצרות של קונפורמציה פפטיד הנכונה להכרת נוגדן. הופעתו של V195 או R202 בתחנה הסופית האיגוף שלהם לבד עלולה לעקם הפפטיד הסינטטיקונפורמציה להכרת נוגדן ומחייב. הקונפורמציה epitope הוא מונע על ידי כוח של שני טרמיני, V195 ו- R202, אשר מאוזנים אחד נגד השני הפפטיד סינתטי 8-mer, 195 VNVSVLCR 202, ו לסתור את פפטיד סינתטי 6-mer, 196 NVSVLC 201. שאריות aa, V195, N196, ו R202, ניתן להחליף בנפרד עם אלאנין מבלי לאבד את היכולת מחייב לחלוטין, ובכך, התוצאות mutagenesis סריקה אלאנין עולה כי שלושת אלה שאריות aa כנראה לא משחקים תפקיד משמעותי הכרה ומחייבת של RG -M56 מב. עם זאת, לאחר החיתוך שאריות אחד יותר מן פפטיד סינתטי 6-mer, 196 NVSVLC 201, הפפטיד 5-mer, 197 VSVLC 201, ללא N196 באזור N-terminal איגוף, מאבד את היכולת להיות מוכר מחויב RG -M56 מב (איור 4C). תוצאה זו מרמזת כי שאריות N196 רשאי גם pלהניח תפקיד חשוב באזור האיגוף של epitope לייצב את הקונפורמציה epitope הנכונה על מנת להקל על ההכרה ומחייבת של מב RG-M56. חשיבותה של שאריות איגוף סביב אזור epitope גם לא נחקרה על ידי מחקרים מחייבים אנטיגן-נוגדן אחרים. המשמעות של איגוף שאריות aa שמסביב באזור epitope α-bungarotoxin עבור הכריכה של נוגדנים נחקר תוך שימוש בתחליפים aa שונים בתוך אותו אתר משנה כולינרגית. לאחר מכן הם הוערכו כמו גם חיוניים, השפעה, או לא השפעת 14. כמו כן, נמצא כי הספציפי של epitope מוכר-הנוגדן של מוקיוס אפיתל הקשורים קרצינומה ניתן להשפיע עוד יותר על ידי שאריות aa איגוף. תופעות אלה עלולות להציג מחסומי קונפורמציה שיכול לעכב את הכריכה של נוגדן כדי אפיטופ 15.
את epitope 6-mer, 196 NVSVLC 201 </ Sub>, יש תכונות הידרופובי מאוד, עם ארבע שאריות הידרופובי, כולל שני valines (197 ו -199), לאוצין אחד (200), ו ציסטאין אחד (201) (מצומצם). שאריות V197, V199, ו C201 הם קריטיים להכרת מב RG-M56 ומחייב, כפי שנקבע על ידי mutagenesis סריקת אלאנין. האזור epitope ששכן באחד שמונה נגד במקביל β-גדילי של תחום פגז (S-מושלם) של חלבון מעיל NNV 16. מעניין לציין, כי epitope אינו מופיע על תחום בליטה החוצה, אבל מסתיר במבנה ג'לי רול של S-מושלם תחת אנטי במקביל β-גדילי אחרים. את epitope, עם הידרופוביות גבוהה, עשוי לקבל microenvironment יציבה יותר בדיכאון זה. יתר על כן, הפפטיד 195 VNVSVLCR 202 3 של epitope זה נמצא לעכב את ההתפשטות של הנגיף נימק ענק לוקוס עצבים בתאי מוח לוקוס. לכן, פפטיד epitope זה הוצע להיות שותףmpetitor המעורבים תחום קולטן מחייב הנדרשים לשם כניסה ויראלי 3. זה היה שיערותיו כי מעכבי כניסת פפטיד המורכבת שאריות הידרופובי ו / או amphipathic יכול לשנות את הקונפורמציה וכימיה הפיזיות של ממשקים הממברנה תאיים והוא יכול לעכב את ההיתוך של ממברנות הסלולר ויראלי 17. יתר על כן, מעכבי כניסת פפטיד סינטטי רבים הוכיחו נכסים בולמים חזקים מול הדבקה בוירוסים שונה 17, 18. לפיכך, הפפטיד epitope המזוהה עם שאריות הידרופובי ועיכוב כניסה חזק נגד זיהום NNV עשוי להקל על הפיתוח של תרופות פפטיד טיפוליות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hybrid-SFM medium | Gibco | 12045-076 | |
| Dulbeccos's Phophate-Buffered Saline (PBS) | Gibco | 21600-069 | |
| Pfu DNA Polymerase | Thermo Scientific | EP0502 | Including buffers |
| T4 DNA Ligase | Roche | 10799009001 | Including buffers |
| NdeI | New England Biolabs | R0111S | Including buffers |
| XhoI | New England Biolabs | R0146S | Including buffers |
| pET-20b(+) vector | Novagen, Merck Millipore | 69739 | |
| E. coli DH-5α competent cell | RBC Bioscience | RH617 | |
| E. coli BL-21(DE3) competent cell | RBC Bioscience | RH217 | |
| Ampicillin | Amresco | 0339-25G | |
| LB broth | Invitrongen | 12780-052 | |
| Isopropylthio-β-D-thiogalactoside (IPTG) | MDBio, Inc. | 101-367-93-1 | |
| Methanol | Merck Millipore | 106009 | |
| Polyoxyethylene 20 Sorbitan Monolaurate (Tween-20) | J.T.Baker | X251-07 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | |
| Glycine | Amresco | 0167-5KG | |
| Tris | Affymetrix, USB | 75825 | |
| NaCl | Amresco | 0241-1KG | |
| EDTA | Amresco | 0105-1KG | |
| Glycerol | Amresco | 0854-1L | |
| NaN3 | Sigma | S2002-500G | |
| BCIP/NBT | PerkinElmer | NEL937001PK | |
| Goat Anti-Mouse IgG, Fc fragment antibody | Jackson ImmunoResearch | 115-055-008 | |
| Immobilon-P (Polyvinylidene fluoride, PVDF) | Merck Millipore | IPVH00010 | |
| Protein G Agarose Fast Flow | Merck Millipore | 16-266 | |
| QIAquick PCR Purification kit | Qiagen | 28106 | |
| UVP BioSpectrum 600 Image System | UVP | n/a | |
| VisionWorks LS Analysis Software Ver 6.8 | UVP | n/a | |
| MyCycler thermal cycler | BioRad | 1709713 |
References
- Milstein, C., Kohler, G. Clonal variations of myelomatous cells (proceedings). Minerva Med. 68 (50), 3453 (1977).
- Lai, Y. S., et al. In vitro neutralization by monoclonal antibodies against yellow grouper nervous necrosis virus (YGNNV) and immunolocalization of virus infection in yellow grouper Epinephelus awoara (Temminck & Schlegel). J Fish Dis. 24 (4), 237-244 (2001).
- Chen, C. W., Wu, M. S., Huang, Y. J., Cheng, C. A., Chang, C. Y. Recognition of Linear B-Cell Epitope of Betanodavirus Coat Protein by RG-M18 Neutralizing mAB Inhibits Giant Grouper Nervous Necrosis Virus (GGNNV) Infection. PLoS One. 10 (5), 0126121 (2015).
- Lai, Y. -S., et al. Propagation of yellow grouper nervous necrosis virus (YGNNV) in a new nodavirus-susceptible cell line from yellow grouper, Epinephelus awoara (Temminck & Schlegel), brain tissue. J Fish Dis. 24 (5), 299-309 (2001).
- Lougee, E., Morjaria, S., Shaw, O., Collins, R., Vaughan, R. A new approach to HLA typing designed for solid organ transplantation: epityping and its application to the HLA-A locus. Int J Immunogenet. 40 (6), 445-452 (2013).
- Radulovich, N., Leung, L., Tsao, M. S. Modified gateway system for double shRNA expression and Cre/lox based gene expression. BMC Biotechnol. 11, 24 (2011).
- Froger, A., Hall, J. E. Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. J Vis Exp. (6), e253 (2007).
- Pronobis, M. I., Deuitch, N., Peifer, M. The Miraprep: A Protocol that Uses a Miniprep Kit and Provides Maxiprep Yields. PLoS One. 11 (8), e0160509 (2016).
- Metzker, M. L.
- Chiu, C. C., John, J. A., Hseu, T. H., Chang, C. Y. Expression of ayu (Plecoglossus altivelis) Pit-1 in Escherichia coli: its purification and immunohistochemical detection using monoclonal antibody. Protein Expr Purif. 24 (2), 292-301 (2002).
- Atassi, M. Z. Antigenic structures of proteins. Their determination has revealed important aspects of immune recognition and generated strategies for synthetic mimicking of protein binding sites. Eur J Biochem. 145 (1), 1-20 (1984).
- Opuni, K. F., et al.
- Chang, C. Y., Chiu, C. C., Christopher John, J. A. The Aquaculture of Groupers. Liao, I. C., Leaño, E. M. , Taiwan Asian Fisheries Society, World Aquaculture Society, The Fisheries Society of Taiwan, National Taiwan Ocean University, Taiwan Press. 207-224 (2008).
- Conti-Tronconi, B. M., et al. Alpha-bungarotoxin and the competing antibody WF6 interact with different amino acids within the same cholinergic subsite. Biochemistry. 30 (10), 2575-2584 (1991).
- Briggs, S., Price, M. R., Tendler, S. J. Fine specificity of antibody recognition of carcinoma-associated epithelial mucins: antibody binding to synthetic peptide epitopes. Eur J Cancer. 29 (2), 230-237 (1993).
- Chen, N. C., et al. Crystal Structures of a Piscine Betanodavirus: Mechanisms of Capsid Assembly and Viral Infection. PLoS Pathog. 11 (10), e1005203 (2015).
- Badani, H., Garry, R. F., Wimley, W. C. Peptide entry inhibitors of enveloped viruses: The importance of interfacial hydrophobicity. Biochim Biophys Acta. , (2014).
- Qureshi, N. M., Coy, D. H., Garry, R. F., Henderson, L. A. Characterization of a putative cellular receptor for HIV-1 transmembrane glycoprotein using synthetic peptides. AIDS. 4 (6), 553-558 (1990).
