Summary
이 프로토콜 열 충격 유발 단백질 식 시스템 (pDHsp/V5-그 의/sf9 셀 시스템), 외국 단백질을 표현 하거나 안티 apoptotic 활동의 잠재적인 외국 단백질 및 그들의 잘린 아미노 평가에 사용 될 수 있는 설명 곤충 세포에서 산입니다.
Abstract
변이 유전자 표현 시스템 잠재 체 외에서 세포 문화 시스템에서 단백질 기능 분석을 수행 하기 위한 가장 중요 한 기술 중 하나입니다. 이 시스템은 과도 식 플라스 미드에 baculoviral 발기인의 통제 익스프레스 외국 유전자를 개발 되었다. 또한,이 시스템은 자체 잠재 또는 외국 단백질 기능 분석 결과에 적용할 수 있습니다. 가장 광범위 하 게 그리고 상업적으로 사용 가능한 변이 유전자 식 시스템 Orgyia pseudotsugata multicapsid nucleopolyhedrovirus (OpMNPV)의 즉시 이른 유전자 (IE) 발기인에 따라 개발 된다. 그러나, 낮은 식 수준 외국 유전자 곤충 세포에서 관찰 되었다. 따라서, 일시적인 유전자 표현 시스템 단백질 식 향상을 위한 건설 되었다. 이 시스템에서 재조합 플라스 미드는 초파리 열 충격 70 (Dhsp70) 발기인의 통제 대상 시퀀스를 포함 하도록 건설 되었다. 이 프로토콜의이 열 충격 기반 pDHsp/V5-그의 (6 히스티딘와 V5 epitope) 응용 프로그램 선물 /Spodoptera frugiperda 셀 (sf9 셀) 시스템; 이 시스템은 또한 곤충 세포에서 후보 단백질의 안티-apoptotic 활동을 평가 하기 위한 유전자 발현 뿐만 아니라 가능 하다. 또한,이 시스템 중 한 재조합 플라스 미드와 페 수 또는 두 개의 잠재적으로 기능적으로 대립 곤충 세포에서 재조합 플라스 미드를 페 공동. 프로토콜이이 시스템의 효율성을 설명 하 고이 기술의 실용적인 사례를 제공 합니다.
Introduction
두 단백질 표정 시스템 단백질 생산을 위해 일반적으로 사용 되었습니다: 원핵생물 단백질 표정 시스템 (대장균 유전자 표현 시스템) 및 진핵생물 단백질 표정 시스템. 하나의 인기 있는 진핵생물 단백질 식 시스템은 잠재 식 벡터 시스템 (BEVS)1. Baculoviruses 먼저 농업의 전세계 생물 관리 요원으로 사용 되었다 산림 해충 및. 지난 몇 년간, baculoviruses 단백질 표정 벡터도를 위한 바이오 도구로 개발 되었다. 더블-좌초 원형 DNA 및 엔벌로프된 nucleocapsids2baculoviruses의 게놈에 의하여 이루어져 있다. 날짜 하려면, seventy-eight 잠재 이상 격리 시퀀스3되었습니다. 호스트 곤충 세포에서 baculoviral 유전자 식의 시간적 cascade를 바탕으로, 유전자 전사 4 시간 계곡, 즉시 초기 지연-초기, 늦은, 그리고 매우 늦은 유전자4등으로 분류 될 수 있습니다.
매우 늦은 유전자 발기인 (즉, 다면체 또는 p10 발기인) 대상 유전자 재조합 잠재 동종 재결합에 의해 생성 하는 동안 운전 하는 데 사용 되었다 BEVSs 지정 되었다. 재조합 잠재 하 여 곤충 세포에서 외국 단백질의 표정은 포유류 단백질 (당단백질 생산에 적합 한) 포스트 번역 상 수정에서의 비슷합니다. 따라서,는 잠재 널리5,,67되었습니다. 그러나, 한 가지 한계 곤충 세포7다른 N glycosylation 통로의 존재입니다.
