Abstract
bağışıklık sisteminin bir antijenik epitopa tanımlanması aşılar ve peptid ilaçların geliştirilmesi kolaylaştırabilir nötralize edici antikorların bir koruyucu mekanizma anlaşılabilmiştir. Peptid tarama delikanlı monoklonal bir antikor (mAb) tarafından tanınan lineer epitop harita basit ve etkili bir yöntemdir. Burada, yazarlar nötrleştirici mAb kullanılarak sinir nekroz virüsü kaplama proteininin antigenik tanınması için seri kesik rekombinant proteinleri, sentetik peptid tasarımı ve nokta-benek hibridizasyonu ile ilgili bir epitop belirlenmesi yöntemi sunulmaktadır. Bu teknik, bir poliviniliden florür (PVDF) membran üzerinde sentetik peptidler ve mAb'lerin nokta benek hibridizasyonu dayanır. RG-M56 mAb tarafından tanınan bir viral kat proteininin en az antijenik bölge 6-mer peptit epitopu üzerine peptit haritalama kesilmiş adım adım daraltıldığı edilebilir. Buna ek olarak, alanin tarama mutajenezi ve tortu, altikamesi veya epitopu oluşturan her bir amino asit tortusu bağlanması önem karakterize etmek için gerçekleştirilebilir. epitop sitesini kuşatan kalıntıları peptid konformasyon düzenlenmesinde kritik roller oynamaya bulundu. tanımlanan epitop peptit bir X-ışını kırılım çalışmasının ve fonksiyonel rekabet veya tedavi için epitopunun peptid-antikor komplekslerinin kristalleri meydana getirmek üzere kullanılabilir.
Introduction
Bağışıklık sisteminde, V, D ve J segmentlerinin rekombinasyon antikorları patojenik enfeksiyon ana korumak için çeşitli antijenlere bağlanması için tamamlayıcılığı belirleyici bölgelerinde (CDR'ler) muazzam varyasyonlarını oluşturmak için sağlar. antijenlere karşı antikorların nötralize savunma antikorlarının CDR ve antijenlerin epitoplarına arasındaki mekansal tamamlayıcılık bağlıdır. Bu nedenle, bu moleküler etkileşim bir anlayış profilaktik aşı tasarımı ve terapötik peptid ilaç geliştirme yardımcı olacaktır. Bununla birlikte, bu nötrleştirme etkileşimi, tek bir antijen birden fazla antijenik alan ile ve dolayısıyla epitop belirleme süreci daha karmaşık hale antikor çoklu CDR'ler, hem de etkilenebilir. Neyse ki, miyelom hücreleri ile, bireysel antikor üreten hücrelerin sigortalar hibridom teknolojisinin gelişmesi, sn hücrelerin sürekli bölünmesi toplu sağlarBir monoklonal antikor (mAb) olarak bilinen retenin belirli bir antikor, 1. Hibridoma hücreleri, spesifik antijenin tek bir antijenik alana bağlanabilir, bu, saf, yüksek afiniteli mAbs üretir. Kurulan antijen-antikor, peptit taraması dahil olmak üzere çeşitli yaklaşımlar arasında bir ilişki ile, karşılık gelen mAb kullanan bir antijenin epitopunun belirlenmesi için kullanılabilir. sentetik peptid teknolojisindeki son gelişmeler peptid tarama tekniği daha erişilebilir ve gerçekleştirmek için daha uygun hale getirmiştir. Kısaca, üst üste binen sentetik peptidlere bir dizi, bir hedef bir antijen dizisine göre üretilir mAb hibridizasyona katı destekli zara ilişkilidir. Peptid tarama bölgesinin antikor bağlanmasını eşlemek için kolay bir yol sunar, ancak, aynı zamanda epitop peptit her AA tortu antikorun CDR arasındaki bağlanma etkileşimini değerlendirmek için tortu, tarama veya ikame arası amino asit (aa) mutagenez kolaylaştırmaktadır.
2, 3, 4 ile san bir orfoz sinir nekroz virüsü (YGNNV) kaplama proteininin lineer epitopa etkin tanımlanması için bir protokol açıklamaktadır. Protokol mAb, inşaat ve seri kesik rekombinant proteinlerin ekspresyonu sentetik üstüste binen peptit tasarım, nokta-benek hibridizasyonu, alanin tarama ve ikame mutagenezi bulunmaktadır. Peptit sentezi yüksek maliyeti göz önüne alındığında, seri arzu edilen bir hedef proteini rekombinant proteinleri kesilmesi aşamasının tadil edilmiş, ve sentetik peptid dizisi nokta-blot analizi gerçekleştirilmiştir önce antijenik bölge yaklaşık 100 ila 200 aa artıkları kadar daraltılmıştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Monoklonal antikor hazırlanması 1.
- Kültür,% 5 CO2 ilave ile 37 ° C 'de 175T şişelerinde serum içermeyen ortam içinde RG-M56 tek klonlu fare hibridoma hücreleri, 2. orta renk inkübasyon beş gün sonra sarı döndüğünde süpernatant toplayın.
Not: hibridoma hücreleri cenin sığır serumu antikor kirlenmesini önlemek için, serum barındırmayan ortam içinde kültürlenmiştir. - 4 ° C'de 30 dakika boyunca 4500 x g'de santrifüj süpernatan ve hücre yıkıntıları pelet haline atın.
