Cell Membrane Repair Assay met behulp van een Laser van het twee-foton microscoop

Samenvatting

Cell membrane verwonding via twee-foton laser is een veelgebruikte methode voor de beoordeling van de membraan opnieuw verzegelen vermogen en kan worden toegepast op meerdere celtypes. Hier beschrijven we een protocol voor in vitro live-imaging membraan daarvan in dysferlinopathy patiënten cellen na twee-foton laser van het baarmoederslijmvlies.

Samenvatting

Talrijke pathofysiologische beledigingen kunnen schade toebrengen aan celmembranen en wanneer in combinatie met aangeboren gebreken in de celmembraan reparatie of integriteit, kunnen leiden tot ziekte. Inzicht in de moleculaire mechanismen rond celmembraan reparatie is daarom een belangrijke doelstelling voor de ontwikkeling van nieuwe therapeutische strategieën voor ziekten in verband met disfunctionele celmembraan dynamiek. Twee-foton laser ablatie veel in vitro en in vivo studies gericht op het begrijpen van de celmembraan opnieuw verzegelen in verschillende contexten van de ziekte gebruiken als maatstaf voor het bepalen van de functionele uitkomsten na experimentele behandelingen. In deze test, zijn celmembranen onderworpen aan verwonding met een twee-foton laser, waardoor de celmembraan breuk en fluorescente kleurstof te infiltreren in de cel. De intensiteit van de fluorescentie binnen de cel kan vervolgens worden gecontroleerd om te kwantificeren van de cel kunnen verzegelen zelf. Er zijn verschillende alternatieve methoden voor de beoordeling van de celmembraan reactie op schade, evenals de grote variatie in de twee-foton laser verwonden aanpak zelf, dus een enkele, uniforme model van cel verwonden beneficiair te verminderen zou dienen de het verschil tussen deze methoden. In dit artikel schetsen wij een eenvoudige twee-foton laser protocol voor de beoordeling van de celmembraan reparatie in vitro in beide gezond en dysferlinopathy patiënt fibroblast cellen transfected met of zonder een full-length dysferlin plasmide verwonden.

Inleiding

Het celmembraan van eukaryotische cellen bestaat uit een dubbele laag van eiwit-studded fosfolipiden die definieert het intra/extracellulaire milieu van de cel en is essentieel voor het behoud van cellulaire homeostase en cel overleven. Celmembraan verwondingen als gevolg van mechanische of chemische beledigingen zijn gemeengoed in verschillende zoogdieren celtypen, met inbegrip van skelet en hartspier, maag en longen cellen^1,2,3,4. Naast Blessures gevolg van dagelijkse fysiologische functie, kunnen celmembranen ook worden beschadigd door mi....

Protocol

Menselijke fibroblast cellen die worden gebruikt in deze studie werden gebruikt met goedkeuring van de menselijke ethische commissie van de faculteit geneeskunde en tandheelkunde bij de Universiteit van Alberta.

1. de transfectie van cellen met full-length DYSF plasmide

1. Cultuur fibroblast cellen in een T225 kolf met 40 mL groei media - 36 mL Dulbecco van bewerkt Eagle Medium (DMEM), 4 mL van foetale runderserum (FBS) en 20 µL van penicilline/streptomycine (P/S) - in een CO₂ incubator bij 37 ° C.
   Opmerking: Cellen moeten worden gekweekt tot ongeveer 70-80% confluentie en mogen niet tot volledig confluent.
2. ....

Resultaten

Gezonde menselijke fibroblasten, dysferlinopathy niet-behandelde patiënten fibroblasten en patiënt fibroblasten transfected met een plasmide met de full-length dysferlin volgorde werden onderworpen aan twee-foton laser verwonden om te beoordelen membraan opnieuw verzegelen van vermogen in real-time. Gezonde menselijke fibroblast cellen weergegeven lage niveaus van FM 4-64 fluorescentie activering na laser verwonden en niet-behandelde patiënten fibroblasten tentoongesteld een hoge mate van.......

Discussie

Twee-foton laser verwonden van de celmembraan is een nauwkeurige en veelzijdige techniek voor de beoordeling van de dynamiek van membraan opnieuw verzegelen in vitro. In dit artikel beschreven we een protocol voor het bepalen van de celmembraan opnieuw verzegelen vermogen in dysferlinopathy patiënten cellen met behulp van de laser van de twee-foton assay verwonden. Onze resultaten tonen aan dat dysferlinopathy patiënt cellen met gebreken in het celmembraan opnieuw verzegelen zijn, die strookt met de bevindingen .......

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Thermo Fisher	11320033
Fetal Bovine Serum	Sigma-Aldrich	F1051
Penicillin-Streptomycin (10.000 U/mL)	Thermo Fisher	15140122
Trypsin-EDTA (0,05%), fenol rood	Thermo Fisher	25300062
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline	Sigma-Aldrich	D8537
35mm met collageen gecoate glazen bodem schotels	MatTek	P53GCOL-1.5-14-C
Serum-vrij media	Thermo Fisher	31985070
Transfectie reagens	Thermo Fisher	15338100
FM 4-64 Kleur	Invitrogen	T13320
Tyrode’s Zout Oplossing	Sigma-Aldrich	T2397
Confocale laserscanning microscoop	Carl Zeiss	NA
Chameleon Twee-foton laser	Coherent	NA