따라서, 새로운 잠재 식 시스템, 변이 유전자 표현 시스템 개발 되었다. 이 시스템은 곤충 세포에서 baculoviral 즉시 초기 발기인 (발기인즉-1 )의 드라이브에서 외국 유전자를 표현합니다. 이 시스템을 사용 하 여 대상 단백질 표현할 수 있습니다 즉시 즉-1 발기인의 통제에 곤충 세포에서 N glycosylation 통로 더 나은 N 연결 oligosaccharides7에 결과 수정 하는 동안. 또한, baculoviral 즉시 이른 유전자 호스트 세포 RNA 중 합 효소 II에 의해 복사할 수 있습니다 그리고 어떤 바이러스 성 요인 활성화4에 대 한 필요 하지 않습니다. 따라서, 외국 단백질 곤충 세포는 짧은 시간 내에 표현할 수 있습니다. 날짜 하려면, 과도 유전자 표현 시스템 잠재 체 외에서 세포 문화 시스템에서 단백질 기능 분석을 수행 하기 위한 가장 중요 한 기술 중 하나입니다. 잠재 또는 외국 단백질의 기능을 분석 하는 시스템을 적용할 수 있습니다. 상업적으로 이용 가능한 변이 유전자 표정 시스템 중 하나는 Orgyia pseudotsugata multicapsid nucleopolyhedrovirus (OpMNPV) (OpIE2 및 OpIE1 발기인)의 즉시 이른 유전자 (IE) 발기인을 기반으로 합니다.
그러나, 곤충 세포에서 외국 유전자의 식 저수준은 여전히 문제가 OpIE 과도 유전자 발기인 기반 식 시스템은 사용된8,,910. 따라서, 다른 변이 유전자 표현 시스템 초파리 열 충격 단백질 70 (hsp70) 유전자8,9발기인에 따라 건설 되었다. H s p 70의 발기인 baculoviral IE 발기인 곤충 세포10열 충격에 의해 유도 된 때 보다 더 효율적으로 작동 합니다. 이 시스템에서 대상 유전자는 초파리 열 충격 70 (Dhsp70) 발기인의 드라이브에서 표현 되었다. 외국 유전자 PCR 기반 복제 방법으로 일시적인 유전자 식 플라스 미드에 쉽게 복제 수 있습니다. 또한, 열 충격 유도 의해 유전자 발현에 대 한 타이밍의 제어를 수행할 수 있습니다.
이 보고서에서 우리는 접근 따르고 (apoptosis 3의 억제 물, iap3 Lymantria xylina MNPV에서에서) baculoviral 유전자의 3 개의 다른 잘림 열 충격에 기초를 둔 일시적인 단백질 식 시스템을 사용 하 여 표현 하 고 추가 안티-apoptotic 활동 분석에이 표현한 단백질을 적용 합니다. 이 시스템 수 중 외국 단백질 신속 하 게 또는 또한 다른 단백질 활동 분석 실험에 적용할 가능성을 하면서 sf9 세포에서 단백질 안티 apoptotic 활동의 평가에 적용할 추가.
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Protocol
1입니다. 준비
- 곤충 세포 배양
- 세포 배양의 50 mL를 준비 합니다. 이렇게 하려면 추가 항생제의 500 µ L (암포 B = 0.25 µ g/mL, 페니실린 단위/100ml, 스 = = 100 µ g/mL) 및 열 비활성화 태아 둔감 한 혈 청 (FBS 또는 항생제) 없이 혈 청 무료 세포 배양에서의 5 mL.
참고: 사용 하기 전에 물 욕조에 30 분 동안 65 ° C에서 소 태아 혈 청을 열. - Spodoptera frugiperda 를 유지 (나비목: Noctuidae), sf9 곤충 세포. 분리 ca. 25 cm2 셀 문화 플라스 크에서 세포의 80%는 플라스 크를 흔들어 하 고 가벼운 현미경 검사 법에서 확인. 다음, 새로운 25 cm2 셀 문화 플라스 크에 세포 현 탁 액의 50%를 전송 하 고 실 온에서 15 분 동안 연결할 셀을 허용. 5 mL 신선한 세포 배양 매체와 매체를 대체 하 고 28 ° c.에 인큐베이터에서 성장 통로 세포 세포 성장에 따라 2 ~ 3 일 마다.
- 세포 배양의 50 mL를 준비 합니다. 이렇게 하려면 추가 항생제의 500 µ L (암포 B = 0.25 µ g/mL, 페니실린 단위/100ml, 스 = = 100 µ g/mL) 및 열 비활성화 태아 둔감 한 혈 청 (FBS 또는 항생제) 없이 혈 청 무료 세포 배양에서의 5 mL.
- 세포 transfection 플라스 미드의 준비
- 삽입 대상 DNA 파편 (예: Lymantria xylina MNPV (LyxyMNPV) iap3 유전자와 그것의 삭제 구조) pDHsp/V5-그의 PCR 기반 복제 방법11. 확인 식민지에 의해 변형 된 식민지의 성장을 PCR PCR 마스터 믹스 (X 2) pDhsp-f 2/Op-IE2R 뇌관을 사용 하 여 설정 합니다. 상업적인 시퀀싱 서비스 여 플라스 미드 시퀀스를 확인 합니다.
참고: 표 1 뇌관 PCR 및 해당 구문 사용을 보여 줍니다. - 문화 단일 시퀀스 세균성 식민지, 200 mL 파운드 매체 포함 하에서 상기 플라스 미드 구조물 (1.2 단계)를 포함 하는 항생제 (50 µ g/mL), 각각 선택 합니다.
- 제조 업체의 지침12에 따라 미디 플라스 미드 키트를 사용 하 여 교양된 대장균 에서 플라스 미드를 추출 합니다.
- 삽입 대상 DNA 파편 (예: Lymantria xylina MNPV (LyxyMNPV) iap3 유전자와 그것의 삭제 구조) pDHsp/V5-그의 PCR 기반 복제 방법11. 확인 식민지에 의해 변형 된 식민지의 성장을 PCR PCR 마스터 믹스 (X 2) pDhsp-f 2/Op-IE2R 뇌관을 사용 하 여 설정 합니다. 상업적인 시퀀싱 서비스 여 플라스 미드 시퀀스를 확인 합니다.
- 세포 배양 매체와 8.5 mL 혈 청 무료 세포 배양 매체의 1.5 mL를 혼합 하 여 도금 매체를 준비 합니다.
- 악티노마이신 D (ActD) 세포 배양 세포 배양 매체의 10 mL로 ActD 주식 (1 mg/mL)의 1.5 µ L을 추가 하 여 준비 (최종 농도 = 150 ng/mL). 4 ° c.에 게
2. 단백질 과도 식
- 시드 셀
- Sf9 셀 문화 플라스 크를 흔들어 수확, 전복 그리고 세포 현 탁 액 50 mL 튜브에가 P10 피펫으로 여 hemocytometer를 10 µ L를 전송. 가벼운 현미경 셀 수를 계산 합니다.
- 실 온에서 15 분 동안 24-잘 접시에 각 음에 3 × 105 sf9 세포를 플레이트. 중 도금의 0.5 mL에 매체를 바꿉니다.
- 플라스 미드의 transfection
- 희석 세포 transfection 시 약: 100 µ L 세럼 무료 세포 배양 매체에 혼합 1 vortexing에 의해 세포 transfection 시 약의 희석 8 µ L s.
- 혈 청 무료 세포 배양 매체와 혼합의 100 µ L에 플라스 미드 DNA (pDHsp70-Ac-P35/V5-그의 pDHsp70-Ly-IAP3/V5-그의 또는 pDHsp70-Ly-IAP3-비르/V5-그의 또는 pDHsp70-Ly-IAP3-반지/V5-그의)의 2 µ g 1에 대 한 vortexing에 의해 추가 (그림 2).
- 희석된 플라스 미드 DNA 및 희석된 세포 transfection 시 약 (210 µ L), 결합 하 고 실 온에서 30 분 동안 1 미 품에 대 한 vortexing에 의해 혼합.
- P1000 피 펫에 의해 셀에 dropwise DNA transfection 시 혼합물의 210 µ L를 추가 합니다. 28 ° C 5 h에서 품 어.
- P1000 피 펫을 사용 하 여 세포 배양 매체의 0.5 mL에 도금 매체를 바꿉니다. 24-잘 접시 테이프로 밀봉 하 고 셀을 16 h 28 ° C에서 품 어.
- 열 충격 transfected 세포: (물 표면에 떠 있는) 42 ° C 물 욕조에 접시를 넣어. 30 분 동안 열 고 28 ℃ 배양 기에 24-잘 접시를 반환 합니다.
- 단백질 발현의 탐지
- 1 h 5 h 열 충격 후, 셀 1 x PBS 버퍼의 0.5 mL을 짧게 세 번 씻어.
참고: 9 mL 소독 ddH2O 10 x PBS 버퍼의 1 mL을 추가 하 여 PBS 버퍼 PBS 버퍼 x 1 배 희석 - 아래로 pipetting으로 SDS 로드 염료 x 1의 40 µ L로 세포를 lyse.
참고: PBS 버퍼 x 1의 30 µ L SDS 샘플 버퍼 x 4의 10 µ L를 혼합 하 여 SDS 로드 염료 x 4를 희석. - 10 분 열 블록에 98 ° C에서 단백질 견본을가 열 하 고 1 분 동안 스핀 다운 서쪽 오 점 분석 결과 대 한 얼음에 넣어.
- 서쪽 오 점 분석 결과
Eslami 및 Lujan13에서 서쪽 오 점 분석 결과의 절차를 따릅니다. SDS 페이지 젤14실행: Coomassie 파란 얼룩 (각 로드 단백질 견본의 수량 잘 같은 금액은 확인 하기 위한 로딩 제어)를 받게 한 젤과 다른 서쪽에 들어서는 오 점 분석 결과, Eslami와 Lujan13 . - 토끼 안티-v 5 항 체 (5 mg/mL) (1: 5000 희석 농도 1 µ g/mL 작업 TBST 버퍼에서)와 염소-토끼 IgG-양 고추냉이 과산화 효소 (HRP) 공액 (0.8 mg/mL) (1:10000 희석 작업 TBST 버퍼에서 V5 태그 융해 단백질 검출 농도 0.08 µ g/mL)입니다.
참고: Polyacrylamide 17.5%의 비율을 조정 하면 될 단백질 분자량 < 17 kDa.
- 1 h 5 h 열 충격 후, 셀 1 x PBS 버퍼의 0.5 mL을 짧게 세 번 씻어.
3. 안티-apoptotic 활동 분석 결과
- 유전자 유도 세포 apoptosis: 2.3 2.1에서 상기 절차를 반복. 공동 1 µ g의 플라스 미드 DNA와 pDHsp/D-rpr/플래그-그의 플라스 미드 DNA (포함 apoptosis 유도 유전자)의 1 µ g transfect [pDHsp70/V5-그의 벡터 (부정적인 제어), pDHsp70-Ac-P35/V5-그의 (긍정적인 제어), pDHsp70-Ly-IAP3/V5-그의 pDHsp70-Ly-IAP3-비르/V5-그의 또는 pDHsp70-Ly-IAP3-반지/V5-그의 각각.]. 5 h 후 열 충격 치료, 세포 생존 능력 분석 실험 (그림 2)을 수행 합니다.
- 화학 유도 세포 apoptosis: 2.3 2.1에서 상기 절차를 반복. 2.1.2 단계에서 6 잘 플레이트의 각 음에 1 x 106 셀 sf9 플레이트. 플라스 미드 DNA의 4 µ g transfect [pDHsp70/V5-그의 벡터 (부정적인 제어), pDHsp70-Ac-P35/V5-그의 (긍정적인 제어), pDHsp70-Ly-IAP3/V5-그의 pDHsp70-Ly-IAP3-비르/V5-그의 또는 pDHsp70-Ly-IAP3-반지/V5-그의 각각.]. 5 h 후 열 충격에 16 h ActD 세포 배양 매체의 2 mL와 sf9 세포를 치료 하 고 세포 생존 능력 분석 실험 (그림 2)를 수행 합니다.
참고: 6 잘 플레이트의 한 잘 커버를 최소 볼륨 1 mL 이다. - 위의 안티 apoptotic 활동 분석 결과 실험, 3.1과 3.2 triplicates에 포함을 수행 합니다.
4. 세포 생존 능력 분석 실험
- 3 시간 1 분 1 x PBS 버퍼의 1 mL를 추가 하 여 치료 세포를 씻어. Pipetting 1 mL 1 x PBS 버퍼 0.04 %trypan 파랑을 포함 하 여 셀을 resuspend 하 고 실내 온도에 3 분 동안 얼룩. 세포 현 탁 액 1.5 mL microtube 전송할.
참고: 1 x PBS 버퍼 및 1 mL 0.4 %trypan 블루 솔루션의 9 mL를 혼합 하 여 0.4 %trypan 블루 솔루션을 희석. - P10 피 펫과 hemocytometer를 10 µ L trypan 블루 스테인드 세포 현 탁 액을 전송 하 고 가벼운 현미경 가능한 그대로 셀.
- 통계 분석
- 기록 된 데이터를 계산 하 고 모든 계산에 대 한 의미 ± 사 우 스 다코타 존재.
- Microsoft Excel과 학생의 두 꼬리 t-검정에 의해를 사용 하 여 데이터를 분석 합니다. P로 통계적으로 중요 한 데이터를 정의-값 < 0.05.
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Representative Results
전체 길이 LyxyMNPV에서 Ly-IAP3의 다른 두 잘림 (BIR 및 도메인) 했다 overexpressed sf9 셀에는 열 충격 기반 pDHsp/V5-그의 기반 /Spodoptera frugiperda 셀 (sf9 셀) 시스템. pDHsp/V5-그의 초파리 열 충격 단백질 발기인, 셀룰러 transcriptional 요인과 번역 시스템 (그림 1)8 를 사용 하 여 다운스트림 유전자 발현 온도 42 ° C 조건에서 드라이브 포함 9,11. 전체 기술 흐름도 그림 2에 표시 됩니다. 1 h 5 h 열 충격 후, 세포 단백질 견본 버퍼와 lysed 되었고 서쪽 오 점 분석 결과 단백질 표정 확인을 복종. 결과 전체 길이 단백질, AC P35, Ly-IAP3, Ly-IAP3-비르, 및 광-IAP3-반지, 1 시간 또는 5 h 후 열 충격에 transfected 세포에서 검출 될 수 표시. 또한, 단백질 축적 5 h 후 열 충격 (그림 3)에서 발견 되었다. 따라서, 데이터, 단백질 기능 분석 결과 최대 단백질 식 시간 포인트 (5 h 후 열 충격)에서 수행 되었다.
유전자 유도 세포 apoptosis와 화학 유도 세포 apoptosis 안티 apoptotic 활동 (그림 2)를 평가 하기 위해이 시스템을 적용할 수 있습니다. 유전자 유도 세포 apoptosis에 대 한 두 구문 (apoptosis 유도 및 대상 유전자 플라스 미드 구조) 공동 transfected sf9 세포 그리고 열 충격된을 가져오는 유전자 발현 했다. 또한, 안티-apoptotic 단백질 Ac-p 35 (긍정적인 제어) 및 apoptosis 유도 단백질 (D-RPR) 또한 표현 되었다이 열 충격 과도 식 시스템을 사용 하 여.
열 충격, 후 두 유전자는 표현 하 고 단백질으로 번역 하기 시작 했다. 벡터/D-RPR에 비해, 긍정적인 제어 (Ac-P35/D-RPR) 높은 안티-apoptotic 활동을, 생존 율의 80%를 도달 했다. 다른 구문 셀 생존 결과에서 연구원은 서로 또는 긍정적인 컨트롤 (그림 4A) 안티-apoptotic 활동을 비교할 수 있습니다. 화학 유도 세포 apoptosis에 대 한 하나의 구문 sf9 셀으로 페 했다. 후 5 h 후 열 충격, 화학 물질 (ActD) 추가 되었다, 그리고 세포 생존 능력 후 16 h (그림 2) 측정 되었다. 각 구문 안티 apoptotic 활동 (그림 4B)에 다양 한 효과 보여 긍정적인 제어 (AC-P35) 또는 부정적인 제어 (벡터)와 비교.
그림 1: 다이어그램 및 뉴클레오티드의 시퀀스 ly-pDHsp/V5-그의 벡터에 따라iap3 상대 플라스 미드 구조입니다. 시작 codon (ATG)은 굵게 표시 됩니다. 밑줄 표시 제한 효소 절단 사이트 (뒷 다리붉은 색;에 III BamHI 파란 색깔에서); 녹색 색상에서 시퀀스 Dhsp70 발기인 영역을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 흐름 차트 열 충격 단백질 식 시스템 (pDHsp/V5-그 의/sf9 셀 시스템) 유도. 유전자 유도 세포 apoptosis와 화학 유도 세포 apoptosis 처리 했다 후에 나타난 초기 단계 (apoptosis 유도 유전자 플라스 미드와 공동 transfection) 또는 이후 단계 열 충격 (화학 유도 된 apoptosis), 각각에 대 한 안티-apoptosis의 시험 수정 된 그림 및 전설 스프링 거11의 허가로 재현. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: Ly-IAP3-반지, Ly-IAP3-비르, Ly-IAP3, AC-p 35의 Overexpression 단백질 식 시스템 (pDHsp/V5-그 의/sf9 셀 시스템) 유도 열 충격을 사용 하 여. 1 시간 또는 5 h 게시물 열 충격, 세포 lysates 수확 되었고 서쪽 오 점 분석 결과 고 SDS/페이지. Α-v 5 항 체와 (B) SDS/페이지 로딩 제어 Coomassie 파란 얼룩이 (A) 서양 오 점 시험 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: D-rpr 또는 악티노마이신 D 유도 된 apoptosis에 대 한 생존 능력 분석 실험. (A) sf9 셀 pDHsp70/V5-그의 벡터 (벡터만)와 페 되었고 공동 pDHsp70 /: drpr/플래그-그의 pDHsp70/V5-그의 벡터, pDHsp70/Ac-P35/V5-그의 pDHsp70/Ly-IAP3/V5-그의 pDHsp70/Ly-IAP3-비르/V5-그의 pDHsp70 페 / Ly-IAP3-반지/V5-그의 각각. 및 벡터와 정 IAP3 벡터와 P35 사이의 차이 통계적으로 유의 한 (t-테스트; P < 0.05). (B) sf9 셀 중 pDHsp70/V5-그의 벡터 또는 pDHsp70/Ac-P35/V5-그의 pDHsp70/Ly-IAP3/V5-그의 pDHsp70/Ly-IAP3-비르/V5-그의 pDHsp70/Ly-IAP3-반지/V5-그의 각각, 열 충격 후 5 h ActD 추가 되었습니다 페 했다 고 16 h 후, 세포 생존 능력 측정 했다. 벡터와 p 35의 차이 통계적으로 유의 한 (t-테스트; P < 0.05). 수정 된 그림 및 전설 스프링 거11의 허가로 재현. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 이름 | 시퀀스 |
| pDHsp-IAP3-HindIII-F | 5´-GGAAGCTTACCATGGACGACGAACGACGCAG-3´ |
| pDHsp-IAP3-BamHI-R | 5´-GCGGATCCCGGATGTAGGAACACCTTGA-3´ |
| iap3-비르-BamHI-r | 5´-CGGGATCCCGGCAGATCGCCGCCGCGGA-3´ |
| iap3-반지-HindIII-F | 5´-GGAAGCTTACCGAGCTCATAAAAAGGCCCGT-3´ |
| pDhsp70-f 2 | 5´-CTGCAACTACTGAAATCAACCAAG-3´ |
| Op-IE2R | 5´-GACAATACAAACTAAGATTTAGTCAG-3´ |
표 1: PCR 기반 복제 방법에 사용 되는 뇌관 세트. * 밑줄이 그어진된 DNA 기본적인 쌍 표시 제한 효소 사이트. 수정 된 입문서 목록 스프링 거11의 허가로 재현.
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Discussion
열 충격 기반 pDHsp/V5-그 의/sf9 셀 시스템의 개념 처음 클레 멘 타인 외. 19948에 의해 설명 되었다. Baculoviral 유전자 발기인 (IE1)와 초파리 hsp70 의 비교는 hsp70 모기 셀10높은 효율을 했다 보여주었다. 또한, 열 충격 유도 때문 단백질 식의 타이밍은 열 충격 처리 후 정확 하 게 제어할 수 수 있습니다. 이 시스템은 다음 새우와 nucleopolyhedrovirus (NPV)의 단백질 기능 분석에 대 한 적용 IAP 단백질9,11. 6 플라스 미드 구조물의 총이이 프로토콜에서 사용한: 3 (pDHsp/V5-그의 pDHsp/Ac-p35/V5-그의 그리고 pDHsp/D-rpr/플래그-그의) 지 앤 Horng 레이9, 그리고 다른 3 개의 건축 (pDHsp-iap3/V5-그의 pDHsp-iap3-비르/V5-그의에 의해 제공 되었다 그리고 pDHsp-iap3-반지/V5-그의) Nai 외에 의해 건설 되었다. 2016,11. 그것은 곤충에이 발기인 작품 baculoviral 유전자 발기인 보다 더 효율적으로 세포 보인다. 그러나,이 프로토콜의 조작, 하는 동안 고려해 야 할 몇 가지 포인트 있습니다. 플라스 미드 transfection 전에 DNA 순서의 삽입 검사는 유전자 발현;에 대 한 중요 한 따라서, 그것은 V5 epitope 대상 시퀀스의 끝에 v 5 태그 융해 단백질을 형성 하기 위하여 함께 융합 한다. 또한, 다른 퓨전 태그 (즉, 플래그 epitope)도 체 외에서 단백질 바인딩 분석 결과 대 한 pDHsp 기반 벡터에서 설계 수 있습니다. 이 확장 프로시저가 추가 단백질 단백질 상호 작용9조사 도움이 될. 따라서, 상업 V5 polyclonal 항 체 단백질의 탐지를 위해 사용 될 수 있습니다. 다른 곤충 세포의 transfection 비율 실험 하기 전에 테스트 되어야 합니다. 낮은 transfection 속도 감지할 수 없는 단백질 표정;의 발생할 수 있습니다. 따라서, 포함 하는 적절 한 보고서 유전자 pDHsp 벡터 (즉, 녹색 형광 유전자) 곤충 세포 transfection 효율을 평가 하에 페 수.
이 열 충격 식 플랫폼의 주요 제한은 단백질 식 수준입니다. 경우에 따라 낮은 단백질 표정 수준 발견 됐다. 파일럿 연구는 발생 했습니다 더 많은 플라스 미드 DNA sf9 셀 (데이터 표시 되지 않음)로 페는 아무 상당한 복용량-의존 효과가 했다. 따라서,이 효과 유비퀴틴 프로테아좀 통로 (UPP) 또는 다른 알 수 없는 메커니즘11에 의해 발생할 수 있습니다. 연구원은 명확 하 게 (즉, MG-132) 프로테아좀 억제제 및 recolve의 단백질 발현이 문제11검토 해야 합니다. 다른 한계는 재조합 형 바이러스와 관련 된 단백질의 지속적인 생산 달성 될 수 없었다. 따라서, 단백질 발현의 양과 안정화도이 시스템에 대 한 우려가 있습니다. 따라서, 단백질 생산의 시간 과정 또한 기능 시험 전에 서쪽 오 점 분석에 의해 시험 한다. 이 프로토콜에서 우리 두 시간 포인트 (1과 5 열 충격 후 h)를 비교 하 고 관찰 5 h 1 h에서 대상 단백질 생산의 축적. 시간 포인트에서 증가 단백질 기능 분석 결과 대 한 최상의 타이밍 조건을 결정 하기 위하여 건의 된다.
단백질에 대 한 기능 분석 결과, 안티-apoptotic 단백질 Ac-p 35 (긍정적인 제어) 및 apoptosis 유도 단백질 (D-RPR)도이 열 충격 과도 식 시스템을 사용 하 여 표현 했다. 이 두 가지 단백질 기능적인 길 항 근9,,1115로 설명 합니다. 따라서, 벡터/D-RPR 및 Ac-P35/D-RPR 될 수 있습니다 부정적인 제어 및 긍정적인 통제, 각각. 이 비교를 사용 하 여 대상 단백질의 안티-apoptotic 활동 결정 수 있습니다.
제시 프로토콜 보다 신속 하 게 외국 단백질을 표현 하는 플랫폼을 제공할 수 있다 또는 더 곤충 세포에서 단백질 안티 apoptotic 활동 평가에 적용할 수 있습니다. 일단 연구는 단백질 기능의 예비 결과 얻을, 추가 연구에 대 한이 시스템을 사용 수 있습니다.
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Disclosures
저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.
Acknowledgments
우리 박사 지 앤 Horng 레이 연구소의 해양 생물학과, 국립 대만 해양 대학 3 플라스 미드 구조물을 제공 하기 위한 감사 합니다. 이 연구에 의해 그랜트 106-2311-B-197-001-과학의 부 및 기술 (대부분)에서 지원 되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibiotic-Antimycotic, 100X | Gibco | 15240-062 | for insect cell culture |
| Certified Foetal Bovine Serum | Bioind | 04-001-1A | |
| Sf-900 II SFM | Thermo Fisher | 10902096 | serum-free cell culture medium |
| Sf9 cells | ATCC | CRL-1711 | |
| 25cm2 cell culture flask | Nunc, Thermo Fisher | 156340 | |
| Inverted light microscopy | WHITED | WHITED WI-400 | |
| RBC HIT Competent Cell | Bioman | RH618-J80 | Escherichia coli (DH5α) |
| L.B. Broth (Miller) | Bioman | LBL407 | |
| Agar, Bacteriological Grade | Bioman | AGR001 | |
| Zeocin | Invitrogen | ant-zn-1 | selection antibiotic |
| PCR Master Mix (2X) | ThermoFisher | K0171 | |
| Geneaid Midi Plasmid Kit (Endotoxin Free) | Geneaid | PIE25 | |
| Actinomycin D | SIGMA | A9415 | |
| Corning 50 mL centrifuge tubes | SIGMA | CLS430829-500EA | 50 mL tubes |
| Hemocytometer | Gizmo Supply Co | B-CNT-SLDE-V2 | |
| 24-Well Multidish | Nunc, Thermo Fisher | 142475 | 24-well plate |
| Cellfectin II Reagent | Thermo Fisher | 10362100 | cell transfectin reagent |
| PBS-Phosphate-Buffered Saline (10X) pH 7.4 | Thermo Fisher | AM9624 | |
| 4×SDS Loading Dye | Bioman | P1001 | |
| Immobilon-P (PVDF Blotting Membranes) | Merck Milipore | IPVH00010 | PVDF membranes |
| Mini Trans-Blot Cell system | BIO-RED | 1703930 | Blotting device |
| Ponceau S solution | SIGMA | 6226-79-5 | |
| Anti-V5 | SIGMA | V8137 | rabbit anti-V5 antibody |
| Goat anti-rabbit IgG-horseradish peroxidase (HRP) | Jackson | 111-035-003 | |
| Tween 20 | Merck | 817072 | |
| 6-Well Multidish | Nunc, Thermo Fisher | 145380 | |
| 0.4 % trypan blue solution | AMRESCO | K940-100ML | |
| P10 pipetman | Gilson | F144802 | |
| P1000 pipetman | Gilson | F123602 | |
| Tape | Symbio | PPS7 | 24 well tape ( 19 mm×36 M) |
References
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- Theilmann, D. A., et al. Family Baculoviridae. Virus Taxonomy: Eighth Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses. Fauquet, C. M., Mayo, M. A., Maniloff, J., Desselberger, U., Ball, L. A. , Springer Press. New York. 1129-1185 (2005).
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- Eslami, A., Lujan, J. Western Blotting: Sample Preparation to Detection. J. Vis. Exp. (44), e2359 (2010).
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- Vucic, D., Kaiser, W. J., Harvey, A. J., Miller, L. K. Inhibition of reaper-induced apoptosis by interaction with inhibitor of apoptosis proteins (IAPs). Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94, 10183-10188 (1997).
