Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Et tripeptid-stabiliseret Nanoemulsion af oliesyre

Published: February 27, 2019 doi: 10.3791/59034
Automatic Translation
1, 1,2, 1,3, 4,5,6, 1,2,3
1Department of Chemistry, Brooklyn College, The City University of New York, 2Ph.D. Program in Chemistry, The Graduate Center of The City University of New York, 3Ph.D. Program in Biochemistry, The Graduate Center of The City University of New York, 4Department of Genetics and Genomic Sciences, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 5Women's Health Research Institute, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 6Laboratory for Translational Research, Western Connecticut Health Network

Summary

Denne protokol beskriver en effektiv metode til at syntetisere en nanoemulsion af en oliesyre acids-platinum(II) konjugat stabiliseret med en lysin-tyrosin-fenylalanin (KYF) tripeptid. Nanoemulsion formularer på mild syntetiske betingelser via samlesæt af KYF og konjugation.

Abstract

Vi beskriver en metode til at producere en nanoemulsion bestående af en oliesyre acids-Pt(II) kerne og en lysin-tyrosin-fenylalanin (KYF) belægning (KYF-Pt-NE). KYF-Pt-NE indkapsler Pt(II) på 10 wt. %, har en diameter på 107 ± 27 nm og en negativ overflade ladning. KYF-Pt-NE er stabilt i vand og i serum, og er biologisk aktive. Konjugation af en fluorophore til KYF tillader syntesen af en fluorescerende nanoemulsion, der egner sig til biologiske billeddannelse. Syntesen af nanoemulsion er udført i et vandigt miljø og KYF-Pt-NE former via samlesæt for en kort KYF peptid og en oliesyre acids-platinum(II) konjugat. Samlesæt proces afhænger af temperaturen af løsningen, det molære forholdet mellem substraterne, og strømningshastigheden af substrat tilsætning. Afgørende skridt omfatter opretholde den optimale omrøring sats under syntesen, tillader tilstrækkelig tid til samlesæt og pre at koncentrere nanoemulsion gradvist i en centrifugal koncentrator.

Introduction

I de seneste år har der været en voksende interesse for Ingeniørvidenskab af nanopartikler til sådanne biomedicinske anvendelser som medicinafgivelse og bioimaging1,2,3,4. Landbrugets multifunktionalitet nanopartikel-baserede systemer kræver ofte inkorporerer flere komponenter inden for én formulering. De byggesten, der er baseret på lipider eller polymerer ofte adskiller sig med hensyn til deres fysisk-kemiske egenskaber samt deres biokompatibilitet og biologiske nedbrydelighed, som i sidste ende kan påvirke funktionen af nanostrukturer1, 5,6. Biologisk afledte materialer, såsom proteiner og peptider, har længe været anerkendt som lovende komponenter af multifunktionelle nanostrukturer på grund af deres sekvens fleksibilitet7,8. Peptider selv samle til stærkt bestilte Supramolekylær arkitekturer danner spiralformet bånd9,10, fibrøst stilladser11,12, og mange flere, dermed bane vejen til bygning biomolekyle-baserede hybrid nanostrukturer ved hjælp af en bottom-up tilgang13.

Peptider er udtømt for applikationer i medicin og bioteknologi, især til anticancer behandling14 og hjerte-kar-sygdomme15 såvel som for antibiotika udvikling16,17, metaboliske lidelser18, og infektioner19. Der er over hundrede af små-peptid therapeutics gennemgår kliniske forsøg20. Peptider er lette at ændre og hurtig til at syntetisere til en lav pris. Derudover er de biologisk nedbrydelige, som i høj grad letter deres biologiske og farmaceutiske anvendelser21,22. Brugen af peptider som strukturelle komponenter omfatter engineering af modtagelig, peptid-baserede nanopartikler og hydrogel depoter for kontrolleret frigivelse23,24,25,26 , 27, peptid-baserede biosensorer28,29,30,31, eller bio-elektroniske enheder32,33,34. Vigtigere, selv korte peptider med to eller tre amino-syre rester, der omfatter phenylalanin blev fundet til at guide den samlesæt behandler35,36,37 og oprette stabiliseret emulsioner38 .

Platinum-baserede lægemidler på grund af deres høje effekt, der anvendes i mange kræft behandlingsregimer, både alene og i kombination med andre agenter39,40. Platin forbindelser inducerer DNA-skader ved at danne monoadducts og intrastrand eller interstrand cross-links. Pt-DNA læsioner er anerkendt af den cellulære maskiner, og hvis ikke repareret, føre til cellulært apoptose. Den vigtigste mekanisme, hvorved Pt(II) bidrager til kræft celledød, er hæmning af DNA transkription41,42. Fordele ved platinum terapi er dog faldet med systemisk toksicitet af Pt(II), der udløser alvorlige bivirkninger. Dette fører til lavere kliniske dosering af Pt(II)43, hvilket ofte resulterer i sub terapeutiske koncentrationer af platin nå DNA'ET. Som følge heraf bidrager DNA reparation, der følger til kræft celle overlevelse og erhverve Pt(II) modstand. Platin kemo-modstand er et stort problem i anticancer terapi og den vigtigste årsag til behandling fiasko44,45.

Vi har udviklet en stabil nanosystem, der indkapsler Pt(II) agent for at give en afskærmning virkning i systemisk cirkulation og mindske bivirkninger Pt II-induceret. Systemet er baseret på en oliesyre acids-Pt(II) kerne stabiliseret med en KYF tripeptid til at danne en nanoemulsion (KYF-Pt-NE)46. Byggesten af KYF-Pt-NE, aminosyrer tripeptid samt oliesyre, har generelt anerkendt som sikre (GRAS) status med Food and Drug Administration (FDA). KYF-Pt-NE er udarbejdet ved hjælp af en nanoprecipitation metode47. Kort sagt, er oliesyre acids-Pt(II) konjugat opløst i et organisk opløsningsmiddel og derefter tilsættes dråbevis til en vandig KYF løsning (figur 1) ved 37 ° C. Løsningen rørte i flere timer at tillade samlesæt af KYF-Pt-NE. Nanoemulsion er koncentreret i 10 kDa centrifugal koncentratorer og vaskes tre gange med vand. Den kemiske ændring af KYF med en fluorophore tillader syntesen af fluorescerende FITC-KYF-Pt-NE egnet til biomedicinsk billeddannelse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Sammenfatning af oliesyre Acids–Platinum(II) konjugat

  1. Aktivering af cisplatin
    1. Suspendere 50 mg (0.167 mmol) af cisplatin i 4 mL vand (fx nanopure) ved 60 ° C.
    2. Tilsættes dråbevis 55,2 mg (0,325 mmol) af AgNO3 i 0,5 mL vand til løsningen af cisplatin og omrøres reaktion i mindst 2 timer ved 60 ° C. Den hvide bundfald af AgCl vil danne, der angiver status for reaktionen.
    3. For at bestemme, hvis aktivisering reaktionen er afsluttet, udføre test med 10% HCl for tilstedeværelsen af gratis Ag+ ion i løsning. Testen bør være negativ (ingen ekstra AgCl bundfald bør danne).
    4. Centrifugeres reaktionsblanding ved 3,220 x g i 10 min. og fjern den hvide bundfald af AgCl.
    5. Indsamle supernatanten og filtrere det via et 0,2 mm sprøjte filter. Teste supernatanten for tilstedeværelsen af platinum ved at anvende 2-3 dråber af løsning via Pasteur pipette SnCl2 krystaller. Testen er positiv, hvis koordinere kompleks af tin med platin farve er mørk gul/orange.
    6. Bruge supernatanten med aktiveret Pt(II) for andet trin.
  2. Reaktion af oliesyre med aktiveret Pt(II)
    1. Suspendere 94,2 mg af oliesyre (0.333 mmol) i 3 mL vand ved 60 ° C.
    2. Tilføje 13,3 mg (0.333 mmol) NaOH i 1 mL vand og blandes med løsning af aktiverede Pt(II) fra trin 1.1
    3. Rør reaktion i 2 timer ved 60 ° C og næste ved rumtemperatur natten over. Den rå vare er en fedtet brun/gul bundfald.
    4. Centrifugeres reaktionsblanding ved 3,220 x g i 10 min. og Fjern supernatanten. Tør den rå vare ved 25 ° C ved hjælp af en rotationsfordamper. Rense produktet af flere vasker med acetonitril. Den endelige farve af ren oliesyre acids–Pt(II) konjugat er bleg gul.

2. Sammenfatning af KYF-Pt-NE, og den FITC-mærket Nanoemulsion FITC-KYF-Pt-NE

  1. Syntese af KYF tripeptid og den fluorescently mærket tripeptid FITC-KYF
    1. Syntetisere KYF ved hjælp af standard solid-state peptid kemi. Brug de følgende standard kobling betingelser til at knytte hver aminosyre: Wang harpiks (2.19 mmol), Fmoc beskyttet aminosyre (4,38 mmol), 2-(1H-Benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethylaminium tetrafluoroborate (TBTU) (4,38 mmol) og diisopropylethylamine (DIPEA) (8.76 mmol). Opløse aminosyrer med TBTU i dimethylformamid (DMF) og DIPEA.
    2. Sættetid 5,7 g af Fmoc-L-Phe 4-alkoxybenzyl alkohol harpiks (0,382 meq/g) i 25 mL DMF for 1 h før brug.
    3. Deprotect Amin gruppe af L-phenylalanin aminosyre med 15 mL 20% Piperidin/DMF løsning for 5 min, kassere opløsningsmidlet og Gentag vask med 20 min cyklus.
    4. Vaske resin til 1 min med følgende opløsningsmidler: DMF, isopropylalkohol (IPA), DMF, IPA, DMF, IPA, DMF, DMF. Kassér opløsningsmidlet efter hver vask.
    5. Udføre Kaiser test for at afgøre tilstedeværelsen af gratis NH2 gruppe på harpiks (Se undertrin) og hvis positive (harpiks frø er lilla), tilføje aminosyre Fmoc-L-tyrosin og udføre koblingen natten over.
      1. Forberede Kaiser test-opløsninger i separate flasker.
      2. Opløses 5 g af ninhydrin i 100 mL ethanol.
      3. 80 g fenol i 20 mL ethanol opløses.
      4. 2 ml af 0,001 M vandig opløsning af kalium cyanid med
        98 mL af pyridin.
      5. Tilføje 2-3 dråber af hver Kaiser teste løsninger til prøven og varmen i kogende vand i 5 min.
    6. Efter vellykket kobling af anden aminosyre, udføre Kaiser test og hvis negativ fortsætte med deprotection protokol (trin 2.1.3 til 2.1.5). Gentag processen med Fmoc-phenylalanin aminosyre.
      1. Ved kobling af alle aminosyrer, vaske resin til 1 min med 5 mL DMF, IPA, DMF, methanol, dichlormethan og diethylether, efter hver vask kassere opløsningsmidlet. Gemme harpiks til videreforarbejdning.
      2. Bruge halvdelen af harpiks for de næste skridt (2.1.7-2.1.9) til at ændre peptid med FITC. For at opnå umodificeret KYF tripeptid, skal du følge proceduren startende 2.1.10.
    7. Ændre den N-terminale aminosyre af KYF KYF-N3 med 6-azidohexanoic syre. Med henblik herpå, blandes 1 g (0,382 mmol) af KYF Wang harpiks og 120.1 mg (0.764 mmol) af 6-azidohexanoic syre med 245,2 mg (0.764 mmol) af TBTU og 197.1 mg (1.528 mmol) af DIPEA i 30 mL DMF. Rør reaktionen natten over ved stuetemperatur.
    8. Få KYF-FITC fra syntesen af KYF-N3 med propargyl fluorescein via et klik reaktion. Med henblik herpå, bland 253 mg (0,097 mmol) af KYF-N3 Wang harpiks med 3.78 mg (0.019 mmol) af CuI solid, 71.9 mg (0.193 mmol) af propargyl fluorescein og 2,24 mg (0,017 mmol) af DIPEA. Reaktionen skal skifte farve fra grøn til brun.
    9. Efter 24 timer, vask resin til 1 min skiftevis med 5 mL DMF og IPA fem gange, methanol og vand tre gange, DMF og vand tre gange, og med dichlormethan og diethylether tre gange. Kassér opløsningsmidlet efter hver vask.
    10. Kløver KYF-FITC eller KYF peptid fra harpiks med en opløsning af trifluoreddikesyre (TFA) / triisopropylsilane (TIPS) h2O på forholdet mellem 95/2.5/2.5 over 3 timer.
    11. Udfælde den rå peptid i en kold diethylether, vaskes tre gange med koldt ether, og derefter tørre under vakuum.
  2. Syntese af FITC-KYF-stabiliseret nanoemulsion med Pt(II) (FITC-KYF-Pt-NE) og KYF-Pt-NE
    1. 10 mg (0.0126 mmol) opløses af oliesyre acids–Pt(II) konjugat i 1,5 mL isopropanol og sted i en 5 mL sprøjte.
    2. Placere sprøjte med oliesyre acids–Pt(II) konjugat i en sprøjten pumpe og angive strømmen til 0,1 mL/min.
    3. For at syntetisere FITC-KYF-Pt-NE, opløse 1 mg (0.00105 mmol) af FITC-KYF og 1 mg (0.00219 mmol) af KYF (1:2 molære forhold af FITC-KYF:KYF) i 20 mL vand og justere temperaturen af løsningen ved 37 ° C. Dække væggene i beholderen med aluminiumsfolie at undgå photobleaching af FITC-fluorophore. For at syntetisere KYF-Pt-NE, 2 mg (0.0044 mmol) opløses af KYF tripeptid i 20 mL vand og justere temperaturen af løsningen ved 37 ° C.
    4. Tilføje oliesyre acids–Pt(II) konjugat dråbevis til opløsningen af FITC-KYF/KYF eller KYF tripeptid. Udføre dette trin under kølerhjelmen.
    5. Opløsningen omrøres natten over ved stuetemperatur til at fordampe organiske opløsningsmidler og lade den samlesæt af FITC-KYF-Pt-NE eller KYF-Pt-NE.
    6. Koncentrere FITC-KYF-Pt-NE eller KYF-Pt-NE i en centrifugal koncentrator (10k MWCO), og vaskes tre gange med 4 mL af nanopure vand.
    7. Gemme de vandige opløsninger af KYF-Pt-NE og FITC-KYF-Pt-NE ved 4 ° C.
    8. Analysere for platin indhold ved hjælp af atomic absorption spektroskopi (AAS), efter producentens guide48.
      1. Forberede platin standarder i 10% HCl løsning for kalibreringskurven (effektiv rækkevidde for AAS er mellem 100 til 1.200 ppb (milliardtedele)).
      2. Opløses 50 µL af KYF-Pt-NE løsning fra trin 2.2 i 100 µL af aqua regia (en blanding 3:1 af koncentreret saltsyre og salpetersyre) og lad ved rumtemperatur natten over. Tilføje 850 µL vand for at nå frem til en afsluttende prøve volumen på 1 mL. Analysere eksemplet bruger AAS. Den endelige syre koncentration skal være 10% i alle analyserede prøver.
      3. Læsning af Pt koncentration i ppb, og beregne det endelige platin indhold i prøven (konto for prøveopløsning og første bind af nanoemulsion).

3. Konfokal billeddannelse af den cellulære optagelse af FITC-KYF-Pt-NE

  1. Seed 6 kræft i æggestokkene cellelinjer (A2780, CP70, SKOV3, OV90, TOV21G og ES2), i 4 godt-kammer Konfokal retter med tæthed på 4,7 x 104 celler pr. kammer, og pre kultur natten over ved 37 ° C.
  2. Efter 24 h, cellerne vaskes tre gange med fosfat buffer saltvand (PBS), og der inkuberes med FITC-KYF-Pt-NE i cellekulturmedium (Se trin 6.1 for celle linje specifikke detaljer) i 15 min. ved 37 ° C.
  3. Efter inkubering fjerner mediet og cellerne vaskes tre gange med PBS.
  4. Fix cellerne med kolde methanol i 5 min ved-20 ° C og vaskes tre gange med 1 mL PBS.
  5. Permeabilize celler med 1 mL 0,1% Triton-X til 10 min. ved stuetemperatur og vaskes tre gange med 1 mL PBS.
  6. Inkuber celler i 90 min. med LAMP1 antistof konjugeret med Alexa Fluor 647 (1 mL) på 1:50 fortynding i PBS ved stuetemperatur. Næste, vaske cellerne 3 gange med PBS.
  7. Fortynd DAPI stamopløsning (1 mg/mL) til 1 mg/mL i PBS. Derefter tilsættes 1 mL af det fortyndede opløsning til hver afdeling og Inkuber i 15 min ved stuetemperatur. Vaske cellerne 3 gange med PBS.
  8. Montere coverslips på et dias ved hjælp af montering medium.
  9. Billede celler ved hjælp af levende celle Konfokal mikroskop ved excitation bølgelængde på 405 nm, 488 nm og 633 nm. Påvisning parametre er angivet som følger: laser power fra 0,2% og ikke mere end 1%, Pinole 1 luftige enhed, få master 650-750, Digital forskydningen 0.
  10. Åbn billede i imaging software. Vælg grafik under viste billede, og vælg Indsæt skalalinjen, indsætte skalalinjen til billedet.

