Method Article

Génération efficace du pancréas/duodénum homéotique Protein 1+ postérieure Foregut/pancréatique progéniteurs de hPSCs dans les Cultures de l’adhérence

DOI:

10.3791/57641

⸱

March 27th, 2019

 ,  ,  , 
1Center for iPS Cell Research and Application (CiRA), Kyoto University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous présentons ici un protocole détaillé afin de différencier les cellules souches pluripotentes humaines (hPSCs) dans les protéines de boîte homéotique pancréas/duodénum 1+ (PDX1+) pour la génération des lignées du pancréas, les cellules basé sur la croissance de monocouche de type non colonie de dissocier les cellules individuelles. Cette méthode convient pour la production homogènes cellules dérivées d’hPSC, la manipulation génétique et dépistage.

Abstract

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Les cellules souches pluripotentes humaines (hPSC)-dérivées des cellules pancréatiques sont une source prometteuse de la cellule pour la médecine régénérative et une plate-forme pour l’étude des processus de développement humains. Réalisé par étapes de différenciation qui récapitule les processus de développement est un des principaux moyens pour générer des cellules pancréatiques y compris pancréas/duodénum homéotique protéine 1+ (PDX1+) des cellules progénitrices pancréatiques. Les protocoles classiques initient la différenciation avec petites colonies peu après le passage. Toutefois, dans l’état de colonies ou d’agrégats, les cellules sont sujettes aux hétérogénéités, qui pourraient entraver la différenciation à PDX1+ cellules. Nous présentons ici un protocole détaillé pour se différencier de hPSCs en PDX1+ cellules. Le protocole consiste en quatre étapes et initie la différenciation par ensemencement monocellules dissociées. L’induction de SOX17+ cellules de l’endoderme définitif a été suivie par l’expression des marqueurs de tube deux intestin primitif, HNF1β et HNF4α et différenciation éventuelle en PDX1+ cellules. Le présent protocole offre une manipulation facile et peut améliorer et stabiliser l’efficacité de différenciation de certaines lignées de hPSC qui ont été précédemment trouvés à se différencier de manière inefficace en lignées endodermiques ou PDX1+ cellules.

Introduction

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Le pancréas se compose principalement de cellules exocrines et endocrines et son dysfonctionnement ou surcharge provoque plusieurs maladies comme la pancréatite, le diabète et le cancer du pancréas. Afin d’élucider la pathogénie de le pancreatopathy, il est nécessaire d’analyser le processus de développement et la fonction des cellules du pancréas. En outre, une alimentation de variétés de cellule stables avec qualité robuste est nécessaire pour établir la thérapie de supplémentation de cellules/tissus. Les cellules souches pluripotentes humaines (hPSC)-dérivées des cellules pancréatiques sont une source prometteuse de la cellule à ces fins, et le protocole de différe....

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Protocol

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Expériences à l’aide de hPSCs ont été approuvées par le Comité d’éthique de la faculté de médecine et la Graduate School of Medicine, Université de Kyoto.

1. préparation des matériaux

Remarque : Préparer tous les milieux et réactifs pour culture de cellules dans un milieu stérile. Échauffement de base milieux de culture à la température ambiante (RT) avant utilisation. Médium pour la différenciation est utilisée moins de 6 h à RT. détails des réactifs sont répertoriés dans la Table des matières.

  1. Différenciation (Figure 1 a<....

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Results

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HiPSCs multiplication (585A129,30) se condensent et forment une monocouche homogène (Figure 1 b) qui convient à la différenciation. HiPSCs indifférenciés (stade 0) sont dissociées et re-graines comme des cellules individuelles à faible densité (1-1. 5 x 105 cellules/cm2). Moins de 1 h, les cellules sont fixées à la plaque et commencent à montrer la partie saillante. Jour 1, les cellules sont se sont multipliés e.......

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Discussion

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La génération de PDX1+ cellules se compose de plusieurs étapes ; par conséquent, il est essentiel de traiter les cellules au moment opportun. Parmi les mesures, l’efficacité de l’induction de l’endoderme définitif dans une large mesure affecte l’efficacité de l’induction final, éventuellement par l’interférence des autres cellules de lignée contaminantes (mésoderme et ectoderme), qui peuvent proliférer et/ou sécrètent des facteurs qui perturber la différenciation spécifique. Si la proportion des SOX17+

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Disclosures

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce travail a été soutenu en partie par le financement de la société japonaise pour la Promotion of Science (JSPS) par l’intermédiaire de Scientific Research (C) (JSPS KAKENHI Grant Number15K09385 et 18 K 08510) à T.T. et subvention pour les chargés de recherche de pages jsp (jsp KAKENHI Grant Number 17J07622) A.K. et l’Agence japonaise pour la recherche médicale et le développement (AMED) par le biais de ses travaux de recherche accordent « Core Center for iPS Cell Research, centre de recherche de réseau pour la réalisation de la médecine régénérative » à K.O. Les auteurs remercient Dr Peter Karagiannis pour la lecture du manuscrit.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Acide benzoïque 3-Keto-N-aminoethyl-N&prime ;-aminocaproyldihydrocinnamoyl cyclopamineToronto Research ChemicalsK171000CYC
4-[(E)-2-(5,6,7,8-Tétrahydro-5,5,8,8-tétraméthyl-2-naphtalényl)-1-propényl]-benzoïqueSanta Cruz BiotechnologySC-203303TTNPB
50 mL Tubes à centrifuger coniques stériles en polypropylèneThermo Fisher Scientific339652
Anticorps anti-CDX2 [EPR2764Y]AbcamAb76541Anti-CDX2, × ; 1/1000 dilution
B-27 Supplément (50 × ;)Thermo Fisher Scientific17504-044Supplément sans sérum
BD FACSAria II Trieur de cellulesBD BiosciencesPour cytométrie en flux
Congélateur biomédicalSANYOMDF-U538Pour -30 ° ; C
Stockage Lames de comptage cellulaire pour compteur de cellules TC10/TC20, double chambreBIO-RAD1450011Lame de comptage en verre
PLAQUE MULTIPUITS DE CULTURE CELLULAIRE, 6 PUITS, PS, TRANSPARENTGreiner bio-one657165Pour la culture de différenciation/plaque à 6 puits
CentrifugeuseTOMYAX-310Pour la culture cellulaire
CentrifugeuseTOMYMX-305Pour RT-qPCR
CHIR99021Axon MedchemAxon 1386
BANC PROPRESHOWA KAGAKU  ;S-1601PRVBanc propre
Corning CellBIND Plaque à 6 puitsCorning3335Pour la culture sans alimentation de hPSC/plaque à 6 puits
Corning Matrigel Matrice de membrane basale Facteur de croissance réduitCorning354230Matrice de membrane basale
Corning Synthemax II-SC SubstratCorning3535Pour la culture sans alimentation de hPSC/matériau de surface synthétique pour hPSC
CryostatLeicaLeica CM1510 SPour l’immunocoloration des agrégats.
Kit Cytofix/CytopermBecton Dickinson554714tampon de permanente/lavage est  ; Tampon de perméabilisation/lavage. Le tampon Cytofix/Cytoperm est un tampon de fixation et de perméabilisation.
Dako penDakoS2002Pour l’immunomarquage d’agrégats
dNTP mix (10 mM)Thermo Fisher Scientific18427-088Pour RT-qPCR
Donkey anti-Goat IgG (H+L) Anticorps secondaire à adsorption croisée, Alexa Fluor 488 ThermoFisher ScientificA11055Anticorps secondaire, × ; 1/500 dilution
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Anticorps secondaire à adsorption croisée élevée, Alexa Fluor 546Thermo Fisher ScientificA10036Anticorps secondaire, × ; dilution 1/500
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Anticorps secondaire à adsorption croisée élevée, Alexa Fluor 546Thermo Fisher ScientificA10040Anticorps secondaire, × ; dilution 1/500
Sérum d’âneMerck MilliporeS30Sérum d’âne
D-PBS(-) sans Ca ou MgNacalai tesque14249-95DPBS
Essential 8 MediumThermo Fisher ScientificA1517001Pour la culture sans alimentation de hPSCs/milieu d’entretien hPSC
Falcon 5 mL Tube à essai en polystyrène à fond rond, avec filtre à cellules Capuchon à pressionCorning3522355 mL Tube en polystyrène à fond rond Corning 5 mL avec filtre à cellules
Pointe filtrante, 1 000 & micro ; LWatoson124-1000SS’utilise avec des pipettes
Pointe Filtre, 20 & micro ; LWatoson124-P20SÀ utiliser avec des pipettes
Pointe de filtre, 200 & micro ; LWatoson124-P200SUtilisation avec des pipettes
Microscope à fluorescenceKeyenceBZ-X700Pour l’immunocoloration
Forma Steri-Cycle CO2 incubateurThermo Fisher Scientific370AIncubateur
HNF-1&beta ; Anticorps (C-20)Santa Cruz Biotechnologysc-7411Anti-HNF1&beta ;, × ; dilution 1/200
HNF-4&alpha ; Anticorps (H-171)Santa Cruz Biotechnologysc-8987Anti-HNF4&alpha ;, × ; dilution 1/200
Hoechst 33342Thermo Fisher ScientificH3570Pour la coloration du noyau, × ; 1/200 dilution
Pancréas humain ARN totalAmbionAM7954Pour RT-qPCR
Anticorps PDX-1/IPF1 humainR& D SystemsAF2419Anti-PDX1, IgG de chèvre, × ; dilution 1/200
Anticorps humains SOX17R& D SystemsAF1924Anti-SOX17, × ; dilution 1/200
MEM amélioré Option moyenneThermo Fisher Scientific10373-017iMEM
Chambre d’incubationCosmo Bio10DOPour l’immunocoloration des agrégats Gants d’examen
latexAdachi
MAS verre diapositive enduitMatsunami Glass83-1881Pour immunocoloration des agrégats
MicroAmp Fast Plaque de réaction à 96 puitsApplied Biosystems/Thermo Fisher Scientific4346907Pour microscope RT-qPCR
OlympusCKX41N-31PHPPour la culture cellulaire
MicrotubeWatoson131-515CS
Monoclonal Anti-&alpha ;-FetoprotéineSIGMAA8452Anti-AFP, × ; 1/200 dilution
Nanodrop 8000Thermo Fisher ScientificPour RT-qPCR
Oligo dTFASMACOligo sur mesurePour la RT-qPCR de la séquence est « TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT »
Paraformaldéhyde, poudreNacalai tesque26126-54PFA, fixateur, dilué dans DPBS
Réfrigérateur pharmaceutiqueSANYOMPR-514Pour 4 ° ; C stockage
PIPETMAN P  ;Pipette GILSON
Recombinante Humaine KGF/FGF-7R& D Systems251-KGKGF
Noggin Humain RecombinantPeproTech120-10CNOGGIN
Recombinant Humain/Souris/Rat Activine AR& D Systems338-ACActivin A
ReverTra Ace (100 U/&mu ; L)TOYOBOTRT-101Pour RT-qPCR
RNase-free DNase Set (50)QIAGEN79254Pour RT-qPCR
RNeasy Mini KitQIAGEN74104Pour RT-qPCR
RPMI 1640 avec L-GlnNacalai tesque30264-85RPMI 1640
Film d’étanchéité pour temps réelTakaraNJ500Pour RT-qPCR
Pipettes sérologiques 10 mLCostar/Corning4488Pour la culture cellulaire
Pipettes sérologiques 25 mLCostar/Corning4489Pour la culture cellulaire
Pipettes sérologiques 5 mLCostar/Corning4487Pour la culture cellulaire
Sox2 (D6D9) XP Rabbit mAbSignalisation cellulaire3579SAnti-SOX2, × ; 1/200
dilution StepOnePlusApplied Biosystems/Thermo Fisher ScientifiquePour RT-qPCR
SaccharoseNacalai tesque30406-25Pour l’immunocoloration des agrégats
TB Green
Premix Ex Taq II  ;		TakaraRR820BPour RT-qPCR
TC20 Compteur de cellules automatiséBIO-RAD1450101J1Compteur automatique
de cellules Tissue-Tek Composé OCT 4583  ;Sakura Finetechnical4583Pour l’immunocoloration des agrégats
Tissue-Tek Cryomold Moules/AdaptateursSakura Finetechnical4566Pour l’immunocoloration des agrégats
Triton X-100Nacalai tesque35501-15
Trypan BlueBIO-RAD1450021
Congélateur ultrafroidSANYOMDF-U33VPour -80 ° ; C stockage
UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0Thermo Fisher Scientific15575-038Diluer avec DPBS pour préparer 0,5 mM EDTA
Veriti Thermal CyclerApplied Biosystems/Thermo Fisher ScientificPour RT-qPCR
Y-27632Wako251-00514
en

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. D'Amour, K. A., et al. Production of pancreatic hormone-expressing endocrine cells from human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 24 (11), 1392-1401 (2006).
  2. Pagliuca, F. W., et al. Generation of functional human pancreatic beta cells in vi....

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