- 5 ml kolonuna (% 50 bulamaç olarak verilir), protein G agaroz 2 ml ilave edilir ve buz soğukluğunda PBS 10 reçine hacim (10 mL) ile dengeye getirin.
- Antikor süpernatant yükleyin 200 mL kolonuna (adım 1.2) ve geçişini atın.
- yıkamak için sütuna buz soğukluğunda 10 ml PBS ilave edin. İki kez tekrarlayın.
- protein G-bağlı antikor elüt edilmesi için sütun 50 mM glisin, pH 2.7, 10 ml ekleyin. ColCollect 10x nötralizasyon tampon 100 ul (1 M Tris, 1.5 M NaCl ve 1 mM EDTA, pH 8.0) ihtiva eden bir mikrosantrifüj tüpü içinde, 900 uL fraksiyonlar.
- -20 ° C'de% 0.03 NaN 3 ile% 50 gliserol saflaştırılmış antikor saklayın.
2. İnşaat ve seri olarak Kesik Rekombinant Proteinlerin İfadesi
- (10x Pfu tampon maddesi 5 uL, her dNTP 0.2 mM, 0.2 uM ileri primer 3, 0.2 uM ters primer 3, 2 mM MgSO 4, pET20b-1A59 3 plasmid DNA 1 ng ve 2.5 U: PCR reaksiyon karışımı hazırlandı ünite) Pfu DNA polimeraz, 50 ul'lik nihai bir hacme kadar O GKD 2 ekleyin.
- Otomatik termal döngü çalıştırmak örnekler aşağıdaki parametreler kullanılarak: Döngü 1 (5 dakika 94 ° C); döngüleri 2-36 (30 s için 94 ° C, 30 sn için 63 ° C ve 60 sn için 72 ° C); ve çevrim 37 (7 dakika süreyle 72 ºC).
- Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR), aşağıdaki kısıtlayıcı enzim sindirimi kolaylaştırmak için PCR saflaştırma kiti 5 kullanarak ürün ekstrakte edin.
- Nde I ve Xho I sınırlama enzimleri ile PCR amplifiye edilmiş DNA fragmanları sindirimi ve Nde I ve Xho I enzim ayrıldı pET-20b (+) vektörüne, bu DNA parçalarının her biri ligate. Escherichia coli DH-5α-kompetan hücreler 6 içine yapıları dönüştürmek.
- Sindirim tamponu sindirim karışım hazırlayın (20 mM Tris-asetat, 10 mM Mg (CH3COO) 2, 50 mM KCH 3 COO ve 1 mM DTT, pH 7.9) ile 1 PCR ile amplifiye DNA ya da PET-20b ug Nde I ve Xho I sınırlama (+) vektörü, DNA, ve 2 U 20 uL nihai hacim içinde enzim.
- yavaşça sindirim karışımı karıştırın ve hızlı bir şekilde aşağı doğru döndürün. sınırlama tam kesim oturup sağlamak için kuru bir banyo içinde, 2 saat boyunca 37 ° C de kuluçkaya bırakılıres.
- Aşağıdaki plazmid yapı kolaylaştırmak için PCR saflaştırma kiti 5 ile sınır enzimi ile sindirilmiş DNA fragmanları ekstrakte edin.
- Ligasyon tamponu bağlanma karışımının hazırlanması (66 mM Tris, 5 mM MgCl2, 1 mM ATP, ve 5 mM DTT, pH 7.5) önceden sindirilmiş, PCR ile amplifiye DNA 100 ng, predigested pET-20b, 10 ng (+) vektör DNA, 10 uL nihai hacim içinde, 5 U T4 DNA ligaz.
- yavaşça ligasyon karışımı karıştırın ve hızlı bir şekilde aşağı doğru döndürün. Bir su banyosu içinde 18 saat boyunca 16 ° C'de inkübe edin.
- DH-5α-kompetan hücreler 100 uL ligasyon numunelerinin 10 uL koyun ve 30 dakika boyunca buz üzerinde mikrosantrifüj tüpü yerleştirmeden önce yavaşça karıştırın. Isı şoku 7 ikna etmek 90 saniye süreyle 42 ºC kuru bir banyosunda ependorf tüp koyun. Hemen 2 dakika süreyle buz üzerine tüp aktarın.
- % 0.5 Bacto maya Extrac Luria-Bertani (LB) ortamı (% 1 Bacto tripton, 900 uL, eklemetüpe T ve% 0.5 NaCl, pH 7.0). 150 rpm'de 45 dakika boyunca çalkalama ile 37 ° C'de inkübe edin. 10 dakika süre ile 4,000 x g 'de santrifüj ile hücreler pelet ve süpernatant atılır.
- LB suyu 50 uL ile pelet yeniden süspanse edin ve 100 ug / ml ampisilin ihtiva eden, önceden-ısıtılmış LB plakaları üzerine her dönüşümü yayıldı. 16 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
- 200 uL ucunu kullanarak tek bir koloni Pick up ve gevşek kapatılmış 15 ml tüp içinde 100 ug / ml ampisilin içeren 3 ml LB suyu içine yerleştirin. 150 rpm'de 12 saat boyunca çalkalanarak 37 ° C'de inkübe edin.
- Her bir kültürden plazmid DNA 8 ekstrakte ve sırası 9 teyit etmek için T7 destekleyici ve T7 bitirme primerler kullanılarak, sekans.
