Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

דנדרימר מבוססי Nanopatterns לא אחיד כדי מקומית משטח שליטה Adhesiveness: שיטה ישירה בידול Chondrogenic

Published: January 20, 2018 doi: 10.3791/56347
Automatic Translation
1,2, 3,1, 1, 4,5, 4,5, 4,5, 6, 3,6, 1,3,7, 8,3, 8,3,5, 1,3,2
1Institute for Bioengineering of Catalonia (IBEC), The Barcelona Institute of Science and Technology (BIST), 2Department of Engineering Electronics, University of Barcelona (UB), 3Networking Biomedical Research Center (CIBER), 4Instituto de Investigacin Biomédica de Málaga (IBIMA), Department of Organic Chemistry, Universidad de Málaga (UMA), 5Andalusian Centre for Nanomedicine and Biotechnology-BIONAND, 6Unidad de Bioingeniería Tisular y Terapia Celular (GBTTC-CHUAC), Grupo de Reumatolog ía, Instituto de Investigación Biomèdica de A Coruña (INIBIC), Complexo Hospitalario Universitario de A Coruña (CHUAC), Sergas, Universidade da Coruña (UDC), 7Institució Catalana de Recerca i Estudis Avançats (ICREA), 8Instituto de Investigación Biomédica de Málaga (IBIMA), Department of Cell Biology, Genetics and Physiology, Universidad de Málaga (UMA)

Summary

שיטה להשיג nanopatterns לא אחידה מבוססי דנדרימר כי היתר שליטה ננו של מקומיים ארגינין-גליצין-אספרטית חומצה (RGD) משטח צפיפות תיאר, הוחל על המחקר של תאית התמיינות אדהזיה ו- chondrogenic.

Abstract

אדהזיה הסלולר ובידול הוא נעשים על ידי חיסול הננומטרי הרכיבים מטריצה חוץ-תאית (ECM), עם ריכוזים המקומי יש השפעה גדולה. כאן אנו מציגים שיטה להשיג בקנה מידה גדול nanopatterns לא אחידה של ארגינין-גליצין-אספרטית (RGD)-dendrimers functionalized, כי היתר שליטה ננו של RGD מקומיים על פני השטח צפיפות. Nanopatterns נוצרות על ידי משטח ספיחה של dendrimers של פתרונות בריכוזים שונים ראשונית מאופיינים זווית מגע מים (CA), photoelectron הספקטרומטריה (XPS), ועל סריקת בדיקה מיקרוסקופיית טכניקות כגון מיקרוסקופ מינהור סריקה מנהור, מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM). הצפיפות השטח המקומי של RGD נמדד באמצעות AFM תמונות באמצעות הסתברות ומפות מתאר של מרחקים interparticle מינימלי, ואז בקורלציה עם התגובה אדהזיה תא ובידול. השיטה nanopatterning המובאת כאן היא הליך פשוט וניתן לשנותם ובצורה ישירה על פני אזורים נרחבים. הוא ולכן הוא תואם באופן מלא עם תא תרבות פרוטוקולים, ניתן להחיל על אחרים ליגנדים זה להפעיל תלויי-ריכוז השפעות על תאים.

Introduction

כאן נתאר פרוצדורה פשוטה ופסיביות מבוססי דנדרימר nanopatterning להשיג משטחים התרבות תאים המאפשרים השליטה של adhesiveness המקומי ב הננומטרי... דווחו הננומטרי פרטים של ארגון ה-ECM,2,1,3 ואת nanopatterning של התא אדהזיה משטחים סיפקה תובנות הדרישות הסלולר הקשורים הידבקות4, 5. ניסויים באמצעות micellar nanopatterns מבוססי ליתוגרפיה חשף ערך סף של 70 nm עבור RGD פפטיד nanospacing, אדהזיה תא שעיכבו באופן משמעותי מעל זה ערך6,7,8 ,9. מחקרים אלה מודגש גם השפעה גדולה של מקומיים יותר. צפיפות ליגנד הכללית תא אדהזיה9,10,11.

במהלך מורפוגנזה, תא אינטראקציות עם הסביבה לעורר את האירועים בידול הראשון, אשר ממשיכים עד נוצר סופית רקמה מורכבת מבני. במסגרת זו, משטחים nanopatterned שימשו כדי להתמודד עם השפעת הגומלין תא-פני הראשונית על מורפוגנזה. מבוסס-ליתוגרפיה nanopatterns RGD עם ריווח לרוחב של 68 nm בβ-סוג Ti-40Nb סגסוגות עזרה לשמור על פנוטיפ מובחן של תאי גזע שאינו מחויב12, בעוד nanospacings RGD של בין 95 ו 150 nm לשפר את הבידול של גזע mesenchymal (MSCs) כלפי adipogenic/osteogenic13,14,15 ו- chondrogenic הגורל16. גם מקרומולקולות וההספק עצמית ששינה עם איתות רכיבים הוכחו ישיר אדהזיה תא ובידול על-ידי מתן ויסות ה-רמזים איתות17אדריכלי ננו. בהקשר זה, נעשה שימוש בתצהיר של dendrimers עם אינטראקציה תא moieties שלהם בתחום החיצוני18,19,20 על משטחי ללמוד תא אדהזיה21,22, מורפולוגיה23,24, הגירה אירועים25,26. עם זאת, חוסר אפיון משטח במחקרים אלה מקשה להקים שום קורלציה בין תצורת משטח דנדרימר ותגובת התא.

ניתן להשיג דנדרימר nanopatterns עם נוזל דמוי סדר ומרווח מוגדר כאשר dendrimers לספוח משטחים טעון-נמוך מפתרונות עם עוצמות יוניים נמוך. 27 על בסיס מאפיין זה, כאן אנו מציגים שיטה להשיג בקנה מידה גדול nanopatterns לא אחידה של RGD-functionalized dendrimers על משטחים נמוכה טעונה היתר שליטה ננו של צפיפות המשטח RGD מקומיים. זווית מגע של מים (CA), photoelectron הספקטרומטריה (XPS), סריקת בדיקה מיקרוסקופיית טכניקות (nanopatterns ה-STM, AFM) הצג כי צפיפות ליגנד מקומי יכול להיות מותאם שינוי הריכוז ההתחלתי דנדרימר בפתרון. צפיפות המשטח RGD המקומי לכמת AFM תמונות מאת ההסתברות ומפות מתאר של מרחקים interparticle מינימלי, ואז בקורלציה עם ניסויים התא. לעומת שיטות אחרות nanopatterning4, nanopatterning מבוססי דנדרימר פשוטה, ניתן בקלות לשנות פני שטחים גדולים, ובכך להיות תואם באופן מלא עם יישומים התרבות תאים. Nanopatterns משמשים בשם דיאלקטריים ביו כדי להעריך את השפעת הצפיפות השטח המקומי RGD תא אדהזיה28 וממשיך את אינדוקציה chondrogenic של MSCs אדם מבוגר29. התוצאות שלנו מראים כי RGD מבוססי דנדרימר nanopatterns לקיים את צמיחת תאים כי התא אדהזיה זה מתחזק גבוהה מקומיים RGD צפיפות המשטח. בניסויים בידול, adhesiveness ביניים של תאים סובסטרטים העדיף MSC עיבוי ובידול chondrogenic המוקדמות. בשל הקלות עם דנדרימר אשר ניתן לשנות קבוצות היקפיים, השיטה המתוארת כאן ניתן להרחיב הלאה כדי אחר ליגנדים ECM זה להפעיל תלויי-ריכוז השפעות על תאים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הכנת הרקע

