Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Düzensiz Nanopatterns Dendrimer tabanlı yerel olarak kumanda yüzeyi Adhesiveness için: Chondrogenic farklılaşma yönlendirmek için bir yöntem

Published: January 20, 2018 doi: 10.3791/56347
Automatic Translation
1,2, 3,1, 1, 4,5, 4,5, 4,5, 6, 3,6, 1,3,7, 8,3, 8,3,5, 1,3,2
1Institute for Bioengineering of Catalonia (IBEC), The Barcelona Institute of Science and Technology (BIST), 2Department of Engineering Electronics, University of Barcelona (UB), 3Networking Biomedical Research Center (CIBER), 4Instituto de Investigacin Biomédica de Málaga (IBIMA), Department of Organic Chemistry, Universidad de Málaga (UMA), 5Andalusian Centre for Nanomedicine and Biotechnology-BIONAND, 6Unidad de Bioingeniería Tisular y Terapia Celular (GBTTC-CHUAC), Grupo de Reumatolog ía, Instituto de Investigación Biomèdica de A Coruña (INIBIC), Complexo Hospitalario Universitario de A Coruña (CHUAC), Sergas, Universidade da Coruña (UDC), 7Institució Catalana de Recerca i Estudis Avançats (ICREA), 8Instituto de Investigación Biomédica de Málaga (IBIMA), Department of Cell Biology, Genetics and Physiology, Universidad de Málaga (UMA)

Summary

Dendrimer tabanlı yerel arginin-glisin-aspartik asit (RGD) yüzey yoğunluğu Nano yönetilsin düzensiz nanopatterns elde etmek için bir yöntem açıklanan ve hücre adezyon ve chondrogenic farklılaşması çalışma için uygulanmıştır.

Abstract

Hücresel yapışma ve farklılaşma hücre dışı Matriks (ECM) bileşenleri, nano eğilim tarafından büyük bir etkiye sahip yerel konsantrasyonları ile klimalı. Burada büyük ölçekli düzensiz nanopatterns arginin-glisin-aspartik asit (RGD) elde etmek için bir yöntem mevcut-yerel RGD Nano yönetilsin functionalized dendrimers yüzey yoğunluğu. Nanopatterns dendrimers ilk farklı konsantrasyonlarda çözümlerinden yüzey adsorpsiyon tarafından kurulur ve su temas açısı tarafından (CA), x-ışını photoelectron spektroskopisi (XPS), ile karakterizedir ve tarama prob mikroskobu teknikleri gibi tünelleme mikroskobu (STM) ve Atomik Kuvvet Mikroskobu (AFM) tarama. RGD yerel yüzey yoğunluğu en az interparticle mesafeler aracılığıyla olasılık kontur haritaları AFM görüntüleri kullanarak ve sonra hücre adezyon yanıt ve farklılaşma ile ilişkili ölçülür. Nanopatterning yöntemi burada sunulan geniş yüzey alanları için basit bir şekilde ölçeklendirilebilir basit bir işlemdir. Bu nedenle hücre kültür protokolleri ile tamamen uyumlu ve konsantrasyon bağımlı etkileri hücrelerde sarfetmek diğer ligandlar uygulanabilir.

Introduction

Burada biz Nano yerel adhesiveness kontrolünü sağlayan hücre kültür yüzeyler elde etmek için bir basit ve çok yönlü dendrimer tabanlı nanopatterning açıklayınız. 1,2,3 ve hücre adezyon yüzeyleri nanopatterning yapışma4' eilgili hücresel gereksinimleri içine derin anlayışlar sağlamıştır ECM organizasyon ayrıntılarını Nano bildirilmiştir, 5. Micellar nanopatterns litografi tabanlı kullanarak deneyler ortaya bir eşik değeri yaklaşık 70 nm RGD peptid nanospacing, hücre adezyon önemli ölçüde bu değer6,7,8 gecikmiş için ,9. Bu çalışmalar aynı zamanda büyük etkisi yerel küresel ligand yoğunluğu daha hücre adezyon9,10,11vurgulanır.

Morfogenez sırasında çevreye olan hücre etkileşimleri son karmaşık doku yapılar oluşturulmuştur kadar hangi devam ilk farklılaşma olayları tetikler. Bu çerçevede, nanopatterned yüzeyler ilk hücre yüzeyine etkileşimler morfogenez üzerinde etkisi mücadele için kullanılmaktadır. Litografi tabanlı RGD nanopatterns 68 yanal bir boşluk ile β-türü Ti-40Nb nm alaşımlar RGD nanospacings 95 ve 150 nm arasında bir farklılaşma geliştirmek iken sigara için kabul edilen kök hücreler12, farklılaşmamış fenotip korumak için yardım Adipojenik/Osteojenik13,14,15 chondrogenic kader ve16doğru Mezenkimal Kök hücre (MSCs). Ayrıca, sinyal bileşenlerle değiştiren Self montaj oluştururlar hücre adezyon ve farklılaşma Nano mimari düzenleme, sinyal gönderme ipuçları17sağlayarak doğrudan gösterilmiştir. Bu bağlamda, dendrimers yüzeyler üzerine onların dış küre18,19,20 moieties hücre etkileşim ile birikimi hücre adezyon21,22eğitim için kullanılan, Morfoloji23,24ve göç olayları25,26. Yine de, bu çalışmalarda yüzey karakterizasyonu eksikliği zor dendrimer yüzey yapılandırma ve hücre yanıt arasında herhangi bir ilişki kurmak için yapar.

Ne zaman dendrimers düşük ücret yüzeylere çözümleri ile düşük iyonik güçlü absorbe Dendrimer nanopatterns sıvı gibi sipariş ve tanımlanmış aralığı ile elde edilebilir. 27 bu özellik temelinde, burada büyük ölçekli düzensiz nanopatterns RGD functionalized dendrimers Nano yönetilsin yerel RGD yüzey yoğunluğu düşük ücret yüzeylerde, elde etmek için bir yöntem mevcut. Su temas açısı (CA), x-ışını photoelectron spektroskopisi (XPS) ve tarama prob mikroskobu teknikleri (STM ve AFM nanopatterns) gösteri çözümünde ilk dendrimer konsantrasyon değiştirme yerel ligand yoğunluğu ayarlanabilir. Yerel RGD yüzey yoğunluğu AFM görüntülerden en az interparticle mesafeler tarafından olasılık kontur haritaları sayısal ve hücre deneyleri ile ilişkili. Diğer nanopatterning teknikleri4ile karşılaştırıldığında, nanopatterning dendrimer tabanlı basit ve kolayca böylece hücre kültür uygulamaları ile tam olarak uyumlu olmak büyük yüzey alanlarını ölçeklendirilebilir. Nanopatterns biyoaktif yüzeylerde hücre adezyon28 ve yetişkin insan MSCs29chondrogenic indüksiyon yerel RGD yüzey yoğunluğu etkisini değerlendirmek için kullanılır. Bizim sonuçlar RGD dendrimer tabanlı nanopatterns hücre büyümesini sürdürmek ve hücre adezyon tarafından yüksek yerel RGD yüzey yoğunluğu takviye edilmiştir gösterir. Farklılaşma deneylerde MSC yoğunlaşma ve erken chondrogenic farklılaşma hücre yüzeyler için ara adhesiveness tercih. Hangi dendrimer ile çevre grupları değiştirilebilir kolaylığı nedeniyle, burada açıklanan yöntemi daha fazla konsantrasyon bağımlı etkileri hücrelerde sarfetmek diğer ECM ligandlar için genişletilebilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. yüzey hazırlama