- Sekans doğrulandıktan sonra, bu, pET-20b DNA, 10 ng (+) tarafımızdan, E. coli BL-21 (DE3) 'e suşa YGNNV kılıf proteini geni uzunlukları farklı olan plazmidler dönüşümüısı-şok yöntemi 7 ing. adımları izleyin 2.3.6-2.3.8 dönüşümü gerçekleştirmek için.
- Gevşek kapaklı 15 ml bir tüp içinde 100 ug / ml ampisilin ihtiva eden 3 ml LB suyu her bir transforme edilmiş E. coli BL-21, hücre tek bir koloni aktarın. 150 rpm çalkalanarak 37 ºC'de kültür inkübe edin.
- Kültür OD 600 yaklaşık 0.6 olduğu zaman 25 ° C, kültür soğutun ve yeniden birleştirici proteinin ifadesini uyarmak için 0.4 mM nihai bir konsantrasyona kadar IPTG ilave edin. 200 rpm çalkalanarak 25 ° C'de fazladan 4 saat süreyle kültür inkübe edin.
- mikrosantrifüj tüpü içine kültürün 1 ml'sinin aktarın. 1 dakika için 12,000 x g'de santrifüj ile hücreler pelet ve süpernatant atılır.
- Mikropipet ile pipetleme aşağı denatürasyon tampon maddesi 100 uL (8 M üre, 20 mM sodyum fosfat, 0.5 M NaCI, pH 7.4) içinde hücre pelletini. dinç vorteks ile karıştırın.
NOT: Örnek solutions artık nokta blot hibridizasyon analizi için, yarı-saydam az yapışkan ve hazır olmalıdır.
Çakışan Peptitler 3. Tasarım ve Sentezi
- Tasarım ve her nokta lekeleme tarafından RG-M56 mAb epitop bölgesini daraltmak için YGNNV kat proteininin 195-338 aa bölgesinden 10 aa artıkları ile halefi ile örtüşen 3 seri 20-mer peptidler sentez.
- Tasarım ve sentez 3 üç 8-mer peptitler (202 195 VNVSVLCR, 197 VSVLCRWS 204 ve 199 VLCRWSVR 206) aşağıdaki sentetik peptid üzerine 6 aa artıkları bir örtüşme ile noktalama yöntemiyle 195-206 aa epitop bölgesini daraltmak için.
- Tasarım ve 3 7-mer sentez (196 NVSVLCR 202 ve 195 VNVSVLC 201), 6-mer (195 VNVSVL 200, 196 NVSVLC 201 ve 1En aza indirmek için komşu peptit üzerinde sırasıyla, 6, 5 üst üste binmekte ve 4 aa artıkları, 97 VSVLCR 202) ve 5-mer peptidleri (202 195 VNVSV 199, 196 NVSVL 200, 197 VSVLC 201 ve 198 SVLCR) noktalama yöntemiyle epitop bölgesi.
4. Nokta benek hibridizasyonu
- 10 mg / mL'lik nihai bir konsantrasyona kadar, dimetil sülfoksit (DMSO) içinde, her sentez peptidi çözülür.
Not: sentetik peptidler değişik çözünürlüğe üstesinden gelmek için, tüm sentetik peptidler DMSO içinde çözündürülmelidir. DMSO tamamen hidrofobik ya da hidrofilik peptitleri çözündürmek için iyi bir çözücüdür. - 2 dakika boyunca metanol ile poliviniliden florit (PVDF) membran bekletin.
NOT: PVDF membran DMSO dayanıklı% 100 kadardır; diğerleri kadar olmayabilir. - modifiye Towbin tamponu (25 mM Tris, 192 mM glisin ve% 0.1 SDS, pH 8.3) için, PVDF membranı ile dengeye2 dakika.
Not:% 10-20 (h / h) metanol transfer sonuçlarını geliştirmek için modifiye Towbin tamponu ilave edilebilir. - modifiye Towbin tamponu ile kromatografi bir parça kağıt durulayın. kromatografi kağıdı üzerine PVDF membran yerleştirin. modifiye Towbin tampon sonraki adıma geçmeden önce PVDF membran yüzeyinden kaybolana kadar bekleyin.
- 10 uL ucu ile membrana her peptid numunesi 2 ul ekle. 10 dakika süre ile kromatografi kağıdı üzerinde PVDF membran hava-kurutun. Çok fazla difüzyon önlemek için zar üzerine yavaş ve aşamalı olarak, her peptit örnek ekleyin.
- hafifçe çalkalanarak oda sıcaklığında 30 dakika boyunca% 5 yağsız süt ile TBST tamponu içinde membran (% 0.05 (h / h) Tween-20, 20 mM Tris, 150 mM NaCI, pH 7.4) ile bloke edin.
- zara% 5 yağsız süt ile TBST tamponu içinde 1.000: 1 oranında bir nihai seyreltme ile RG-M56 mAb ekleyin. hafifçe çalkalanarak 1 saat boyunca 37 ° C'de membran inkübe edin.
- bu nedenle antikorunu çıkarındökülmesinden. hafifçe çalkalanarak 5 dakika süreyle TBST tamponu içinde membran yıkayın. İki kez tekrarlayın.
- zara% 5 yağsız süt ile TBST tamponu içinde 5.000: 1 bir son seyreltide ikincil antikor (keçi anti-fare IgG, Fc, konjuge alkalin fosfataz) ekleyin. hafifçe çalkalanarak 1 saat boyunca 37 ° C'de membran inkübe edin.
- antikor çözüm atın. hafifçe çalkalanarak 5 dakika süreyle TBST tamponu içinde membran yıkayın. iki kez yıkama adımı yineleyin.
- karanlıkta 15 dakika için oda sıcaklığında BCIP / NBT substrat çözeltisi ile membran geliştirir. Sinyal göründüğünde GKD 2 O ile membran yıkayarak gelişmekte durdurun.
- membran Hava kurutun ve bir görüntü sistemi kullanılarak dot-blot görüntü yakalamak.
- Görüntü analiz yazılımı 3 kullanarak her nokta leke yoğunluğunu ölçmek.
5. Alanin Tarama ve Değişiklik
- Tasarım ve 3 alanin ve Methi sentezonine, ikame peptidler. VAVSVLCR 202, 195 VNASVLCR 202, 195 VNVAVLCR 202, 195 VNVSALCR 202, 195 VNVSVACR 202, 195 VNVSVLAR 202 8-mer peptidi 195 VNVSVLCR 202 alanine her AA artığı yerine sentez peptidleri 195 ANVSVLCR 202, 195, ve 195 VNVSVLCA 202 . SJNNV genotip epitop peptit 195 VNVSVMCR 202 oluşturmak için metionin aa kalıntısı lösin 200 değiştirin.
- alanin tarama ve ikame mutagenez nokta blotlama gerçekleştirmek için Bölüm 4 izleyin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu deneyin amacı, mAb kullanılarak nokta blotlama yoluyla bir epitopu belirlemek için yapıldı. Hızlı ve verimli bir şekilde mAb tarafından algılanan antijenik bölge daraltmak için, C-terminali bir 6xHis füzyon etiketidir tam boyunda ve seri olarak kesildi YGNNV rekombinant kaplama proteinleri bir E. coli pET ifade sistemi 10 (Şekil 1 A) ile ilgili olarak ifade edildi. Elde edilen rekombinant proteinleri nokta benek hibridizasyonu için RG-M56 mAb ve anti-6xHis antikoru kullanılarak PVDF membran üzerine tespit edildi. Nokta blot 1-338 AA (tam uzunlukta), 51-338 AA, ve 195-338 AA, ancak 1-100 AA veya 1-200 AA yeniden birleştirici protein (Şekil 1B) karşı olumlu sinyaller ortaya koymuştur. nokta dizisi anti-6xHis antikora karşı hibridize ve rekombinant proteinlerin ekspresyonu teyit etmiştir. Bu veriler RG-M56 mAb tanıma epitop 144-aa rekombinant protein nea bulunduğunu göstermektedirR Cı-terminali YGNNV kılıf proteini (195-338 aa).
bunların komşu tasarlanmış ve epitop bölgesini daraltmak için peptit tarama için 144-aa rekombinant proteinin dizisi sentezlenmiştir üzerine Daha sonra, 10 aa-tortuları uzun seri 20-mer peptitler örtüşmektedir. Bu sentetik peptidler, bir PVDF zarı üzerine tespit ve RG-M56 mAb kullanarak nokta-benek hibridizasyonu tabi tutuldu. Sonuç, sadece peptit 195-214 AA ve pozitif kontrol, 195-338 aa rekombinant protein (Şekil 2A) ile ilgili pozitif sinyalleri göstermiştir. epitop peptit 195-214 aa bölümünün ancak peptid 205-224 AA bölgesi, 6-aa artıkları üç seri 8-mer peptitler içinde bulunan gibi 197-, AA tortu, 195-206 (peptid 195-202 AA üst üste 204 AA, ve 199-206 aa) tasarlandı ve sentezlendi. Dot-blot hibridizasyon sonuçları kullanarak peptid 195-202 aa ve pozitif kontrol peptit 195-214 aa üzerinde olumlu sinyaller gösterdiRG-M56 mAb (Şekil 2B).
Alanin tarama ve ikame mutagenez 8-mer epitopu, her AA tortu, 195 VNVSVLCR 202 özgüllüğünün değerlendirilmesi için yapıldı. 8-mer peptidi her AA tortu, tek tek alanin ile ikame edilmiştir. alanin mutasyon peptid dizisi daha sonra bir pozitif kontrol olarak peptit 195-202 AA kullanılarak bir PVDF zarı üzerine yerleştirildi. Nokta-blot analizi, üç yerine mutasyonlar, V197A, V199A ve C201A, RG-M56 mAb (Şekil 3A) bağlanma afinitesi kaldırıldı olduğunu göstermiştir. SJNNV genotipi epitopa de aa Tortu, 200 metiyonin olmasına rağmen, diğer dört Betanodavirus genotipi epitopları bir lösin yerine, SJNNV genotip dizisi, 195 VNVSVMCR 202, pozitif kontrol için olduğu gibi, RG-M56 mAb karşı pozitif bağlanma afinitesi gösterdi (Şekil 3A). Bu sonuç epitopları o gösterirf tüm Betanodavirus genotipleri RG-M56 mAb tarafından kabul edilebilir. Epitop sitesine katılan her bir AA artığının bağlanma afinitesi daha fazla görüntü analiz yazılımı (Şekil 3B) kullanılarak her bir alanin yer değiştirmesi ile nokta leke sinyal yoğunluğunun ölçülmesiyle nicelleştirilmiştir. V197A, V199A ve C201A ikameleri yoğunlukları% 10,2,% 18,6, ve% 8.5, indirgenmiş sırasıyla, pozitif kontrol (% 100) ile karşılaştırıldığında zaman V195A ise, S198A, L200A, R202A ve L200M ikameler pozitif kontrolün olduğu gibi daha yüksek ya da benzer yoğunlukları saptandı. N196A ikame etkileyen kuvveti pozitif kontrolde bir% 37.4 azalma ile, belirsiz dikkati çekiyor. Bu sonuçlar, V197, V199 ve C201 RG-M56 mAb bağlanması için gerekli kalıntıları olduklarını göstermektedir.
