Abstract
De identificatie van een antigeen epitoop door het immuunsysteem zorgt voor het begrijpen van het beschermingsmechanisme van neutraliserende antilichamen die de ontwikkeling van vaccins en geneesmiddelen peptide kan vergemakkelijken. Peptide scannen is een eenvoudige en efficiënte methode die rechtlijnig brengt de lineaire epitoop herkend door een monoklonaal antilichaam (mAb). Hier de auteurs presenteren een epitoop bepaling methodiek waarbij serieel afgeknotte recombinante eiwitten, synthetisch peptide ontwerp en dot-blot hybridisatie voor de antigene herkenning van nerveuze necrose virus manteleiwit met behulp van een neutraliserende mAb. Deze techniek is gebaseerd op de dot-blot hybridisatie van synthetische peptiden en mAbs op een polyvinylideenfluoride (PVDF) membraan. De minimale antigeen gebied van een viraal manteleiwit herkend door de RG-M56 mAb kan teruggebracht worden stap voor stap bijgesneden peptide mapping op een 6-meer peptide epitoop. Bovendien, alanine scanning mutagenese en residuen substitutie kan worden uitgevoerd om de binding betekenis van elke aminozuurrest die het epitoop karakteriseren. De resten aan weerszijden van de epitoop website bleken cruciale rol in peptide conformatie regelgeving spelen. Het geïdentificeerde epitoop peptide kan worden gebruikt om kristallen van epitoop peptide-antilichaam complexen een röntgendiffractie onderzoek en functionele concurrentie, of therapeutische vormen.
Introduction
In het immuunsysteem, de recombinatie van V-, D- en J-segmenten zorgt voor antilichamen tegen enorme variaties van complementariteitsbepalende gebieden (CDR's) te creëren voor binding aan verschillende antigenen aan de host pathogene infectie te beschermen. De verdediging neutraliserende antilichamen tegen antigenen afhankelijk van de ruimtelijke complementariteit van de CDR's van de antilichamen en de epitopen van de antigenen. Daarom zal een begrip van deze moleculaire interactie profylactisch vaccin ontwerp en therapeutische ontwikkeling peptide helpen. Dit kan echter neutralisatie interactie beïnvloed door zowel meerdere antigene domeinen van één antigeen en door meerdere CDR's van antilichamen, die bijgevolg het epitoop behandelingsprocedure complexer. Gelukkig is de ontwikkeling van hybridoma technologie, die afzonderlijke antilichaamproducerende cellen ondersteunen gen met myelomacellen, zorgt voor een constant delende partij cellen secrete een specifiek antilichaam, bekend als een monoklonaal antilichaam (mAb) 1. Hybridoma cellen die zuivere hoge affiniteit mAbs binden aan een enkele antigene domein van een specifiek antigeen. De verhouding van het antigeen-antilichaam gevestigde verschillende manieren, waaronder peptide scannen, kan worden gebruikt om het epitoop van een antigeen via de bijbehorende mAb te bepalen. Recente ontwikkelingen in de synthetische peptide technologie hebben het peptide scantechniek toegankelijker en handiger te voeren gemaakt. Kort samengevat, een set van overlappende synthetische peptiden worden geproduceerd volgens een doelantigeen sequentie en worden gekoppeld aan een vaste drager membraan mAb hybridisatie. Peptide scanning biedt niet alleen een eenvoudige manier aan het antilichaam bindingsgebied kaart, maar vergemakkelijkt ook aminozuur (aa) mutagenese met scannen of residu substitutie de bindingsinteractie tussen elke aa residu van het epitoop peptide en de CDR's van het antilichaam te beoordelen.
2, 3, 4. Het protocol omvat mAb preparaat, constructie en expressie van serieel afgeknotte recombinante eiwitten, synthetische peptiden overlappend ontwerp, dot-blot hybridisatie, alanine scanning en substitutie mutagenese. Gezien de hoge kosten van peptidesynthese, de stap van het serieel afkappen de recombinante eiwitten van een gewenst doeleiwit werd gewijzigd en het antigene gebied werd teruggebracht tot ongeveer 100 tot 200 aa resten voor het synthetische peptide matrix dot-blotanalyse werd uitgevoerd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bereiding van monoklonaal antilichaam
- De cultuur van de RG-M56 muis monoklonale hybridoomcellen 2 in serum-vrij medium in 175T kolven bij 37 ° C met 5% CO 2 te vullen. Verzamel de bovenstaande vloeistof wanneer de kleur van het medium wordt geel na vijf dagen incuberen.
OPMERKING: Hybridoma cellen werden gekweekt in serumvrij medium antilichaam verontreiniging uit foetaal runderserum voorkomen. - Centrifugeer de supernatant bij 4500 xg gedurende 30 min bij 4 ° C en werp de celresten pellet.
- Voeg 2 ml proteïne G agarose (geleverd als een 50% suspensie) aan een 5 ml kolom en equilibreren met 10 hars volumes (10 ml) ijskoude PBS.