  1. חישול 1.4 x 1.1 ס מ Au(111) על מישה סובסטרטים.
    1. מניחים את המצע Au(111) על כיריים זכוכית קרמיקה, anneal זה עם להבה בוטאן במשך 3 דקות אפשר את המצע להתקרר תחת אווירה ארגון. חזור על שלב זה עבור כל המצע Au(111).
      הערה: Au(111) סובסטרטים אמור לשמש מיד לאחר חישול.
  2. הכנת פוליפוני (חומצה לקטית-L) (PLLA)-מצופה זכוכית סובסטרטים.
    1. לחתוך ולשטוף את השקופיות זכוכית.
      1. חותכים שקופיות מיקרוסקופ לתוך שקופיות 18 של 1.25 ס מ x 1.25 ס מ עם חותך עצה היהלומים. להפוך כניסה קטן בצד התחתון של כל שקופית, כך הצד העליון והתחתון ניתן להבחין מאוחר יותר.
      2. לשטוף את השקופיות ביסודיות עם מים יונים ואחריו אתנול 96%. לאפשר להם מילה נהדרת...
    2. הכינו את הפתרון PLLA של 2%.
      1. להוסיף 200 מ ג של PLLA 10 מ של 1, 4-dioxane צינור לחץ. הוספת סרגל מערבבים וסגור את הצינור בחוזקה.
      2. למקם את צינור לחץ אמבט גליצרין על פלטה חמה ב 60 מעלות צלזיוס תחת ערבוב עדין במשך 24 שעות, ולאחר מכן להעביר את הפתרון כדי בקבוקון זכוכית 15-mL.
    3. ציפוי בשקופיות זכוכית עם הפתרון PLLA.
      1. למקם את שקופיות זכוכית, את המבחנה עם הפתרון PLLA על פלטה חמה נקי ב 60 מעלות צלזיוס. הקפידו למקם את השקופיות פונה כלפי מעלה, לאפשר להם להישאר לפחות 10 דקות להגיע הטמפרטורה הדרושים.
      2. להכין את coater ספין ולהגדיר את תוכנית המצוינים בטבלה 1.
      3. במקום אחד של הפנים שקופיות למעלה על coater ספין, באמצעות מערכת ואקום. עם פיפטה פסטר, להחיל 0.25 mL של הפתרון PLLA על השקופית, כדי לוודא כי המשטח כולו מכוסה. הפעל את התוכנית ציפוי. חזור על שלב זה עבור כל שקופית.

2. דנדרימר Nanopatterning

  1. הכנת דנדרימר RGD-Functionalized (RGD-Cys-D1) 28 פתרונות.
    1. להמיס 5 מ"ג של דנדרימר ב 6.494 מ ל מים יונים. זהו פתרון א
      הערה: השתמש פתרון מניות דנדרימר בתוך 6 חודשים של הכנה.
    2. Sonicate פתרון A 10 דקות והכן פתרונות B ו- C בעקבות בטבלה 2.
    3. Sonicate פתרון C עבור 10 דקות והכן פתרונות D, E ו- F בעקבות בטבלה 2.
    4. לאחסן פתרונות B, C, D, E ו- F-4 ° C עד השימוש. פתרון A ניתן לאחסן ב-20 ° C לשימוש מאוחר יותר.
  2. Nanopatterning של Dendrimers RGD-Cys-D1-מצעים
    1. בשכונה תרביות רקמה, לעקר את סובסטרטים מאת בין אותם עם אור UV עבור 13 דקות.
      הערה: שלב זה נחוץ רק כאשר nanopatterned סובסטרטים עומדים לשמש תא תרבות סובסטרטים. במקרה זה, לשמור על התנאים סטרילי (תרביות רקמה הוד, חומרים סטרילי, פתרונות וטכניקות) עבור השלבים הבאים.
    2. מקם כל הפנים המצע את הבארות של צלחת, מטפל בהם בזהירות עם פינצטה.
    3. Sonicate פתרונות B, C, D, E ו- F עבור 10 דקות.
    4. עוברים את הפתרונות דנדרימר RGD-Cys-D1 קוטר 0.22-מיקרומטר מסנן באמצעות מזרק ישירות הבארות המכיל את מצעים (2 מ ל/טוב). לפחות שלושה העתקים לכל דנדרימר ריכוז מומלץ. לסגור, לסגור את הצלחת ולהשאיר אותה בטמפרטורת החדר (RT) עבור 16 h.
    5. להסיר ולמחוק את הפתרונות. לשטוף את מצעים עם מים יונים סטרילי ויבש. חנות מצעים ב 4 º C.
      הערה: הפרוטוקול אפשר לעצור כאן.

3. הכנת מצעים שליטה

הערה: כל השלבים בוצעו בפתרונות תרביות רקמה סטרילי הוד, רק חומרים סטרילי, ושימשו בטכניקות. . לפחות שש לשלוט סובסטרטים היו בשימוש (שלושה העתקים של הפקד חיובי), שלושה העתקים של הפקד שלילי.

  1. בשכונה תרביות רקמה, לעקר את סובסטרטים מאת בין אותם עם אור UV עבור 13 דקות.
  2. שליטה סובסטרטים לניסוי אדהזיה פיברובלסט.
    1. השתמש annealed להבה Au(111) סובסטרטים של הפקד שלילי. זהב יש השפעה ידועה דנטורציה של חלבונים זה מקנה מאפייני דבק אנטי-תא28. Sonicate כל הפתרונות ולסנן לפני המצע הדגירה.
    2. עבור הפקדים חיובית, לטבול annealed להבה Au(111) סובסטרטים בפתרון של פג RGD-השתנה תיול, Ac-Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Asp-NH-ethylene גליקול מונו-11-mercaptoundecanamide (RGD-פג-SH)30 , triethylene גליקול מונו-11-mercaptoundecyl אתר (פג-SH) ביחס של שן טוחנת מטריים אתנול 96% עבור 16 h RT.
    3. לכבס מצעים ביסודיות אתנול, לייבש אותם עם ארגון. חנות מצעים ב 4 º C.
  3. מצעים הבקרה עבור Chondrogenesis.
    1. השתמש סובסטרטים PLLA הבתוליים של הפקד שלילי. ללא טיפול פני שטח, PLLA מראה עניים ממשק עם תאים חיים. 31
    2. עבור הפקדים חיובית, להכין 5 מ של 0.1 mg/mL fibronectin בתוך תמיסת מלח באגירה פוספט (PBS), דגירה לכל סובסטרט PLLA מ ל 1.6 של הפתרון fibronectin עבור h 1-RT.
    3. להסיר, למחוק את הפתרון fibronectin, לשטוף את מצעים עם PBS. חנות מצעים ב 4 º C.

4. אפיון משטח

  1. AFM הדמיה
    1. בצע AFM הדמיה של סובסטרטים PLLA עבור ניתוח חספוס. מכיוון dendrimers בקוטר של 4-5 nm, בערכי חספוס של 1 ננומטר צריכה להתקבל עבור החזיית נכונה nanopatterns. כמו כן, לבצע AFM הדמיה של nanopatterns. בשני המקרים, לבצע AFM הקשה מצב באוויר.
    2. בחר שלוחה של סיליקון עם האביב קבוע k = 40 N/m וν לתדר המתאים של = 300 kHz, הר זה על הציוד AFM.
    3. הר המדגם על הבמה של מיקרוסקופ כוח אטומי. בהתאם הסידור של המנגנון, כוונון של הדמיה מפרטים עשויות להשתנות. התייעץ עם המדריך של היצרן.
    4. גישת המדגם עם קצה המיקרוסקופ עד מגע.
    5. לשיקוף PLLA לניתוח חספוס, בחר לפחות ארבעה תחומי 20 x 20 מיקרומטר לכל המצע נציג שלושה סובסטרטים עצמאית. תמונה דנדרימר nanopatterns, לבחור לפחות שלושה להחליפן בתמונות של 5 × 5 מיקרומטר לכל סובסטרט של שלושה סובסטרטים עצמאית לכל תנאי (דנדרימר הראשונית ריכוז בתמיסה). כדי למנוע נזק לשכבת דנדרימר תוך הדמיה, להתאים את שנקבעה מראש כדי לשמור על הכוח לכל הפחות.
      הערה: הבחירה של אזור ההדמיה תלויה גם טווח עבודה של הסורק פיזואלקטריים. נא עיין במדריך כלי בהקשר זה.
    6. תהליך הגובה AFM תמונות על-ידי הזזת כל סריקת קו פולינום החלקה פונקציות שימוש בתוכנה קניינית של היצרן של המנגנון AFM, לנתח את אלה של PLLA לחישוב חספוס פני השטח. שורש-ממוצע מרובע (RMS) ניתוח עשוי לספק אופציה מתאימה.
  2. מדידת צפיפות המשטח RGD מקומיים.
    1. להשיג את הסף תמונה של גובה מעובד AFM תמונות כדי לבחור את dendrimers על פני השטח.
    2. לקבוע את מיקומי החלקיקים באמצעות תמונה בתוכנת עיבוד ולהשתמש בהם כדי להשיג את המרחקים interparticle מינימלי (dדקות).
    3. מגרש dדקות ערכי z למיקומים חלקיקים המתאימים כדי לקבל את מפות קונטור ההסתברות עבור dדקות. להתאים את קנה המידה של צבע של העלילה להמחיש את האזורים של מקומיים RGD משטח בצפיפות הגבוהה (dדקות < 70 ננומטר).
    4. לכמת את האזור של האזורים עם מקומיים RGD משטח בצפיפות הגבוהה באמצעות תמונה בתוכנת עיבוד. כוללים את תחומי דנדרימר אגרגטים בחישוב.
  3. הדמיית ה-STM.
    הערה: ניתן לבצע הדמיה STM רק עבור nanopatterns על מוליך Au(111) סובסטרטים. המדידות נעשות באוויר.
    1. מקם את המצע nanopatterned בעל מדגם של ציוד ה-STM. בדוק את חיבור חשמלי בין מדגם לבין מחזיק עם בודק.
    2. לחרוט טיפ של החומר הנבחר בדיקה (כלומר. Pt 0.8: Ir 0.2) בקוטר המבטיח התאמה נכונה על ראשו של ציוד ה-STM. ניתן לבצע חריטה חיתוך ידני או באמצעות תחריט אלקטרוכימי. 32
      הערה: תחריט אלקטרוכימי רינדור עוד טיפים סימטרי.
    3. הר העצה בראש של ציוד ה-STM וחבר את הדגימה.
    4. הגדר "זרם" בערוץ משוב (זה סוג המדידה, הנוכחי יהיה קבוע על-ידי כיוונון משוב). להתאים את הסטייה מתח ואת הנוכחית שנקבעה מראש, גודל סריקה כדי לקבל תמונה טוב נפתרה פעם הטיפ עוסק.
      הערה: הבחירה של אזור ההדמיה תלויה גם טווח עבודה של הסורק פיזואלקטריים. נא עיין במדריך כלי בהקשר זה.
    5. תהליך הדימויים הטופוגרפי STM על-ידי הזזת כל קו סריקה לשם החלקת פולינום פונקציות שימוש בתוכנה קניינית של היצרן של מנגנון ה-STM.
  4. מדידות CA.
    1. מדד CA ב- מצעים nanopatterned בשיטת ושחרור sessile לעבר עמדות שונות שלוש על שלוש סובסטרטים עצמאית לכל תנאי (דנדרימר הראשונית ריכוז בתמיסה) עם מערכת אופטית CA.
    2. למלא את microsyringe במים יונים, קבע את הפרמטרים בתוכנה CA לייצר טיפות של 1 µL.
    3. המקום המדגם על הבמה, כך השטח של המדגם הוא נראה בבירור על המחשב עבור הדמיה.
    4. הזז את המזרק עם micromanipulator עד שיהיה קרוב לפני השטח, לוותר על הירידה על גבי המשטח. להקליט את התמונה מיד לאחר ייצוב droplet.
      הערה: במדידות CA, חשוב מאוד לשלוט לחות על מנת להשיג תוצאות לשחזור.
    5. לנתח את CAs נמדד עם התוכנה הקניינית של היצרן של המנגנון CA. ניתן להתאים את שיטת התאמה לדרישות המשתמש. שיטת המדידה אליפטית יכולה להיות אופציה.

5. תרבית תאים

הערה: כל הפעולות בוצעו בפתרונות הוד תרביות רקמה וחומרים רק סטרילי, ושימשו בטכניקות.

  1. פיברובלסט אדהזיה הניסוי.
    1. תרבות NIH 3T3 העכבר מתחלקים fibroblasts מתוך פסקאות מוקדמות (< 10) 37 ° C, כ- 4.6% CO2 אווירה במדיום הבזליים עם גלוקוז גבוהות בתוספת 10% סרום שור עוברית (FBS), 1%-גלוטמין, 1% פניצילין-סטרפטומיצין ו 1% נתרן פירובט (מדיום הגידול). מבחנות T75 עבור זריעה סך של 500,000 תאים לכל בקבוק של 10 מ"ל של מדיום הגידול מומלצים.
    2. הסר בינוני הישן עם פיפטה 10 מ ל כל יומיים והחלף 10 מ"ל של מדיום הגידול המוכנים באופן טרי.
    3. התרבות תאים במצע הגידול עד להגיע בסביבות 80% הנהרות ולאחר מכן הסר המדיום הוסף 5 מ של טריפסין לאדם את הבקבוק. כדי להבטיח ניתוק התא הנכון מהחלק התחתון של הבקבוק, לשמור על הפתרון טריפסין בקשר עם התאים עבור 5 דקות ב 37 º C.
    4. הוסף 5 מ של מדיום הגידול לכל הבקבוק ולאסוף את התאים בתוך שפופרת צנטרפוגה. Centrifuge התאים ב 470 x גרם במשך 5 דק. הסר את תגובת שיקוע, resuspend בגדר תא ב- 10 מ"ל של מדיום הגידול. לקבוע את הריכוז של תאים באמצעות של hemocytometer.
    5. העברה של סובסטרטים טוב צלחות אינה מטופלת עבור תרביות רקמה (שאינו חסיד).
    6. זרע התאים על סובסטרטים-צפיפות של תאים/ס מ 4,0002 במדיום הגידול, תקופת דגירה אותם של 4.5 h ב- 37 מעלות צלזיוס ו-10% CO2 אווירה.
  2. Chondrogenic אינדוקציה של MSCs.
    1. תרבות MSCs האנושי של פסקאות מוקדמות (< 5)-37 ° C ו- 4.6% CO2 האווירה מדיום הגידול MSC. מבחנות T75 עבור זריעה סך של 500,000 תאים לכל בקבוק של 10 מ"ל של מדיום הגידול מומלצים.
    2. שנה את בינוני כל 3 ימים (כפי שמתואר 5.1.2).
    3. Trypsinize התאים לפני 80% הנהרות מתמלאת, צנטריפוגה ו resuspend אותם בתוך מדיום הגידול MSC (כפי שמתואר 5.1.3). לקבוע את הריכוז של תאים באמצעות של hemocytometer.
    4. Centrifuge התאים שוב, resuspend אותם ב 10 מ"ל של chondrogenesis בתדר בינוני.
    5. להעביר את סובסטרטים הלוחות לוחיות הרישוי טוב אינה מטופלת עבור תרביות רקמה (שאינו חסיד). זרע התאים על סובסטרטים-צפיפות של תאים/ס מ 3,0002.
    6. לשנות את המדיום chondrogenic כל 3 ימים (כפי שמתואר 5.1.2).

6. התא קיבוע Immunostaining

הערה: ניתן לבצע את הפעולות הבאות בתנאי שאינו סטרילי.

  1. מסיר את המדיה ולשטוף את התאים בעדינות עם PBS. לתקן אותם על-ידי הוספת 10% הפתרון פורמלין במשך 20 דקות ב- RT.
  2. הסר את פורמלין, לשטוף את התאים עם PBS.
  3. לחסום את הקבוצות אלדהיד חופשית על-ידי הוספת פתרון 50 מ מ של אמוניום כלוריד (NH4Cl) ב- PBS. להשאיר את התאים עבור 20 דקות ב- RT. להסיר NH4Cl פתרון ולשטוף את התאים עם PBS.
    הערה: הפרוטוקול אפשר לעצור כאן. דוגמאות לחנות ב- PBS ב 4 º C.
  4. הסר PBS permeabilize בתאים על-ידי הוספת פתרון 0.1% של סאפונין הפתרון חסימה (1% אלבומין ב- PBS) 10 דקות בשטיפת RT. התאים עם PBS, העברת דגימות צלחת טוב חדש.
  5. דגירה התאים עם פתרון של נוגדנים העיקרי בפתרון חסימה (טבלה 3) עבור h 1-RT. לאחר מכן, להסיר את הפתרון נוגדן ראשוני, לשטוף את התאים עם PBS.
  6. דגירה התאים עם נוגדנים משניים בפתרון חסימה (טבלה 3) עבור h 1-RT.
    הערה: להימנע אור חשיפה.
  7. הסר את הפתרון נוגדנים משניים ולשטוף את התאים עם PBS ויבש.
    הערה: הפרוטוקול אפשר לעצור כאן. אחסן את הדגימות PBS ב 4 ° C בחושך.
  8. הרכבה דגימה להסתכלות במיקרוסקופ: שימוש בחותך עצה היהלומים, חותכים coverslips 1.25 ס מ x 1.25 ס מ. µL 50 להחיל של מיקרוסקופיית הרכבה בינונית על הדגימות ואת לכסות אותם בעדינות עם coverslips לחתוך.
  9. העברת הדגימות לנמען נוח, לכסות אותו. עם רדיד אלומיניום וחנות בחושך ב 4 ° C עד התצפית.

7. תא הדמיה וניתוח נתונים

הערה: אטום Au(111), מצעים מבוסס-microslide עבה, מיקרוסקופ זקוף יש להשתמש.

  1. פיברובלסט אדהזיה הניסוי.
    1. שימוש במיקרוסקופ epifluorescence מצויידים מצלמה דיגיטלית, נמוך (כלומר 10 X), הגדלה גבוהה (כלומר X 40) מטרות. לבצע מדידות באוויר.
    2. מניחים את הדגימה על גרעינים תא הבמה ואת התמונה עם המטרה X 10 שימוש של עירור אולטרה סגול, longpass מסנן פליטה כדי להמחיש את הכתם Hoechst/דאפי.
    3. התמונה תא שלד התא, מוקד הדבקויות (FAs) עם המטרה X 40, בחירת המסנן מיקרוסקופ התואמת את מפרטי fluorochrome נוגדנים המתאימים.
    4. על כימות פא, להשתמש בתוכנת עיבוד תמונה כדי להמיר תמונות לקבצים 8 סיביות. להסיר את תמונות הרקע ולהמיר בינארי על-ידי הגדרת סף. לחשב לפחות 30 תמונות לכל דגימה ולשקול FAs מיקרומטר 12 עבור חישוב.
  2. Chondrogenic אינדוקציה של MSCs.
    1. תמונה עיבוי התא בשלבים ההתחלתיים של אינדוקציה chondrogenic (< 5 ימים) עם מיקרוסקופ epifluorescence זקוף מצויד במצלמה דיגיטלית נמוך (כלומר 10 X) המטרה ההגדלה. השתמש מסנן פליטה אולטרה סגול של עירור ו- longpass כדי להמחיש את הכתם Hoechst/דאפי.
    2. למדידת לאזור מעובה, להשתמש בתוכנת עיבוד תמונה של, להמיר תמונות 8 סיביות, להסיר את הרקע ובחר סף מדגיש את קווי המתאר צבירה. לחשב את השטח של החלקיקים.
    3. Immunostained דגימות FAs, סיבי אקטין שלד התא של הסחוס ספציפיים קולגן סוג II אלפא 1 (COL2A1) עם מיקרוסקופ קונפוקלי זקוף בהגדלה (כלומר X 40-60). איסוף מקטעים במרווח נציג (כלומר 1-0.5 מיקרומטר).
    4. כדי לעבד את המחסנית, השתמש בתוכנת עיבוד תמונה. להמיר תמונות 8 סיביות, להסיר את הרקע, ולהפוך אותם בינארית על-ידי הגדרת סף. להתייחס לכל הפחות שלושה עיבוי התא לכל תנאי של שלוש דוגמאות עצמאית.
    5. לכמת החלבון פא צבעונית שטחים מהאזור הבזליים של עיבוי התא ולבטא אותם כאחוז המקביל של אזור לחלק למספר של גרעין התא בתמונה.
    6. כדי למדוד COL2A1 מכתים, להשתמש z קונאפוקלית-תחזיות ולכמת את הסכום של האזור המתוכנן (מקסימום שטח COL2A1 עבור דגימה). לנרמל את הערך אזור שהושג נגד האזור של עיבוי התואם.

8. כמותיים הפוכה תמלול-פולימראז תגובת שרשרת (לרביעיית-PCR) ניתוח

הערה: כדי למנוע זיהום RNase, להשתמש וואר פלסטיק חד פעמיות, סטרילי, ללבוש כפפות חד פעמיות לטיפול ריאגנטים ו- RNA. תמיד להשתמש נכונה טכניקות aseptic מיקרוביולוגית ולהשתמש פתרון טיהור המתאים כדי להסיר RNase זיהום משטחי עבודה ופריטים שאינם חד פעמיים כגון צנטריפוגות, פיפטות.

  1. לבודד את סך ה-RNA, pulverize זה ב disrupter RNA. מתייחסים RNA דגימות עם DNase ולהחלפתן cDNA באמצעות ערכת סינתזה cDNA.
  2. התנהלות לרביעיית-PCR באמצעות תחל הפקטור שעתוק SOX9. Beta-2-microglobulin (B2M) וחלבון ribosomal L13a (RPL13a) יכול לשמש גנים משק בית.
  3. לחשב את רמות הביטוי, לנרמל אותם נגד הפקד שלילי (PLLA).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

אנו מציגים שיטה nanopatterning המאפשר משטח adhesiveness לטפל בבית ננו (איור 1). המבנה הכימי של RGD-Cys-D1 מוצג איור 1A. Dendrimers היו בדוגמת על משטחים Au(111) מוליך חשמל ברזולוציה גבוהה אפיון STM. דנדרימר נמוך הריכוזים בתמיסה (עד 10-5% w/w) שניתנו dendrimers מבודדים של 4-5 nm קוטר (איור 1B), בעוד אגרגטים דנדרימר מאוד ארוזה נוצר בריכוזים גבוהים (איור 1C). AFM משטח אפיון (דמויות 1 D-G, בשורה העליונה) גילה כי ניתן להתאים את חלוקת השטח RGD-Cys-D1 dendrimers כפונקציה של ריכוז דנדרימר הראשונית בפתרון. במפות מתאר ההסתברות עבור dדקות, התוצאה צפיפויות ננו RGD מקומיות שונות על פני השטח (דמויות 1 D-G, השורה התחתונה).

בניסויים התרבות תאים, אינטגרינים קולטן קרום התא של בסביבות 10 ננומטר בקוטר זיהה את רצף RGD בפריפריה dendrimers. למרות שמונה עותקים של רצף זה נמסרו לכל דנדרימר, ויקיים אינטראקציה דנדרימר אחד בלבד לכל אינטגרין בשל גודלו (4-5 nm נמדדת STM; איור 1B). כלומר, כל דנדרימר בתנאי אתר בודד לכריכה אינטגרין, ובכך ומאפשר קשר ישיר מהתפלגות דנדרימר (כפי שניתן לראות של AFM תמונות) ההתפלגות RGD זמין עבור אדהזיה תא. יתר על כן, אין שינויים משמעותיים נמצאו ערכי CA השיג עבור תצורות שונות nanopattern עשוי להשפיע תא אדהזיה29. מאפיינים אלה להפוך דנדרימר nanopatterns על משטחים מסתיימים מצעים מתאים שדרכו לווסת וללמוד בהתנהגות התא.

תא הדבקה על nanopatterned ש-au(111) נבדק עם fibroblasts בתוך 24 השעות הראשונות של תרבות (איור 2 א) ועם MSCs על nanopatterned PLLA (איור 2B). בשני המקרים, האחוז של אזור מוכתם paxillin חלבון ה-FA (פקס) גדל בהדרגה עם ריכוז דנדרימר, כפי שעשה RGD המקומי משטח צפיפות (האחוז של אזור nanopatterned עם dדקות מתחת לסף 70-nm הדבקה היעילה תא; טבלה 4). ריכוז דנדרימר הראשוני של 10-2% w/w ופקדי חיובית, האחוז של אזור צבעונית פאקס בכל תא ירד, המתאם עם האחוז של אזור nanopatterned עם dדקות < 70 nm אבד.

האחוז של שטח כבוש מאת dדקות < 70 nm (השורה התחתונה1D איור-G ו בטבלה 4) היא אינדיקציה טובה של צפיפות השטח המקומי של RGD עבור nanopatterns עד 10-5% w/w דנדרימר הראשונית ריכוז אבל לא של אלה עד 10-2% w/w, עקב צבירת דנדרימר. צבירת הפיק דגימות מאוד הטרוגנית מבחינת התפלגות ליגנד, עם רק אחוז קטן של המשטח עם ערכימינימום dמתחת לסף 70-nm (השורה התחתונהאיור 1D וטבלה 4). XPS תוצאות המחקר הראו כי משטחים אלה להציג את צפיפות RGD הגלובלי המקבילה-510% w/w-נגזר nanopatterns28. התבוננות זו מציינת כי צפיפות RGD המרבי הושג אזורים המכילים דנדרימר אגרגטים ואת האחוז של שטח כבוש מאת dדקות < 70 nm אינה מייצגת של צפיפות השטח המקומי RGD ב את התיק הזה.

ניתן לייחס את התצפית כי פקדי חיובי (ציפויים הומוגנית) עם מקומיים RGD משטח מאליהם לא הראה הגידול הצפוי ב תא אדהזיה אפקט הפרעה סטרית. תוצאות אלו מצביעים על כך, לעומת משטחים הומוגנית המתאימה נפוץ בתרבות תא, RGD nanopatterns לקיים תא אדהזיה ביעילות רבה יותר. ממצא זה ובכך מדגיש את הרלוונטיות של צפיפות ליגנד מקומיים.

אינטראקציות עם הסביבה ב מורפוגנזה להזניק את האירועים בידול התא הראשון, להפיץ אותם עד הקמת המבנים רקמות מורכבות הסופי. כדי להעריך את ההשפעות של דנדרימר nanopatterns על הידבקות תא ובידול, השתמשנו על אינדוקציה chondrogenic של MSCs כמודל. במהלך chondrogenesis, שם הוא מטריצה פעילה שיפוץ, אשר ממלא תפקיד מאלף בבימוי התאים דרך השלבים השונים של היווצרות הסחוס.

MSCs עברה chondrogenesis על nanopatterns (איור 3). בידול Chondrogenic מתחיל עם צעד עיבוי התא, אשר כרוך תא גיוס כדי להיווצר עיבוי צפופה, הקמת תקשורת לתא, ושינויים והמצוות תא מורפולוגיה33. מראה דמות 3A שהתרחשו עיבוי התא את הכל מצעים, עיבוי הזה גדל באזור עם הגדלת ריכוזים דנדרימר עד 2.5 x 10-8% w/w לאזור מעובה ואז ירד שוב עבור דנדרימר ריכוז של-210% w/w , עבור הפקד חיובי. הצעד עיבוי התא chondrogenesis מתרחשת דרך התא הפעיל תנועה ולא דרך עלייה תא התפשטות34. תנועת התא הזה הוא המועדף על ידי הדבקה גמישה עם המצע: הדבקויות יציב צריך להיווצר להתיר כוחות המתיחה להעביר את הגופה תא, ו באותו זמן, אלה הדבקויות צריך להיות חלש מספיק כדי לאפשר שחרור תא המצע במהלך תנועה. עיבוי התא הוא המועדף על ידי עלייה בצפיפות המקומי RGD פני השטח עד 2.5x10-8% w/w-נגזר nanopatterns, עם איזון טוב בין תא אדהזיה תנועת התא. עבור 10-2 ו הפקד חיובית, הצפיפות השטח המקומי RDG היה גבוה מדי, ובכך ופוגע האירוע עיבוי.

בידול Chondrogenic התמורה מעיבוי prechondrogenic: תאים עיבוי הופכים למעוגלים יותר ולהתחיל הסינתזה של הסחוס סמני ספציפיים כגון החלבון ECM COL2A1, שעתוק גורם SOX933, 34 , 35. בהתאם לכך, מצעים עם adhesiveness ביניים, להעדיף את היווצרות התא עיבוי, הראה גבוה יותר COL2A1 מכתים (איור 3B), רמות גבוהות יותר של ביטוי mRNA SOX9 (איור 3C).

התוצאות שלנו להדגיש את ההשפעה של תא-תא מטריקס אינטראקציות כבר בשלבים המוקדמים של בידול chondrogenic. אינטראקציות כאלה ניתן לטפל בקלות דרך מבוסס דנדרימר nanopatterns.

שלב הזמן (s) מהירות (rpm) האצת (סל"ד/s)
1 5 500 300
2 30 3,000 1,500

טבלה 1: טווה תוכנית השלבים המשמשת את השקופיות זכוכית עם הפתרון PLLA מוכנים. צעד ראשון המגון שימש ב 500 סל ד עם האצה של 300 סל ד/s 5 ס ולאחריו צעד אחרון ב-3000 סל ד עם האצה של 1,500 סל"ד/s ב-30 s.

פתרון RGD-Cys-D1 (mg/mL) RGD-Cys-D1 (מ ג) MQ מים (µL)
A 0.77 5 6,494
RGD-Cys-D1 (% w/w) פתרון (µL)
B 10-2 779 5,220
C 10-5 0.78 6,000
פתרון C (µL)
D 2, 5 x 10-8 15.0 5,985
E 10-8 6.0 5,994
F 4 x 10-9 2.4 5,998

בטבלה 2: פרטים על ההכנה של פתרונות RGD-Cys-D1 להשתמש. פתרון מניות של dendrimers RGD-Cys-D1 הוכן על ריכוז סופי של 0.77 מ"ג/מ"ל (פתרון A), שמהם הוכנו פתרונות B ו- C-10-2 וריכוזי 10-5% w/w . פתרון C עם ריכוז w/w 10-5%של RGD-Cys-D1 דנדרימר שימש להכנת פתרונות D, E ו- F בריכוזים הסופי של 2.5 x 10-8, 10-8 ו- 4 x 10-9%w/w, בהתאמה.

שם נפח (µL) חסימת מאגר (mL)
מיקס ראשוני ארנב mAb פקס 65 12.870
MAb העכבר כדי COL2A1 32.5
מיקס משני אלקסה עבור חיל הים 488 עז אנטי עכבר 13 12.961
אלקסה עבור חיל הים 568 עז נגד ארנב 13
פתרון Hoechst 13

טבלה 3: הכנת פתרון נוגדן. נוגדן ראשוני התערובת הכיל נוגדנים חד שבטיים, כנגד פקס מיוצר ארנב מדולל 1:200 בפתרון חסימה עם נוגדנים חד שבטיים כנגד COL2A1 מיוצר 1:400 העכבר מדולל בפתרון חסימה. התערובת נוגדנים משניים הכלולים הכתם גרעין התא Hoechst ואת הנוגדנים משני מיוצר עז נגד עכבר, ארנב בהתאמה (הנקראת עם אלקסה עבור חיל הים 488, 568 fluorophores, בהתאמה).

Figure 1
איור 1 : Nanopatterning RGD-Cys-D1 דנדרימר עבור הפקד הננומטרי של צפיפות המשטח RGD מקומיים. (א) RGD-Cys-D1 דנדרימר מבנה המכיל עד שמונה עותקים של פפטיד RGD דבק התא. נציג ה-STM תמונות (הטיה = 200 mV, קבע נקודה = 0.5 nA) של RGD-Cys-D1 nanopatterns על Au(111) של פתרון מימית הראשוני של 10-8% w/w (סולם בר = 3 ננומטר, B) והשיג הפרופיל המתאים גובה-המרחק על מקווקו אזור המצוין (B)ו- (ג) של 10-2% w/w מציג דנדרימר צבירה (סולם בר = 20 ננומטר). (D-G) נציג AFM תמונות של nanopatterns RGD-Cys-D1-PLLA להשיג הפתרונות המתאימים דנדרימר מימית של 10-2%, 2.5 x 10-8%, 10%-8ו-94 x 10% w/w, בהתאמה (סולם בר = 1 מיקרומטר). המפה המתאימה של קונטור ההסתברות המרחק המינימלי interparticle (dדקות) מוצג מתחת לכל תמונה AFM, עם צפיפות גבוהה אזורים RGD מוצגים בצבע אדום כהה (dדקות < 70 ננומטר). Dendrimers ו דנדרימר אגרגטים מתוארים בצבע שחור עבור בהירות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2 : תא אדהזיה על nanopatterns RGD-Cys-D1. מגרש של אחוז שטח צבעונית פאקס חלבון הפא בכל תא עבור התאים בקשר עם המצע (ציר שמאלי) לריכוז דנדרימר הראשונית. ערכים מושווים עם מקומיים RGD משטח צפיפות (אחוז של שטח ב- nanopatterns המכיל ערכים dדקות מתחת לסף nm 70) (ציר נכון) עם 100 ו- 0 אחוזים שהוקצו החיובי (+ שליטה) ושלילי (- . שולטת שליטה), בהתאמה. (א) פיברובלסט אדהזיה על דנדרימר nanopatterns על Au(111) לאחר 4.5 h של תרבות. (B) MSC אדהזיה על דנדרימר nanopatterns על PLLA להעריך יום 1 האינדוקציה chondrogenic. ערכים מקבלים כמו הממוצע עם סטיית תקן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

RGD-Cys-D1 (% w/w) אזור (< dדקות = 70 ננומטר) (%) ב- Au(111) אזור (< dדקות = 70 ננומטר) (%) ב- PLLA
10-2 5 ± 1 2 ± 2
10-5 97 ± 2
2, 5 x 10-8 65 ± 11 90 ± 2
10-8 25 ± 16 45 ± 7
4 x 10-9 18 ± 11

בטבלה 4: אחוז של שטח עם d min הערכים מתחת 70 nm שהושג עבור התצהיר דנדרימר RGD-Cys-D1 על Au(111) ועל PLLA משטחים כפונקציה של ריכוז דנדרימר הראשוני היה.

Figure 3
איור 3 : Chondrogenic הבידול של MSCs על nanopatterns RGD-Cys-D1. (א) עיבוי של MSCs תרבותי על RGD-Cys-D1 nanopatterns על PLLA אחרי 5 ימים של אינדוקציה chondrogenic. נציג epifluorescence תמונות של גרעין התא ויטראז'ים (Hoechst; סרגל קנה מידה = מיקרומטר 300; בשורה העליונה) מגרש של האזור של תאים עיבוי (השורה התחתונה) שהתקבל ב- nanopatterns RGD-Cys-D1 של ריכוזים שונים דנדרימר הראשונית. בידול ממשיך מהשלב עיבוי התא עם הביטוי של סמנים chondrogenic ספציפית: (B) אחוז האזור של COL2A1 מכתים מנורמל עם השטח של העיבוי תא מההשתקפויות המתאימים קונאפוקלית z- מתקבל לאחר 5 ימים האינדוקציה chondrogenic. (ג) יחסית SOX9 mRNA ביטוי (נגד שליטה שלילי) אחרי 3 ימים של אינדוקציה chondrogenic. תינתן ערכים כמו הממוצע עם סטיית התקן ב (B) ו- (ג). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

במהלך הפיתוח של הפרוטוקול המתואר, יש לשקול מספר צעדים קריטיים. הראשון מתייחס nanopattern אפיון בסריקת טכניקות בדיקה במיקרוסקופ. כדי להמחיש את nanopatterns, השטח שבו מופק המתבנת חייב להיות ערך חספוס מתחת הקוטר אכזרי של dendrimers, אשר הוא סביב 4-5 nm כפי שנמדד על-ידי ה-STM (איור 1B). כמו כן, זה צריך לקחת בחשבון כי הדמיה ברזולוציה גבוהה STM מוגבל מצעים מוליך, במקרה זה Au(111). כל הרמה של הפולימר מן הפינות של השקופית לאחר הציפוי הספין ניתן לתקן באמצעות דבק מסתיימים.

דנדרימר nanopatterning הוא תהליך שבאמצעותו להשיג מבוקר adhesiveness תא המקומי ב הננומטרי. על בסיס הרכבה עצמית של dendrimers על פני השטח על ידי ספיחה, טכניקה זו אינה דורשת כל ציוד מורכב nanopatterning, ובכך שמנוגדים בעבר תיאר שיטות מבוססות-ליתוגרפיה36,37, 38. nanopatterning דנדרימר ניתן בקלות לשנות פני שטחים גדולים והוא תואם באופן מלא עם תא תרבות פרוטוקולים.

דנדרימר nanopatterning השיטה המתוארת כאן ניתן למצוא יישומים עתידיים רפואה רגנרטיבית. דרך השליטה דנדרימר nanopatterning-תא adhesiveness הופך טכניקה זו מתאימה ההתניה של biomaterials לפני ההשתלה, ובכך להקל על השתלבותם רקמות הפונדקאי. יתר על כן, הקלות עם דנדרימר אשר יכול להיות שונה moieties היקפיים הופך דנדרימר nanopatterning מתאים אחר ליגנדים זה להפעיל תלויי-ריכוז פעילות על תאים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

המחברים מכירים מן גופן-באך ו אלברט ג'י Castaño על עזרתם ביישוב dדקות כמת. הם גם מכירים יחידת מתקדמות מיקרוסקופ דיגיטלי במכון לחקר וההתערבות (ברצלונה IRB) לתת המחברים להקליט הוידאו המקומית שלהם. עבודה זו נתמכה על ידי רשת ביו מחקר מרכז (CIBER), ספרד. CIBER הוא שיוזמה ממומן על ידי את השישי הלאומית R & D & אני תוכנית 2008-2011, Iniciativa Ingenio 2010, Consolider התוכנית, CIBER פעולות, דה אינסטיטוטו סאלוד קרלוס השלישי, עם התמיכה של הקרן לפיתוח אזורי אירופה. עבודה זו היא נתמכה על ידי הנציבות אוניברסיטאות ומחקר של המחלקה של חדשנות, אוניברסיטאות, ארגוני של Generalitat דה קטלוניה (2014 SGR 1442). זה היה גם במימון הפרויקטים OLIGOCODES (מס ' MAT2012-38573-C02) ו- CTQ2013-41339-P, מוענק על ידי משרד הכלכלה הספרדית תחרותיות, בנוסף INTERREG V-A ספרד-פורטוגל 2014-2020 POCTEP (0245_IBEROS_1_E). C.R.P. מודה תמיכה כספית מ ספרדי משרד הכלכלה ואת התחרותיות המענק (מס ' IFI15/00151).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Gold (111) on mica. 1.4x1.1 cm  Spi Supplies 466PS-AB
Glass micro slides, plain Corning 2947-75x25
Deionized water Millipore 18MΩ cm
Ethanol 96% PanReac 131085.1212
L-Lactide/DL-Lactide copolymer Corbion 95/05 molar ratio
1,4 - dioxane Sigma-Aldrich 296309-1L
Silicone oil, high temperature Acros Organics 174665000
Spinner Laurell WS-650MZ-23NPP/Lite
Tissue culture laminar flow hood Telstar Bio II Advance Class II biological safety cabinet
Filter unit Millex-GP SLGP033RB 0.22 µm
Syringe 10 mL Discardit 309110
Atomic Force microscope Veeco Instruments Dimension 3000 AFM instrument
Silicon AFM probes Budget Sensors Tap300AI-G Resonant Freq. 300 kHz, k = 40 N/m
Scanning tunneling microscope Molecular Imaging PicoSPM microscope
Pt0.8:Ir0.2 wire Advent PT671012 Diameter 0.25 mm
WSxM 4.0 software Nanotec electronica
Optical contact angle (CA) system Dataphysics
SCA20 software Dataphysics
X-ray photoelectron spectrometer Physical Electronics Perkin-Elmer PHI 5500 Multitechnique System
Fibronectin from bovine plasma Sigma-Aldrich F1141-1MG 1.0 mL solution
Dulbecco's Phosphate Buffer Saline (DPBS) Gibco 21600-10 Powder
Mouse embryo fibroblasts ATCC ATCC CRL-1658 NIH/3T3
Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) liquid high glucose Gibco 11960044 liquid high glucose, no glutamine, 500 mL
Fetal Bovine Serum (FBS) Gibco 16000044 500 mL
L-Glutamine Invitrogen 25030 200 mM (100X)
Penicillin-streptomycin Invitrogen 15140
Sodium pyruvate Invitrogen 11360039 100 mL
T75 culture flasks Nunclon 156499
Trypsin Life Technologies 25200072 0,25% EDTA
Centrifuge Hermle Labortechnik Z 206 A
Non-tissue culture treated plate, 12 well Falcon 351143 Non-adherent
Adipose-derived hMSCs ATCC ATCC PCS-500-011 Cell vial 1 mL
MSC basal medium ATCC ATCC PCS-500-030
MSC growth kit ATCC ATCC PCS-500-040 Low serum
Chondrocyte differentiation tool ATCC ATCC PCS-500-051
Formalin solution Sigma-Aldrich HT5011-15ML neutral buffered, 10%
Ammonium chloride Sigma-Aldrich A9434-500G for molecular biology, suitable for cell culture, ≥99.5%
Saponin Sigma-Aldrich 47036-50G-F for molecular biology, used as non-ionic surfactant, adjuvant
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A3059-50G
Rabbit monoclonal [Y113] anti-paxillin antibody Abcam ab32084 Diluted 1:200
Mouse monoclonal [1F5] anti-collagen alpha-1 XX chain  Acris Antibodies AM00212PU-N Diluted: 1:400
Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) secondary antibody Invitrogen A10667 2 mg/mL. Diluted 1:1000
Alexa Fluor 568-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L) secondary antibody Invitrogen A11036 2 mg/mL. Diluted 1:1000
Hoechst 33342 Thermo Fisher H3570 10ML 10 mg/mL. Diluted 1:1000
Cover glass 24x24 mm Deltalab D102424
Fluoromount Sigma-Aldrich F4680-25ML
Epifluorescence Microscope Nikon Eclipse E1000 upright microscope with a CCD camera
Confocal Microscope Leica Microsystems Leica SPE Upright Confocal Microscope
ImageJ 1.50g freeware http://imgej.nih.gov/ij
MATLAB software The MATHWORKS, Inc.
OriginPro 8.5 software  OriginLab Coorporation

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jiang, F., Hörber, H., Howard, J., Müller, D. J. Assembly of collagen into microribbons: Effects of pH and electrolytes. J. Struct. Biol. 148 (3), 268-278 (2004).
  2. Smith, M. L., et al. Force-induced unfolding of fibronectin in the extracellular matrix of living cells. PLoS Biol. 5 (10), 2243-2254 (2007).
  3. Little, W. C., Smith, M. L., Ebneter, U., Vogel, V. Assay to mechanically tune and optically probe fibrillar fibronectin conformations from fully relaxed to breakage. Matrix Biol. 27 (5), 451-461 (2008).
  4. Christman, K. L., Enriquez-Rios, V. D., Maynard, H. D. Nanopatterning proteins and peptides. Soft Matter. 2, 928-939 (2006).
  5. Falconnet, D., Csucs, G., Grandin, H. M., Textor, M. Surface engineering approaches to micropattern surfaces for cell-based assays. Biomaterials. 27 (16), 3044-3063 (2006).
  6. Arnold, M., et al. Activation of integrin function by nanopatterned adhesive interfaces. ChemPhysChem. 5 (3), 383-388 (2004).
  7. Cavalcanti-Adam, E. A., et al. Lateral spacing of integrin ligands influences cell spreading and focal adhesion assembly. Eur. J. Cell. Biol. 85 (3-4), 219-224 (2006).
  8. Cavalcanti-Adam, E. A., et al. Cell spreading and focal adhesion dynamics are regulated by spacing of integrin ligands. Biophys. J. 92 (8), 2964-2974 (2007).
  9. Arnold, M., et al. Cell interactions with hierarchically structured nano-patterned adhesive surfaces. Soft Matter. 5 (1), 72-77 (2009).
  10. Malmström, J., et al. Large area protein patterning reveals nanoscale control of focal adhesion development. Nano Lett. 10 (2), 686-694 (2010).
  11. Deeg, J. A., et al. Impact of local versus global ligand density on cellular adhesion. Nano Lett. 11 (4), 1469-1476 (2011).
  12. Medda, R., et al. Investigation of early cell–surface interactions of human mesenchymal stem cells on nanopatterned β-type titanium-niobium alloy surfaces. Interface Focus. 4, 20130046 (2014).
  13. Wang, X., et al. Effect of RGD nanospacing on differentiation of stem cells. Biomaterials. 34 (12), 2865-2874 (2013).
  14. Wang, X., Ye, K., Li, Z. H., Yan, C., Ding, J. D. Adhesion, proliferation, and differentiation of mesenchymal stem cells on RGD nanopatterns of varied nanospacings. Organogenesis. 9 (4), 280-286 (2013).
  15. Wang, X., Li, S. Y., Yan, C., Liu, P., Ding, J. D. Fabrication of RGD micro/nanopattern and corresponding study of stem cell differentiation. Nano Lett. 15 (3), 1457-1467 (2015).
  16. Li, Z. H., et al. Effects of RGD nanospacing on chondrogenic differentiation of mesenchymal stem cells. J. Mater. Chem. B. 3 (12), 5197-5209 (2015).
  17. Stephanopoulos, N., et al. Bioactive DNA-peptide nanotubes enhance the differentiation of neural stem cells into neurons. Nano Lett. 15 (1), 603-609 (2015).
  18. Rolland, O., Turrin, C. O., Caminade, A. M., Majoral, J. P. Dendrimers and nanomedicine: Multivalency in action. New J. Chem. 33, 1809-1824 (2009).
  19. Saovapakhiran, A., D’Emanuele, A., Attwood, D., Penny, J. Surface modification of PAMAM dendrimers modulates the mechanism of cellular internalization. Bioconjug. Chem. 20 (4), 693-701 (2009).
  20. Albertazzi, L., Fernandez-Villamarin, M., Riguera, R., Fernandez-Megia, E. Peripheral functionalization of dendrimers regulates internalization and intracellular trafficking in living cells. Bioconjug. Chem. 23 (5), 1059-1068 (2012).
  21. Mikhail, A. S., Jones, K. S., Sheardown, H. Dendrimer grafted cell adhesion peptide-modified PDMS. Biotechnol. Prog. 24 (4), 938-944 (2008).
  22. Kino-oka, M., Kim, J., Kurisaka, K., Kim, M. H. Preferential growth of skeletal myoblasts and fibroblasts in co-culture on a dendrimer-immobilized surface. J. Biosci. Bioeng. 115 (1), 96 (2013).
  23. Kim, M. H., et al. Morphological regulation and aggregate formation of rabbit chondrocytes on dendrimer immobilized surfaces with D-glucose display. J. Biosci. Bioeng. 107 (2), 196-205 (2009).
  24. Lomba, M., et al. Cell adhesion on surface patterns generated by the photocrosslinking of hyperbranched polyesters with a trisdiazonium salt. React. Funct. Polym. 73 (3), 499-507 (2013).
  25. Maheshwari, G., Brown, G., Lauffenburger, D. A., Wells, A., Griffith, L. G. Cell adhesion and motility depend on nanoscale RGD clustering. J. Cell Sci. 113 (Pt 10), 1677-1686 (2000).
  26. Kim, M. H., Kino-oka, M., Kawase, M., Yagi, K., Taya, M. Synergistic effect of D-glucose and epidermal growth factor display on dynamic behaviors of human epithelial cells. J. Biosci. Bioeng. 104 (5), 428-431 (2007).
  27. Pericet-Camara, R., Cahill, B. P., Papastavrou, G., Borkovec, M. Nano-patterning of solid substrates by adsorbed dendrimers. Chem. Commun. 3, 266-268 (2007).
  28. Lagunas, A., et al. Large-scale dendrimer-based uneven nanopatterns for the study of local arginine–glycine–aspartic acid (RGD) density effects on cell adhesion. Nano Res. 7 (3), 399-409 (2014).
  29. Lagunas, A., et al. Tailoring RGD local surface density at the nanoscale toward adult stem cell chondrogenic commitment. Nano Res. , (2017).
  30. Prats-Alfonso, E., et al. Effective and Versatile Strategy for the Total Solid-Phase Synthesis of Alkanethiols for Biological Applications. Eur. J. Org. Chem. 2013 (7), 1233-1239 (2013).
  31. Zhu, Y. B., Gao, C. Y., Liu, X. Y., He, T., Shen, J. C. Immobilization of biomacromolecules onto aminolyzed poly(L-lactic acid) toward acceleration of endothelium regeneration. Tissue Eng. 10 (1-2), 53-61 (2004).
  32. Güell, A., Díez-Pérez, I., Gorostiza, P., Sanz, F. Preparation of reliable probes for electrochemical tunneling spectroscopy. Anal. Chem. 76 (17), 5218-5222 (2004).
  33. Bobick, B. E., Chen, F. H., Le, A. M., Tuan, R. S. Regulation of the chondrogenic phenotype in culture. Birth Defects Res. C Embryo Today. 87 (4), 351-371 (2009).
  34. De Lise, A. M., Fisher, L., Tuan, R. S. Cellular interactions and signaling in cartilage development. Osteoarthritis Cartilage. 8 (5), 309-334 (2000).
  35. Kosher, R. A., Kulyk, W. M., Gay, S. W. Collagen gene expression during limb cartilage differentiation. J. Cell Biol. 102 (4), 1151-1156 (1986).
  36. Biebricher, A., Paul, A., Tinnefeld, P., Golzhauser, A., Sauer, M. Controlled three-dimensional immobilization of biomolecules on chemically patterned surfaces. J. Biotechnol. 112 (1-2), 97-107 (2004).
  37. Tinazli, A., Piehler, J., Beuttler, M., Guckenberger, R., Tampé, R. Native protein nanolithography that can write, read and erase. Nat. Nanotechnol. 2, 220-225 (2007).
  38. Oberhansl, S., et al. Facile Modification of Silica Substrates Provides a Platform for Direct-Writing Surface Click Chemistry. Small. 8 (4), 541-545 (2012).

Tags

בביו-הנדסה גיליון 131 דנדרימר Nanopattern חומצה אספרטית-גליצין-ארגינין (RGD) מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) תא אדהזיה גזע Mesenchymal (Mscs) Chondrogenesis
דנדרימר מבוססי Nanopatterns לא אחיד כדי מקומית משטח שליטה Adhesiveness: שיטה ישירה בידול Chondrogenic
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Casanellas, I., Lagunas, A.,… More

Casanellas, I., Lagunas, A., Tsintzou, I., Vida, Y., Collado, D., Pérez-Inestrosa, E., Rodríguez-Pereira, C., Magalhaes, J., Gorostiza, P., Andrades, J. A., Becerra, J., Samitier, J. Dendrimer-based Uneven Nanopatterns to Locally Control Surface Adhesiveness: A Method to Direct Chondrogenic Differentiation. J. Vis. Exp. (131), e56347, doi:10.3791/56347 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter