Abstract
Identifieringen av en antigenepitop av immunsystemet gör det möjligt för förståelsen av skyddsmekanism av neutraliserande antikroppar som kan underlätta utvecklingen av vacciner och peptidläkemedel. Peptid scanning är en enkel och effektiv metod att rättframt kartor den linjära epitop som igenkännes av en monoklonal antikropp (mAb). Här presenterar författarna en epitop bestämningsmetod som involverar serie stympade rekombinanta proteiner, syntetisk peptid design och dot-blot-hybridisering för antigen erkännande av nervös necrosis virus coat protein med användning av en neutraliserande mAb. Denna teknik förlitar sig på dot-blot-hybridisering av syntetiska peptider och mAbs på en polyvinylidenfluorid (PVDF) membran. Den minsta antigena regionen av ett viralt höljeprotein som känns igen av den RG-M56 mAb kan inskränkas för steg-för-steg trimmas peptidkartläggning på en 6-mer-peptid-epitopen. Dessutom, mutagenes och återstoden alaninscanning subkonstitution kan utföras för att karaktärisera bindningen betydelsen av varje aminosyrarest som utgör epitopen. Resterna flankerar epitopen platsen konstaterades att spela kritiska roller i peptidkonforma reglering. Den identifierade epitopen peptiden kan användas för att bilda kristaller av epitoppeptiden-antikroppskomplex för en röntgendiffraktion studien och funktionell konkurrens, eller för terapeutika.
Introduction
I immunsystemet, tillåter rekombinationen av V-, D-, och J-segment för antikroppar för att skapa enorma variationer av komplementaritetsbestämmande regioner (CDR) för bindning till olika antigener för att skydda värden från patogen infektion. Den neutraliserande försvar av antikroppar mot antigener beror på den rumsliga komplementaritet mellan de CDR av antikropparna och de epitoper av antigenerna. Därför kommer en förståelse av denna molekylär interaktion hjälpa profylaktiskt vaccin design och terapeutiska peptiden läkemedelsutveckling. Emellertid kan denna neutralisation växelverkan påverkas både genom multipla antigena domäner från en enda antigen och genom multipla CDRs av antikroppar, vilket följaktligen gör epitopen bestämningsprocessen mer komplex. Lyckligtvis möjliggör en ständigt dividera sats av celler till sek utveckling av hybridom-teknik, som säkringar individuella antikroppsproducerande celler med myelomceller,rete en specifik antikropp, känd som en monoklonal antikropp (mAb) 1. Hybridomceller producerar dessa rena, med hög affinitet mAbs att binda till ett enda antigent domänen av ett specifikt antigen. I förhållandet mellan antigen-antikropps etablerad, flera tillvägagångssätt, inklusive peptid skanning, kan användas för att bestämma epitopen av ett antigen med användning av dess motsvarande mAb. Den senaste utvecklingen inom syntetisk peptid teknik har gjort peptid scanning tekniken mer tillgänglig och enklare att utföra. I korthet är en uppsättning av överlappande syntetiska peptider som framställts i enlighet med en målantigen-sekvens och är associerade till en fast-uppburen membran för mAb hybridisering. Peptid scanning erbjuder inte bara ett enkelt sätt att kartlägga den antikroppsbindande regionen, utan underlättar också aminosyra (aa) mutagenes genom rest scanning eller substitution för att utvärdera bindningsväxelverkan mellan varje aa rest av epitopen peptiden och CDR av antikroppen.
2, 3, 4. Protokollet innehåller mAb förberedelse, konstruktion och uttryck av serie stympade rekombinanta proteiner, syntetiska överlappande peptid design, dot-blot-hybridisering, alaninavsökning och substitutionsmutagenes. Med tanke på de höga kostnaderna för peptidsyntes, var steget att seriellt trunkera de rekombinanta proteiner av ett önskat målprotein modifieras och den antigena regionen minskat ner till omkring 100 till 200 aa-rester innan den syntetiska peptiden array dot-blot-analys utfördes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Framställning av monoklonal antikropp
- Kultur de RG-M56 musmonoklonala hybridomceller 2 i serumfritt medium i 175T-kolvar vid 37 ° C med 5% CO2 tillägg. Samla supernatanten när färgen på mediet blir gult efter fem dagars inkubation.
OBS: Hybridomceller odlades i serumfritt medium för att undvika antikropps kontamination från fetalt bovint serum. - Centrifugera supernatanten vid 4500 xg under 30 min vid 4 ° C och kasta celldebris pellet.
- Tillsätt 2 ml av protein G agaros (levereras som en 50% slurry) till en 5 ml kolonn och jämvikt med 10 harts volymer (10 ml) iskall PBS.
- Belastning 200 ml av antikropps supernatanten (steg 1,2) på kolonnen och kassera genomslaget.
- Tillsätt 10 ml iskall PBS till kolonnen för att tvätta den. Upprepa två gånger.
- Tillsätt 10 ml 50 mM glycin, pH 2,7 till kolonnen för att eluera protein G-associerade antikroppen. collect 900 mikroliter-fraktioner i ett mikrocentrifugrör innehållande 100 | il av 10 x neutraliseringsbuffert (1 M Tris, 1,5 M NaCl och 1 mM EDTA, pH 8,0).
- Lagra den renade antikroppen i 50% glycerol med 0,03% NaN3 vid -20 ° C.
2. Konstruktion och uttryck av serie Stympade rekombinanta proteiner
- Förbered en PCR-reaktionsblandning: 5 mikroliter av 10x Pfu-buffert, 0,2 mM av varje dNTP, 0,2 ^ M framåt primer 3, 0,2 ^ M omvänd primer 3, 2 mM MgSO 4, 1 ng pET20b-1A59 tre plasmid-DNA, och 2,5 U ( enhet) av Pfu-DNA-polymeras; lägga DDH 2 O till en slutlig volym av 50 mikroliter.
- Kör prover i en automatisk termocyklern med hjälp av följande parametrar: Cykel 1 (94 ° C under 5 min); cykler 2-36 (94 ° C i 30 s, 63 ° C under 30 s och 72 ° C under 60 s); och cykel 37 (72 ° C i 7 min).
- Extrahera polymeraskedjereaktion (PCR) produkter genom att använda en PCR-reningskit 5 för att underlätta följande restriktionsenzymdigerering.
- Smälta den PCR-amplifierade DNA-fragmenten med Nde I och Xho I-restriktionsenzymer och ligera var och en av dessa DNA-fragment i Ndel och Xhol-enzym-kluven pET-20b (+) vektor. Omvandla konstruktionerna i Escherichia coli DH-5a kompetenta celler 6.
- Förbereda uppslutningsblandningen i digereringsbuffert (20 mM Tris-acetat, 10 mM Mg (CH3COO) 2, 50 mM KCH 3 COO, och 1 mM DTT, pH 7,9) med 1 | ig av PCR-amplifierat DNA eller pET-20b (+) vektor-DNA, och två U av Nde i och Xho i-restriktionsenzymer i en slutvolym av 20 mikroliter.
- Blanda matsmältningen blandning försiktigt och snabbt spinn ner. Inkubera vid 37 ° C under 2 timmar i en torr bad att garantera fullständig skärning av begränsningen sittaes.
- Extrahera restriktionsenzymdigere DNA-fragment med användning av en PCR-reningskit 5 för att underlätta följande plasmidkonstruktion.
- Förbereda ligeringsblandningen i ligeringsbuffert (66 mM Tris, 5 mM MgCl2, 1 mM ATP och 5 mM DTT, pH 7,5) med 100 ng av predigested, PCR-amplifierat DNA, 10 ng av predigested pET-20b (+) vektor-DNA, och 5 U av T4 DNA-ligas i en slutlig volym av 10 mikroliter.
- Blanda ligeringsblandningen försiktigt och snabbt spinn ner. Inkubera vid 16 ° C under 18 h i ett vattenbad.
- Sätt 10 mikroliter av ligation prover i 100 mikroliter av DH-5α-kompetenta celler och blanda försiktigt innan du placerar mikrocentrifugrör på is under 30 minuter. Sätt mikrocentrifugrör i en torr bad vid 42 ° C under 90 s för att inducera värmechock 7. Överför omedelbart röret på is under 2 min.
- Lägg 900 mikroliter av Luria-Bertani (LB) buljong (1% Bacto trypton, 0,5% Bacto jäst extract, och 0,5% NaCl, pH 7,0) till röret. Inkubera vid 37 ° C med 150 rpm skakning under 45 min. Pelletera cellerna genom centrifugering vid 4000 x g under 10 min och kasta bort supernatanten.
- Resuspendera pelleten med 50 mikroliter av LB-buljong och sprids varje transformation på förvärmda LB-plattor innehållande 100 ug / ml ampicillin. Inkubera plattorna vid 37 ° C under 16 h.
- Plocka upp en enda koloni med hjälp av en 200 mikroliter spets och placera den i 3 ml LB-buljong innehållande 100 mikrogram / ml ampicillin i en löst tak 15 ml rör. Inkubera vid 37 ° C med 150 rpm skakning i 12 timmar.
- Extrahera plasmid DNA åtta från varje kultur och sekvensera den med T7-promotor och T7 terminator-primers för att bekräfta sekvensen 9.
- Efter sekvensbekräftelse, omvandla 10 ng av DNA från dessa pET-20b (+) plasmider med varierande längder av YGNNV coat prote i BL-21 (DE3) stam av E. coli av ossing värmechock metod 7. Följ steg 2.3.6-2.3.8 att utföra omvandlingen.
- Överföra en enda koloni från varje transformerad E. coli BL-21 cellen i 3 ml LB-buljong innehållande 100 | ig / ml ampicillin i en löst capped 15 ml rör. Inkubera kulturen vid 37 ° C med 150 rpm skakning.
- Kyla kulturen till 25 ° C när OD 600 av kulturen är ca 0,6 och tillsätt IPTG till en slutkoncentration av 0,4 mM för att inducera uttrycket av det rekombinanta proteinet. Inkubera kulturen för en extra fyra timmar vid 25 ° C med 200 rpm skakning.
- Överföra en ml av kulturen in i ett mikrocentrifugrör. Pelletera cellerna genom centrifugering vid 12.000 xg i 1 min och kasta bort supernatanten.
- Resuspendera cellpelleten i 100 mikroliter av denatureringsbuffert (8 M urea, 20 mM natriumfosfat och 0,5 M NaCl, pH 7,4) genom att pipettera upp och ned med en mikropipett. Blanda genom kraftig virvelbildning.
OBS: Prov solutions bör nu vara halvtransparent, lite klibbigt, och redo för dot-blot-hybridiseringsanalys.
3. Design och syntes av överlappande peptider
- Design och syntetisera 3 seriella 20-mer-peptider som var och en överlappar dess efterföljare med 10 aa rester från 195 till 338 aa regionen av YGNNV coat protein för att begränsa den epitop regionen RG-M56 mAb genom dot blotting.
- Design och syntetisera tre tre 8-mer-peptider (195 VNVSVLCR 202, 197 VSVLCRWS 204 och 199 VLCRWSVR 206) med en överlappning av 6 aa rester till nästa syntetisk peptid för att begränsa epitopen regionen 195-206 aa genom dot blotting.
- Design och syntetisera 3 7-mer (196 NVSVLCR 202 och 195 VNVSVLC 201), 6-mer (195 VNVSVL 200, 196 NVSVLC 201, och en97 VSVLCR 202), och 5-mer-peptider (195 VNVSV 199, 196 NVSVL 200, 197 VSVLC 201, och 198 SVLCR 202) med en överlappning av 6, 5, och 4 aa-rester, respektive, på deras grann peptider för att minimera epitopregionen genom dot-blotting.
4. Dot-blot-hybridisering
- Upplösa varje syntetiserad peptid i dimetylsulfoxid (DMSO) till en slutlig koncentration av 10 mg / ml.
OBS: För att övervinna den varierande lösligheten av syntetiska peptider, bör samtliga syntetiska peptider upplösas i DMSO. DMSO är ett bra lösningsmedel för att fullständigt lösa hydrofoba eller hydrofila peptider. - Blötlägg polyvinylidenfluorid (PVDF) membran med metanol under 2 min.
OBS: PVDF-membran är upp till 100% beständig mot DMSO; andra kan inte vara så. - Jämvikta PVDF-membranet med modifierad Towbin-buffert (25 mM Tris, 192 mM glycin och 0,1% SDS, pH 8,3) för2 min.
OBS: 10-20% (volym / volym) metanol kan tillsättas till modifierade Towbin-buffert för att förbättra överföringsresultat. - Skölj en bit kromatografi papper med den modifierade Towbin-buffert. Placera PVDF membran på kromatografi papper. Vänta tills den modifierade Towbin-buffert har försvunnit från PVDF membranytan innan du fortsätter till nästa steg.
- Tillsätt 2 mikroliter av varje peptid prov till membranet med en 10 mikroliter spets. Lufttorka PVDF-membranet på kromatografi papper för 10 min. Lägg varje peptid prov långsamt och gradvis på membranet för att undvika alltför mycket diffusion.
- Blockera membranet i TBST-buffert (0,05% (volym / volym) Tween-20, 20 mM Tris, och 150 mM NaCl, pH 7,4) med 5% fettfri mjölk under 30 min vid rumstemperatur med försiktig skakning.
- Lägga RG-M56 mAb vid en slutlig spädning av 1: 1000 i TBST-buffert med 5% fettfri mjölk till membranet. Inkubera membranet vid 37 ° C i 1 h med försiktig skakning.
- Ta bort antikroppen sålution. Tvätta membranet i TBST-buffert under 5 min med försiktig skakning. Upprepa två gånger.
- Lägga till den sekundära antikroppen (get-anti-mus-IgG, Fc, konjugerat alkaliskt fosfatas) vid en slutlig spädning av 1: 5000 i TBST-buffert med 5% fettfri mjölk till membranet. Inkubera membranet vid 37 ° C i 1 h med försiktig skakning.