- Load 200 ml van het antilichaam supernatant (stap 1.2) op de kolom en gooi de doorwerking.
- Voeg 10 ml ijskoude PBS om de kolom te wassen. Herhaal dit twee keer.
- Voeg 10 ml 50 mM glycine, pH 2,7 aan de kolom om het eiwit G-geassocieerde antilichaam te elueren. collect 900 ul fracties in een microcentrifugebuis met 100 ui 10x neutralisatie buffer (1 M Tris, 1,5 M NaCl en 1 mM EDTA, pH 8,0).
- Bewaar het gezuiverde antilichaam in 50% glycerol met 0,03% NaN3 bij -20 ° C.
2. Constructie en expressie van Serieel afgeknotte recombinante eiwitten
- Bereid een PCR reactiemengsel: 5 ui 10 x Pfu buffer, 0,2 mM van elk dNTP, 0,2 pM forward primer 3, 0,2 uM reverse primer 3, 2 mM MgSO4, 1 ng pET20b-1A59 3 plasmide-DNA, en 2,5 U ( eenheid) van Pfu DNA polymerase; voeg DDH 2 O tot een eindvolume van 50 ul.
- Run monsters in een automatische thermische cycler met de volgende parameters: Cyclus 1 (94 ° C gedurende 5 min); cycli 2-36 (94 ° C gedurende 30 seconden, 63 ° C gedurende 30 seconden, en 72 ° C gedurende 60 s); en cyclus 37 (72 ° C gedurende 7 min).
- Extraheer de polymerasekettingreactie (PCR) producten met behulp van een PCR zuivering kit 5 voor de volgende restrictie-enzymdigestie vergemakkelijken.
- Digest het PCR-geamplificeerde DNA-fragmenten met NdeI en XhoI-restrictie-enzymen en ligeren elk van deze DNA fragmenten in NdeI en XhoI-enzym geknipt pET-20b (+) vector. Transformeer de constructen in Escherichia coli DH-5α-competente cellen 6.
- Bereid het digestiemengsel in digestiebuffer (20 mM Tris-acetaat, 10 mM Mg (CH3COO) 2, 50 mM KCH 3 COO, en 1 mM DTT, pH 7,9) met 1 ug PCR-geamplificeerde DNA of pET-20b (+) vector DNA, en 2 U van NdeI en XhoI restrictie-enzymen in een uiteindelijk volume van 20 pl.
- Meng de spijsvertering mengsel voorzichtig en snel spin down. Incubeer bij 37 ° C gedurende 2 uur in een droge bad om te zorgen voor de volledige snijden van de beperking zittenes.
- Extraheer de restrictie-enzymen gedigereerde DNA-fragmenten onder toepassing van een PCR zuivering kit 5 onderstaande plasmideconstructie te vergemakkelijken.
- Bereid het ligatiemengsel in ligatiebuffer (66 mM Tris, 5 mM MgCl2, 1 mM ATP en 5 mM DTT, pH 7,5) met 100 ng voorverteerd, PCR-geamplificeerd DNA, 10 ng voorverteerd pET-20b (+) vector DNA en 5 U van T4 DNA ligase in een eindvolume van 10 pi.
- Meng de ligatiemengsel voorzichtig en snel spin down. Incubeer bij 16 ° C gedurende 18 h in een waterbad.
- Put 10 pi van het ligatiemengsel monsters in 100 ul van de DH-5α-competente cellen en meng voorzichtig alvorens de microcentrifugebuis op ijs gedurende 30 min. Zet de microcentrifugebuis in een droge bad bij 42 ° C gedurende 90 s aan heat shock 7 induceren. Onmiddellijk over de buis op ijs gedurende 2 minuten.
- Voeg 900 ul van Luria-Bertani (LB) bouillon (1% Bacto trypton, 0,5% Bacto gist extractiet en 0,5% NaCl, pH 7,0) aan de buis. Incubeer bij 37 ° C met 150 rpm schudden gedurende 45 minuten. Pellet de cellen door centrifugeren bij 4000 x g gedurende 10 min en gooi het supernatant.
- Resuspendeer de pellet met 50 pl LB-bouillon en uitgespreid elke transformatie op voorverwarmd LB platen met 100 ug / ml ampicilline. Incubeer de platen bij 37 ° C gedurende 16 uur.
- Ophalen van een enkele kolonie met een 200 ul tip en plaats deze in 3 ml LB-bouillon die 100 ug / ml ampicilline in een losjes afgedekte 15 ml buis. Incubeer bij 37 ° C met 150 rpm schudden gedurende 12 uur.
- Extraheer het plasmide-DNA 8 van elke kweek en de sequentie met behulp van T7-promotor en T7-terminator primers met de sequentie 9 bevestigen.
- Na sequentiebevestiging, transformatie 10 ng DNA uit deze pET-20b (+) plasmiden met verschillende lengtes van YGNNV manteleiwitgen in de BL-21 (DE3) stam van E. coli door onsing de heat-shock-methode 7. Volg de stappen 2.3.6-2.3.8 om de transformatie uit te voeren.