4. lægemidlet Release undersøgelser

  1. Foretage drug release undersøgelser i PBS. Juster pH-værdier af tre PBS buffere til 7.4, 6,8 og 5.0 henholdsvis.
  2. Fortynd 5 μl af KYF-Pt-NE i 180 μL af passende pH PBS buffer, overføre til 3,5 kDa MWCO mini dialyse cup og der inkuberes ved 37 ° C i PBS.
  3. Fjerne buffer fra hver tre mini dialyse rør 2, 4, 6, 24, 48 og 140 timer, og måle de platin koncentrationer af AAS. Forberede alle prøverne efter trin 2.2.8 men justere det endelige rumfang af prøven til 500 µL.

5. celle kultur metoder

  1. Kultur celle linjer A2780, CP70, SKOV-3, OV-90, TOV - 21G, ES-2 i cellekulturmedium (DMEM) suppleret med 10% (A2780, CP70, SKOV-3, ES-2) eller 15% (TOV - 21G, OV-90) føtal bovint serum (FBS), med L-glutamin og penicillin/streptomycin. Vokse alle celler i en 5% CO2, vand mættet atmosfære ved 37 ° C.
  2. Frø 3 x 105 celler i hver 96-brønd plade og pre kultur natten til in vitro-inkubation eksperimenter. Forberede KYF-Pt-NE, cisplatin og carboplatin løsningerne i vand. Justere koncentrationen af Pt(II) i KYF-Pt-NE til at matche koncentrationen af carboplatin og cisplatin til hver cellelinje. Der inkuberes i 72 timer ved 37 ° C.
  3. Efter inkubationen evaluere cellulære levedygtighed ved hjælp af en kolorimetrisk assay (MTT celleproliferation analysen). Kort, fjerne medium og tilføje 110 μl af 10% MTT i medium til hver godt og Inkuber i 2 timer ved 37 ° C. Derefter tilsættes 100 μL vaskemiddel til hver brønd og Inkuber i 5 timer ved 37 ° C.
  4. Kontrollere absorbans ved 570 nm ved hjælp af pladelæseren. Analysere resultater ved hjælp af statistisk analyse med Z-test og P-test.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Repræsentant TEM billede af KYF-Pt-NE udarbejdet ved hjælp af denne protokol er vist i figur 2A. KYF-Pt-NEs er sfærisk i morfologi, godt spredt, og ensartede i størrelse. Kerne diameter af KYF-Pt-NEs, målt direkte fra tre TEM billeder med et minimum af 200 målinger udført, er 107 ± 27 nm. Den hydrodynamiske diameter af KYF-Pt-NE, analyseret ved hjælp af dynamiske lys spektroskopi (DLS), fandtes for at være 240 nm med en polydispersity indeks af 0.156. Zeta potentiale af KYF-Pt-NE i vand blev fastsat for tre uafhængige sammenstillinger med den gennemsnitlige værdi af-60.1 mV. Høj omfanget af potentielle angiver god kolloid stabilitet af formuleringen, og den negative overflade ladning tilskrives ioniseret COO- overflade grupper af oliesyre syrer. Det isoelektriske punkt KYF er 8.59, og derfor er det positivt ladede på neutral pH.

Nanoemulsions evne til at krydse den cellulære membran blev undersøgt ved hjælp af fluorescently mærket FITC-KYF-Pt-NE og ovarie cancer cellelinjer. Resultaterne præsenteres i figur 2B. Det kan tydeligt ses, at FITC-KYF-Pt-NEs (grøn) er fordelt i cytosol men endnu ikke var forbundet med lysosomer (rød). Dette resultat viser, at KYF-Pt-NEs angive celler og kan tjene som intracellulære drug levering køretøj.

KYF-Pt-NEs og FITC-KYF-Pt-NEs stabilitet blev vurderet med DLS. Diameteren af nanoemulsions i vand blev målt flere måneder og resultaterne præsenteres i fig. 3. Den hydrodynamiske diameter af begge formuleringer langsomt steg i 4 måneder i opbevaring, til 320 nm (KYF-Pt-NE) og 240 nm (FITC-KYF-Pt-NE), men nanoskala dimensionerne blev bevaret. Dette resultat tyder på, at KYF tripeptid effektivt stabiliserer nanoemulsions over lange perioder.

Pt(II) indkapsling effektivitet og overgang fra nanoemulsion blev målt med AAS. Koncentrationen af Pt(II) i KYF-Pt-NE blev etableret for at være 10 wt.%. Pt(II) frigivelse fra KYF-Pt-NE på pH 7,4 (fysiologiske), 6.8 (tumor interstitium)49og 5.0 (endosomal)50 er præsenteret i figur 4A. Pt(II) version er den langsomste ved pH 7,4 med kun 20,8% af Pt(II) udgivet efter 4 h, mens pH-værdi på 6,8 og 5.0 udgivelsen var 32.8 af og 47,5%, henholdsvis. Den samme tendens fortsatte efter 24 timer og 6 dage. Dette resultat angiver, at Pt(II) frigivelse fra KYF-Pt-NE er pH afhængig, og det kan forsinkes i systemisk cirkulation, og fremskyndet når nanoemulsions translocate i tumor.

Den biologiske aktivitet i KYF-Pt-NE blev etableret i vitro ved hjælp af de samme æggestokkræft cellelinjer som de billeddiagnostiske undersøgelser. Cellerne blev inkuberet med KYF-Pt-NE i 72 timer ved KYF-Pt-NE koncentration svarer til IC50 for hver cellelinje. Levedygtighed blev vurderet ved hjælp af MTT analysen og resultaterne blev sammenlignet med kun celler, KYF-NE, oliesyre acids-Pt(II) konjugat, carboplatin og cisplatin. Resultaterne af biologisk aktivitet af KYF-Pt-NE er vist i figur 4B. KYF-Pt-NE reduceret levedygtighed isogene cellelinjer A2780 (Pt følsomme) og CP70 (Pt resistente) af 44,3% og 46,2% henholdsvis. Carboplatin, klinisk relevante analog, faldt rentabiliteten af 18,5% (A2780) og 9,6% (CP70) kun. Den samme tendens til større KYF-Pt-NE effekt på celledød blev observeret på tværs af andre cellelinjer. Levedygtigheden af Pt(II) følsomme TOV - 21G celler blev reduceret med 55.9% efter inkubation med KYF-Pt-NE, mens carboplatin resulteret i sænkning levedygtigheden af bare 16,5%. I OV-90 celler med mellemliggende Pt(II) modstand, blev levedygtighed sænket af 55.3 (KYF-Pt-NE) og 23,9% (carboplatin). De to resistente kræft cellelinjer, ES-2 og SKOV-3, viste reduktion i levedygtighed af 45,9% og 54,3%, henholdsvis for KYF-Pt-NE, og 10,3% (ES-2) og 16,8% (SKOV-3) for carboplatin.

Den biologiske aktivitet i KYF-Pt-NE versus cisplatin blev også sammenlignet. Cisplatin er Pt II-baseret agent for første generation, der er ikke længere foretrukket i klinikken på grund af dens toksicitet profil51. I to cellelinjer, SKOV-3 og TOV - 21G, blev levedygtighed reduktion øget med 15% og 40%, henholdsvis for KYF-Pt-NE end for cisplatin. I de resterende cellelinjer, aktiviteten af KYF-Pt-NE var sammenlignelig med cisplatin (A2780, CP70, OV-90), eller lavere lidt (ES-2). Oliesyre acids-Pt(II) konjugat fandtes også for at være biologisk aktive. KYF-Pt-NE viste imidlertid højere reduktion i bæredygtighed end konjugation i størstedelen af de cellelinjer, testet, der angiver betydningen af nanoformulation i Pt(II) aktivitet.

De biologiske anvendelser af nanoparticulate systemer kræver stabilitet i biologisk relevante medier, dermed stabiliteten af KYF-Pt-NE blev evalueret i 20% føtal bovint serum (FBS) og resultaterne præsenteres i fig. 4 c. Vi fundet ingen beviser af KYF-Pt-NE hjælp i serum efter en dag med inkubation.

Figure 1
Figur 1. Komponenter i nanoemulsions (øverst) og skematisk af nanoemulsion forberedelse (nederst). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2. TEM billede af KYF-Pt-NE (A) og konfokal mikroskop billeder af FITC-KYF-Pt-NE (grøn) udbredelsen af kræft i æggestokkene celler (kerner er blå og lysosomer er rød) (B). Skala barer er 10 μm. Dette tal er blevet tilpasset med tilladelse fra Bioconjugate kemi 2018, 29, 2514-2519. 46 copyright 2018 American Chemical Society. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3. Stabilitet af KYF-Pt-NE og FITC-KYF-Pt-NE i vand. Hvert punkt repræsenterer middelværdien og standardafvigelsen for N = 3 og p <0,005. Dette tal er blevet tilpasset med tilladelse fra Bioconjugate kemi 2018, 29, 2514-2519. 46 copyright 2018 American Chemical Society. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4. KYF-Pt-NE stabilitet og biologiske aktivitet. (A) Pt(II) frigivelse fra KYF-Pt-NE i PBS buffer på forskellige pHs (PBS, 37 ° C). Cellulære levedygtighed af forskellige æggestokkræft cellelinjer efter 72 h inkubation med KYF-Pt-NE (B). Hver kolonne repræsenterer middelværdien og standardafvigelsen for N = 3 og p <0,005. Koncentrationerne er konstante i hver cellelinje og er som følger: 4.92 mM (A2780), 8,80 mM (CP70), 2,46 mM TOV - 21G, 9,84 mM (SKOV3), 7.38 mM (ES-2), 19,7 mM (OV-90). Koncentrationen af KYF-Pt-NE og oliesyre acids–Pt(II) konjugat blev justeret for Pt(II) indhold målt ved AAS. Forkortelser: "Carbpt" – carboplatin; "KYF-NE" – KYF tripeptid-belagt nanoemulsion; "KYF-Pt-NE" – KYF tripeptid-belagt nanoemulsion indeholdende Pt(II); Cispt – cisplatin; PT-oliesyre – oliesyre acids–Pt(II) konjugat. (C) KYF-Pt-NE stabilitet i serum. Dette tal er blevet tilpasset med tilladelse fra Bioconjugate kemi 2018, 29, 2514-2519. 46 copyright 2018 American Chemical Society. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Kritiske trin i nanoemulsion syntese omfatter justering kindtand forholdet mellem substraterne, vedligeholdelse temperatur og flow sats kontrol under oliesyre acids–Pt(II) tilsætning, giver tilstrækkelig tid til samlesæt og rensning af produktet ved hjælp af en centrifugal koncentrator kolonne. Disse parametre påvirke størrelse og morfologi af KYF-Pt-NE; således er det især vigtigt at fastholde de rette molære forhold og justere de syntetiske betingelser korrekt.

Forholdet mellem substrater under nanoemulsion syntese (trin 3) er afgørende for den samlesæt proces og bestemmer den endelige størrelse af produktet. KYF til oliesyre acid-Pt(II) kindtand forholdet er 1:3, og den optimale koncentration af KYF tripepide i vand er 0,2 mM. Derudover har den organisk opløsningsmiddel, der anvendes til at opløse oliesyre acid-Pt(II) konjugat i trin 3.1 være blandbart med vand, kompatibel med filtreringssystem, og fordampning nemt ved stuetemperatur.

Et af de kritiske trin er dråbevis tilføjelsen af oliesyre acid-Pt(II) konjugat til KYF løsning (trin 3,4). Strømmen skal ikke være langsommere end 0,1 mL/min og ikke hurtigere end 0,2 mL/min., fordi en sub-optimale hastighed kan fremkalde udfældning af nanoemulsion. Også, oliesyre acids–Pt(II) konjugat bør føjes til KYF løsning ved 37 ° C under omrøring blandingen på en røre pladen på 600 rpm. Når alle de oliesyre acid-Pt(II) er blevet tilføjet, skal at opløsningen opbevares ved stuetemperatur og omrøring hastigheden reduceret til 150 rpm. Trin 3.5 bør udføres ved stuetemperatur. Det optimale tidspunkt for den samlesæt af KYF-Pt-NE (trin 3.5) er 24 timer.

Der er en risiko for, at produktet kan udfældes mens nanoemulsion er at blive pre koncentreret. Det anbefales derfor, at nanoemulsion være fortyndet med ekstra vand før der centrifugeres i en centrifugal koncentrator og spundet ikke er hurtigere end 2,465 x g. Den fortyndede nanoemulsions skal føjes til den centrifugale koncentrator på alikvoter mellem spins, og at nanoemulsion bør blandes i filteret, før den næste portion er tilføjet.

Evnen til at form nanoemulsions med fedtsyrer derivater end oliesyre er ikke blevet testet og er endnu fastlagt. Fremtidige ansøgninger kan omfatte brug af forskellige peptider til at lette fælles forsamling med oliesyre. Oliesyre konjugater med platin-baserede lægemidler kan også bruges som potentielle kerner af nanoemulsions.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke et interessekonflikt til at videregive.

Acknowledgments

Vi taknemmeligt anerkender støtte fra National Cancer Institute, give SC2CA206194. Ingen konkurrerende finansielle interesser er erklæret.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-(1H-benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium
tetrafluoroborate (TBTU)		 ANASPEC INC.: AS-20376 SPPS
4-well chamber confocal dish Lab-Tek II, Thermo Fisher Scientific 154526 For imaging
6-bromohexanoic acid Chem-Impex INT’L INC. 24477 Click modification for peptide
A2780 Generously doanted by professor John Martignetti from The Mount Sinai Hospital Ovarian cancer cell line
Barnstead Nanopure Thermo Fisher D11901 water filtration system
BUCHI rotavapor R-3 Buchi Z568090 For solvent removal and sample drying
Centrifuge 5810 R eppendorf 5811F For platinum complex separation
Cis-dichlorodiamineplatinum (II) 99% Acros Organics 19376-0050 in vitro tests
CP70 Generously doanted by professor John Martignetti from The Mount Sinai Hospital Ovarian cancer cell line
Digital water bath VWR 97025-134 For warming up media for cell culture
Dynamic Light Scattering (DLS) Brookhaven Instrument Corporation For nanoparticle size measurments
ES-2 ATCC CRL-1978 ovarian cancer cell line
Fmoc-L-Lys(Boc)-OH 99.79% Chem-Impex INT’L INC. 00493 SPPS
Fmoc-L-Phe 4-alkoxybenzyl alcohol resin (0.382 meq/g), Chem-Impex INT’L INC. 01914 SPPS
Fmoc-LTyr(tBu)-OH 98% Alfa Aesar H59730 SPPS
HERACELL 150i CO2 incubator Thermo Scientific Fisher incubator
High pressure syringe pump New Era 1010-US For platinum complex addition in nanoparticle synthesis
Hotplate/stirrer VWR 12365-382 For sample stirring and heating
LAMP-1 Antibody(cojugated with Alexa Fluor 647) Santa Cruz Biotechnology sc-18821 AF647 For imaging
N,N-diisopropylethylamine (DIPEA) Oakwood Chemical 005027 SPPS
Ninhydrin 99% Alfa Aesar A10409 Kaiser test
Oleic acid Chem-Impex INT’L INC. 01421 For platinum complex synthesis
OV90 ATCC CRL-11732 Ovarian cancer cell line
PBS Corning 21-031-CV For cell wash
Permount mounting medium Fisher Chemical SP15-100 For imaging
Phenol Fisher Chemical A92500 Kaiser test
Phosphotungstic acid Fisher Chemical A248-25 negative stain for TEM
Piperidine 99% BTC 219260-2.5L SPPS
Platinum AAS standard soultion Alfa Aesar 88086 1000ug/ml for calibration curve
Propargyl bromide 97% Alfa Aesar L10595 For alkyne modification of fluoresceine
Scientific biological cabinet Thermo Scientific Fisher 1385 Bio-hood for cell culture
Self-Cleaning Vacuum System Welch 2028 Vacuum pump for rotavapor
Silver nitrate Acros Organics 19768-0250 Cisplatin activation
SKOV3 ATCC HTB-77 Ovarian cancer cell line
Sodium hydroxide Fisher Scientific S313-1 For platinum complex synthesis
Tin (II) chloride Sigma Aldrich 208256 Test for Platinum presence
TOV21G ATCC CRL-11730 Ovarian cancer cell line
Trifluoroacetic acid 99% (TFA) Alfa Aesar L06374 SPPS
Triisopropylsilane (TIPS) Chem-Impex INT’L INC. 01966 SPPS
Triton-X Sigma Aldrich T8787-100ML For imaging
Uranine powder 40% Fisher Scientific S25328A For alkyne modification of fluoresceine
Vivaspin 20 (10000 MWCO) Sartorious VS2001 For Nanoparticle wash and condensation
VWR Inverted Microscope VWR 89404-462 For cell culture monitoring

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Agrahari, V., Agrahari, V., Mitra, A. K. Nanocarrier fabrication and macromolecule drug delivery: challenges and opportunities. Therapeutic Delivery. 7 (4), 257-278 (2016).
  2. Anselmo, A. C., Mitragotri, S. Nanoparticles in the clinic. Bioengineering & Translational Medicine. 1 (1), 10-29 (2016).
  3. Peer, D., Karp, J. M., Hong, S., Farokhzad, O. C., Margalit, R., Langer, R. Nanocarriers as an emerging platform for cancer therapy. Nature Nanotechnology. 2 (12), 751-760 (2007).
  4. Roy Chowdhury, M., Schumann, C., Bhakta-Guha, D., Guha, G. Cancer nanotheranostics: Strategies, promises and impediments. Biomedicine & Pharmacotherapy. 84, 291-304 (2016).
  5. Jeevanandam, J., Chan, Y. S., Danquah, M. K. Nano-formulations of drugs: Recent developments, impact and challenges. Biochimie. , 99-112 (2016).
  6. Meerum Terwogt, J. M., Groenewegen, G., Pluim, D., Maliepaard, M., Tibben, M. M., Huisman, A., ten Bokkel Huinink, W. W., Schot, M., Welbank, H., Voest, E. E., Beijnen, J. H., Schellens, J. M. Phase I and pharmacokinetic study of SPI-77, a liposomal encapsulated dosage form of cisplatin. Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 49 (3), 201-210 (2002).
  7. Fan, Z., Sun, L., Huang, Y., Wang, Y., Zhang, M. Bioinspired fluorescent dipeptide nanoparticles for targeted cancer cell imaging and real-time monitoring of drug release. Nature Nanotechnology. 11 (4), 388-394 (2016).
  8. Jeong, Y., et al. Enzymatically degradable temperature-sensitive polypeptide as a new in-situ gelling biomaterial. Journal of Controlled Release. 137 (1), 25-30 (2009).
  9. Uesaka, A., et al. Morphology control between twisted ribbon, helical ribbon, and nanotube self-assemblies with his-containing helical peptides in response to pH change. Langmuir. 30 (4), 1022-1028 (2014).
  10. Hwang, W., Marini, D. M., Kamm, R. D., Zhang, S. Supramolecular structure of helical ribbons self-assembled from a B-sheet peptide. Journal of Chemical Physics. 118 (1), 389-397 (2003).
  11. Svobodova, J., et al. Poly(amino acid)-based fibrous scaffolds modified with surface-pendant peptides for cartilage tissue engineering. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 11 (3), 831-842 (2017).
  12. Kumar, V. A., et al. Highly angiogenic peptide nanofibers. ACS Nano. 9 (1), 860-868 (2015).
  13. Romera, D., Couleaud, P., Mejias, S. H., Aires, A., Cortajarena, A. L. Biomolecular templating of functional hybrid nanostructures using repeat protein scaffolds. Biochemical Society Transactions. 43 (5), 825-831 (2015).
  14. Medina, S. H., Schneider, J. P. Cancer cell surface induced peptide folding allows intracellular translocation of drug. Journal of Controlled Release. 209, 317-326 (2015).
  15. Recio, C., Maione, F., Iqbal, A. J., Mascolo, N., De Feo, V. The Potential Therapeutic Application of Peptides and Peptidomimetics in Cardiovascular Disease. Frontiers in Pharmacology. 7, 526 (2016).
  16. McCarthy, K. A., et al. Phage Display of Dynamic Covalent Binding Motifs Enables Facile Development of Targeted Antibiotics. Journal of the American Chemical Society. 140 (19), 6137-6145 (2018).
  17. Lazar, V., et al. Antibiotic-resistant bacteria show widespread collateral sensitivity to antimicrobial peptides. Nature Microbiology. 3 (6), 718-731 (2018).
  18. Czeczor, J. K., McGee, S. L. Emerging roles for the amyloid precursor protein and derived peptides in the regulation of cellular and systemic metabolism. Journal of Neuroendocrinology. 29 (5), (2017).
  19. Branco, M. C., Sigano, D. M., Schneider, J. P. Materials from peptide assembly: towards the treatment of cancer and transmittable disease. Current Opinion in Chemical Biology. 15 (3), 427-434 (2011).
  20. Cheetham, A. G., et al. Targeting Tumors with Small Molecule Peptides. Current Cancer Drug Targets. 16 (6), 489-508 (2016).
  21. Ndinguri, M. W., Solipuram, R., Gambrell, R. P., Aggarwal, S., Hammer, R. P. Peptide targeting of platinum anti-cancer drugs. Bioconjugate Chemistry. 20 (10), 1869-1878 (2009).
  22. Eskandari, S., Guerin, T., Toth, I., Stephenson, R. J. Recent advances in self-assembled peptides: Implications for targeted drug delivery and vaccine engineering. Advanced Drug Delivery Reviews. 110, 169-187 (2017).
  23. Zhou, J., Du, X., Yamagata, N., Xu, B. Enzyme-Instructed Self-Assembly of Small D-Peptides as a Multiple-Step Process for Selectively Killing Cancer Cells. Journal of the American Chemical Society. 138 (11), 3813-3823 (2016).
  24. Sun, J. E., et al. Sustained release of active chemotherapeutics from injectable-solid beta-hairpin peptide hydrogel. Biomaterials Science. 4 (5), 839-848 (2016).
  25. Lock, L. L., Reyes, C. D., Zhang, P., Cui, H. Tuning Cellular Uptake of Molecular Probes by Rational Design of Their Assembly into Supramolecular Nanoprobes. Journal of the American Chemical Society. 138 (10), 3533-3540 (2016).
  26. Kalafatovic, D., Nobis, M., Son, J., Anderson, K. I., Ulijn, R. V. MMP-9 triggered self-assembly of doxorubicin nanofiber depots halts tumor growth. Biomaterials. 98, 192-202 (2016).
  27. Frederix, P. W., et al. Exploring the sequence space for (tri-)peptide self-assembly to design and discover new hydrogels. Nature Chemistry. 7 (1), 30-37 (2015).
  28. Horsley, J. R., et al. Photoswitchable peptide-based 'on-off' biosensor for electrochemical detection and control of protein-protein interactions. Biosensors and Bioelectronics. 118, 188-194 (2018).
  29. Hoyos-Nogues, M., Gil, F. J., Mas-Moruno, C. Antimicrobial Peptides: Powerful Biorecognition Elements to Detect Bacteria in Biosensing Technologies. Molecules. 23 (7), 1683 (2018).
  30. Xiao, X., et al. Advancing Peptide-Based Biorecognition Elements for Biosensors Using in-Silico Evolution. ACS Sensors. 3 (5), 1024-1031 (2018).
  31. Puiu, M., Bala, C. Peptide-based biosensors: From self-assembled interfaces to molecular probes in electrochemical assays. Bioelectrochemistry. 120, 66-75 (2018).
  32. Wang, J., et al. Developing a capillary electrophoresis based method for dynamically monitoring enzyme cleavage activity using quantum dots-peptide assembly. Electrophoresis. 38 (19), 2530-2535 (2017).
  33. Etayash, H., Thundat, T., Kaur, K. Bacterial Detection Using Peptide-Based Platform and Impedance Spectroscopy. Methods in Molecular Biology. 1572, 113-124 (2017).
  34. Handelman, A., Apter, B., Shostak, T., Rosenman, G. Peptide Optical waveguides. Journal of Peptide Science. 23 (2), 95-103 (2017).
  35. Chen, C., Liu, K., Li, J., Yan, X. Functional architectures based on self-assembly of bio-inspired dipeptides: Structure modulation and its photoelectronic applications. Advances in Colloid and Interface Science. 225, 177-193 (2015).
  36. Reddy, S. M., Shanmugam, G. Role of Intramolecular Aromatic pi-pi Interactions in the Self-Assembly of Di-l-Phenylalanine Dipeptide Driven by Intermolecular Interactions: Effect of Alanine Substitution. Chemphyschem. 17 (18), 2897-2907 (2016).
  37. Marchesan, S., et al. Unzipping the role of chirality in nanoscale self-assembly of tripeptide hydrogels. Nanoscale. 4 (21), 6752-6760 (2012).
  38. Scott, G. G., McKnight, P. J., Tuttle, T., Ulijn, R. V. Tripeptide Emulsifiers. Advanced Materials. 28 (7), 1381-1386 (2016).
  39. Galanski, M., Jakupec, M. A., Keppler, B. K. Update of the preclinical situation of anticancer platinum complexes: novel design strategies and innovative analytical approaches. Current Medicinal Chemistry. 12 (18), 2075-2094 (2005).
  40. Wheate, N. J., Walker, S., Craig, G. E., Oun, R. The status of platinum anticancer drugs in the clinic and in clinical trials. Dalton Transactions. 39 (35), 8113-8127 (2010).
  41. Oberoi, H. S., Nukolova, N. V., Kabanov, A. V., Bronich, T. K. Nanocarriers for delivery of platinum anticancer drugs. Advanced Drug Delivery Reviews. 65 (13-14), 1667-1685 (2013).
  42. Fichtinger-Schepman, A. M., van Oosterom, A. T., Lohman, P. H., Berends, F. cis-Diamminedichloroplatinum(II)-induced DNA adducts in peripheral leukocytes from seven cancer patients: quantitative immunochemical detection of the adduct induction and removal after a single dose of cis-diamminedichloroplatinum(II). Cancer Research. 47 (11), 3000-3004 (1987).
  43. Englander, E. W. DNA damage response in peripheral nervous system: coping with cancer therapy-induced DNA lesions. DNA Repair. 12 (8), 685-690 (2013).
  44. Galluzzi, L., et al. Molecular mechanisms of cisplatin resistance. Oncogene. 31 (15), 1869-1883 (2012).
  45. Boeckman, H. J., Trego, K. S., Turchi, J. J. Cisplatin sensitizes cancer cells to ionizing radiation via inhibition of nonhomologous end joining. Molecular Cancer Research. 3 (5), 277-285 (2005).
  46. Dragulska, S. A., et al. Tripeptide-Stabilized Oil-in-Water Nanoemulsion of an Oleic Acids-Platinum(II) Conjugate as an Anticancer Nanomedicine. Bioconjugate Chemistry. 29 (8), 2514-2519 (2018).
  47. Martinez Rivas,, J, C., et al. Nanoprecipitation process: From encapsulation to drug delivery. International Journal of Pharmaceutics. 532 (1), 66-81 (2017).
  48. Agilent Technologies. Analytical Methods for Graphite Tube Atomizers, User's Guide Manual, 8th edition. , (2012).
  49. Park, S. Y., et al. A smart polysaccharide/drug conjugate for photodynamic therapy. Angewandte Chemie. 50 (7), 1644-1647 (2011).
  50. Canton, I., Battaglia, G. Endocytosis at the nanoscale. Chemical Society Reviews. 41 (7), 2718-2739 (2012).
  51. Lokich, J., Anderson, N. Carboplatin versus cisplatin in solid tumors: an analysis of the literature. Annals of Oncology. 9 (1), 13-21 (1998).

Tags

Bioteknologi spørgsmålet 144 Nanoemulsion oliesyre tripeptid anticancer behandling biologiske imaging medicinafgivelse
Et tripeptid-stabiliseret Nanoemulsion af oliesyre
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dragulska, S. A., Wlodarczyk, M. T., … More

Dragulska, S. A., Wlodarczyk, M. T., Poursharifi, M., Martignetti, J. A., Mieszawska, A. J. A Tripeptide-Stabilized Nanoemulsion of Oleic Acid. J. Vis. Exp. (144), e59034, doi:10.3791/59034 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter