Summary
Dans ce protocole, nous démontrons l’application de la tomographie électronique série-section d’élucider la structure mitochondriale dans les muscles de vol indirect de drosophile .
Abstract
Les mitochondries sont des éléments cellulaires puissants qui produisent des métabolites ATP et lipides, mais aussient de régulent le calcium l’homéostasie et la mort cellulaire. L’ultrastructure unique riche en crêtes double membrane de cet organite est élégamment disposé à remplir plusieurs fonctions en partitionnant les biomolécules. Ultrastructure mitochondriale est intimement liée à différentes fonctions ; Toutefois, les détails de ces relations structure-fonction commencent seulement à être décrite. Ici, nous démontrons l’application de la tomographie électronique série-section d’élucider la structure mitochondriale dans les muscles de vol indirect de drosophile . La tomographie électronique série-section peut être adaptée pour étudier toute structure cellulaire en trois dimensions.
Introduction
Microscopie électronique est un outil précieux pour étudier le contexte structural des assemblées subcellulaires et organites qui effectuent les processus cellulaires. Méthodes ont été développées afin de préserver l’ultrastructure des cellules ou des tissus soit par fixation chimique avec les aldéhydes ou par haute pression gel (HPF) suivie de congeler substitution (FS)1,2. Les blocs de spécimen incorporé peuvent alors être sectionnés, teintés et observées avec un microscope électronique à transmission (TEM). Le spécimen de HPF pourrait également être traité conformément cryo-État, comme par cryo-sectionnement ou par faisceau ionique focalisé (FIB) fraisage et observé par cryo-EM3,4.
Bien que la section mince EM donne un aperçu morphologiques informative, les images 2D qui en résulte peuvent révéler seulement l’ultrastructure d’une coupe particulière. Comment l’ultrastructure est organisé en un volume 3D reste masqué. Afin de visualiser l’ultrastructure cellulaire en trois dimensions, une méthode de tomographie électronique a été développée où série d’images de l’inclinaison ont été acquis et retour prévu pour générer une reconstruction tomographique5 (Figure 1). Une série de double inclinaison peut être collectée en tournant l’échantillon de 90° et d’acquérir une deuxième série d’inclinaison. Ceci minimisera les artefacts des coins manquants qui résultent des angles de l’échantillonnage limité et améliorer la résolution de la tomodensitométrie :.
Nous décrivons ici l’application de la tomographie électronique série-section pour étudier l’ultrastructure mitochondriale de Drosophila vol indirect muscle (IFM)6,7,8,9 . Afin d’obtenir des reconstructions 3D couvrant toute mitochondries (environ 2,5 µm d’épaisseur), coupes sériées proviennent de blocs de tissus Drosophila IFM. Tomographies de chaque section ont été prélevés individuellement à l’aide de logiciels de collecte automatique de données. Reconstruction tomographique ont été obtenues des tomographies séries ont été jointes avec le package IMOD pour obtenir un volume reconstruit d’une mitochondrie ensemble. Les tomographies jointes ont été analysées par le logiciel 3D. Les densités des crêtes mitochondriales sont segmentées pour générer un modèle de segmentation qui a révélé l’organisation en trois dimensions.
Protocol
1. section des tissus de drosophile à l’aide d’un Microtome de lame vibrante
- Offrir une drosophile sur glace et plonger chaque volée unique dans 1 mL d’agarose fusion faible de 4 % dans un tampon phosphate. Permettre d’agarose solidifier sur la glace. En général, 4-6 mouches ont été traitées.
- Utilisez un microtome de lame vibrante pour section de gel d’agarose embarqués drosophile en tranches avec 100 µm d’épaisseur et de plonger dans la solution de fixation contenant glutaraldéhyde à 2,5 % dans un tampon phosphate 0,1 M.
NOTE : Vibratome sectionnement est préférable car les tissus architecture reste plus intacte par rapport aux autres méthodes. Alternativement, pinces de dissection peut être utilisé pour disséquer les IFM dans la solution de fixation contenant glutaraldéhyde à 2,5 % dans un tampon phosphate 0,1 M.
2. préparer des échantillons EM par le gel à haute pression et la méthode de Substitution (HPF/FS) gel
- Laver des sections de tissu en 3 gouttes (150 µL) de tampon phosphate, puis 2 gouttes (~ 100 µL) de tampon phosphate avec 20 % de BSA. Placez ensuite les sections en or transporteurs pour HPF rempli avec un tampon et 20 % de BSA.
- Charger l’échantillon contenant les transporteurs dans un congélateur à haute pression selon le manuel de l’utilisateur.
- Après la congélation, du support sous azote liquide, les transporteurs et transferts de polluants à un appareil de cryo-substitution refroidi à-140 ° C.
- Effectuer le protocole de cryo-substitution, comme le montre le tableau 1, avec le FS cocktail contenant du glutaraldéhyde à 2 %, 2 % le tétroxyde d’osmium et 0,1 % dans l’acétone, l’acétate d’uranyle.
- Retirez délicatement les spécimens de transporteurs avec une aiguille et incorporer des spécimens en résine à la température ambiante. Polymériser la résine à 65 ° C pendant 16 h.
Remarque : Les protocoles FS devraient être modifiés afin de préparer d’autres types d’échantillons. HPF/FS est préférable pour préserver l’ultrastructure et minimiser la perte du contenu cellulaire.- Vous pouvez également appliquer un protocole de fixation chimique. Difficulté des spécimens avec glutaraldéhyde à 2,5 % du jour au lendemain, laver avec tampons et puis fixer avec 1 % de tétroxyde d’osmium pour 2 h. lavage et déshydrater avec croissant des concentrations d’éthanol et puis infiltrer et incorporer des spécimens en résine de Spurr avant polymérisation à 65 ° C pendant 16 h.
3. préparer la série-sections des spécimens pour Electron Tomography
- Tailler les blocs de spécimen pour exposer la face du bloc souhaitée qui contient des tissus.
- Prétraitez les particules d’or (10 nm de diamètre) avec 1 % de BSA pour 30 min. laver et suspendre les particules d’or dans le tampon PBS. Superposition des particules d’or sur les grilles de fente de cuivre recouverts d’un film de carbone pour créer des marqueurs de fiducial.
- Vérifier sous TEM pour avoir des marqueurs de fiducial suffisantes (au moins 5-10 marqueurs) dans le champ de vision de l’acquisition de tomographie.
- Coupe des coupes sériées, 200-250 nm d’épaisseur, en utilisant un ultramicrotome.
- Recueillir des coupes sériées sur grilles de fente en utilisant une boucle parfaite pour les coupes minces.
- Tacher les sections avec citrate de plomb de Reynold pendant 10 min.
- Superposer une deuxième couche de particules d’or fiducial sur le dessus les sections.
4. Rassemblez Double inclinaison Electron Tomography
- Charger la grille sur un support de tomographie à deux axes et l’insérer dans le microscope électronique à transmission fonctionnant à 200 kV.
- Aligner le microscope au foyer eucentric.
- Mettre en place le logiciel de collecte de données automatique. Ajuster et aligner le faisceau d’électrons lors du réglage d’imagerie multi-échelles. Se référer au manuel utilisateur pour opération détail10 (Figure 2).
- Acquérir des références sombres et claires de caméra dans un espace vide sans film de carbone avec le paramètre de collection de tomographie.
- Recueillir un atlas de grille à faible grossissement. Sélectionnez les mitochondries sur coupes sériées comme cibles pour la collecte de tomographie.
- Acquérir une série d’inclinaison de-60 ° à + 60 °, par incréments de 2 ° sur axe-A pour chaque cible.
NOTE : Les angles d’inclinaison seront mécaniquement limitées par la conception du porte-échantillon. Le titulaire bloquera le faisceau sur les angles d’inclinaison élevée. - Pour collecter la deuxième série d’inclinaison, faites pivoter le porte-échantillon 90°. Acquérir un nouvel atlas. Sélectionner les positions correspondantes et d’acquérir la série d’inclinaison sur l’axe-B pour chaque cible.
Remarque : Autres logiciels, tels que SerialEM et Xplore3D, sont disponibles pour la collecte automatique des données.
5. reconstruction 3D tomographies et sous-volumes Segment à l’aide de logiciels
- Reconstruire les tomographies des images de deux axes tilt à l’aide de logiciels IMOD11.
- Se référer au manuel utilisateur pour les détails de l’opération.
- Aligner la série tilt individuels par le positionnement des repères repères or. Reconstruire les tomographies par la méthode de la Technique de Reconstruction itérative simultanée (SIRT) soit par la méthode de Projection arrière pour les deux axes-A et B-axe, respectivement (Figure 3).
- Combiner des tomographies de l’axe-A et B-axe pour générer un tomogramme double inclinaison avec réduction artefact de coin manquant.
- Réunir des tomographies double inclinaison de coupes sériées d’obtenir des reconstructions couvrant le volume entier de mitochondrie. Modéliser les écarts entre les coupes sériées par le programme IMOD.
- Coupez les tomographies jointes et bin à une taille désirée pour la segmentation de volume.
- Analyser les tomographies séries jointes à l’aide de logiciels 3D.
- Se référer au manuel utilisateur pour les détails de l’opération.
- Filtrer les tomographies avec un filtre gaussien (ou autre méthode souhaitée) pour améliorer le contraste des fonctionnalités et réduire la densité de fond.
- Segmenter l’ultrastructure des mitochondries manuellement ou automatiquement.
- Afficher les modèles de segmentation pour permettre l’inspection en 3D.
- Générer des films en utilisant les outils disponibles en 3D.
Representative Results
Nous avons appliqué la tomographie électronique série-section pour analyser les caractéristiques structurales des crêtes mitochondriales qui reflète son état énergétique et le vieillissement. Nous avons montré que les mitochondries de Drosophila IFM forment un système intégré des crêtes et matrice réseau en 3D (Figure 4)7. En outre, des mouches mutantes avec défaut de réplication ADN mitochondrial et un phénotype de vieillissement accéléré accumulent des mitochondries qui contenait les paragraphes de l’oignon qui tournoie core (Figure 5)7.
Figure 1 : Illustration de la reconstruction de tomographie électronique d’une série de tilt. Dans l’expérience, un faisceau d’électrons est transmis via un objet 3D lorsque l’objet est incliné à des degrés divers. Pour chaque condition d’inclinaison, une projection 2D est générée et capturée avec un appareil photo. Les projections en 2D puis retour devraient pour reconstruire l’objet 3D basé sur le théorème de la tranche centrale. Dans l’illustration, le même processus est illustré d’une image 2D originale qui est projetée dans une seule dimension sous différents angles d’inclinaison. Les projections de 1D sont ensuite utilisées pour reconstruire l’image 2D. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : collecte de données automatique. Un affichage d’image viewer du logiciel montrant l’atlas d’une grille de fente contenant des coupes sériées, multi-échelle ciblant des mitochondries et acquis incliner images. Echelle = 500 µm (panneau supérieur gauche), 100 µm (panneau en bas à gauche), 1 µm (panneau de droite). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Serial-section électron tomographie d’une seule mitochondrie dans les muscles de vol indirect de drosophile . Micrographies 2D (A) et (B) les tomographies 3D de coupes sériées couvrant la totalité du volume d’une mitochondrie. (C), la série-section rejoint tomographies devraient pour créer une coupe longitudinale, l’axe z montré verticalement. Notamment, Découpe tissus conduit à perte de matériau, laissant les lacunes entre les tomographies jointes. Echelle = 500 nm. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : crêtes intra-mitochondries et réseau de matrice a révélé en 3D intégrés. (A) les tranches de reconstructions tomographiques électrons mitochondriale montrant permet de basculer entre les membranes lamellaires par l’intermédiaire de l’axe z. (B) Illustrations des crêtes observées commutation motifs spirales droit droitier ou gaucher. (C) segmentation tomographique illustrant une gaucher spirale en 3D (D) crêtes modes de commutation ont été analysés et rendu des couleurs sur le modèle de segmentation (E, F). Tranche tomographique montrant la matrice latérale confluence (densités foncées, marqué en rouge) à travers les membranes des crêtes (densités de blanches). Segmentation (G) modèle de la tomodensitométrie : en (E) montrant la confluence de la matrice latéral (en rouge) et des crêtes représentatifs (en gris). Echelle = 50 nm (A), 200 nm (C) et 300 nm (D, E, F, G). Ce chiffre était de la réimpression de Jiang et al. 7 s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : mitochondries avec oignon carottes tourbillonnantes accumulent chez les mouches présentant des défauts de réplication ADN mitochondriales au cours du vieillissement. Les tranches tomographiques représentatifs et la segmentation correspondante (panneaux de droite), montrant une vue en coupe (en haut) et une vue de coupe longitudinale (en bas) d’une âme en tourbillonnante. Segmentation de volume est indiquée par un rendu des couleurs arbitraires pour mettre en évidence le noyau tourbillonnant. Echelle : 200 nm. Ce chiffre était de la réimpression de Jiang et al. 7 s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
| Étape | Temp | Temps | Solution | |||
| 1 | -140 ° C et 0-9 ° C | 30 min | Azote liquide | |||
| 2 | -90 ° C | 96 h | Cocktail de FS | |||
| 3 | -90 ° C et-60 ° C | 6 (5 ° C/h) | Cocktail de FS | |||
| 4 | -60 ° C | 12 hr | Cocktail de FS | |||
| 5 | -60 ° C à-25 ° C | 7 (5 ° C/h) | Cocktail de FS | |||
| 6 | -25 ° C | 12 hr | Cocktail de FS | |||
| 7 | -25 ° C à 0 ° C | 5 (5 ° C/h) | Cocktail de FS | |||
| 8 | 0 ° C | 1 hr x 3 fois | Acétone | |||
| 9 | Température ambiante | Infiltration de résine | ||||
Tableau 1 : Protocole de substitution en congélation.
Discussion
Dans ce protocole, nous décrivons un workflow optimisé pour l’application de tomographie électronique série-section Etudier 3D ultrastructure mitochondriale des muscles de vol indirect de drosophile . Préservation de l’ultrastructure dans l’échantillon est le principal défi technique pour ce type d’analyse. Afin de mieux préserver l’ultrastructure deux méthodologiques, des mesures ont été inclus. Tout d’abord, le tissu a été échantillonné en sectionnant avec vibration microtome de lame afin de maintenir l’architecture tissulaire autant que possible. Deuxièmement, un protocole de HPF/FS a été optimisé pour préserver l’ultrastructure organites lors de la préparation des blocs d’échantillons embarqués. Échantillons ont été congelés sous haute pression, ce qui abaisse le point de congélation de l’eau et réduit la formation de cristaux de glace qui endommagent l’ultrastructure1. Spécimens aussi épais que 0,1 mm peuvent être vitrifiés instantanément et ensuite soumis pour cryo-substitution pour générer des blocs de l’échantillon pour l’analyse de l’EM. La conservation améliorée de l’ultrastructure de HPF/FS a été notée, par rapport aux méthodes de fixation chimique. Avec cette série d’étapes pour la préparation de l’échantillon, préservation des membranes mitochondriales de doubles et des membranes de crêtes a été considérablement améliorée.
L’étape la plus difficile de la méthode est d’obtenir des coupes sériées du spécimen. Le faisceau d’électrons a limité la capacité de pénétration, l’épaisseur de la section se limite à deux 250 nm ou 500 nm en utilisant un TEM fonctionnant à 200 kV ou 300 kV, respectivement. Parce que l’épaisseur d’une mitochondrie peut être plus de 2 µm, coupes sériées sont tenus d’obtenir des reconstructions de volume complet. Cependant, récupérer un nombre suffisant de coupes sériées pour enjamber un organite ensemble est un défi technique. Tailler la face du bloc pour être aussi plate que possible entre les bases du trapèze peut permettre à une grille de fente accueillir plus de sections et couvre donc les plus gros volumes. En outre, en utilisant une boucle parfaite pour les coupes minces augmente le taux de réussite de transférer les coupes sériées au réseau.
La tomographie électronique série-section peut être accomplie avec équipement de base standard EM. Toutefois, la méthode a quelques limitations inévitables résultant de contraintes techniques. Un est que le matériau est inévitablement perdue entre coupes sériées, laissant de larges vides dans la reconstruction jointe. Deuxième est l’artefact de coin manquant, qui se pose en raison des angles d’inclinaison limitée qui sont réalisables. Cette restriction se produit parce que le porte-échantillon ne peut pas être activé dans une rotation complète sans bloquer le faisceau d’électrons. Malgré ces limites, la tomographie électronique série-section fournit une résolution suffisante pour révéler l’ultrastructure cellulaire et les organites en 3D.
Pour l’imagerie plus petite échelle, la tomographie cryo-électronique est une technologie émergente qui peut être utilisée pour obtenir la structure macromoléculaire complexes et assemblées sur place à résolution nm ou angström auxiliaire en combinaison avec sub-tomographique 3de reconstruction. Dans cette application, les cellules sont éclaircis par découpe ou par faisceau ionique focalisé Rainurez dans l’azote liquide. Les tomographies sont recueillis en vertu de la cryo-conditions où les structures moléculaires sont conservés à proximité de l’état natif sans fixation chimique, déshydratation ou incorporation. À l’autre bout de l’échelle, pour analyser des volumes grand tissu au détriment de la résolution, microscopie électronique à balayage îlot serial est une modalité attrayante même si elle nécessite un instrument spécifique4.
Disclosures
Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun intérêt financier concurrentes.
Acknowledgments
Les études ont été effectuées dans la base de EM à l’Institut de biologie cellulaire et organismique et la cryo-EM de l’Academia Sinica, Taipei, Taiwan. Le travail a été soutenu par l’Académie chinoise des sciences et de la plupart.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| vibrating blade microtome | Leica | VT1200S | Tissue sectioning |
| high-pressure freezer | Leica | EM HPM100 | Specimen preparation |
| freeze-substitution device | Leica | EM AFS2 | Specimen preparation |
| ultramicrotome | Leica | EM UC7 | Ultra-thin sectioning |
| dual-axis tomography holder | Fischione | Model 2040 | tomography collection |
| transmission electron microscope | FEI | Tecnai F20 | tomography collection |
| CCD | Gatan | UltraScan 1000 | tomography collection |
| Leginon | NRAMM/AMI | tomography collection | |
| IMOD | Boulder Laboratory for 3-D Electron Microscopy of Cells | Tomography reconstruction | |
| Avizo 3D | FEI | Tomography analysis |
References
- Dahl, R., Staehelin, L. A. High-pressure freezing for the preservation of biological structure: theory and practice. J Electron Microsc Tech. 13 (3), 165-174 (1989).
- Sabatini, D. D., Bensch, K., Barrnett, R. J. Cytochemistry and electron microscopy. The preservation of cellular ultrastructure and enzymatic activity by aldehyde fixation. J Cell Biol. 17, 19-58 (1963).
- Rigort, A., et al. Micromachining tools and correlative approaches for cellular cryo-electron tomography. J Struct Biol. 172 (2), 169-179 (2010).
- Denk, W., Horstmann, H. Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure. PLoS Biol. 2 (11), e329 (2004).
- Lucic, V., Forster, F., Baumeister, W. Structural studies by electron tomography: from cells to molecules. Annu Rev Biochem. 74, 833-865 (2005).
- Soto, G. E., et al. Serial section electron tomography: a method for three-dimensional reconstruction of large structures. Neuroimage. 1 (3), 230-243 (1994).
- Jiang, Y. F., et al. Electron tomographic analysis reveals ultrastructural features of mitochondrial cristae architecture which reflect energetic state and aging. SciRep. 7, 45474 (2017).
- Cogliati, S., Enriquez, J. A., Scorrano, L. Mitochondrial Cristae: Where Beauty Meets Functionality. TrendsBiochemSci. 41 (3), 261-273 (2016).
- Friedman, J. R., Nunnari, J. Mitochondrial form and function. Nature. 505 (7483), 335-343 (2014).
- Suloway, C., et al. Fully automated, sequential tilt-series acquisition with Leginon. J Struct Biol. 167 (1), 11-18 (2009).
- Mastronarde, D. N., Held, S. R. Automated tilt series alignment and tomographic reconstruction in IMOD. J Struct Biol. 197 (2), 102-113 (2017).