- Transfer een enkele kolonie van elke getransformeerde E. coli BL-21 cellen in 3 ml LB-bouillon die 100 ug / ml ampicilline in een losjes afgedekte 15 ml buis. Incubeer de cultuur bij 37 ° C met 150 rpm schudden.
- Koel de cultuur 25 ° C wanneer de OD 600 van de kweek ongeveer 0,6 en voeg IPTG tot een uiteindelijke concentratie van 0,4 mM om de expressie van het recombinante eiwit te induceren. Incubeer de cultuur voor een extra 4 uur bij 25 ° C met 200 rpm schudden.
- Breng 1 ml van de kweek in een microcentrifugebuis. Pellet de cellen door centrifugatie bij 12.000 xg gedurende 1 min en gooi het supernatant.
- Resuspendeer de celpellet in 100 pl denaturatie buffer (8 M ureum, 20 mM natriumfosfaat en 0,5 M NaCl, pH 7,4) door op en neer pipetteren met een micropipet. Meng door krachtig vortexen.
LET OP: Het monster solutions moet nu halftransparant, een beetje plakkerig en klaar voor de dot-blot hybridisatie assay.
3. Design en Synthese van overlappende peptiden
- Ontwerp en synthetiseren 3 seriële 20-meer peptiden die elk overlappen met zijn opvolger met 10 aa resten uit de 195-338 aa regio van het YGNNV manteleiwit om een beperking van het epitoop regio RG-M56 mAb door dot blotting.
- Ontwerp en synthetiseren 3 drie 8-mer peptiden (195 VNVSVLCR 202, 197 VSVLCRWS 204 en 199 VLCRWSVR 206) met een overlapping van 6 aa resten naar de volgende synthetische peptide om een beperking van het epitoop regio 195-206 aa door dot blotting.
- Ontwerp en synthetiseren 3 7-mer (196 NVSVLCR 202 en 195 VNVSVLC 201), 6-mer (195 VNVSVL 200, 196 NVSVLC 201 en 197 VSVLCR 202), en 5-meer peptiden (195 VNVSV 199, 196 NVSVL 200, 197 VSVLC 201 en 198 SVLCR 202) met een overlapping van 6, 5 en 4 aa-residuen,, op naburige peptiden aan het minimaliseren epitoopregio door dot blotting.
4. Dot-blot hybridisatie
- Ontbinden elke gesynthetiseerde peptide in dimethylsulfoxide (DMSO) tot een uiteindelijke concentratie van 10 mg / ml.
OPMERKING: Om de gevarieerde oplosbaarheid van synthetische peptiden te overwinnen, moeten alle synthetische peptiden worden opgelost in DMSO. DMSO is een goed oplosmiddel voor hydrofobe of hydrofiele peptiden volledig oplossen. - Week de polyvinylideenfluoride (PVDF) membraan met methanol gedurende 2 minuten.
OPMERKING: PVDF membraan tot 100% resistent DMSO; anderen kunnen niet zo zijn. - Equilibreren het PVDF membraan met gemodificeerd Towbin buffer (25 mM Tris, 192 mM glycine en 0,1% SDS, pH 8,3) voor2 minuten.
OPMERKING: 10-20% (v / v) methanol worden toegevoegd gemodificeerde Towbin buffer om de overdracht te verbeteren. - Spoel een stuk chromatografie papier met de gewijzigde Towbin buffer. Plaats de PVDF-membraan op de chromatografie papier. Wacht tot de gewijzigde Towbin buffer is verdwenen uit de PVDF membraanoppervlak voordat u doorgaat naar de volgende stap.
- Voeg 2 ul van elk monster peptide aan het membraan met een 10 pi tip. Lucht-drogen PVDF membraan op de chromatografie papier voor 10 min. Voeg elk peptide monster langzaam en geleidelijk op het membraan te veel diffusie te voorkomen.
- Blokkeer het membraan in TBST buffer (0,05% (v / v) Tween-20, 20 mM Tris en 150 mM NaCl, pH 7,4) met 5% magere melk gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur onder zachtjes schudden.
- Add RG-M56 mAb in een uiteindelijke verdunning van 1: 1000 in TBST buffer met 5% magere melk aan het membraan. Incubeer het membraan bij 37 ° C gedurende 1 uur onder zacht schudden.
- Verwijder het antilichaam zodatlutie. Was het membraan in TBST buffer gedurende 5 minuten onder zacht schudden. Herhaal dit twee keer.
- Voeg het tweede antilichaam (geit anti-muis IgG, Fc geconjugeerd alkalisch fosfatase) in een uiteindelijke verdunning van 1: 5000 in TBST buffer met 5% magere melk aan het membraan. Incubeer het membraan bij 37 ° C gedurende 1 uur onder zacht schudden.
- Gooi de antilichaamoplossing. Was het membraan in TBST buffer gedurende 5 minuten onder zacht schudden. Herhaal de wasstap tweemaal.