  1. 1.4 x 1.1 cm Au(111) Mika yüzeyler üzerinde tavlama.
    1. Cam seramik Ocak Au(111) substrat yerleştirin ve bir argon atmosfer altında soğutmak için belgili tanımlık substrate 3 dk. izin ver bir bütan alev ile TAV. Her Au(111) substrat için bu adımı yineleyin.
      Not: Au(111) yüzeylerde hemen tavlama sonra kullanılmalıdır.
  2. Poli (L-laktik asit) hazırlanması (PLLA)-cam yüzeylerde kaplı.
    1. Kesme ve cam slaytlar yıkayın.
      1. Mikroskopi slaytlar 1,25 cm x 1,25 cm bir elmas uçlu kesici ile 18 slaytlar içine kesti. Böylece üst ve alt tarafı daha sonra ayırt edilebilir küçük bir girinti her slaydın alt tarafında olun.
      2. Slaytları % 96 etanol tarafından takip deiyonize su ile iyice yıkayın. Onları kurumasını sağlar.
    2. % 2 PLLA çözüm hazırlamak.
      1. PLLA 200 mg 1,4-dioxane bir basınç tüp 10 mL ekleyin. Bir heyecan çubuğu eklemek ve tüp sıkıca kapatın.
      2. Gliserin banyo 24 h için nazik karıştırma altında 60 ° C'de sıcak tabakta basınç boru yerleştirin ve sonra çözüm 15 mL cam şişe aktarın.
    3. Cam slaytlar PLLA çözüm ile kaplama.
      1. Cam slaytlar ve şişeyi PLLA çözüm ile 60 ° C'de temiz sıcak bir tabak yerleştirin Yukarı bakacak şekilde slaytlar yerleştirdiğinizden emin olun ve onlara gerekli sıcaklık ulaşmak en az 10 dk kalmasını sağlar.
      2. Spin coater hazırlamak ve Tablo 1' de belirtilen program ayarla.
      3. Bir vakum sistemi kullanılarak spin coater üzerinde slaytlar yüzleri yukarı yerleştirin. Pasteur pipet ile 0.25 mL PLLA çözeltisi tüm yüzeyi kaplı emin slayda uygulanır. Kaplama programını çalıştırın. Her slayt için bu işlemi tekrarlayın.

2. Dendrimer Nanopatterning

  1. RGD-Functionalized Dendrimer (RGD-Cys-D1) 28 çözümleri hazırlanması.
    1. Dendrimer 6.494 mL deiyonize su içinde 5 mg geçiyoruz. Bu çözüm A. olduğunu
      Not: dendrimer hisse senedi çözüm hazırlık 6 ay içinde kullanın.
    2. Çözüm A 10 min için solüsyon içeren temizleyicide ve B ve C Tablo 2aşağıdaki çözümleri hazırlayın.
    3. Çözüm C 10 min için solüsyon içeren temizleyicide ve D, E ve F Tablo 2aşağıdaki çözümleri hazırlayın.
    4. Çözümler B, C, D, E ve F 4 ° C'de kullanmak kadar saklamak. Çözüm A daha sonra kullanmak için-20 ° C'de muhafaza edilebilir.
  2. Nanopatterning RGD-Cys-D1 Dendrimers yüzeyler üzerinde
    1. Bir doku kültürü başlık, onları 13 dk için UV ışığıyla irradiating yüzeylerde sterilize.
      Not: nanopatterned yüzeylerde hücre kültür yüzeyler kullanılmak üzere giderken bu adımı yalnızca gereklidir. Bu durumda, aşağıdaki adımları için steril koşullar (doku kültürü başlık, steril malzemeler, çözümleri ve teknikleri) korumak.
    2. Her substrat yüzünü onları dikkatle cımbız ile işleme bir tabak, kuyu yerleştirin.
    3. Çözümler B, C, D, E ve F 10 min için solüsyon içeren temizleyicide.
    4. RGD-Cys-D1 dendrimer çözümleri yüzeylerde (2 mL/de) içeren wells doğrudan kullanarak 0,22-µm çapı filtre geçişi. Dendrimer konsantrasyonu başına en az üç yinelemeler tavsiye edilir. Kapatın ve plaka mühür ve oda sıcaklığında (RT) 16 h için bırakın.
    5. Kaldırmak ve çözümleri atın. Steril deiyonize su ile ve kuru yüzeylerde yıkayın. Yüzeylerde 4 ° C'de depolayın
      Not: Protokol burada duraklatılmış.

3. Denetim yüzeylerde hazırlanması

Not: Tüm adımları steril doku kültürü hood ve sadece steril malzemeler, çözümlerinde gerçekleştirilen ve teknikleri kullanılmıştır. En az altı yüzeylerde kullanılan (pozitif kontrol üç yineleme) ve negatif kontrol üç kopyaları kontrol.

  1. Bir doku kültürü başlık, onları 13 dk için UV ışığıyla irradiating yüzeylerde sterilize.
  2. Denetim yüzeylerde Fibroblast adezyon deney için.
    1. Alev komplementer Au(111) yüzeyler negatif kontrol kullanın. Altın Anti-hücre yapışkanlı özellikleri28confers bir iyi bilinen protein-denatürasyon etkiye sahiptir. Tüm çözümler solüsyon içeren temizleyicide ve substrat kuluçka önce filtre.
    2. Alev komplementer Au(111) yüzeylerde RGD-modified PEG thiol, Ac-Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Asp-NH-ethylene glikol mono-11-mercaptoundecanamide (RGD-PEG-SH)30 ve triethylene glikol bir çözümde pozitif kontrol için bırakın Mono-11-mercaptoundecyl eter (PEG-SH) adlı bir 1: 100 molar oranı % 96'sı etanol RT. 16 h için
    3. Yüzeyler iyice etanol yıkayıp onları argon ile kurulayın. Yüzeylerde 4 ° C'de depolayın
  3. Denetim yüzeyler için Chondrogenesis.
    1. Bozulmamış PLLA yüzeyler negatif kontrol kullanın. Yüzey herhangi bir tedavi olmadan, PLLA canlı hücreler ile zavallı arabirim oluşturarak gösterir. 31
    2. Pozitif kontrollerin 5 mL serum fizyolojik (PBS) fosfat tamponlu 0.1 mg/mL fibronektin de hazırlamak ve her PLLA substrat 1.6 mL 1 h RT. fibronektin çözeltisi ile kuluçkaya
    3. Kaldırmak ve fibronektin çözüm atın ve yüzeylerde PBS ile yıkayın. Yüzeylerde 4 ° C'de depolayın