- Kassera antikropplösningen. Tvätta membranet i TBST-buffert under 5 min med försiktig skakning. Upprepa tvättsteg två gånger.
- Utveckla membranet med BCIP / NBT-substratlösning vid rumstemperatur under 15 min i mörker. Stoppa utveckla genom att tvätta membranet med DDH 2 O när signalen visas.
- Lufttorka membranet och fånga dot-blot-bilden med hjälp av ett bildsystem.
- Mäta intensiteten av varje dot blot med hjälp av bildanalys programvara 3.
5. alaninscanning och Substitution
- Utforma och syntetisera tre alanin och methiOnine substitutionspeptider. Byt varje aa rest med alanin för 8-mer-peptid 195 VNVSVLCR 202 och syntetisera peptider 195 ANVSVLCR 202, 195 VAVSVLCR 202, 195 VNASVLCR 202, 195 VNVAVLCR 202, 195 VNVSALCR 202, 195 VNVSVACR 202, 195 VNVSVLAR 202 och 195 VNVSVLCA 202 . Byt aa rester leucin 200 till metionin för att skapa SJNNV genotyp epitoppeptiden 195 VNVSVMCR 202.
- Följ avsnitt 4 för att utföra alaninscanning och substitutionsmutagenes dot blotting.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Målet med detta experiment var att identifiera en epitop genom punktblotting med hjälp av mAb. Att snabbt och effektivt begränsa den antigena regionen som känns igen av mAb, var av full längd och i serie stympade YGNNV rekombinant höljesproteiner med en 6xHis-fusions tagg vid C-terminus som uttrycks från en E. coli-PET-expressionssystemet 10 (Figur 1A). De resulterande rekombinanta proteiner sågs på PVDF-membranet med hjälp av RG-M56 mAb och anti-6xHis antikropp för dot-blot-hybridisering. Dot blotting avslöjade positiva signaler mot 1-338 aa (fullängd), 51-338 aa, och 195-338 aa, men inte 1-100 aa eller 1-200 aa rekombinanta proteiner (Figur 1B). Punktuppsättningen hybridiserade mot anti-6xHis antikropp och bekräftade uttrycket av alla rekombinanta proteiner. Dessa data tyder på att epitopen av RG-M56 mAb erkännande ligger i en 144-aa rekombinant protein near C-terminalen av YGNNV höljeprotein (195-338 aa).
Därefter, seriella 20-mer-peptider med 10 aa-rester lång lappar på sin granne utformades och syntetiserades från sekvensen av 144-aa rekombinanta proteinet för peptid scanning för att begränsa epitopen regionen. Dessa syntetiska peptider sågs på ett PVDF-membran och utsattes för dot-blot-hybridisering med användning av RG-M56 mAb. Resultatet visade positiva signaler endast på peptiden 195-214 aa och den positiva kontrollen, 195-338 aa rekombinant protein (Figur 2A). Som epitopen är belägen inom peptiden 195-214 aa region men inte peptiden 205-224 aa region, tre seriella 8-mer-peptider med 6-aa-rester överlappar från aa rest 195-206 (peptiderna 195-202 aa, 197- 204 aa, och 199-206 aa) utformades och syntetiserades. Dot-blot-hybridisering Resultaten visade positiva signaler på peptiden 195-202 aa och den positiva-kontrollpeptiden 195-214 aa använderRG-M56 mAb (Figur 2B).
Alaninscanning och substitutionsmutagenes utfördes för att utvärdera specificiteten av varje aa rester av 8-mer-epitopen, 195 VNVSVLCR 202. Varje aa rester av 8-mer peptid individuellt ersattes med alanin. Alanin mutation peptiduppställningen placerades sedan på ett PVDF-membran med användning av peptid 195-202 aa som en positiv kontroll. Dot-blot-analys visade att de tre ersätter mutationer V197A, V199A, och C201A, avskaffade bindningsaffiniteten för RG-M56 mAb (figur 3A). Även om aa rest 200 i SJNNV genotypen epitop är metionin, i motsats till en leucin i de övriga fyra Betanodavirus genotyp epitoper, den SJNNV genotypen sekvensen, 195 VNVSVMCR 202, visade positiv bindningsaffinitet mot RG-M56 mAb, liksom den hos den positiva kontrollen (figur 3A). Detta resultat indikerar att epitoperna of alla Betanodavirus genotyper kan igenkännas av RG-M56 mAb. Bindningsaffiniteten för varje aa rest deltar till epitopen stället vidare kvantifieras genom att mäta signalstyrkan i dot blot av varje alaninsubstitution med hjälp av bildanalysmjukvara (figur 3B). Intensiteterna hos de V197A, V199A, och C201A substitutioner minskade till 10,2%, 18,6% och 8,5%, respektive, i jämförelse med de för den positiva kontrollen (100%), under det att V195A, S198A, L200A, R202A, och L200M substitutioner uppvisade högre eller liknande intensiteter som den för den positiva kontrollen. Det är värt att notera att påverkans styrkan i N196A substitutionen är tvetydigt, med en minskning av den positiva kontrollen 37,4%. Dessa resultat tyder på att V197, V199, och C201 är viktiga rester för bindningen av RG-M56 mAb.
De alanin scanning mutagenes resultat visar att aa resterna V195, N196, och R202 kanersättas med alanin, vilket innebär att epitopen regionen skulle kunna vara ytterligare minskat ner vid båda ändar. Därför är den steg-för-steg trimmas peptidkartläggning genom 7-mer, 6-mer, och 5-mer syntetiska peptider steg var utformad för att minimera den antigena regionen. Den positiva signalen var närvarande på 6-mer syntetisk peptid 196 NVSVLC 201, men inte på de 7-mer och 5-mer syntetiska peptider (Figur 4). Dessa data indikerar att den minimala epitopen hos NNV höljeprotein som känns igen av RG-M56 mAb är ett 6-mer-peptid, 196 NVSVLC 201.
Figur 1: Minskning av epitopregionen använder seriellt stympade rekombinanta proteiner och monoklonala antikroppen. (A) Karta över serie stympade rekombinanta NNVCPs. NNVCP 1-338 aa är fullängdshöljesprotein. (B) Dot-blot-analys av rekombinanta NNVCPs. Vänster: Karta över de serietrunkerade YGNNV rekombinanta höljeproteiner på PVDF-membranet. USA: Dot-blot-analys utfördes med användning av anti-6xHis-antikropp. Höger: dot-blot-analys utfördes med användning av RG-M56 mAb. NNVCP: nervös necrosis virus coat protein; aa: aminosyra; PVDF: polyvinylidenfluorid; N: N-änden; C: C-terminalen; mAb: monoklonal antikropp. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Fine kartläggning av epitopen regionen med användning av syntetiska peptider. (A) Vänster: Aminosyrasekvenser av 20-mer syntetiska peptider anpassas till NNVCP 195-338 aa; varje föregående peptiden hade en 10 aa-rester lång överlappning med följande peptid. Höger: Karta över synthetic peptider på PVDF-membranet. Rekombinant NNVCP 195-338 aa användes som en positiv kontroll. Dot-blot-analys utfördes med användning av RG-M56 mAb. (B) Vänster: aminosyrasekvenserna för de 8-mer syntetiska peptider, 195-202 aa, 197-204 aa, och 199-206 aa; varje föregående peptiden hade en 6 aa-rester lång överlappning med följande peptid. Syntetisk peptid 195-214 aa användes som en positiv kontroll. Höger: dot-blot-analys utfördes med användning av RG-M56 mAb. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: alanin scanning och substitutionsmutagenes av 195 VNVSVLCR 202 epitop. (A) Aminosyrasekvenser av substitutionsmutagenes och dot-blot-analys. Varje aa residue av epitopen regionen 195-202 aa, ersattes individuellt med alanin. L200M substitution är den SJNNV genotypen sekvensen vid Betanodavirus höljeprotein epitop regionen. Syntetisk peptid 195-202 aa användes som en positiv kontroll. De utbytta aa rester är understrukna. (B) Kvantifiering av dot blot-signalen bindningsaffinitet. Signalintensiteten av den positiva kontrollen (195-202 aa) bestämdes som 100%. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Minst epitop bestämning. Den 7-mer (A), 6-mer (B), och 5-mer (C) syntetiska peptider 195-202 aa användes för att identifiera den minimala epitopen som känns igen av RG-M56 mAb. syntetiska peptide 195-202 aa användes som en positiv kontroll. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta protokoll ger en snabb och enkel teknik för att identifiera en mAb erkända linjär epitop. Med hänsyn till kostnaden för peptidsyntes och produktionseffektiviteten för syntetisera peptider, var den antigena regionen av virushöljeproteinet reduceras genom att uttrycka seriellt stympade rekombinanta proteiner före peptidavsökningsanalys. Som sådan var den pålitliga och effektiva E.coli pET-expressionssystem som används för att producera dessa seriellt stympade rekombinanta proteiner, såsom rekombinanta proteiner med molekylvikter mellan 10 till 50 kDa lätt kan uttryckas genom detta system. På detta sätt, kan epitopen vara lätt minskat ner till en mer hanterbar 100 till 200 aa region. PET-20b (+) vektor var specifikt valts, eftersom den innehåller en sekvens som kodar för expression av 6xHis-taggar, vilket gör att de producerade 6xHis-tag-fusionsproteiner som skall immunodetected användning av en anti-6xHis-antikropp för att bekräfta expressionen av rekombinant proteins. De producerade rekombinanta höljeproteiner analyserades med hjälp RG-M56 mAb via en dot-blot-hybridiseringsanalys. En alternativ metod för rekombinant protein epitop bestämningen är att rena de uttryckta rekombinanta proteinerna via immobiliserad metalljon-affinitetskromatografi 10, separera de rekombinanta proteinerna med SDS-polyakrylamidgelelektrofores, och utför Western blot-analys 3.
För att ytterligare och mer fint mappa epitop lokalisering bestäms av resultaten av dot-blot-hybridiseringsanalys med användning av seriellt stympade rekombinanta proteiner, var överlappande syntetiska peptider med olika storlekar utformade. Bland de olika möjliga längder av syntetisk peptid att syntetisera 20-mer med 10 aa-rester långa överlappande peptider valdes först i peptid scanning, både för sin höga syntes renhet (cirka 90%) och för deras peptidlängd, tillräckligt för sökandet efter den kontinuerliga epitope känns igen av B-cellantikropp 11. Observera att noggrannheten och renheten hos syntetiserade peptider försämras som den syntetiserade peptiden är längre. På detta sätt, var epitopregionen snabbt reduceras till omkring 10 aa-rester i längd. Efter serie 8-mer överlappande peptider undersöktes, var det linjära epitopregionen definieras peptid 195-202 aa. Därefter alaninavsökning av denna 8-mer-epitop-peptid avslöjar den kritiska bindningsaffinitet styrkan hos varje aa rest, vilket gör sökandet efter den minimala epitopen. De väsentliga roller V197, V199, och C201 aa rester innebär att den linjära epitopen region omfattar minst 5 aa rester från 197 till 201. Dessutom kan aa rester V195, N196, och R202 ersättas med alanin utan att helt förlora bindning affinitet, vilket indikerar att epitopen regionen kan reduceras till 7, 6, eller till och med 5 aa rester i längd. Små peptidsekvenser kan lätt och ekonomiskt syntetiseras för sökningen av linjära (samen fortlöpande) epitoper. Detta är dock syntetisk peptid scanning teknik inte lämplig för bestämning av en diskontinuerlig epitop av en antikropp, om den inte kombineras med epitop excision och masspektrometrisk analys 12.
I detta protokoll var en dot-blot-hybridisering teknik som används för att söka den linjära epitop av en mAb. Dot-blot-hybridisering är en enkel men effektiv metod. I början av sökningen, när epitopregionen är minskat ner från en storskalig landskap, är det största problemet att observera antingen en positiv eller negativ signal efter hybridisering av antikroppen till en mål-membranbundet protein, eftersom de flesta mAbs endast binda till en specifik epitop av ett antigent protein (fig 1 och 2). Men när man använder dot-blot-hybridisering för att undersöka bindningen tillgängligheten för respektive aa rest inom epitopregionen mot antikroppen, såsom genom alaninsubstitution mutagenes,signalstyrkan i varje substituerad aa återstoden bestäms av dot blotting bör vägas in i den totala bindande betydelse. Att signalintensiteten kan kvantifieras enkelt med hjälp av bildanalysmjukvara (Figur 3B) eller en densitometer. Alternativt kan en enzymkopplad immuno-sorbent analys (ELISA) utföras för att kvantifiera graden av bindningsaffinitet och den resulterande signalstyrkan 3.
I den tidigare studien, den enda höljeproteinet av icke-höljes nervösa necrosis virus var immun igen av 10 mAb med en hög neutralisation indexvärde mellan 6,5-4,5 (log 10 NI) 2. Den mycket specifika igenkännings förmåga mAb vidare användas för utveckling av ett steg, snabb immunokromatografisk diagnostiskt kit för detektion av NNV-infekterade fisk 13. Den antigenepitop av nervös necrosis virus coat protein erkändes av RG-M18mAb som en 8-mer-peptid, 195 VNVSVLCR 202 3, genom vilken en ny NNV receptor identifierades (opublicerade data). I den aktuella studien var epitopen nervös necrosis virus coat protein ytterligare minskat ner till en 6-mer-peptid, 196 NVSVLC 201, av den andra mAb, RG-M56.
Det är oväntat att två 7-mer-peptider (196 NVSVLCR 202 och 195 VNVSVLC 201) innehållande 6-mer-peptid 196 NVSVLC 201 inte erkänns av RG-M56 mAb (figur 4A). En rimlig tolkning är att även om de omgivande resterna V195 och R202 kan inte direkt bidra till det bindande interaktionen mellan epitopen och antikroppen, de flankerande resterna påverkar bildandet av den korrekta peptiden konforma för antikroppsigenkänning. Utseendet på V195 eller R202 vid sina flankerande terminalen ensam kan contort den syntetiska peptidenkonforma för antikroppsigenkänning och bindning. Epitopen konforma drivs av styrkan i båda ändarna, V195 och R202, som är balanserad mot varandra i 8-mer syntetisk peptid, 195 VNVSVLCR 202, och motverkas i 6-mer syntetisk peptid, 196 NVSVLC 201. AA rester, V195, N196, och R202, kan individuellt ersättas med alanin utan att helt förlora bindningsförmåga, och därmed alanin scanning mutagenes resultat indikerar att dessa tre aa rester inte kan spela en viktig roll i igenkänning och bindning av RG -M56 mAb. Men efter trimning en mer rester från 6-mer syntetisk peptid, 196 NVSVLC 201, 5-mer-peptid, 197 VSVLC 201, utan N196 i N-terminal flankerande regionen, förlorar förmågan att kännas igen och bindas av RG -M56 mAb (figur 4C). Detta resultat tyder på att N196 rest också kan pläggs en viktig roll i den flankerande regionen av epitopen för att stabilisera den korrekta epitopen konformation i syfte att underlätta igenkänning och bindning av RG-M56 mAb. Vikten av flankerande rester som omger epitopen regionen hade också utforskats av andra antigen-antikroppsbindningsstudier. Betydelsen av flankerande aa-rester som omger α-bungarotoxin epitop region för bindning av antikroppar undersöktes med användning av olika aa substitutioner inom samma kolinerg underwebbplatsen. De utvärderades därefter antingen nödvändigt, inflytelserik, eller inte inflytelserika 14. Det konstaterades också att specificiteten av antikroppen erkända epitop av karcinom-associerat epiteliala muciner kan ytterligare påverkas av de flankerande aa-rester. Dessa effekter kan presentera konformationella hinder som kan hämma bindningen av en antikropp till en epitop 15.
Den 6-mer-epitopen, 196 NVSVLC 201 </ Sub>, har extremt hydrofoba funktioner, med fyra hydrofoba rester, inklusive två Valines (197 och 199), en leucin (200), och ett cystein (201) (reducerad form). Rester V197, V199, och C201 är avgörande för RG-M56 mAb igenkänning och bindning, som bestämdes genom alaninscanning-mutagenes. Epitopen regionen belägen på en av åtta anti-parallella p-strängar i skalet domän (S-domänen) i NNV höljesproteinet 16. Intressant nog inte epitopen inte visas på utsidan utskjutande domän, men gömmer sig i jelly-roll struktur S-domänen under andra anti-parallella p-strängar. Epitopen, med dess höga hydrofobicitet, kan erhålla en stabilare mikromiljön i denna fördjupning. Dessutom var 195 VNVSVLCR 202 3 peptiden enligt denna epitop visade sig hindra förökning av den gigantiska grouper nervösa necrosis virus i grouper hjärnceller. Därför var detta epitoppeptiden föreslagits vara en competitor inblandad i receptorbindande domänen som erfordras för viralt inträde 3. Det antogs att peptid inträdeshämmare innefattar hydrofoba och / eller amfipatiska rester kan förändra fysiska konformation och kemi cellmembranet gränssnitt och kan hämma fusion av cellulära och virala membranen 17. Dessutom har många syntetiska peptidinträdeshämmare visat starka hämmande egenskaper mot olika virusinfektioner 17, 18. Således kan den identifierade epitoppeptiden med hydrofoba rester och starkt inträde inhibition mot NNV infektion underlätta utveckling av terapeutiska peptidläkemedel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hybrid-SFM medium | Gibco | 12045-076 | |
| Dulbeccos's Phophate-Buffered Saline (PBS) | Gibco | 21600-069 | |
| Pfu DNA Polymerase | Thermo Scientific | EP0502 | Including buffers |
| T4 DNA Ligase | Roche | 10799009001 | Including buffers |
| NdeI | New England Biolabs | R0111S | Including buffers |
| XhoI | New England Biolabs | R0146S | Including buffers |
| pET-20b(+) vector | Novagen, Merck Millipore | 69739 | |
| E. coli DH-5α competent cell | RBC Bioscience | RH617 | |
| E. coli BL-21(DE3) competent cell | RBC Bioscience | RH217 | |
| Ampicillin | Amresco | 0339-25G | |
| LB broth | Invitrongen | 12780-052 | |
| Isopropylthio-β-D-thiogalactoside (IPTG) | MDBio, Inc. | 101-367-93-1 | |
| Methanol | Merck Millipore | 106009 | |
| Polyoxyethylene 20 Sorbitan Monolaurate (Tween-20) | J.T.Baker | X251-07 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | |
| Glycine | Amresco | 0167-5KG | |
| Tris | Affymetrix, USB | 75825 | |
| NaCl | Amresco | 0241-1KG | |
| EDTA | Amresco | 0105-1KG | |
| Glycerol | Amresco | 0854-1L | |
| NaN3 | Sigma | S2002-500G | |
| BCIP/NBT | PerkinElmer | NEL937001PK | |
| Goat Anti-Mouse IgG, Fc fragment antibody | Jackson ImmunoResearch | 115-055-008 | |
| Immobilon-P (Polyvinylidene fluoride, PVDF) | Merck Millipore | IPVH00010 | |
| Protein G Agarose Fast Flow | Merck Millipore | 16-266 | |
| QIAquick PCR Purification kit | Qiagen | 28106 | |
| UVP BioSpectrum 600 Image System | UVP | n/a | |
| VisionWorks LS Analysis Software Ver 6.8 | UVP | n/a | |
| MyCycler thermal cycler | BioRad | 1709713 |
References
- Milstein, C., Kohler, G. Clonal variations of myelomatous cells (proceedings). Minerva Med. 68 (50), 3453 (1977).
- Lai, Y. S., et al. In vitro neutralization by monoclonal antibodies against yellow grouper nervous necrosis virus (YGNNV) and immunolocalization of virus infection in yellow grouper Epinephelus awoara (Temminck & Schlegel). J Fish Dis. 24 (4), 237-244 (2001).
- Chen, C. W., Wu, M. S., Huang, Y. J., Cheng, C. A., Chang, C. Y. Recognition of Linear B-Cell Epitope of Betanodavirus Coat Protein by RG-M18 Neutralizing mAB Inhibits Giant Grouper Nervous Necrosis Virus (GGNNV) Infection. PLoS One. 10 (5), 0126121 (2015).
- Lai, Y. -S., et al. Propagation of yellow grouper nervous necrosis virus (YGNNV) in a new nodavirus-susceptible cell line from yellow grouper, Epinephelus awoara (Temminck & Schlegel), brain tissue. J Fish Dis. 24 (5), 299-309 (2001).
- Lougee, E., Morjaria, S., Shaw, O., Collins, R., Vaughan, R. A new approach to HLA typing designed for solid organ transplantation: epityping and its application to the HLA-A locus. Int J Immunogenet. 40 (6), 445-452 (2013).
- Radulovich, N., Leung, L., Tsao, M. S. Modified gateway system for double shRNA expression and Cre/lox based gene expression. BMC Biotechnol. 11, 24 (2011).
- Froger, A., Hall, J. E. Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. J Vis Exp. (6), e253 (2007).
- Pronobis, M. I., Deuitch, N., Peifer, M. The Miraprep: A Protocol that Uses a Miniprep Kit and Provides Maxiprep Yields. PLoS One. 11 (8), e0160509 (2016).
- Metzker, M. L.
- Chiu, C. C., John, J. A., Hseu, T. H., Chang, C. Y. Expression of ayu (Plecoglossus altivelis) Pit-1 in Escherichia coli: its purification and immunohistochemical detection using monoclonal antibody. Protein Expr Purif. 24 (2), 292-301 (2002).
- Atassi, M. Z. Antigenic structures of proteins. Their determination has revealed important aspects of immune recognition and generated strategies for synthetic mimicking of protein binding sites. Eur J Biochem. 145 (1), 1-20 (1984).
- Opuni, K. F., et al.
- Chang, C. Y., Chiu, C. C., Christopher John, J. A. The Aquaculture of Groupers. Liao, I. C., Leaño, E. M. , Taiwan Asian Fisheries Society, World Aquaculture Society, The Fisheries Society of Taiwan, National Taiwan Ocean University, Taiwan Press. 207-224 (2008).
- Conti-Tronconi, B. M., et al. Alpha-bungarotoxin and the competing antibody WF6 interact with different amino acids within the same cholinergic subsite. Biochemistry. 30 (10), 2575-2584 (1991).
- Briggs, S., Price, M. R., Tendler, S. J. Fine specificity of antibody recognition of carcinoma-associated epithelial mucins: antibody binding to synthetic peptide epitopes. Eur J Cancer. 29 (2), 230-237 (1993).
- Chen, N. C., et al. Crystal Structures of a Piscine Betanodavirus: Mechanisms of Capsid Assembly and Viral Infection. PLoS Pathog. 11 (10), e1005203 (2015).
- Badani, H., Garry, R. F., Wimley, W. C. Peptide entry inhibitors of enveloped viruses: The importance of interfacial hydrophobicity. Biochim Biophys Acta. , (2014).
- Qureshi, N. M., Coy, D. H., Garry, R. F., Henderson, L. A. Characterization of a putative cellular receptor for HIV-1 transmembrane glycoprotein using synthetic peptides. AIDS. 4 (6), 553-558 (1990).