- Ontwikkeling van de membraan met BCIP / NBT substraatoplossing bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten in het donker. Stop de ontwikkeling door het wassen van de membraan met DDH 2 O wanneer het signaal wordt weergegeven.
- Air-droog het membraan en vast te leggen beeld de dot-blot met behulp van een afbeelding systeem.
- Meet de intensiteit van elke dot blot met behulp van software voor beeldanalyse 3.
5. Alanine Scanning en Substitutie
- Ontwerpen en synthetiseren van 3 alanine en methionine substitutie peptiden. Vervang elk aa residu met alanine voor de 8-meer peptide 195 VNVSVLCR 202 en synthetiseren peptiden 195 ANVSVLCR 202, 195 VAVSVLCR 202, 195 VNASVLCR 202, 195 VNVAVLCR 202, 195 VNVSALCR 202, 195 VNVSVACR 202, 195 VNVSVLAR 202, en 195 VNVSVLCA 202 . Vervang aa residu leucine 200 naar methionine aan de SJNNV genotype epitooppeptide VNVSVMCR 195 202 maken.
- Volg Deel 4 uit te voeren alanine scanning en substitutie mutagenese dot blotting.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het doel van dit experiment was om een epitoop te identificeren door middel van dot blotting met behulp van mAb. Snel en doeltreffend beperken het antigeen gebied herkend door mAb, met de volledige lengte en afgeknot serieel YGNNV recombinante manteleiwitten met 6xHis fusion label de C-terminus werden tot expressie gebracht vanaf een E. coli expressiesysteem PET 10 (Figuur 1A). De resulterende recombinante eiwitten werden gespot op het PVDF membraan met behulp RG-M56 mAb en anti-6xHis antilichaam voor dot-blot hybridisatie. De dot blotting openbaarde positieve signalen tegen 1-338 aa (full-length), 51-338 aa, en 195-338 aa, maar niet 1-100 aa of 1-200 aa recombinante eiwitten (Figuur 1B). De dot matrix gehybridiseerd tegen de anti-6xHis antilichaam en bevestigde de expressie van recombinante eiwitten. Deze gegevens geven aan dat de epitoop van RG-M56 mAb herkenning ligt in een 144-aa recombinant eiwit near de C-terminus van YGNNV coat eiwit (195-338 aa).
Vervolgens, seriële 20-mer peptiden met een 10 aa-residu-lange overlapt op hun buren werden ontworpen en gesynthetiseerd uit de sequentie van 144 aa-recombinant eiwit peptide scannen om een beperking van het epitoopgebied. Deze synthetische peptiden werden gespot op een PVDF membraan en onderworpen aan dot-blot hybridisatie onder toepassing RG-M56 mAb. Het resultaat toonde positieve signalen alleen het peptide 195-214 aa en de positieve controle, aa 195-338 recombinant eiwit (Figuur 2A). Aangezien de epitoop zich bevindt binnen het peptide 195-214 aa gebied maar niet het peptide 205-224 aa regio drie seriële 8-mer peptiden met 6-aa resten overlappen van aa residu 195-206 (peptiden aa 195-202, 197- 204 aa, en 199-206 aa) werden ontworpen en gesynthetiseerd. Dot-blot hybridisatie resultaten toonden positieve signalen op het peptide 195-202 aa en de positieve-controle peptide aa 195-214 middelsRG-M56 mAb (Figuur 2B).
Alanine scanning mutagenese en substitutie werden uitgevoerd om de specificiteit van elk aa residu van de 8-mer epitoop, 195 VNVSVLCR 202 evalueren. Elk aa residu van de 8-meer peptide werd individueel vervangen door alanine. De alanine mutatie peptide matrix werd vervolgens op een PVDF membraan met behulp van peptide 195-202 aa als een positieve controle. Dot-blot-analyse gaf aan dat de drie vervangen mutaties V197A, V199A en C201A, schafte de bindingsaffiniteit van RG-M56 mAb (Figuur 3A). Hoewel aa residu 200 in de SJNNV genotype epitoop methionine, in tegenstelling tot een leucine in de andere vier Betanodavirus genotype epitopen, de SJNNV genotype sequentie 195 VNVSVMCR 202, toonde positieve bindingsaffiniteit tegen RG-M56 mAb, zoals die van de positieve controle (Figuur 3A). Dit resultaat geeft aan dat de epitopen of alle Betanodavirus genotypen zijn te herkennen aan RG-M56 mAb. De bindingsaffiniteit van elke aa residu deelneemt aan de epitoop plaats werd verder gekwantificeerd door de signaalintensiteit van de dot blot van elke alanine vervanging door beeldanalyse software (Figuur 3B). De intensiteiten van de V197A, V199A en C201A substituties werden teruggebracht tot 10,2%, 18,6% en 8,5%, respectievelijk, vergeleken met die van de positieve controle (100%), terwijl de V195A, S198A, L200A, R202A, en L200M substituties werden hogere of gelijke intensiteiten als die van de positieve controle. Vermeldenswaard is dat de invloed van de kracht N196A substitutie dubbelzinnig, met een vermindering van 37,4% van de positieve controle. Deze resultaten geven aan dat V197, V199 en C201 zijn essentiële residuen voor de binding van RG-M56 mAb.
De alaninescanningmutagenese resultaten blijkt dat de aa resten V195, N196, en R202 kanworden vervangen door alanine, hetgeen impliceert dat de epitoopregio Verderop kan worden versmald aan beide uiteinden. Daarom is de stap-voor-stap bijgesneden peptidekartering tot 7-mer, 6-mer en 5-mer synthetische peptiden stap is ontworpen om de antigene regio minimaliseren. Het positieve signaal was aanwezig op het 6-meer synthetisch peptide NVSVLC 196 201, maar niet op de 7-meer en 5-mer synthetische peptiden (Figuur 4). Deze gegevens geven aan dat de minimale epitoop van NNV manteleiwit herkend door RG-M56 mAb is het 6-meer peptide, 196 NVSVLC 201.
Figuur 1: Vermindering van het epitoopgebied via serieel afgeknotte recombinante eiwitten en monoklonale antilichamen. (A) Kaart van serieel afgeknotte recombinant NNVCPs. NNVCP 1-338 aa volledige lengte manteleiwit. (B) Dot-blot-analyse van recombinant NNVCPs. Links: Kaart van de serie afgekapt YGNNV recombinante manteleiwitten op de PVDF-membraan. Midden: het dot-blot analyse werd uitgevoerd met anti-6xHis antilichaam. Rechts: De dot-blot analyse werd uitgevoerd met behulp van RG-M56 mAb. NNVCP: nerveuze necrose virus manteleiwit; aa: aminozuur; PVDF: polyvinylideenfluoride; N: N-terminus; C: C-terminus; mAb: monoklonaal antilichaam. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Fijne kaart brengen van het epitoop regio met behulp van synthetische peptiden. (A) Linker: aminozuursequenties van het 20-meer synthetische peptiden werden uitgelijnd NNVCP aa 195-338; elke voorgaande peptide had een 10 aa-residu-lange overlap met de volgende peptide. Rechts: Kaart van de synthetic peptiden op het PVDF membraan. Recombinant NNVCP 195-338 aa werd gebruikt als een positieve controle. De dot-blot analyse werd uitgevoerd met RG-M56 mAb. (B) Linker: Aminozuursequenties van de 8-mer synthetische peptiden, aa 195-202, 197-204 aa en aa 199-206; elke voorgaande peptide had een 6 aa-residu-lange overlap met de volgende peptide. Synthetisch peptide aa 195-214 werd toegepast als een positieve controle. Rechts: De dot-blot analyse werd uitgevoerd met behulp van RG-M56 mAb. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Alanine scanning en substitutie mutagenese van de 195 VNVSVLCR 202 epitoop. (A) Aminozuursequenties van substitutie mutagenese en dot-blot-analyse. Elke aa residue van het epitoopgebied, aa 195-202, werd individueel vervangen door alanine. L200M substitutie is de SJNNV genotype sequentie aan het Betanodavirus manteleiwit epitoop regio. Synthetisch peptide aa 195-202 werd toegepast als een positieve controle. Het vervangen aa residuen zijn onderstreept. (B) Kwantificering van de dot blot signaal bindingsaffiniteit. De signaalintensiteit van de positieve controle (195-202 aa) werd bepaald als 100%. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Minimum epitoop vastberadenheid. De 7-mer (A), 6-mer (B) en 5-mer (C) synthetische peptiden aa 195-202 werden gebruikt om de minimale epitoop herkend door RG-M56 mAb identificeren. synthetische Peptide aa 195-202 werd toegepast als een positieve controle. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit protocol biedt een snelle en eenvoudige techniek om een lineaire mAb herkende epitoop te identificeren. Gezien de kosten van peptidesynthese en de productie-efficiëntie van het synthetiseren van peptiden de antigene gebied van het virus manteleiwit werd verminderd tot expressie serieel afgeknotte recombinante eiwitten voor peptide-scanning analyse. Als zodanig werd het betrouwbaar en doelmatig pET E. coli expressiesysteem gebruikt om deze serieel afgeknotte recombinante eiwitten, recombinante eiwitten met molecuulgewichten tussen 10 en 50 kDa kunnen eenvoudig worden uitgedrukt door dit systeem. Zo kan het epitoop eenvoudig worden teruggebracht tot een handelbaarder 100-200 aa regio. De pET-20b (+) vector werd speciaal gekozen, omdat het een sequentie die codeert voor de expressie van 6xHis-markeringen, waardoor de geproduceerde 6xHis-tag fusie-eiwitten voor immunologisch gebruikmaking van een anti-6xHis antilichaam om de expressie van de bevestiging bevat recombinant proteins. De geproduceerde recombinante manteleiwitten werden vervolgens geanalyseerd met behulp van RG-M56 mAb via een dot-blot hybridisatie assay. Een alternatieve werkwijze voor het recombinant eiwit epitoop oordeel is, de tot expressie gebrachte recombinante eiwitten via geïmmobiliseerde metaalion affiniteitschromatografie 10 zuiveren, scheiden de recombinante eiwitten met SDS-polyacrylamide gelelektroforese en Western blot analyse uitgevoerd 3.
Verdere en fijn in kaart epitoop locatie bepaald door de resultaten van de dot-blot-hybridisatie-analyse met serieel afgeknotte recombinante eiwitten werden overlappende synthetische peptiden met verschillende afmetingen gemaakt. Van de verschillende mogelijke lengten van synthetische peptide te synthetiseren, 20-mer met 10 aa-residu-lange overlappende peptiden werden eerst geselecteerd in het peptide scannen, zowel hun hoge synthese zuiverheid (ongeveer 90%) en hun peptidenlengte genoeg voor de zoektocht naar de continue epitope herkend door B-cel antilichaam 11. De nauwkeurigheid en zuiverheid van gesynthetiseerde peptiden afnemen als de gesynthetiseerde peptide langer. Zo werd het epitoopgebied snel af tot ongeveer 10 aa residuen lang. Na seriële 8-mer overlappende peptiden werden ondervraagd, was het lineaire epitoop regio gedefinieerd 195-202 aa peptide. Vervolgens alaninescanning van het 8-mer peptide epitoop toont de kritische bindingsaffiniteit sterkte van elk aa residu, waardoor het zoeken naar de minimale epitoop. De essentiële rol van de V197, V199, en C201 aa resten impliceert dat de lineaire epitoop regio beslaat ten minste 5 aa residu's, van 197 tot 201. Bovendien kan aa resten V195, N196, en R202 worden vervangen door alanine, zonder volledig te verliezen binding affiniteit, wat aangeeft dat het epitoop gebied kan worden verlaagd tot 7, 6, 5 of zelfs aa residuen lang. Kleine peptide sequenties kunnen gemakkelijk en economisch worden gesynthetiseerd voor het zoeken naar lineaire (continuous) epitopen. Echter, deze synthetische peptide scantechniek is niet geschikt voor de bepaling van een discontinue epitoop van een antilichaam, indien het wordt gecombineerd met epitoop excisie en massaspectrometrische analyses 12.
In dit protocol werd een dot-blot hybridisatie techniek wordt het lineaire epitoop van een mAb te zoeken. Dot-blot hybridisatie is een eenvoudige maar effectieve methode. In het begin van het onderzoek, wanneer het epitoop regio wordt versmald van een grootschalige landschap, de belangrijkste zorg is een positief of negatief signaal waarnemen na hybridisatie van het antilichaam aan een doelwit-membraaneiwit, zoals de meeste mAbs binden aan een specifiek epitoop van een antigeen eiwit (figuren 1 en 2). Echter, bij gebruik van dot-blot hybridisatie aan de binding beschikbaarheid van elke aa residu binnen de epitoop gebied tegen het antilichaam staand zoals door alanine substitutie mutagenesehet signaal intensiteit van elke vervangen aa residu bepaald door dot blotting moeten worden verwerkt in het algemeen bindend betekenis. Dat signaalintensiteit gemakkelijk gekwantificeerd worden met beeldanalyse software (figuur 3B) of een densitometer. Als alternatief kan een enzymgekoppelde immuno-sorbent assay (ELISA) worden uitgevoerd om de mate van bindingsaffiniteit en de resulterende signaalsterkte 3 kwantificeren.
In de vorige studie, uitsluitend manteleiwit van niet-envelop nerveuze necrose virus-immuno herkend door mAb's 10 met een hoge neutralisatie-indexwaarde tussen 6,5-4,5 (log 10 NI) 2. De zeer specifieke herkenning vermogen van de mAbs werden verder gebruikt voor de ontwikkeling van de eenstaps snelle immunochromatografische diagnostische kit voor de detectie van geïnfecteerde vis NNV 13. De antigene epitoop van nerveuze necrose virus manteleiwit werd erkend door de RG-M18mAb als een 8-meer peptide, 195 VNVSVLCR 202 3, waardoor een nieuw NNV receptor werd geïdentificeerd (ongepubliceerde gegevens). In het onderhavige onderzoek werd het epitoop van nerveuze necrose manteleiwit verder teruggebracht tot een 6-meer peptide, 196 NVSVLC 201, door de andere mAb, RG-M56.
Het is onverwacht dat twee 7-mer peptiden (196 NVSVLCR 202 en 195 VNVSVLC 201) bevattende 6-meer peptide NVSVLC 196 201 niet door RG-M56 mAb (Figuur 4A) herkend. Een redelijke interpretatie is dat, hoewel de omringende residuen R202 en V195 kan niet direct bijdragen aan de bindingsinteractie tussen het epitoop en antilichamen, de flankerende resten beïnvloeden de vorming van de juiste conformatie van peptide antilichaamherkenning. Het uiterlijk van de V195 of R202 op hun flankerende terminus alleen kan de synthetische peptide contortconformatie voor erkenning antilichaam en bindend. De epitoop conformatie wordt aangedreven door de kracht van beide uiteinden, V195 en R202, die met elkaar in evenwicht in de 8-mer synthetische peptide, 195 VNVSVLCR 202, en tegengewerkt in het 6-meer synthetisch peptide, 196 NVSVLC 201. De aa residu's, V195, N196, en R202, kunnen afzonderlijk worden vervangen door alanine zonder volledig verlies van bindingsvermogen en dus het alanine scanning mutagenese resultaten geven aan dat deze drie aa residu's geen belangrijke rol spelen bij de herkenning en binding van RG -M56 mAb. Echter, na het trimmen één residu van het 6-meer synthetisch peptide, 196 NVSVLC 201, het 5-meer peptide, 197 VSVLC 201 zonder N196 in het N-eindstandige flankerende gebied, verliest het vermogen om herkend en gebonden door RG -M56 mAb (Figuur 4C). Dit resultaat suggereert dat de N196 residu kan ook plegt een belangrijke rol in het flankerende gebied van het epitoop op de juiste conformatie epitoop stabiliseert om de herkenning en binding van RG-M56 mAb vergemakkelijken. Het belang van flankerende residuen rond het epitoopgebied was ook onderzocht door andere antigeen-antilichaambindingsonderzoeken. De betekenis van aa flankerende residuen rond de α-bungarotoxine epitoop gebied voor de binding van antilichamen werd onderzocht met verschillende aa substituties binnen dezelfde cholinerge subsite. Zij werden vervolgens geëvalueerd als essentieel lijkt, invloedrijk of niet invloed 14. Ook werd gevonden dat de specificiteit van het antilichaam herkende epitoop van carcinoom geassocieerde mucinen epitheliale verder kan worden beïnvloed door flankerende aa resten. Deze effecten kunnen conformatie belemmeringen die de binding van een antilichaam kan belemmeren tegen een epitoop 15 aanwezig.
De 6-mer epitoop, 196 NVSVLC 201 </ Sub>, heeft extreem hydrofobe eigenschappen, vier hydrofobe residuen, waaronder twee valines (197 en 199), een leucine (200) en een cysteïne (201) (gereduceerde vorm). Residuen V197, V199 en C201 zijn essentieel voor RG-M56 mAb herkenning en binding, zoals bepaald door alanine scanning mutagenese. De epitoop regio was gelegen aan een van de acht anti-parallelle β-strengen van de shell domein (S-domein) van de NNV manteleiwit 16. Het is interessant dat het epitoop niet op het buitennok domein, maar verbergt de jelly-roll structuur van het S-domein onder andere antiparallelle β-strengen. Het epitoop met hoge hydrofobiciteit, kan een stabielere micro dit depressie verkrijgen. Bovendien is de VNVSVLCR 195 202 3 van het peptide-epitoop werd gevonden aan de verspreiding van de reuzendtandbaarzen nerveuze necrose in grouper hersencellen belemmeren. Daarom werd dit epitoop peptide voorgesteld om mede tempetitor betrokken bij de receptor-bindende domein nodig is voor virale binnenkomst 3. De hypothese was dat peptide entry inhibitoren bestaande uit hydrofobe en / of amfipathische resten kunnen de fysieke bouw en chemie van celmembraan interfaces veranderen en kan de fusie van cellulaire en virale membranen 17 belemmeren. Bovendien hebben vele synthetische peptide entry inhibitoren sterke remmende eigenschappen tegen diverse virusinfecties 17, 18 getoond. Aldus kan het geïdentificeerde epitoop peptide met hydrofobe residuen en sterke toetreding remming tegen infectie NNV de ontwikkeling van therapeutische peptide drugs faciliteren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hybrid-SFM medium | Gibco | 12045-076 | |
| Dulbeccos's Phophate-Buffered Saline (PBS) | Gibco | 21600-069 | |
| Pfu DNA Polymerase | Thermo Scientific | EP0502 | Including buffers |
| T4 DNA Ligase | Roche | 10799009001 | Including buffers |
| NdeI | New England Biolabs | R0111S | Including buffers |
| XhoI | New England Biolabs | R0146S | Including buffers |
| pET-20b(+) vector | Novagen, Merck Millipore | 69739 | |
| E. coli DH-5α competent cell | RBC Bioscience | RH617 | |
| E. coli BL-21(DE3) competent cell | RBC Bioscience | RH217 | |
| Ampicillin | Amresco | 0339-25G | |
| LB broth | Invitrongen | 12780-052 | |
| Isopropylthio-β-D-thiogalactoside (IPTG) | MDBio, Inc. | 101-367-93-1 | |
| Methanol | Merck Millipore | 106009 | |
| Polyoxyethylene 20 Sorbitan Monolaurate (Tween-20) | J.T.Baker | X251-07 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | |
| Glycine | Amresco | 0167-5KG | |
| Tris | Affymetrix, USB | 75825 | |
| NaCl | Amresco | 0241-1KG | |
| EDTA | Amresco | 0105-1KG | |
| Glycerol | Amresco | 0854-1L | |
| NaN3 | Sigma | S2002-500G | |
| BCIP/NBT | PerkinElmer | NEL937001PK | |
| Goat Anti-Mouse IgG, Fc fragment antibody | Jackson ImmunoResearch | 115-055-008 | |
| Immobilon-P (Polyvinylidene fluoride, PVDF) | Merck Millipore | IPVH00010 | |
| Protein G Agarose Fast Flow | Merck Millipore | 16-266 | |
| QIAquick PCR Purification kit | Qiagen | 28106 | |
| UVP BioSpectrum 600 Image System | UVP | n/a | |
| VisionWorks LS Analysis Software Ver 6.8 | UVP | n/a | |
| MyCycler thermal cycler | BioRad | 1709713 |
References
- Milstein, C., Kohler, G. Clonal variations of myelomatous cells (proceedings). Minerva Med. 68 (50), 3453 (1977).
- Lai, Y. S., et al. In vitro neutralization by monoclonal antibodies against yellow grouper nervous necrosis virus (YGNNV) and immunolocalization of virus infection in yellow grouper Epinephelus awoara (Temminck & Schlegel). J Fish Dis. 24 (4), 237-244 (2001).
- Chen, C. W., Wu, M. S., Huang, Y. J., Cheng, C. A., Chang, C. Y. Recognition of Linear B-Cell Epitope of Betanodavirus Coat Protein by RG-M18 Neutralizing mAB Inhibits Giant Grouper Nervous Necrosis Virus (GGNNV) Infection. PLoS One. 10 (5), 0126121 (2015).
- Lai, Y. -S., et al. Propagation of yellow grouper nervous necrosis virus (YGNNV) in a new nodavirus-susceptible cell line from yellow grouper, Epinephelus awoara (Temminck & Schlegel), brain tissue. J Fish Dis. 24 (5), 299-309 (2001).
- Lougee, E., Morjaria, S., Shaw, O., Collins, R., Vaughan, R. A new approach to HLA typing designed for solid organ transplantation: epityping and its application to the HLA-A locus. Int J Immunogenet. 40 (6), 445-452 (2013).
- Radulovich, N., Leung, L., Tsao, M. S. Modified gateway system for double shRNA expression and Cre/lox based gene expression. BMC Biotechnol. 11, 24 (2011).
- Froger, A., Hall, J. E. Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. J Vis Exp. (6), e253 (2007).
- Pronobis, M. I., Deuitch, N., Peifer, M. The Miraprep: A Protocol that Uses a Miniprep Kit and Provides Maxiprep Yields. PLoS One. 11 (8), e0160509 (2016).
- Metzker, M. L.
- Chiu, C. C., John, J. A., Hseu, T. H., Chang, C. Y. Expression of ayu (Plecoglossus altivelis) Pit-1 in Escherichia coli: its purification and immunohistochemical detection using monoclonal antibody. Protein Expr Purif. 24 (2), 292-301 (2002).
- Atassi, M. Z. Antigenic structures of proteins. Their determination has revealed important aspects of immune recognition and generated strategies for synthetic mimicking of protein binding sites. Eur J Biochem. 145 (1), 1-20 (1984).
- Opuni, K. F., et al.
- Chang, C. Y., Chiu, C. C., Christopher John, J. A. The Aquaculture of Groupers. Liao, I. C., Leaño, E. M. , Taiwan Asian Fisheries Society, World Aquaculture Society, The Fisheries Society of Taiwan, National Taiwan Ocean University, Taiwan Press. 207-224 (2008).
- Conti-Tronconi, B. M., et al. Alpha-bungarotoxin and the competing antibody WF6 interact with different amino acids within the same cholinergic subsite. Biochemistry. 30 (10), 2575-2584 (1991).
- Briggs, S., Price, M. R., Tendler, S. J. Fine specificity of antibody recognition of carcinoma-associated epithelial mucins: antibody binding to synthetic peptide epitopes. Eur J Cancer. 29 (2), 230-237 (1993).
- Chen, N. C., et al. Crystal Structures of a Piscine Betanodavirus: Mechanisms of Capsid Assembly and Viral Infection. PLoS Pathog. 11 (10), e1005203 (2015).
- Badani, H., Garry, R. F., Wimley, W. C. Peptide entry inhibitors of enveloped viruses: The importance of interfacial hydrophobicity. Biochim Biophys Acta. , (2014).
- Qureshi, N. M., Coy, D. H., Garry, R. F., Henderson, L. A. Characterization of a putative cellular receptor for HIV-1 transmembrane glycoprotein using synthetic peptides. AIDS. 4 (6), 553-558 (1990).