alanin tarama mutajenezi sonuçları aa artıkları V195, N196 ve R202 can açığaepitop bölgesi daha, her iki terminalde de daraltılabilir olabilir anlamına gelir alanin ile değiştirilebilir. Bu nedenle, adım adım 7-mer, 6-mer ve 5-mer sentetik peptitler adımda peptit haritalama kesilmiş antijenik bölge en aza indirmek üzere tasarlanmıştır. Pozitif sinyal, ancak 7-mer ve 5-mer sentetik peptidler ile, (Şekil 4), 6-mer sentetik peptit 196 NVSVLC 201 mevcuttu. Bu veriler, RG-M56 mAb tarafından tanınan nnv kaplama proteininin en az bir epitop 6-mer peptidi, 196 NVSVLC 201 olduğunu göstermektedir.
Şekil 1: seri kısaltılmış rekombinant proteinleri ve monoklonal antikor kullanılarak bir epitop bölgesine indirgenmesi. Seri kesik rekombinant NNVCPs (A) ilk. NNVCP 1-338 AA tam uzunlukta kaplama proteinidir. (B) Dot-bloRekombinant NNVCPs t analizi. Sol: PVDF membran üzerinde seri kesilir YGNNV rekombinant kat proteinlerinin Haritası. Orta: nokta-benek analizi, anti-6xHis antikor kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Sağ: nokta-benek analizi, RG-M56 mAb kullanılarak gerçekleştirilmiştir. NNVCP: Sinir nekroz virüsü kılıf proteini; AA: amino asittir; PVDF: polivinil florür; : N-terminali; Cı: C-terminali; mAb: monoklonal antikor. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2: sentetik peptidler kullanılarak epitop bölgesine ince harita. (A) Sol: 20-mer sentetik peptidlerin amino asit dizileri, NNVCP 195-338 AA hizalandı; her biri ile peptidi aşağıdaki peptit ile bir 10 aa-tortuları uzun üst üste vardı. Sağ: s HaritasıPVDF zarı üzerine ynthetic peptidler. Rekombinant NNVCP 195-338 aa bir pozitif kontrol olarak kullanıldı. Nokta-blot analizi RG-M56 mAb kullanılarak gerçekleştirilmiştir. (B) sol: 8-mer sentetik peptidler, 195-202 AA, 197-204 AA, ve 199-206 aa amino asit sekansları; her biri ile peptidi aşağıdaki peptid ile 6 AA kalıntıları uzun üst üste vardı. Sentetik peptit 195-214 aa bir pozitif kontrol olarak kullanıldı. Sağ: nokta-benek analizi, RG-M56 mAb kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3: 195 VNVSVLCR 202 epitopunun alanin tarama ve ikame mutajenezi. Değişiklik mutajenez ve nokta-leke analizi (A) amino asit dizileri. Her aa repitop bölgesi, 195-202 aa esidue, alanin ile ayrı ayrı değiştirildi. L200M ikamesi Betanodavirus kılıf proteini epitop bölgesinde SJNNV genotip dizisidir. Sentetik peptit 195-202 aa bir pozitif kontrol olarak kullanıldı. yerini aa artıkları altı çizilmiştir. Nokta blot analizi bağlanma afinitesi (B) belirlenmesi. Pozitif kontrol (195-202 aa) sinyal yoğunluğu% 100 olarak tespit edilmiştir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 4: Minimum epitop belirlenmesi. 195-202 aa 7-mer (A), 6-mer (B) ve 5-mer (C), sentetik peptidler, RG-M56 mAb tarafından tanınan en az epitopunu belirlemek için kullanılmıştır. sentetik peptidleride 195-202 aa bir pozitif kontrol olarak kullanıldı. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokol, mAb tanınan lineer epitopunu belirlemek için hızlı ve basit bir teknik sunmaktadır. dikkate peptit sentezi ve sentez peptidlerin üretim verimliliği maliyeti alarak, virüs kaplama proteininin antijenik bölgenin peptit tarama analizinden önce seri kesik rekombinant proteinleri ifade azaltılmıştır. 10 ila 50 arasındaki moleküler ağırlıklara sahip bir araya getiren proteinler kDa kolaylıkla bu sistem ile ifade edilebilir Bu nedenle, güvenli ve etkili bir E.coli pET ifade sistemi, bu seri olarak kısaltılmış rekombinant proteinleri üretmek için kullanıldı. Bu şekilde, epitop kolayca daha yönetilebilir 100-200 aa bölgeye daraltıldığı edilebilir. üretilen 6xHis-Tag füzyon proteinlerinin izin 6xHis-etiketler ekspresyonu kodlayan ekspresyonunu doğrulamak için, bir anti-6xHis antikoru kullanılarak bağışıklık kazandırılmış olan bir sekansı içerdiği pET-20b (+) vektörü, özellikle, seçilen rekombinant proteinler. üretilen rekombinant kaplama proteinleri Bundan sonra, bir nokta-leke melezleşme testi ile RG-M56 mAb kullanılarak analiz edilmiştir. Rekombinant protein Epitop belirlenmesi için alternatif bir yöntem olup, hareketsizleştirilmiş metal iyonu ilişkisi kromatografisi, 10 ile ifade edilen rekombinant proteinleri saflaştırmak SDS-poliakrilamit jel elektroforezi ile rekombinant proteinlerin ayrılması ve Western blot analizini 3 yapmaktır.
Daha fazla ve daha ince seri kesik rekombinant proteinleri kullanarak nokta-blot hibridizasyon analizi sonuçlarından tespit epitop haritasının, farklı boyutlarda olan üst üste binen sentetik peptidler dizayn edilmiştir. sentezlemek için sentetik peptid farklı olası uzunlukları arasında, yeterli, (yaklaşık% 90) ve peptid uzunluğu için yüksek sentez saflık için hem de 10 aa-artıkları uzun çakışan peptidler peptid tarama ilk seçildi 20-mer sürekli e için aramapitope B-hücresi antikoru 11 tarafından tanınan. Sentezlenen peptit uzun olduğu gibi sentezlenmiş peptitlerin doğruluk ve saflığı bozulabilir unutmayın. Bu şekilde, epitop bölgesi, hızla uzunluğu yaklaşık 10 aa artıkları düşürülmüştür. Seri 8-mer çakışan peptitler Ankete edildikten sonra, bir lineer epitop bölgesine 195-202 aa peptit tanımlanmıştır. Daha sonra, bu 8-mer epitop peptit alanin tarama az epitop için arama sağlayan, her AA artığının önemli bağlanma afinitesi gücünü ortaya koyar. V197, V199 ve C201 aa artıkları temel roller bir lineer epitop bölgesine mutlak bağlayıcı kaybetmeden 197 Dahası, aa artıkları V195, N196, ve R202 alanin ile ikame edilmiş olabilir 201. için, en az 5 aa artıkları kapsayan anlamına gelmektedir afinite, epitop bölgesi uzunluğu 7, 6, ya da 5 aa artıkları indirgenebilir işaret etmektedir. Küçük peptid dizileri kolaylıkla ve ekonomik olarak doğrusal arama (CO sentezlenebilirntinuous) epitoplar. Bu epitop eksizyonu ile bir araya getirilmiş ve kütle spektrometrik 12 analiz sürece Bununla birlikte, bu, sentetik peptit tarama tekniği, bir antikorun bir süreksiz epitopunun belirlenmesi için uygun değildir.
Bu protokol, bir nokta-blot hibridizasyon tekniği mAb lineer epitop aramak için kullanılmıştır. Nokta benek hibridizasyon basit ama etkili bir yöntemdir. Epitop bölge geniş çaplı bir manzara daraltılır arama, başında, ana endişe çoğu mAbs gibi bir hedef zara bağlı protein antikor hibridizasyon sonra olumlu ya da olumsuz bir sinyal ya gözlemlemektir sadece bir antijenik protein belirli bir epitopa (Şekil 1 ve 2) bağlanır. Bununla birlikte, bu alanin yer değiştirmesi mutagenezle olarak antikorun karşı epitop bölgesi içinde her AA artığının bağlanması durumu keşfetmek için nokta benek hibridizasyonu kullanıldığında,noktalama yöntemiyle belirlenen her ikame AA artığının sinyal yoğunluğu genel bağlanma öneme dahil edilmelidir. Bu sinyal yoğunluğu görüntü analiz yazılımı (Şekil 3B) veya dansitometresi kullanılarak kolaylıkla belirlenebilir. Seçenek olarak ise, bir enzim-bağlantılı bağışıklık emici tahlil (ELISA) bağlanma afinitesi derecesi ve elde edilen sinyal gücü 3 ölçmek için gerçekleştirilebilir.
Bir önceki çalışmada, sigara zarf sinir nekroz virüsünün tek kat protein olan bağışıklık tanınan (10 NI log) 4.5 6.5 arasında yüksek nötralizasyon endeks değeri ile 10 mAb'ler 2. MAb'lerin yüksek düzeyde spesifik tanıma yeteneği daha nnv enfekte balık 13 tespiti için tek-aşamalı, hızlı immünokromatografik teşhis kitinin geliştirilmesi için kullanılmıştır. Sinir nekroz virüsü kaplama proteininin antigenik epitop RG-M18 tarafından tanındımAb yeni nnv reseptörü (yayınlanmamış veriler) tespit edilmiştir, üzerinden bir 8-mer peptidi, 195 VNVSVLCR 202 3 gibi. Bu çalışmada, sinir nekroz virüsü kaplama proteininin epitop ayrıca bir 6-mer peptit kadar daraltılmış, 196 NVSVLC 201, Diğer mAb, RG-M56 tarafından.
6-mer peptid 196 NVSVLC 201 içeren iki 7-mer peptitler (196 NVSVLCR 202 ve 195 VNVSVLC 201) RG-M56 mAb (Şekil 4A) tarafından tanınmayan o beklenmedik bir durumdur. Makul bir yorumlama çevreleyen artıklar V195 ve R202'nin doğrudan epitop ile antikor arasında bağlanma etkileşimine katkıda bile, yanda yer alan rezidülerin antikor tarama için uygun peptit konformasyon oluşumunu etkileyen olmasıdır. kendi yan ucunda V195 veya R202 görünümü, tek başına, sentetik peptit çarpıtmak olabilirAntikor tanıma ve bağlanma için yapıya. Epitop, yapıya, VNVSVLCR 202 195, 8-mer sentetik peptit birbirine karşı dengelenir, her iki terminalde, V195 ve R202, gücü ile tahrik edilir ve NVSVLC 201 196, 6-mer sentetik peptid içinde etkisiz. aa artıkları, V195, N196 ve R202, bireysel tamamen kaybetmeden bağlanma yeteneği olmadan alanin ile değiştirilebilir ve böylece, alanin tarama mutajenezi sonuçları bu üç aa artıkları tanıma önemli bir rol oynamadığını göstermektedir ve RG bağlayıcı -M56 mAb. Ancak, 6-mer sentetik peptit bir veya daha tortu kesme sonra 196 NVSVLC 201, N-terminali komşu bölgede N196 olmayan 5-mer peptidi, 197 VSVLC 201, RG tarafından tanınan ve bağlanmış olan yeteneğini kaybeder -M56 mAb (Şekil 4C). Bu sonuç N196 kalıntısı olabilir ayrıca p anlaşılacağıtanıma ve RG-M56 mAb'nin bağlanma sağlamak için doğru epitop şekil uyumuna stabilize etmek için epitop komşu bölgede önemli bir rol yerleştirin. Epitop bölgeyi çevreleyen komşu tortuların önemi, diğer antijen-antikor bağlanma çalışmaları ile incelenmiştir edilmiştir. antikorların bağlanma için α-bungarotoxin epitop bölgesini çevreleyen aa artıkları komşu önemi, aynı kolinerjik alt site içinde farklı AA ikameleri kullanılarak araştırılmıştır. Daha sonra, gerekli etkili veya 14 etkili değil ya da değerlendirildi. Ayrıca, karsinoma ile ilişkili epitel müsinlerin antikoru tarafından tanınan epitopun özgüllüğü, bundan başka eteklenen aa artıkları ile etkilenebilir bulunmuştur. Bu etkiler, bir epitopa 15 bir antikorun bağlanma engelleyebilir yapısal engeller mevcut olabilir.
6-mer epitopu, 196 NVSVLC 201 </ Alt> son derece hidrofobik özelliklere sahip, iki Valines (197 ve 199), bir lösin (200), ve bir sistein (201), (indirgenmiş formu) dahil olmak üzere dört hidrofobik tortuları ile. alanin tarama mutagenezi ile belirlenen kalıntıları V197, V199 ve C201, RG-M56 mAb tanıma ve bağlanma için kritik öneme sahiptir. Epitop bölgesi nnv kaplama proteininin 16 kabuk alan (S-alan) sekiz adet anti-paralel β-şeritlerin birinde yer almıştır. İlginçtir, epitop dış çıkıntı etki alanında görünür, ancak diğer anti-paralel β-ipliklerini altında S-etki jöle rulo yapısında gizler değil. epitop, yüksek hidrofobisite ile bu depresyon daha istikrarlı bir mikro elde edebilir. Ayrıca, bu epitopun 195 VNVSVLCR 202 3 peptidin orfoz beyin hücreleri dev orfoz sinir nekrozu virüsü ilerlemesini engellemek için saptanmıştır. Bu nedenle, bu epitop peptit ko olduğu önerilmiştirmpetitor viral giriş 3 için gerekli reseptör bağlanma alanı yer. Bu peptid giriş inhibitörleri hücre zarı arayüzlerinin bir fiziksel biçimi ve kimya değiştirebilir, hidrofobik ve / veya amfipatik artıkları içeren, hücresel ve viral membran 17 füzyon engel olacağı öngörülmüştür. Ayrıca, birçok sentetik peptid giriş inhibitörleri çeşitli virüs enfeksiyonları 17, 18 karşı güçlü engelleyici özelliklere göstermiştir. Bu nedenle, hidrofobik artıkları ve nnv enfeksiyonuna karşı güçlü bir giriş inhibisyonu ile tanımlanan epitop peptit terapötik peptit ilaçların geliştirilmesi kolaylaştırabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hybrid-SFM medium | Gibco | 12045-076 | |
| Dulbeccos's Phophate-Buffered Saline (PBS) | Gibco | 21600-069 | |
| Pfu DNA Polymerase | Thermo Scientific | EP0502 | Including buffers |
| T4 DNA Ligase | Roche | 10799009001 | Including buffers |
| NdeI | New England Biolabs | R0111S | Including buffers |
| XhoI | New England Biolabs | R0146S | Including buffers |
| pET-20b(+) vector | Novagen, Merck Millipore | 69739 | |
| E. coli DH-5α competent cell | RBC Bioscience | RH617 | |
| E. coli BL-21(DE3) competent cell | RBC Bioscience | RH217 | |
| Ampicillin | Amresco | 0339-25G | |
| LB broth | Invitrongen | 12780-052 | |
| Isopropylthio-β-D-thiogalactoside (IPTG) | MDBio, Inc. | 101-367-93-1 | |
| Methanol | Merck Millipore | 106009 | |
| Polyoxyethylene 20 Sorbitan Monolaurate (Tween-20) | J.T.Baker | X251-07 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | |
| Glycine | Amresco | 0167-5KG | |
| Tris | Affymetrix, USB | 75825 | |
| NaCl | Amresco | 0241-1KG | |
| EDTA | Amresco | 0105-1KG | |
| Glycerol | Amresco | 0854-1L | |
| NaN3 | Sigma | S2002-500G | |
| BCIP/NBT | PerkinElmer | NEL937001PK | |
| Goat Anti-Mouse IgG, Fc fragment antibody | Jackson ImmunoResearch | 115-055-008 | |
| Immobilon-P (Polyvinylidene fluoride, PVDF) | Merck Millipore | IPVH00010 | |
| Protein G Agarose Fast Flow | Merck Millipore | 16-266 | |
| QIAquick PCR Purification kit | Qiagen | 28106 | |
| UVP BioSpectrum 600 Image System | UVP | n/a | |
| VisionWorks LS Analysis Software Ver 6.8 | UVP | n/a | |
| MyCycler thermal cycler | BioRad | 1709713 |
References
- Milstein, C., Kohler, G. Clonal variations of myelomatous cells (proceedings). Minerva Med. 68 (50), 3453 (1977).
- Lai, Y. S., et al. In vitro neutralization by monoclonal antibodies against yellow grouper nervous necrosis virus (YGNNV) and immunolocalization of virus infection in yellow grouper Epinephelus awoara (Temminck & Schlegel). J Fish Dis. 24 (4), 237-244 (2001).
- Chen, C. W., Wu, M. S., Huang, Y. J., Cheng, C. A., Chang, C. Y. Recognition of Linear B-Cell Epitope of Betanodavirus Coat Protein by RG-M18 Neutralizing mAB Inhibits Giant Grouper Nervous Necrosis Virus (GGNNV) Infection. PLoS One. 10 (5), 0126121 (2015).
- Lai, Y. -S., et al. Propagation of yellow grouper nervous necrosis virus (YGNNV) in a new nodavirus-susceptible cell line from yellow grouper, Epinephelus awoara (Temminck & Schlegel), brain tissue. J Fish Dis. 24 (5), 299-309 (2001).
- Lougee, E., Morjaria, S., Shaw, O., Collins, R., Vaughan, R. A new approach to HLA typing designed for solid organ transplantation: epityping and its application to the HLA-A locus. Int J Immunogenet. 40 (6), 445-452 (2013).
- Radulovich, N., Leung, L., Tsao, M. S. Modified gateway system for double shRNA expression and Cre/lox based gene expression. BMC Biotechnol. 11, 24 (2011).
- Froger, A., Hall, J. E. Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. J Vis Exp. (6), e253 (2007).
- Pronobis, M. I., Deuitch, N., Peifer, M. The Miraprep: A Protocol that Uses a Miniprep Kit and Provides Maxiprep Yields. PLoS One. 11 (8), e0160509 (2016).
- Metzker, M. L.
- Chiu, C. C., John, J. A., Hseu, T. H., Chang, C. Y. Expression of ayu (Plecoglossus altivelis) Pit-1 in Escherichia coli: its purification and immunohistochemical detection using monoclonal antibody. Protein Expr Purif. 24 (2), 292-301 (2002).
- Atassi, M. Z. Antigenic structures of proteins. Their determination has revealed important aspects of immune recognition and generated strategies for synthetic mimicking of protein binding sites. Eur J Biochem. 145 (1), 1-20 (1984).
- Opuni, K. F., et al.
- Chang, C. Y., Chiu, C. C., Christopher John, J. A. The Aquaculture of Groupers. Liao, I. C., Leaño, E. M. , Taiwan Asian Fisheries Society, World Aquaculture Society, The Fisheries Society of Taiwan, National Taiwan Ocean University, Taiwan Press. 207-224 (2008).
- Conti-Tronconi, B. M., et al. Alpha-bungarotoxin and the competing antibody WF6 interact with different amino acids within the same cholinergic subsite. Biochemistry. 30 (10), 2575-2584 (1991).
- Briggs, S., Price, M. R., Tendler, S. J. Fine specificity of antibody recognition of carcinoma-associated epithelial mucins: antibody binding to synthetic peptide epitopes. Eur J Cancer. 29 (2), 230-237 (1993).
- Chen, N. C., et al. Crystal Structures of a Piscine Betanodavirus: Mechanisms of Capsid Assembly and Viral Infection. PLoS Pathog. 11 (10), e1005203 (2015).
- Badani, H., Garry, R. F., Wimley, W. C. Peptide entry inhibitors of enveloped viruses: The importance of interfacial hydrophobicity. Biochim Biophys Acta. , (2014).
- Qureshi, N. M., Coy, D. H., Garry, R. F., Henderson, L. A. Characterization of a putative cellular receptor for HIV-1 transmembrane glycoprotein using synthetic peptides. AIDS. 4 (6), 553-558 (1990).