4. yüzey karakterizasyonu

  1. AFM görüntüleme
    1. PLLA yüzeylerde AFM görüntüleme için bir pürüzlülük çözümlemesi gerçekleştirin. Dendrimers 4-5 nm, pürüzlülük değerleri 1 çapında beri nm nanopatterns doğru görselleştirme için elde. Ayrıca, nanopatterns AFM görüntüleme gerçekleştirmek. Her iki durumda da hava modunda dokunarak AFM gerçekleştirin.
    2. Silikon konsol seçin bir bahar sürekli k = 40 N/m ve bir rezonans frekansı ν = 300 kHz ve AFM ekipman monte edin.
    3. Örnek Atomik kuvvet mikroskobu sahnede bağlayın. Aparatı up bağlı olarak ayarlama ve görüntüleme özellikleri farklı olabilir. Üreticinin el kitabı bakın.
    4. Örnek mikroskop ucu ile temas kadar yaklaşın.
    5. PLLA pürüzlülük analiz için görüntü için üç bağımsız yüzeylerde 20 x 20 µm substrat başına en az dört temsilcisi alanı seçin. Dendrimer nanopatterns resim, koşul (çözüm ilk dendrimer konsantrasyon) başına üç bağımsız yüzeylerde 5 × 5 mikron substrat başına en az üç temsilcisi görüntüleri seçmek için. Dendrimer katman görüntüleme sırasında zarar görmesini önlemek için en azından kuvvet tutmak için kullanılabilir ayar noktası ayarlayın.
      Not: Görüntüleme alanını seçim da piezoelektrik tarayıcı çalışma aralığına bağlıdır. Lütfen bu konuda araç kullanım kılavuzuna bakın.
    6. AFM yükseklik yaklaştırarak görüntüleri işlemi her işlevleri AFM cihaz üreticisine özel mülk yazılım kullanma tesviye polinom hattına inceden inceye gözden geçirmek ve bu yüzey pürüzlülüğü hesaplamak için PLLA analiz. Kök ortalama kare (RMS) analizi uygun bir seçenek sağlayabilir.
  2. Yerel RGD yüzey yoğunluğu ölçüm.
    1. Görüntü eşikleri işlenmiş AFM yükseklik görüntülerin yüzeyi dendrimers seçmek için edinin.
    2. Bir görüntü işleme yazılımı kullanarak parçacık konumları belirler ve en az interparticle mesafeler (ddk) elde etmek için kullanabilirsiniz.
    3. Dmin değerleri z ddkiçin olasılık kontur haritaları elde etmek için ilgili parçacık konumlara arsa. En yüksek yerel RGD yüzey yoğunluğu (ddk < 70 nm) bölgelerinde görselleştirmek için arsa renk ölçeğini ayarlama.
    4. Alan bölgelerin bir görüntü işleme yazılımı kullanarak en yüksek yerel RGD yüzey yoğunluğu ile ölçmek. Dendrimer toplamları alanlarında hesaplamaya dahil.
  3. STM görüntüleme.
    Not: STM görüntüleme sadece için nanopatterns iletken Au(111) yüzeyler üzerinde gerçekleştirilebilir. Ölçümler havada yapılır.
    1. Nanopatterned substrat yer STM ekipman örnek tutucu. Örnek ile sahibi arasındaki elektrik bağlantısı Sınayıcısı ile kontrol edin.
    2. Seçili sonda malzeme (i.e. ucu etch PT 0.8: Ir 0,2) başında STM ekipman uygun montaj sağlayan çapında. Gravür el ile kesme veya elektrokimyasal gravür tarafından gerçekleştirilebilir. 32
      Not: Elektrokimyasal gravür daha fazla simetrik ipuçları vermektedir.
    3. STM ekipman başkanı ipucunda bağlama ve örnek bağlanın.
    4. "Geribildirim kanalda geçerli" küme (bu tür ölçümü, geçerli bir geri bildirim ayarlama tarafından sürekli olacak). Önyargı voltaj ve geçerli ayar noktası ve ucu nişanlı bir kez de çözümlenmiş bir görüntü elde etmek için tarama boyutu ayarlayın.
      Not: Görüntüleme alanını seçim da piezoelektrik tarayıcı çalışma aralığına bağlıdır. Lütfen bu konuda araç kullanım kılavuzuna bakın.
    5. Polinom tesviye için her tarama satırı sığdırma tarafından STM topografik görüntüleri işlevleri STM cihaz üreticisine özel mülk yazılım kullanma işlemi.
  4. CA ölçümleri.
    1. Koşul (çözüm ilk dendrimer konsantrasyon) optik CA sistemle başına üç bağımsız yüzeyler üzerinde üç farklı pozisyonlarda sesil bırakma yöntem tarafından nanopatterned yüzeyler üzerinde ölçü CA.
    2. Microsyringe deiyonize su ile doldurun ve damla 1 µL üretmek için CA yazılımında parametreleri ayarlayın.
    3. Böylece örnek yüzeyinin açıkça görülebilir görüntüleme için bilgisayarda örnek sahne alanı'nda yerleştirin.
    4. Yüzeye yakın gelene micromanipulator şırınga taşımak ve damla yüzeyine dağıtmak. Kaydı hemen sonra damlacık sabitleme görüntü.
      Not: CA ölçümlerde bu tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için nem kontrol etmek çok önemlidir.
    5. CA cihaz üreticisine özel mülk yazılımla ölçülen CAs analiz. Uygun yöntemi kullanıcı gereksinimleri için ayarlanabilir. Eliptik uygun yöntem bir seçenek olabilir.

5. hücre kültürü

Not: Tüm adımları bir doku kültürü hood ve sadece steril malzemeler, çözümlerinde gerçekleştirilen ve teknikleri kullanılmıştır.

  1. Fibroblast adezyon deney.
    1. Kültür NIH 3T3 fare embriyonik fibroblastlar 37 ° C ve % 4.6 CO2 atmosfer Bazal ortamda erken pasajlar (< 10) üzerinden % 10 fetal sığır serum ile (FBS), takıma yüksek glikoz ile %1 L-glutamine, % 1 penisilin-streptomisin ve % 1 sodyum pyruvate (büyüme orta). T75 şişe toplam 500.000 hücre büyüme ortamının 10 mL şişeye başına tohum için tavsiye edilir.
    2. 2 günde bir 10 mL pipet ile eski orta kaldırın ve taze hazırlanmış büyüme orta 10 mL ile değiştirin.
    3. Kültür hücreler büyüme orta kadar %80 izdiham, sonra Kaldır orta ulaşmak ve tripsin şişe başına 5 mL ekleyin. Balonun altındaki uygun hücre dekolmanı emin olmak için 37 ° C'de 5 min için hücreleri temas tripsin çözüm korumak
    4. 5 mL şişe başına büyüme ortamının ekleyin ve bir santrifüj tüpü hücrelerde toplamak. 470 x g 5 dk. Kaldır, hücreleri süpernatant santrifüj kapasitesi ve hücre Pelet büyüme orta 10 mL resuspend. Bir hemasitometre kullanarak hücre konsantrasyonu belirlemek.
    5. Doku kültürü (yapışık olmayan) için tedavi değil tabak iyi yüzeylerde aktarın.
    6. 4.000 hücreler/cm2 büyüme Orta yoğunluk, yüzeylerde hücrelerdeyse tohum ve onları 4.5 h 37 ° C ve % 10 CO2 atmosfer için kuluçkaya.
  2. MSCs indüksiyon Chondrogenic.
    1. Kültür insan MSCs erken pasajlar üzerinden (< 5) 37 ° C ve % 4.6 CO2 atmosfer MSC büyüme orta. T75 şişe toplam 500.000 hücre büyüme ortamının 10 mL şişeye başına tohum için tavsiye edilir.
    2. Orta (5.1.2 içinde açıklandığı gibi) her 3 günde değiştirin.
    3. % 80 izdiham ulaştı ve santrifüj kapasitesi ve onları (5.1.3 içinde açıklandığı gibi) MSC büyüme aracı olarak resuspend önce hücreleri trypsinize. Bir hemasitometre kullanarak hücre konsantrasyonu belirlemek.
    4. Hücreleri tekrar santrifüj kapasitesi ve onları 10 mL chondrogenesis-inducing orta resuspend.
    5. Yüzeylerde doku kültürü (yapışık olmayan) için tedavi değil yeni iyi tabak tabak aktarın. 3.000 hücreler/cm2yoğunluğu, yüzeylerde hücrelerdeyse tohum.
    6. Chondrogenic orta 3 günde (5.1.2 içinde açıklandığı gibi) değiştirin.

6. hücre fiksasyon ve Immunostaining

Not: Aşağıdaki adımları non-steril koşullarda gerçekleştirilir.

  1. Medyayı çıkarın ve hücreleri nazikçe PBS ile yıkayın. RT 20 dk için % 10 formalin çözüm ekleyerek düzeltmek
  2. Formalin kaldırmak ve PBS hücrelerle yıkayın.
  3. Serbest aldehit gruplarını PBS içinde bir 50 mM çözüm amonyum klorür (NH4Cl) ekleyerek engellemek. 20 dk RT. kaldırmak NH4Cl çözüm için hücre bıraktığınızdan ve PBS hücrelerle yıkayın.
    Not: Protokol burada duraklatılmış. PBS mağaza örnekleri 4 ° C'de
  4. Ve saponin % 0,1 çözümünün engelleme çözümde (PBS %1 albümin) 10 dakika dik yıkamada PBS hücrelerle ekleyerek hücreleri permeabilize ve örnekleri için yeni bir iyi tabak transfer PBS çıkarın.
  5. Bir çözüm engelleme çözümde (Tablo 3) RT. 1 h için birincil antikorların hücrelerle kuluçkaya Daha sonra birincil antikor çözümü kaldırmak ve PBS hücrelerle yıkayın.
  6. Kuluçkaya RT. 1 h için engelleme çözüm (Tablo 3) ikincil antikor içeren hücreler
    Not: ışık önlemek maruz kalma.
  7. İkincil antikor çözümü kaldırmak ve PBS ve kuru hücreleri yıkayın.
    Not: Protokol burada duraklatılmış. Örnekleri PBS karanlıkta 4 ° C'de depolayın.
  8. Örnek montaj için mikroskop gözlem: elmas uçlu kesici kullanarak, geçerli 50 µL 1,25 cm x 1,25 cm. orta örnekleri üzerine montaj mikroskopi coverslips oyulmuş ve onları hafifçe kesilmiş coverslips ile koruyun.
  9. Örnekler uygun bir alıcıya transfer, gözlem kadar alüminyum folyo ve mağaza içinde 4 ° C'de karanlık ile kapak.

7. hücre görüntüleme ve veri analizi

Not: opak Au(111) ve kalın microslide tabanlı yüzeyler için dik bir mikroskobu kullanılması gerekir.

  1. Fibroblast adezyon deney.
    1. Kullanım bir epifluorescence mikroskobu hedefleri bir dijital fotoğraf makinesi ve düşük (yani 10 X) ve yüksek (yani 40 X) büyütme ile donatılmıştır. Ölçümler havada gerçekleştirin.
    2. Örnek bir ultraviyole uyarma, Höchst/DAPI leke görselleştirmek için longpass emisyon filtre kullanarak 10 X amacı ile sahne ve görüntü hücre çekirdeği yerleştirin.
    3. Görüntü hücre sitoiskeleti ve odak yapışıklıklar (FAs) karşılık gelen antikor fluorochrome özellikleri ile eşleşen mikroskop filtre seçmek 40 X amacı ile.
    4. FA miktar için 8-bit görüntüleri dönüştürmek bir görüntü işleme yazılımı kullanın. İkili arka plan ve dönüştürmek resimlere bir eşik ayarlayarak kaldırın. En az 30 kare / örnek hesaplamak ve FAs 1 µm2 hesaplaması için düşünün.
  2. MSCs indüksiyon Chondrogenic.
    1. Görüntü hücre yoğunluğu chondrogenic indüksiyon (< 5 gün) ilk aşamalarında bir dijital fotoğraf makinesi ve düşük (Yani 10 X) ile donatılmış bir dik epifluorescence mikroskobu ile büyütme objektif. Höchst/DAPI leke görselleştirmek için ultraviyole uyarma ve longpass emisyon filtreyi kullanın.
    2. Yoğuşma alan ölçme, bir görüntü işleme yazılımı kullanın, görüntü 8 bit dosyalarına dönüştürmek, arka plan çıkarmak ve toplama kontur vurgular bir eşik seçin. Parçacıkların alanını hesaplamak.
    3. FAs, sitoiskeleti aktin iplikleri ve kıkırdak özgü kollajen tip II Alfa 1 (COL2A1) bir dik confocal mikroskobu yüksek büyütmede (yani 40-60 X) ile örnek immunostained. Bölümler temsilcisi aralığında (Yani 0.5 – 1 µm) toplamak.
    4. Yığın işlemek için bir görüntü işleme yazılımı kullanın. 8-bit dosyaları için görüntüleri dönüştürmek, arka plan çıkarmak ve onları bir eşik ayarlayarak ikili olun. Üç bağımsız örneklerin koşul başına üç hücre yoğunluğu en az tedavi.
    5. Hücre yoğunluğu Bazal Bölge alanlarından lekeli SK protein ölçmek ve onlara karşılık gelen hücre çekirdeği görüntü sayısı bölü alanının yüzdesi olarak ifade eder.
    6. COL2A1 boyama ölçmek için öngörülen alan (örnek başına maksimum COL2A1 alanı) toplamı ölçmek ve confocal z-projeksiyonlar kullanın. Karşılık gelen yoğuşma alan karşı alınan alan değeri normalleştirmek.

8. kantitatif ters transkripsiyon-Polimeraz zincir reaksiyonu (qRT-PCR) analiz

Not: RNase kirlenmesini önlemek için tek kullanımlık, steril plastik eşya kullanın ve reaktifler ve RNA işlerken tek kullanımlık eldiven giymek. Her zaman uygun Mikrobiyolojik aseptik teknikler kullanmak ve bir uygun dekontaminasyon çözüm RNase kirlenme çalışma yüzeyleri ve santrifüjler ve Pipetler gibi olmayan tek öğeleri kaldırmak için kullanın.

  1. Toplam RNA yalıtmak ve onu bir RNA bozguncu ezmek. Dnaz örnekleriyle RNA tedavi ve cDNA sentez seti kullanarak cDNA dönüştürmek.
  2. QRT-PCR kuralları transkripsiyon faktörü SOX9primerler kullanılarak. Beta-2-Mikroglobulin (B2a) ve ribozomal protein L13a (RPL13a)-ebilmek var olmak kullanılmış temizlik genler.
  3. İfade düzeylerini hesaplama ve negatif kontrol (PLLA) karşı normalleştirmek.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Biz Nano (şekil 1) ele alınması gereken yüzey adhesiveness sağlayan bir nanopatterning yöntemi mevcut. RGD-Cys-D1 kimyasal yapısını şekil 1Aile gösterilir. Dendrimers elektrik iletken Au(111) yüzeylerde yüksek çözünürlük STM karakterizasyonu için desenli. Çözüm (en çok 10-5% w/w) konsantrasyonlarda düşük dendrimer 4-5 nm çapında (şekil 1B), daha yüksek konsantrasyonlarda (şekil 1 c) oluşan son derece dolu dendrimer toplamları süre izole dendrimers render. AFM yüzey karakterizasyonu (Rakamlar 1 D-G, üst satır) RGD-Cys-D1 dendrimers yüzey dağıtım çözümü ilk dendrimer konsantrasyon bir fonksiyonu olarak ayarlanabilir saptandı. Ddkiçin olasılık dağılımı haritalar üzerinde farklı yerel RGD Nano yoğunlukları (Rakamlar 1 D-G, alt satır) yüzeyinde sonuçlanır.

Hücre kültür deneylerde, hücre membran reseptör integrinler yaklaşık 10 nm çapında tanınan dendrimers periferal RGD sıra. Bu sırası sekiz kopya dendrimer sağlanan rağmen tek bir dendrimer (STM; ölçülen 4-5 nm boyutu nedeniyle integrin başına etkileşim Şekil 1B). Diğer bir deyişle, her dendrimer tek bir site integrin bağlama için böylece doğrudan bir ilişki dendrimer dağılımından (AFM görüntülerde görüldüğü gibi) izin ve RGD dağıtım hücre adezyon için kullanılabilir sağladı. Ayrıca, önemli hiçbir varyasyon hücre adezyon29etkileyebilir farklı nanopattern yapılandırmaları için alınan CA değerleri bulunmuştur. Bu özellikleri dendrimer nanopatterns hangi aracılığıyla Biyouyumlu yüzeyler uygun yüzeyler modüle ve hücre davranış çalışma yapmak.

Hücre adezyon nanopatterned Au(111) için nanopatterned PLLA (şekil 2B) kültür (şekil 2A) ilk 24 saat içinde fibroblastlar ve MSCs ile test edildi. Yerel RGD yüzey yoğunluğu (nanopatterned alanı yüzdesini ddk 70 nm eşiğin ile yaptığı gibi her iki durumda da, giderek artan dendrimer konsantrasyon ile SK protein paxillin (pax) için alanı yüzdesini lekeli etkin hücre adezyon için; Tablo 4). Bir ilk dendrimer konsantrasyonu 10-2%için w/w ve olumlu denetimleri, alanının yüzdesi düşmüştür hücre başına pax için lekeli ve ddk < 70 nm ile nanopatterned alanının yüzdesi ile korelasyon kayboldu.

Dmin tarafından işgal yüzey alanı yüzdesi < 70 nm (şekil 1 d-G alt satır ve Tablo 4) nanopatterns 10-5% w/w ilk dendrimer kadar için yerel RGD yüzey yoğunluğu iyi bir gösterge olduğunu konsantrasyon değil, o kadar 10-2% w/w, dendrimer toplama nedeniyle. Toplama dmin değerleri (şekil 1 d alt satır ve Tablo 4) 70-nm eşiğin yüzeyle sadece küçük bir yüzdesi ile ligand dağıtım açısından son derece heterojen örnekleri üretilen. XPS sonuçlar gösterdi Bu yüzeyler için 10-5% w/wkarşılaştırılabilir bir küresel RGD yoğunluğu sunmak-nanopatterns28türetilmiş. Bu gözlem maksimum RGD yoğunluk dendrimer toplamları içeren bölgelerin elde edildi ve yüzey alanı yüzdesi dmin tarafından işgal gösterir < 70 nm yerel RGD yüzey yoğunluğu temsilcisi değildir Bu durumda.

Maksimum yerel RGD yüzey yoğunluğu ile pozitif denetimleri (homojen kaplama) hücre adezyon beklenen artış gösteriyor değil gözlem için steric engel etkisi bağlanabilir. Bu sonuçlar belirtmek yaygın olarak kullanılan hücre kültüründe karşılık gelen homojen yüzeyler ile karşılaştırıldığında, RGD nanopatterns hücre adezyon daha verimli bir şekilde sürdürmek. Bu bulgu böylece yerel ligand yoğunluğu alaka vurgulamaktadır.

Etkileşimleri ile morfogenez çevresindeki ortamda ilk hücre farklılaşması olayları tetikler ve bunları son karmaşık doku yapılarının kuruluş kadar yayar. Hücre adezyon ve farklılaşma dendrimer nanopatterns etkilerini değerlendirmek için bir model olarak MSCs chondrogenic indüksiyon kullandık. Chondrogenesis sırasında işte aktif matris remodeling, hangi hücreler arasında kıkırdak oluşumu farklı aşamalarında yönetmenlik öğretici bir rol oynar.

MSCs chondrogenesis nanopatterns (şekil 3) üzerinde uygulandı. Chondrogenic farklılaşma hücre işe alım yoğun yoğunlaşması, hücre hücre iletişim ve eşlik eden değişiklikleri kurulması hücre morfolojisi33oluşturmak için içerir hücre yoğunlaşma adım ile başlar. Hücre yoğunlaşma tüm yüzeylerde ve o yoğunlaşması oluştu şekil 3A gösterir alanda artan dendrimer konsantrasyonları ile ilâ 2.5 x 10-8% w/w yoğuşma alan sonra tekrar bir dendrimer için azalma arttı konsantrasyonu 10-2% w/w ve pozitif kontrolü için. Chondrogenesis hücre yoğunlaşma adımda Hücre proliferasyonu34artış yoluyla değil, etkin hücrenin hareketi oluşur. Bu hücre hareketi ile belgili tanımlık substrate esnek yapışma tarafından tercih edilir: istikrarlı yapışıklıklar çekiş güçleri hücre cesedi taşımak için izin vermek için kurulan ve aynı zamanda, bu yapışıklıklar hücre serbest bırakmak--dan belgili tanımlık substrate sırasında izin vermek için zayıf olmalıdır hareketi. Hücre yoğunlaşma artış tarafından 2.5x10-8% w/wkadar yerel RGD yüzey yoğunluğu içinde tercih-hücre adezyon ve hücre hareketi arasında iyi bir denge ile nanopatterns, türetilmiş. 10-2 ve pozitif kontrol için yerel RDG yüzey yoğunluğu çok yüksek, böylece yoğunlaşma olay bozulması.

Chondrogenic farklılaşma gelirleri prechondrogenic yoğunlaşması: yoğunlaşması hücrelerinde daha yuvarlak haline ve ECM protein COL2A1 ve transkripsiyon faktörü SOX933, gibi kıkırdak belirli işaretleri sentezi başlatmak 34 , 35. buna göre yüzeylerde hücre yoğunlaşması, oluşumu lehine bir ara adhesiveness ile daha yüksek COL2A1 (şekil 3B) Boyama ve SOX9 mRNA ifade (şekil 3 c) yüksek düzeyde gösterdi.

Sonuçlarımız hücre-hücre matris etkileşimleri etkisi chondrogenic farklılaşma erken evrelerinde vurgulayın. Bu tür etkileşimler nanopatterns dendrimer tabanlı kolayca saptanabilir.

Adım Zaman (s) Dönüş hızı (rpm) Hızlanma (devir/dakika/sn)
1 5 500 300
2 30 3000 1.500

Tablo 1: Cam slayt hazır PLLA çözüm ile kat için kullanılan değer değişimi programı adımları. Bir ilk homojenizasyon adım 300 d/d/s ivme ile 500 rpm'de 5 için kullanılan s. takip 1500 devir/dakika/sn 30 için ivme ile 3000 rpm'de son bir adım s.

