Hücre zarının iki fotonlu lazer ile yaralama membran yeniden mühürlemeden yeteneği değerlendirmek için yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir ve birden çok hücre türü için uygulanabilir. Burada, vitro canlı İki fotonlu lazer ablasyon takip dysferlinopathy hasta hücrelerde membran yeniden mühürleme, görüntüleme için bir protokol açıklayın.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
İki fotonlu lazer mikroskop kullanarak hücre zarı tamir tahlil
Bu makalede
Özet
Özet
Çok sayıda patofizyolojik hakaret hücre zarlarında zarar verebilir ve hücre zarının onarım veya bütünlüğü, doğuştan gelen kusurlar ile birleştiğinde hastalığı neden olabilir. Hücre zarı tamir çevreleyen temel moleküler mekanizmaları anlama, bu nedenle, işlevsel olmayan hücre zarı dynamics ile ilişkili hastalıklar için yeni tedavi stratejilerinin geliştirilmesi için önemli bir amacın var. Hücre zarının çeşitli hastalık bağlamlarda yeniden mühürlemeden anlama amaçlayan birçok içinde in vitro ve in vivo çalışmada İki fotonlu lazer ablasyon fonksiyonel sonuçlar deneysel tedavileri takip belirlemek için standart olarak kullanmaktadır. Bu tahlil, hücre zarlarında hücre membran rüptürü ve hücre sızmaya floresan boya için neden bir iki fotonlu lazer ile yaralama için tabi tutulmaktadır. Hücre içinde floresan yoğunluğu sonra kendisini yeniden mühürlemek için hücrenin yeteneği ölçmek için takip edilebilir. Hücre zarının yanıt yaralanma, yaklaşım kendini yaralama İki fotonlu lazer büyük varyasyon olarak değerlendirmek için birkaç farklı yöntemi var, bu nedenle, hücre yaralama bir tek, birleştirilmiş model beneficially azaltmak için hizmet verecek Bu metodolojileri arasında varyasyon. Bu makalede, basit bir iki fotonlu lazer hücre zarı tamir vitro hem de sağlıklı ve dysferlinopathy hastanın fibroblast hücreleri veya bir tam uzunlukta dysferlin plazmid olmadan transfected değerlendirilmesi için protokol yaralama anahat.
Giriş
Bir çift-hücre içi/hücre dışı ortam tanımlar ve hücresel homeostazı ve hücre yaşam bakımı için önemlidir tabaka-in protein çivili fosfolipitler, ökaryotik hücre hücre zarı oluşur. Hücre zarının yaralanmaları mekanik veya kimyasal hakaret kaynaklanan çeşitli memeli hücre türleri sıradan, dahil iskelet ve kalp kası, mide ve akciğer hücreleri1,2,3,4. Yaralanmalar için günlük fizyolojik fonksiyon sonucu ek olarak, hücre zarlarında Ayrıca çevre hakaret, bakteriyel toksinler ve iskemik reperfüzyon5tarafından zarar görebilir....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Bu çalışmada kullanılan insan fibroblast hücre Tıp Fakültesi ve diş hekimliği University of Alberta adlı insan Etik Komitesi onay ile kullanılmıştır.
1. transfection tam uzunlukta DYSF plazmid içeren hücrelerin
- Kültür fibroblast hücrelerinde büyüme medya - 36 mL Dulbecco'nın modifiye kartal orta (DMEM), fetal sığır serum (FBS) 4 mL ve penisilin/streptomisin (P/S) - CO2 kuluçka 37 ° C'de 20 µL 40 mL içeren bir T225 şişesi
Not: Hücreleri yaklaşık % 70-80 confluency kültürlü olmalı ve tamamen Konfluent olmak için izin verilmemelidir. - Hücreleri tohum için hazırlamak için iki kez fosfat tamponlu tuz (PBS) 40 m....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Sağlıklı insan fibroblast, dysferlinopathy olmayan tedavi hasta fibroblastlar ve hasta fibroblastlar tam uzunlukta dysferlin sıra tabi yeteneği yeniden mühürlemeden membran değerlendirmek için iki fotonlu lazer yaralama için içeren bir plazmid transfected gerçek zamanlı olarak. Sağlıklı insan fibroblast hücreleri görüntülenen lazer yaralama takip FM 4-64 Floresans etkinleştirme düzeyi düşük ve sigara tedavi hasta fibroblastlar sergilenen yaralanma takip göreli floresan yoğunluğu yüksek de.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
İki fotonlu lazer hücre membran yaralama içinde vitroyeniden mühürlemeden membran dinamikleri değerlendirmek için hassas ve çok yönlü bir tekniktir. Bu makalede, hücre zarının dysferlinopathy hasta hücrelerin tahlil yaralama İki fotonlu lazer kullanarak yeteneği yeniden mühürlemeden belirlemek için bir iletişim kuralı açıklanan. Dysferlinopathy hasta hücrelerin hücre zarının yeniden mühürleme, arızalı diğer araştırmacılar tarafından bulguları ile uyumlu olduğu ve hangi daha fazla hücre zarı dynamics kas arasında.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar ifşa gerek yok.
Teşekkürler
Bu eser yenilik (CFI) tıp ve diş hekimliği, arkadaş, Garrett Cumming araştırma sandalye Fonu, HM Toupin nörolojik bilim araştırma sandalye Fonu, kas distrofisi Kanada, Kanada Vakfı Alberta Üniversitesi Fakültesi tarafından desteklenmiştir, Alberta ileri eğitim ve Teknoloji (AET), Kanadalı Sağlık Araştırma (CIHR), Jesse'nin yolculuk - gen ve hücre tedavisi, kadın ve çocuk sağlığı Araştırma Enstitüsü (WCHRI), temeli enstitüleri ve Alberta Sağlık Çözümleri (AIHS yeniliklerin ).
Dr. Steven Laval tam uzunlukta dysferlin plazmid ile bize sağlamak için teşekkür etmek istiyorum. Ayrıca Dr Katsuya Miyake teknik tavsiye için teşekkür etmek istiyorum.....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı (DMEM) | Thermo Fisher | 11320033 | |
| Fetal Sığır Serumu | Sigma-Aldrich | F1051 | |
| Penisilin-Streptomisin (10.000 U / mL) | Thermo Fisher | 15140122 | |
| Tripsin-EDTA (% 0.05), fenol kırmızısı | Thermo Fisher | 25300062 | |
| Dulbecco' s Fosfat Tamponlu Tuzlu | Salamin Sigma-Aldrich | D8537 | |
| 35mm kollajen kaplı cam tabanlı tabaklar | MatTek | P53GCOL-1.5-14-C | |
| Serumdan yoksun ortam | Thermo Fisher | 31985070 | |
| Transfeksiyon reaktifi | Thermo Fisher | 15338100 | |
| FM 4-64 Boya | Invitrogen | T13320 | |
| Tyrode' s Tuzlar Çözeltisi | Sigma-Aldrich | T2397 | |
| Konfokal lazer tarama mikroskobu | Carl Zeiss | NA | |
| Bukalemun İki fotonlu lazer | Tutarlı | NA |
Kaynaklar
- Cong, X., Hubmayr, R. D., Li, C., Zhao, X. Plasma membrane wounding and repair in pulmonary diseases. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 312 (3), L371-L391 (2017).
- Demonbreun, A. R., McNally, E. M. Plasma Membrane Repair in Health and Disease. Curr Top Membr. 77
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