Çözüm RGD-Cys-D1 (mg/mL) RGD-Cys-D1 (mg) MQ su (µL)
A 0.77 5 6,494
RGD-Cys-D1 (% w/w) Çözüm (µL)
B 10-2 779 5,220
C 10-5 0.78 6.000
Çözüm C (µL)
D 2,5 x 10-8 15,0 5985
E 10-8 6.0 5,994
F 4 x 10-9 2.4 5,998

Tablo 2: Kullanılan RGD-Cys-D1 çözümleri hazırlanması ayrıntılarını. RGD-Cys-D1 dendrimers hisse senedi bir çözüm içinden 10-2 ve 10-5% w/w konsantrasyonları B ve C çözümleri hazırlanmıştır 0,77 mg/mL (a çözüm) son bir konsantrasyon adlı hazırlanmıştır. RGD-Cys-D1 dendrimer çözümünün C 10-5% w/w konsantrasyon ile çözümler D, E ve F 2, 5 x 10-8, 10-8 ve 4 x 10-9%w/w, son konsantrasyonlarda sırasıyla hazırlamak için kullanıldı.

Adı Birim (µL) Engelleme arabellek (mL)
Birincil mix Tavşan mAb pax için 65 12.870
Fare mAb COL2A1 için 32.5
İkincil mix Alexa Fluor 488 keçi Anti-fare 13 12.961
Alexa Fluor 568 keçi Anti-tavşan 13
Höchst çözüm 13

Tablo 3: antikor eriyik hazırlığı. Birincil antikor bulunan karışım Monoklonal antikor tavşan üretilen pax karşı 1: 200 ile seyreltilmiş fare 1: 400 engelleme çözümde üretilen COL2A1 karşı Monoklonal antikor engelleme çözümde seyreltilmiş. Hücre çekirdeği leke Höchst ikincil antikor karışımı kapsanan ve ikincil antikorlar üretilen keçi fare ve tavşan karşı içinde sırasıyla (etiketli Alexa Fluor 488 ve 568 fluorophores, sırasıyla).

Figure 1
Resim 1 : RGD-Cys-D1 dendrimer nanopatterning yerel RGD yüzey yoğunluğu Nano kontrolü için. (A) en çok sekiz hücre yapışkanlı RGD peptid kopyalarını içeren RGD-Cys-D1 dendrimer yapısı. Temsilcisi STM görüntüleri (önyargı = 200 mV, ayar noktası 0.5 nA =) üzerinden 10-8% w/w ilk sulu bir çözüm üzerinde Au(111) RGD-Cys-D1 nanopatterns in (ölçek çubuğu = 3 nm, B) ve karşılık gelen yükseklik-mesafe profil elde kesik üzerinde Bölge gösterilir (B)ve (C) dendrimer toplama gösterilen 10-2% w/w (ölçek çubuğu = 20 nm). (D-G) RGD-Cys-D1 nanopatterns PLLA üzerinde temsilcisi AFM görüntüleri elde edilen ilgili dendrimer sulu çözümlerinden 10-2%, 2.5 x 10-8%, 10-8%ve 4 x 10-9% w/w, sırasıyla (ölçek çubuğu 1 µm =). Karşılık gelen en az interparticle mesafe (ddk) olasılık dağılımı harita her AFM görüntünün altında koyu kırmızı ile gösterilen RGD bölgeler yüksek yoğunluklu gösterilir (ddk < 70 nm). Dendrimers ve dendrimer toplamları siyah netlik için tasvir edilmektedir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Resim 2 : Hücre adezyon üzerinde RGD-Cys-D1 nanopatterns. SK protein pax substrat (sol eksen) ilk dendrimer konsantrasyon ile temas hücrelerin hücre başına için lekeli alan yüzdesi arsa. Değerler yerel RGD yüzey yoğunluğu (70 nm eşiğin altına dmin değerleri içeren nanopatterns yüzey alanının yüzdesi) ile karşılaştırılır (sağ eksen) (+ kumanda) olumlu olarak atanan 100 ve 0 yüzdeleri ve negatif (- denetimi), sırasıyla alırız. (A) Fibroblast yapışma üzerinde kültür 4.5 h sonra Au(111) üzerinde dendrimer nanopatterns. (B) MSC yapışma dendrimer nanopatterns PLLA chondrogenic indüksiyon 1 gün değerlendirilen üzerinde üzerinde. Değerleri standart sapma ile ortalama olarak verilmiştir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

RGD-Cys-D1 (% w/w) Alan (< ddk = 70 nm) (%) Au(111) üzerinde Alan (< ddk = 70 nm) (%) PLLA üzerinde
10-2 5 ± 1 2 ± 2
10-5 97 ± 2
2, 5 x 10-8 65 ± 11 90 ± 2
10-8 25 ± 16 45 ± 7
4 x 10-9 18 ± 11

Tablo 4: alanı yüzdesi d Min değerleri aşağıda 70 nm elde RGD-Cys-D1 dendrimer ifade Au(111) ve PLLA kullanılan ilk dendrimer konsantrasyonları bir fonksiyonu olarak yüzeyler için.

Figure 3
Şekil 3 : Chondrogenic RGD-Cys-D1 nanopatterns üzerinde MSCs farklılaşma. (A) RGD-Cys-D1 nanopatterns PLLA üzerinde üzerinde 5 gün sonra chondrogenic indüksiyon kültürlü MSCs yoğunlaşma. Temsilcisi epifluorescence görüntülerini lekeli hücre çekirdeği (Höchst; Ölçek çubuğu 300 µm; = üst satır) ve hücre yoğunluğu (alt satır) alanının RGD-Cys-D1 nanopatterns farklı ilk dendrimer konsantrasyonları üzerinden elde edilen arsa. Farklılaşma hücre yoğunlaşma adım belirli chondrogenic işaretleri ifade ile devam eder: COL2A1 karşılık gelen confocal z-yansımalar gelen hücre yoğuşma bulunduðu normalleştirilmiş boyama alanının yüzdesi (B) 5 gün sonra chondrogenic indüksiyon elde etti. Chondrogenic indüksiyon 3 gün sonra (C) göreli SOX9 mRNA ifade (karşı negatif kontrol). Değerleri (B) ve (C)standart sapma ile ortalama olarak verilmiştir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Açıklanan protokol geliştirilmesi sırasında birkaç kritik adım düşünülmelidir. İlk tarama prob mikroskobu teknikleri ile nanopattern karakterizasyonu anlamına gelir. Nanopatterns görselleştirmek için nerede desenlendirme üretilen Yüzey pürüzlülük değerinin altında civarındadır dendrimers ortalama çapı olması gerekir (şekil 1B) STM tarafından ölçülen 4 – 5 nm. Ayrıca, yüksek çözünürlüklü STM görüntüleme için bu durumda Au(111) iletken yüzeylerde sınırlıdır dikkate alınmalıdır. Herhangi bir slayt köşesinden polimer spin-kaplama sonra kaldırma Biyouyumlu tutkal kullanarak düzeltilmesi.

Dendrimer nanopatterning bir işlemi üzerinden elde etmek yerel hücre adhesiveness, nano kontrollü olduğunu. Temel kendinden montajlı adsorpsiyon tarafından yüzeyinde dendrimers bu teknik herhangi bir karmaşık nanopatterning donanım gerektirmez, böylece daha önce ile zıt açıklanan yöntemleri litografi tabanlı36,37, 38. Dendrimer nanopatterning kolayca geniş yüzey alanları için ölçeklendirilebilir ve hücre kültürü iletişim kuralları ile tam olarak uyumludur.

Burada açıklanan dendrimer nanopatterning yöntemi gelecekteki uygulamalar rejeneratif tıp alanında bulabilirsiniz. Tarafından dendrimer nanopatterning hücre adhesiveness üzerinde denetim bu teknik Biyomalzeme implantasyonu, böylece ana bilgisayar doku içine entegrasyonu kolaylaştırmak önce Klima için uygundur. Ayrıca, hangi dendrimer ile periferik moieties değiştirilebilir kolaylığı dendrimer nanopatterning konsantrasyon bağımlı hücreleri faaliyete sarfetmek diğer ligandlar için uygun yapar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgments

Yazarlar Oriol yazı tipi-Bach ve Albert G. Castaño ddk miktar onların yardım kabul edersiniz. Onlar da gelişmiş Digital mikroskobu birimi (IRB Barcelona) kendi tesislerinde video kaydetmek yazarlar izin Biyomedikal Araştırma Enstitüsü'nde kabul. Bu eser ağ Biyomedikal Araştırma Merkezi (CIBER tarafından), İspanya desteklenmiştir. CIBER bir girişim VI Ulusal ar-ge & ben planı 2008-2011, bulunan INGENIO 2010, Consolider programı, CIBER eylemleri ve Instituto de tarafından Salud Carlos III, Avrupa Bölgesel Kalkınma Fonu desteği ile finanse var. Bu eser üniversiteler ve araştırma departmanı yenilik, üniversiteler ve kurumsal Generalitat de Catalunya için komisyon tarafından desteklenen (2014 SGR 1442). Ayrıca OLIGOCODES (No projeler tarafından finanse edildi MAT2012-38573-C02) ve CTQ2013-41339-P, rekabet ve İspanyolca Ekonomi Bakanlığı tarafından Ayrıca INTERREG V-A İspanya-Portekiz 2014 2020 POCTEP (0245_IBEROS_1_E) için verilmiştir. C.R.P. İspanyolca Ekonomi Bakanlığı ve rekabet gücünü grant (No mali desteği kabul eder. IFI15/00151).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Gold (111) on mica. 1.4x1.1 cm  Spi Supplies 466PS-AB
Glass micro slides, plain Corning 2947-75x25
Deionized water Millipore 18MΩ cm
Ethanol 96% PanReac 131085.1212
L-Lactide/DL-Lactide copolymer Corbion 95/05 molar ratio
1,4 - dioxane Sigma-Aldrich 296309-1L
Silicone oil, high temperature Acros Organics 174665000
Spinner Laurell WS-650MZ-23NPP/Lite
Tissue culture laminar flow hood Telstar Bio II Advance Class II biological safety cabinet
Filter unit Millex-GP SLGP033RB 0.22 µm
Syringe 10 mL Discardit 309110
Atomic Force microscope Veeco Instruments Dimension 3000 AFM instrument
Silicon AFM probes Budget Sensors Tap300AI-G Resonant Freq. 300 kHz, k = 40 N/m
Scanning tunneling microscope Molecular Imaging PicoSPM microscope
Pt0.8:Ir0.2 wire Advent PT671012 Diameter 0.25 mm
WSxM 4.0 software Nanotec electronica
Optical contact angle (CA) system Dataphysics
SCA20 software Dataphysics
X-ray photoelectron spectrometer Physical Electronics Perkin-Elmer PHI 5500 Multitechnique System
Fibronectin from bovine plasma Sigma-Aldrich F1141-1MG 1.0 mL solution
Dulbecco's Phosphate Buffer Saline (DPBS) Gibco 21600-10 Powder
Mouse embryo fibroblasts ATCC ATCC CRL-1658 NIH/3T3
Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) liquid high glucose Gibco 11960044 liquid high glucose, no glutamine, 500 mL
Fetal Bovine Serum (FBS) Gibco 16000044 500 mL
L-Glutamine Invitrogen 25030 200 mM (100X)
Penicillin-streptomycin Invitrogen 15140
Sodium pyruvate Invitrogen 11360039 100 mL
T75 culture flasks Nunclon 156499
Trypsin Life Technologies 25200072 0,25% EDTA
Centrifuge Hermle Labortechnik Z 206 A
Non-tissue culture treated plate, 12 well Falcon 351143 Non-adherent
Adipose-derived hMSCs ATCC ATCC PCS-500-011 Cell vial 1 mL
MSC basal medium ATCC ATCC PCS-500-030
MSC growth kit ATCC ATCC PCS-500-040 Low serum
Chondrocyte differentiation tool ATCC ATCC PCS-500-051
Formalin solution Sigma-Aldrich HT5011-15ML neutral buffered, 10%
Ammonium chloride Sigma-Aldrich A9434-500G for molecular biology, suitable for cell culture, ≥99.5%
Saponin Sigma-Aldrich 47036-50G-F for molecular biology, used as non-ionic surfactant, adjuvant
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A3059-50G
Rabbit monoclonal [Y113] anti-paxillin antibody Abcam ab32084 Diluted 1:200
Mouse monoclonal [1F5] anti-collagen alpha-1 XX chain  Acris Antibodies AM00212PU-N Diluted: 1:400
Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) secondary antibody Invitrogen A10667 2 mg/mL. Diluted 1:1000
Alexa Fluor 568-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L) secondary antibody Invitrogen A11036 2 mg/mL. Diluted 1:1000
Hoechst 33342 Thermo Fisher H3570 10ML 10 mg/mL. Diluted 1:1000
Cover glass 24x24 mm Deltalab D102424
Fluoromount Sigma-Aldrich F4680-25ML
Epifluorescence Microscope Nikon Eclipse E1000 upright microscope with a CCD camera
Confocal Microscope Leica Microsystems Leica SPE Upright Confocal Microscope
ImageJ 1.50g freeware http://imgej.nih.gov/ij
MATLAB software The MATHWORKS, Inc.
OriginPro 8.5 software  OriginLab Coorporation

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jiang, F., Hörber, H., Howard, J., Müller, D. J. Assembly of collagen into microribbons: Effects of pH and electrolytes. J. Struct. Biol. 148 (3), 268-278 (2004).
  2. Smith, M. L., et al. Force-induced unfolding of fibronectin in the extracellular matrix of living cells. PLoS Biol. 5 (10), 2243-2254 (2007).
  3. Little, W. C., Smith, M. L., Ebneter, U., Vogel, V. Assay to mechanically tune and optically probe fibrillar fibronectin conformations from fully relaxed to breakage. Matrix Biol. 27 (5), 451-461 (2008).
  4. Christman, K. L., Enriquez-Rios, V. D., Maynard, H. D. Nanopatterning proteins and peptides. Soft Matter. 2, 928-939 (2006).
  5. Falconnet, D., Csucs, G., Grandin, H. M., Textor, M. Surface engineering approaches to micropattern surfaces for cell-based assays. Biomaterials. 27 (16), 3044-3063 (2006).
  6. Arnold, M., et al. Activation of integrin function by nanopatterned adhesive interfaces. ChemPhysChem. 5 (3), 383-388 (2004).
  7. Cavalcanti-Adam, E. A., et al. Lateral spacing of integrin ligands influences cell spreading and focal adhesion assembly. Eur. J. Cell. Biol. 85 (3-4), 219-224 (2006).
  8. Cavalcanti-Adam, E. A., et al. Cell spreading and focal adhesion dynamics are regulated by spacing of integrin ligands. Biophys. J. 92 (8), 2964-2974 (2007).
  9. Arnold, M., et al. Cell interactions with hierarchically structured nano-patterned adhesive surfaces. Soft Matter. 5 (1), 72-77 (2009).
  10. Malmström, J., et al. Large area protein patterning reveals nanoscale control of focal adhesion development. Nano Lett. 10 (2), 686-694 (2010).
  11. Deeg, J. A., et al. Impact of local versus global ligand density on cellular adhesion. Nano Lett. 11 (4), 1469-1476 (2011).
  12. Medda, R., et al. Investigation of early cell–surface interactions of human mesenchymal stem cells on nanopatterned β-type titanium-niobium alloy surfaces. Interface Focus. 4, 20130046 (2014).
  13. Wang, X., et al. Effect of RGD nanospacing on differentiation of stem cells. Biomaterials. 34 (12), 2865-2874 (2013).
  14. Wang, X., Ye, K., Li, Z. H., Yan, C., Ding, J. D. Adhesion, proliferation, and differentiation of mesenchymal stem cells on RGD nanopatterns of varied nanospacings. Organogenesis. 9 (4), 280-286 (2013).
  15. Wang, X., Li, S. Y., Yan, C., Liu, P., Ding, J. D. Fabrication of RGD micro/nanopattern and corresponding study of stem cell differentiation. Nano Lett. 15 (3), 1457-1467 (2015).
  16. Li, Z. H., et al. Effects of RGD nanospacing on chondrogenic differentiation of mesenchymal stem cells. J. Mater. Chem. B. 3 (12), 5197-5209 (2015).
  17. Stephanopoulos, N., et al. Bioactive DNA-peptide nanotubes enhance the differentiation of neural stem cells into neurons. Nano Lett. 15 (1), 603-609 (2015).
  18. Rolland, O., Turrin, C. O., Caminade, A. M., Majoral, J. P. Dendrimers and nanomedicine: Multivalency in action. New J. Chem. 33, 1809-1824 (2009).
  19. Saovapakhiran, A., D’Emanuele, A., Attwood, D., Penny, J. Surface modification of PAMAM dendrimers modulates the mechanism of cellular internalization. Bioconjug. Chem. 20 (4), 693-701 (2009).
  20. Albertazzi, L., Fernandez-Villamarin, M., Riguera, R., Fernandez-Megia, E. Peripheral functionalization of dendrimers regulates internalization and intracellular trafficking in living cells. Bioconjug. Chem. 23 (5), 1059-1068 (2012).
  21. Mikhail, A. S., Jones, K. S., Sheardown, H. Dendrimer grafted cell adhesion peptide-modified PDMS. Biotechnol. Prog. 24 (4), 938-944 (2008).
  22. Kino-oka, M., Kim, J., Kurisaka, K., Kim, M. H. Preferential growth of skeletal myoblasts and fibroblasts in co-culture on a dendrimer-immobilized surface. J. Biosci. Bioeng. 115 (1), 96 (2013).
  23. Kim, M. H., et al. Morphological regulation and aggregate formation of rabbit chondrocytes on dendrimer immobilized surfaces with D-glucose display. J. Biosci. Bioeng. 107 (2), 196-205 (2009).
  24. Lomba, M., et al. Cell adhesion on surface patterns generated by the photocrosslinking of hyperbranched polyesters with a trisdiazonium salt. React. Funct. Polym. 73 (3), 499-507 (2013).
  25. Maheshwari, G., Brown, G., Lauffenburger, D. A., Wells, A., Griffith, L. G. Cell adhesion and motility depend on nanoscale RGD clustering. J. Cell Sci. 113 (Pt 10), 1677-1686 (2000).
  26. Kim, M. H., Kino-oka, M., Kawase, M., Yagi, K., Taya, M. Synergistic effect of D-glucose and epidermal growth factor display on dynamic behaviors of human epithelial cells. J. Biosci. Bioeng. 104 (5), 428-431 (2007).
  27. Pericet-Camara, R., Cahill, B. P., Papastavrou, G., Borkovec, M. Nano-patterning of solid substrates by adsorbed dendrimers. Chem. Commun. 3, 266-268 (2007).
  28. Lagunas, A., et al. Large-scale dendrimer-based uneven nanopatterns for the study of local arginine–glycine–aspartic acid (RGD) density effects on cell adhesion. Nano Res. 7 (3), 399-409 (2014).
  29. Lagunas, A., et al. Tailoring RGD local surface density at the nanoscale toward adult stem cell chondrogenic commitment. Nano Res. , (2017).
  30. Prats-Alfonso, E., et al. Effective and Versatile Strategy for the Total Solid-Phase Synthesis of Alkanethiols for Biological Applications. Eur. J. Org. Chem. 2013 (7), 1233-1239 (2013).
  31. Zhu, Y. B., Gao, C. Y., Liu, X. Y., He, T., Shen, J. C. Immobilization of biomacromolecules onto aminolyzed poly(L-lactic acid) toward acceleration of endothelium regeneration. Tissue Eng. 10 (1-2), 53-61 (2004).
  32. Güell, A., Díez-Pérez, I., Gorostiza, P., Sanz, F. Preparation of reliable probes for electrochemical tunneling spectroscopy. Anal. Chem. 76 (17), 5218-5222 (2004).
  33. Bobick, B. E., Chen, F. H., Le, A. M., Tuan, R. S. Regulation of the chondrogenic phenotype in culture. Birth Defects Res. C Embryo Today. 87 (4), 351-371 (2009).
  34. De Lise, A. M., Fisher, L., Tuan, R. S. Cellular interactions and signaling in cartilage development. Osteoarthritis Cartilage. 8 (5), 309-334 (2000).
  35. Kosher, R. A., Kulyk, W. M., Gay, S. W. Collagen gene expression during limb cartilage differentiation. J. Cell Biol. 102 (4), 1151-1156 (1986).
  36. Biebricher, A., Paul, A., Tinnefeld, P., Golzhauser, A., Sauer, M. Controlled three-dimensional immobilization of biomolecules on chemically patterned surfaces. J. Biotechnol. 112 (1-2), 97-107 (2004).
  37. Tinazli, A., Piehler, J., Beuttler, M., Guckenberger, R., Tampé, R. Native protein nanolithography that can write, read and erase. Nat. Nanotechnol. 2, 220-225 (2007).
  38. Oberhansl, S., et al. Facile Modification of Silica Substrates Provides a Platform for Direct-Writing Surface Click Chemistry. Small. 8 (4), 541-545 (2012).

Tags

Biyomühendislik sayı: 131 Dendrimer Nanopattern arginin-glisin-aspartik asit (RGD) Atomik Kuvvet Mikroskobu (AFM) hücre adezyon Mezenkimal Kök hücre (MKH) Chondrogenesis
Düzensiz Nanopatterns Dendrimer tabanlı yerel olarak kumanda yüzeyi Adhesiveness için: Chondrogenic farklılaşma yönlendirmek için bir yöntem
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Casanellas, I., Lagunas, A.,… More

Casanellas, I., Lagunas, A., Tsintzou, I., Vida, Y., Collado, D., Pérez-Inestrosa, E., Rodríguez-Pereira, C., Magalhaes, J., Gorostiza, P., Andrades, J. A., Becerra, J., Samitier, J. Dendrimer-based Uneven Nanopatterns to Locally Control Surface Adhesiveness: A Method to Direct Chondrogenic Differentiation. J. Vis. Exp. (131), e56347, doi:10.3791/56347 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter