Summary
このプロトコルでは、リジン ・ チロシン ・ フェニルアラニン (KYF) トリペプチドで安定したオレイン酸 acids-platinum(II) 共役のナノエマルションを合成するための効率的な方法について説明します。穏やかな条件合成を介しての自己集合、KYF と共役ナノエマルション フォーム。
Abstract
オレイン酸 acids-Pt(II) コアとリジン-チロシン ・ フェニルアラニン (KYF) コーティング (KYF Pt NE) から成るナノエマルションを生成する方法について述べる。KYF Pt NE は、107 ± 27 nm と負の表面電荷の直径を有する 10 重量 % で Pt(II) をカプセル化します。KYF Pt NE は安定した水と、血清と生物学的活性します。KYF に fluorophore の活用により生体イメージングに適した蛍光ナノエマルションの合成ができます。水溶液環境と短い KYF ペプチドおよびオレイン酸 acids-platinum(II) 共役の自己集合による KYF Pt NE フォームで、ナノエマルションの合成を行います。自己組織化プロセスは、ソリューションの温度、基板のモル比と基質添加の流量に依存します。重要なステップは、合成の際に最適な撹拌速度を維持し、自己組織化のための十分な時間を許可する、ナノエマルションを遠心濃縮器に徐々 に集中して事前に含まれます。
Introduction
近年では、ナノ粒子ドラッグデリバリーとバイオ1,2,3,4としてこのような医用工学における関心の高まりがあった。ナノ粒子ベースのシステムの多面的機能はしばしば 1 つの定式化の内で複数のコンポーネントを組み込むことを必要とします。しばしば脂質またはポリマーに基づくビルディング ブロックは、その物理化学的特性、生体適合性、生分解性は、最終的にナノ構造1,の機能に影響を与える可能性があります点で異なる5,6。タンパク質やペプチドなどの生物学的派生材料は長い多機能ナノ構造、シーケンス柔軟性7,8のための有望なコンポーネントとして認識されています。非常に発注された超分子構造体形成ヘリカルに自己組み立てるペプチド リボン9,10、線維性足場11,12、および多く、従って建物への道を舗装生体分子ベースのハイブリッド ナノ構造をボトムアップ型を使用してのアプローチ13。
ペプチドは、医学やバイオ テクノロジー、特に抗がん剤療法14と抗生物質開発16,17、代謝と心血管疾患15同様のアプリケーションに検討されています。障害18、および感染症19。小さなペプチドによる治療受けている臨床試験20数百以上あります。ペプチドは、簡単を変更して高速に低コストで合成しています。さらに、彼らはその生物学・薬学アプリケーション21,22を容易に大きく生分解されます。ペプチド構造部材としての使用を含む、ペプチド ベースの応答性ナノ粒子の放出制御23,24,25,26のハイドロゲル デポ工学,27ペプチドを用いたバイオ センサー28,29,30,31, またはバイオ電子デバイス32,33,34。重要なは、フェニルアラニンを含む 2 つまたは 3 つのアミノ酸残基とも短いペプチッドはガイドに発見された、自己集合35,36,37を処理し、安定したエマルジョン38 を作成します.
彼らの高効率により、プラチナ ベースの薬は、両方単独でそして他のエージェント39,40との組み合わせで多くのがんの治療で使用されます。白金化合物は、monoadducts、intrastrand または interstrand のクロスリンクを形成し DNA 損傷を誘発します。Pt DNA 損傷は細胞機械装置によって認識され、修復されていない場合は細胞をアポトーシスに導きます。Pt(II) が癌細胞の死に貢献、最も重要なメカニズムは、DNA 転写41,42の抑制です。ただし、重篤な副作用を発生させる Pt(II) の全身毒性によってプラチナ療法の利点は減少します。これ Pt(II)43, で、しばしば DNA に達するプラチナのサブ治療濃度の低い臨床投与に します。結果として、次の DNA 修復はがん細胞の生存と Pt(II) 抵抗性の獲得に貢献します。プラチナ化学療法抵抗は、抗がん剤療法と治療障害44,45の主な原因主な問題。
全身循環のシールド効果を提供するためにおよび Pt II による副作用を軽減するため、Pt(II) エージェントをカプセル化する安定したナノシステムを開発しました。システムは、ナノエマルション (KYF Pt NE)46を形成する KYF トリペプチドで安定したオレイン酸 acids-Pt(II) のコアに基づいています。KYF Pt 北東、オレイン酸と同様に、トリペプチドのアミノ酸のビルディング ブロックは、食品医薬品局 (FDA) と一般認識として安全 (フォアグラ) ステータスを持っています。KYF Pt NE は、47nanoprecipitation メソッドを使用して準備されます。要するに、オレイン酸 acids-Pt(II) 共役は有機溶剤に溶解し、37 ° C で水の KYF ソリューション (図 1) に滴下し、KYF Pt 好中球エラスターゼの自己集合を許可するいくつかの時間のため、溶液を攪拌します。ナノエマルションは 10 kDa 遠心コンセントレーターに集中し、水で 3 回洗浄しました。Fluorophore と KYF の化学修飾により蛍光 FITC-KYF-白金-NE の合成、生体イメージングに適した。
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Protocol
1. オレイン酸 Acids–Platinum(II) 共役の合成
- シスプラチンの活性化
- 60 ° C で 50 mg (0.167 モル) 4 mL の水 (例えば、nanopure) にシスプラチンを中断します。
- シスプラチンのソリューションに 0.5 mL の水にアグノ3滴 55.2 mg (0.325 ミリ モル) を追加し、60 ° C で少なくとも 2 時間の反応をかき混ぜる反応の進行状況を示す塩化銀の白色沈殿物を形成します。
- 活性化反応は完了するには、10% のテストを行う無料 Ag+イオンの存在の hcl が掲載。テストは負の値にする必要があります (追加 AgCl の沈殿物を形成する必要がありますなし)。
- 3,220 × g 10 分で反応混合物を遠心分離し、塩化銀の白色沈殿物を削除します。
- 上清を収集し、0.2 mm のシリンジ フィルターを介してフィルターします。プラチナの有無を清をテストするには、新規2結晶をパスツール ピペットで溶液の 2 〜 3 滴を適用します。検査結果が陽性の場合はプラチナでスズの座標複合体の色は濃い黄色/オレンジ色です。
- 2 番目のステップの活性化 Pt(II) の上澄みを使用します。
- オレイン酸活性化 Pt(II) との反応
- 60 ° C で水 3 mL でオレイン酸 (0.333 モル) 94.2 mg を中断します。
- 1 mL の水の NaOH の 13.3 mg (0.333 mmol) を追加し、手順 1.1 からアクティブ化された Pt(II) の溶液を混ぜてください
- 2 h の反応 60 ° c、次に室温で一晩撹拌します。原油製品は油性の茶色/黄色沈殿物です。
- 3,220 × g 10 分で反応混合物を遠心し、上清を除去します。ロータリーエバポレーターを使用して 25 の ° C で粗製品を乾燥させます。アセトニ トリルと複数の洗浄によって、製品を浄化します。純粋なオレイン酸 acids–Pt(II) 共役の最終的な色は淡い黄色です。
2. KYF-白金-NE の合成と FITC 標識ナノエマルション FITC-KYF-白金-NE
- KYF トリペプチドと蛍光に分類されたトリペプチド FITC KYF の合成
- 標準的な固体ペプチド化学を用いた KYF を合成します。カップリング条件次の標準を使用して、各アミノ酸を添付する: 王ガレージ (2.19 m モル)、fmoc 保護保護アミノ酸 (4.38 モル) 2-(1H-Benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethylaminium テトラフルオロホウ酸 (TBTU) (4.38 モル) と diisopropylethylamine(DIPEA)(8.76 モル)。ジメチルホルムアミド (DMF) に TBTU とアミノ酸の溶解と DIPEA。
- DMF を 1 時間使用する前に 25 mL で fmoc 保護-L-フェニルアラニン 4-alkoxybenzyl アルコール樹脂 (0.382 meq/g) の 5.7 g を浸します。
- 5 分間 20% ピペリジン/DMF 溶液 15 mL と L-フェニルアラニン アミノ酸のアミン グループを deprotect、溶媒を破棄し、20 分サイクルで洗浄を繰り返します。
- 1 分以下の溶剤で樹脂を洗う: DMF、イソプロピル アルコール (IPA)、DMF、IPA、DMF、IPA、DMF、DMF。各洗浄した後、溶媒を破棄します。
- 樹脂の無料 NH2グループの存在を定めるためカイザー テストを実行 (手順を参照してください) (樹脂種は紫) 陽性、fmoc 保護 L-チロシンのアミノ酸を追加すると、結合を実行して一晩。
- カイザー別ボトルでテスト ソリューションを準備します。
- エタノール 100 mL にニンヒドリンの 5 g を溶かします。
- エタノール 20 mL にフェノールの 80 g を溶解します。
- 青酸カリの 0.001 M 水溶液 2 mL を混ぜてください。
ピリジンの 98 mL。 - 各カイザーの 2 〜 3 滴 5 分間水を沸騰のサンプルおよび熱ソリューションのテストを追加します。
- 2 番目のアミノ酸の成功したカップリングは、カイザー テストを実行して負が脱保護プロトコル (手順 2.1.3 に 2.1.5) を続行します。Fmoc 保護フェニルアラニン アミノ酸とプロセスを繰り返します。
- すべてのアミノ酸の結合、時に各洗浄溶媒を破棄後の DMF、IPA、DMF、メタノール、ジクロロ メタン、ジエチル エーテル 5 mL で 1 分のガレージを洗ってください。さらに処理用樹脂を保存します。
- FITC とペプチドを変更するのに次の手順 (2.1.7-2.1.9) 樹脂の半分を使用します。そのまま KYF トリペプチドを得るためには、2.1.10 から始まる手順に従います。
- 6-azidohexanoic 酸 KYF N3 KYF の N 末端アミノ酸を変更します。このため、1 g (0.382 モル) KYF 王ガレージの 120.1 mg (0.764 ミリ モル) 6-azidohexanoic 酸の 245.2 mg (0.764 ミリ モル) とのミックス TBTU 197.1 mg (1.528 モル) DIPEA の DMF の 30 mL で。反応を室温で一晩攪拌します。
- KYF N3クリック反応によるプロパルギル フルオレセインの合成から KYF FITC を取得します。このため、固体 CuI の 3.78 mg (0.019 モル)、プロパルギル フルオレセインの 71.9 mg (0.193 モル) 2.24 mg (0.017 モル) DIPEA と KYF N3王ガレージの 253 mg (がかかります 0.097 mmol) をミックスします。反応は、茶色に緑から色を変更必要があります。
- 24 h 後 1 分交互に DMF と IPA の 5 mL、メタノールと水を三度、DMF と水 3 回、5 回とジクロロ メタンとジエチル エーテルの樹脂を 3 回洗います。各洗浄した後、溶媒を破棄します。
- トリフルオロ酢酸 (TFA) 溶液でガレージから KYF FITC または KYF ペプチドを切断/triisopropylsilane (ヒント)/H2O 95/2.5/2.5 の比率で 3 時間以上。
- 冷たいジエチル エーテル、冷たいエーテルと三度洗いと、真空下で乾燥し、粗ペプチドを沈殿させます。
- Pt(II) (FITC KYF Pt NE) と KYF Pt NE FITC KYF 安定ナノエマルションの合成
- 1.5 ml のイソプロパノールのオレイン酸 acids–Pt(II) 共役と 5 mL の注射器の場所の 10 mg (0.0126 mmol) を解散します。
- オレイン酸 acids–Pt(II) 共役シリンジをシリンジ ポンプにし、流れを 0.1 mL/分に設定します。
- FITC KYF Pt NE を合成するために FITC KYF と KYF 1 mg (0.00219 mmol) の 1 mg (0.00105 mmol) を溶解 (FITC のモル比を 1:2-KYF:KYF) 20 mL の水にし、37 ° c. に解決の温度を調整FITC の蛍光の退色を避けるためにアルミ箔容器の壁をカバーしてください。KYF Pt NE を合成、水 20 mL で KYF トリペプチドの 2 mg (0.0044 モル) を溶解し、37 ° c. に解決の温度を調整
- FITC KYF/KYF または KYF トリペプチドの溶液に滴下オレイン酸 acids–Pt(II) 共役を追加します。この手順では、フードの下で。
- 有機溶媒を蒸発させるように、室温で一晩ソリューションをかき混ぜる、FITC KYF Pt NE または KYF Pt ねの自己集合
- 遠心濃縮器で FITC KYF Pt NE または KYF Pt NE を集中 (10 k MWCO)、4 mL の nanopure 水で 3 回洗浄します。
- 4 ° C で KYF Pt NE と FITC KYF Pt NE の水溶液を格納します。
- プラチナの量を原子吸光分析 (原子吸光法)、次の製造元のガイド48を使用しての分析します。
- 10% 塩酸溶液でプラチナ基準を備える検量線 (原子吸光法の有効範囲は 100 に 1,200 ppb (10億分の 1) の間)。
- 王水 (濃塩酸と硝酸の 3:1 の混合) の手順 2.2 で 100 μ L から KYF Pt NE ソリューションの 50 μ L を溶かし、常温で一晩おきます。最終的なサンプル量は 1 mL に達する水の 850 μ L を追加します。原子吸光法を使用してサンプルを分析します。最終酸濃度は、すべての分析試料を 10% をする必要があります。
- Ppb で Pt 濃度の読書を記録し、サンプル (サンプル希釈とナノエマルションの最初のボリュームのアカウント) で最終的なプラチナの量を計算します。
3 FITC KYF Pt NE の細胞内取り込み共焦点イメージング
- 4 チャンバーごとの4セル数 10 × 4.7 の密度でも商工会議所共焦点料理に 6 卵巣癌細胞株 (A2780、CP70、SKOV3、OV90、TOV21G、ES2) をシードし、37 ° C で一晩培養済み
- リン酸バッファー生理食塩水 (PBS) で三度セルを洗浄して、24 時間後とセル培地の FITC KYF Pt 鍛錬と孵化 (セルの行の特定の詳細手順 6.1 参照) 37 ° C で 15 分間
- インキュベーション後、メディアを取り出し、洗浄 3 回 PBS のセル。
- -20 ° C で 5 分間冷メタノールとセルを修正し、3 回 1 mL の PBS で洗浄します。
- 0.1 ml の 1 セルを permeabilize % トリトン X 室内温度と洗浄で 10 分の 3 回 1 mL の PBS の。
- 1:50 で Alexa Fluor 647 (1 mL) と共役 LAMP1 抗体 90 分細胞をインキュベート室温で PBS で希釈。次に、PBS で 3 回セルを洗浄してください。
- DAPI 原液 (1 mg/mL) を 1 mg/mL の PBS で希釈します。各チャンバーに希釈した溶液の 1 mL を追加し、室温で 15 分間インキュベートします。PBS で 3 回洗浄を行う。
- メディアをマウントを使用してスライド上 coverslips にマウントします。
- 画像の 405 の励起波長で生きているセルの共焦点顕微鏡を用いた細胞 nm、488 nm および 633 nm。以下の通り検出パラメーターを設定: 0.2% と 1% 以上、ピノール 1 風通しの良いユニットからレーザー電力利得マスター 650-750、デジタル オフセット 0。
- 画像処理ソフトウェアで画像を開く。表示されたイメージの下にグラフィックスを選択し、挿入スケール バー画像にスケールバーを挿入するを選択します。
4. 薬物放出の研究
- PBS の薬物放出の研究を行います。それぞれ 7.4 6.8、5.0 3 PBS バッファーの pH 値を調整します。
- 180 μ L の PBS バッファーの適切な pH で KYF Pt NE の 5 μ L を希釈、3.5 kDa MWCO ミニ透析カップに移し、PBS で 37 ° C で孵化させなさい。
- 2、4、6、24、48、および 140 h でそれぞれ 3 つのミニ透析チューブからバッファーを削除し、原子吸光法による白金濃度を測定します。2.2.8 の手順に従ってすべてのサンプルを準備が 500 μ L のサンプルの最終的な音量を調整します。
5. 細胞培養法
- 培養細胞は、L-グルタミンとペニシリン/ストレプトマイシン A2780 CP70、skov 氏 3、OV 90、tov さん-21 G、添加 (A2780、CP70、skov 氏-3、ES 2) 10% や 15% (tov さん-21 G、OV 90) ウシ胎児血清 (FBS)、細胞培養液中 (DMEM) ES 2 をラインします。すべての 5% CO2のセル、37 ° C で水飽和雰囲気を成長します。
- 各 96 ウェル プレートでの培養実験のため一晩前培養種 3 × 105セル。水にカルボプラチン、シスプラチン、KYF Pt NE ソリューションを準備します。各細胞株のシスプラチンとカルボプラチンの濃度に合わせて KYF Pt 鍛錬で Pt(II) の濃度を調整します。37 ° C で 72 時間インキュベートします。
- インキュベーション後、比色アッセイ (MTT のセル拡散の試金) を用いた細胞の生存率を評価します。簡潔に、培地を取り除き、各媒体で MTT がよく、37 ° C で 2 時間インキュベート 10 %110 μ L を追加各ウェルに 100 μ L の洗剤を追加し、37 ° C で 5 時間インキュベート
- 570 で吸光度をチェック プレート リーダーを使用して nm。統計分析を使用して Z 検定と P 検の結果を分析します。
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Representative Results
このプロトコルを使用して準備 KYF Pt NE の代表の TEM 像を図 2 aに示します。KYF Pt ファミコン、球状形態、よく分散していると均一の大きさの。KYF-白金-ファミコン、200 測定、最低 3 つの TEM 画像から直接測定のコア径は、107 ± 27 nm です。KYF-白金-NE、動的光分光法 (DLS) を使用して分析の流体力学的直径が 240 に発見された 0.156 の多分散性のインデックスを持つ nm。-60.1 の平均値と 3 つの独立した合成 KYF Pt 水 - NE のゼータ電位を測定した mV。ポテンシャルの高い等級を示します、定式化のコロイド安定性良いと負の表面電荷はオレイン酸のイオン COO-表面グループに起因します。KYF の等電ポイント 8.59 であり従ってそれが正荷電中性 pH で。
蛍光に分類された FITC KYF Pt NE および卵巣癌細胞株を用いた細胞膜を通過する、ナノエマル ジョンの能力を検討しました。結果は、図 2 bに掲載されています。それがはっきりわかります、FITC-KYF-白金-ファミコン (グリーン) 細胞質内分散、まだリソソーム (赤) と関連付けられていません。この結果は、KYF Pt ファミコン セルを入力し、細胞内薬物デリバリー車両として使用できることを示します。
KYF Pt ファミコンと FITC KYF Pt 別項記載以外の安定性は、DLS と評価されました。水のナノエマル ジョンの直径は、数ヶ月にわたって測定されましたし、結果を図 3に示します。両方の製剤の流体力学的直径が徐々 に増加ストレージ 320 に 4 カ月間 nm (KYF Pt NE) と 240 nm (FITC-KYF-白金-NE)、しかしナノスケール寸法が保存されていた。KYF トリペプチドは、時間の長い期間にわたってナノエマル ジョンを効果的に安定を示唆します。
Pt(II) カプセル化効率、ナノエマルションからのリリースは、原子吸光法で測定した.KYF Pt NE の Pt(II) 濃度は 10 wt.% に設立されました。Ph KYF Pt NE から、Pt(II) リリース 7.4 (生理学)、6.8 (腫瘍の間質)49、および 5.0 (エンドソーム)50は、図 4 aで提示されます。Pt(II) リリースは 4 時間後 pH 6.8 ならびに 5.0 でリリースされの 32.8% 47.5%、それぞれを放したり Pt(II) の 20.8% だけで pH 7.4 で遅いです。同じ傾向は、24 時間後と 6 日後に続いています。KYF Pt NE から Pt(II) リリースは pH 依存性、全身循環の遅延および、ナノエマル ジョンが腫瘍に若し一度加速できるである、この結果を示します。
KYF Pt NE の生物活性は、イメージングの研究のように同じ卵巣がん細胞株を用いた生体外で設立されました。セルは、KYF Pt NE と各セルライン IC50対応する KYF Pt NE 濃度での 72 時間培養。生存率は、MTT の試金を使用して査定された、シスプラチン、カルボプラチン、オレイン酸 acids-Pt(II) 共役 KYF NE のセルのみを比較しました。KYF Pt NE の生物活動の結果は、図 4 bに表示されます。KYF Pt NE では、同質細胞 A2780 の生存率 (Pt 依存) と CP70 (Pt 耐) で 44.3% 46.2% 削減。カルボプラチン、臨床的に関連性の高いアナログには 18.5% (A2780)、9.6% (CP70) のみ生存率が減少しました。大きい KYF Pt NE に及ぼす細胞死の同様の傾向は、同様に他の細胞の間で観察されました。Pt(II) 敏感な tov さん-21 G 細胞の生存率によって減った 55.9% KYF Pt 鍛錬と孵化後わずか 16.5% 生存率の低下で起因したカルボプラチン中。OV 90 中間 Pt(II) 抵抗性細胞の生存率は 55.3% (KYF Pt NE)、23.9% (カルボプラチン) により低下しました。2 つ耐性癌細胞株、ES 2 と skov 氏-3 の減少を示した生存率 45.9% 54.3%、それぞれ、KYF Pt 北東、10.3% (ES-2) およびカルボプラチンの 16.8% (skov 氏-3)。
シスプラチン KYF Pt NE の生物学的活性を比較したも.シスプラチンは、もはやその毒性プロファイル51のためクリニックで支持は第一世代の Pt II ベース エージェントです。2 つの細胞株 skov 氏 3 と tov さん-21 G、生存率削減大きかった 15%、40%、それぞれ、KYF Pt 北東よりのシスプラチンの。残りのセル行の KYF Pt NE の活動は、シスプラチン (A2780、CP70、OV 90) に匹敵するか (ES-2) を少し下げます。オレイン酸 acids-Pt(II) 共役は、生物学的活性にもわかった。ただし、KYF Pt NE は Pt(II) 活動における nanoformulation の意義を示すテスト細胞の大半で共役より生存率の高い減少を示した。
ナノ粒子システムの生物学的応用生物学的関連性の高いメディアの安定性を必要とする、従って KYF Pt NE の安定性が 20% 牛胎児血清 (FBS) で評価した、図 4の結果が表示されます。我々 は見つかりません KYF Pt NE オプソニンの証拠血清で培養 1 日後。
図 1。ナノエマル ジョン (上) とナノエマルションの調製 (下) の模式図のコンポーネント。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2。KYF Pt NE (A) および卵巣癌細胞による取り込みを FITC-KYF Pt NE (緑) の共焦点顕微鏡画像の TEM 像 (核、青とリソソームが赤) (B)。スケール バーは、10 μ m です。この図は、2514-2519ナノ診断化学2018 年、29 から許可を適応されています。46著作権 2018年アメリカの化学社会。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3。KYF Pt NE と水で FITC-KYF Pt-NE の安定性。各ポイント平均と N = 3 とpの標準偏差を表す <0.005 。この図は、2514-2519ナノ診断化学2018 年、29 から許可を適応されています。46著作権 2018年アメリカの化学社会。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4。KYF Pt NE の安定性と生物活性します。(A) Pt(II) 異なる pHs (PBS、37 ° C) で PBS バッファー KYF Pt NE からリリースします。KYF Pt NE (B) で 72 時間培養後別の卵巣癌細胞の細胞生存率。各列を表す意味と N = 3 の標準偏差とp <0.005。濃度は各細胞の定数であり、以下の通り: 4.92 ミリメートル (A2780) 8.80 (CP70) 2.46 mM (tov さん-21 G)、9.84 ミリメートル (SKOV3) 7.38 (ES-2) 19.7 mM (OV-90)。原子吸光法によって測定される Pt(II) コンテンツに関して KYF Pt NE とオレイン酸 acids–Pt(II) 共役の濃度が調整されました。略語:"Carbpt"-カルボプラチン。「KYF ね」-KYF トリペプチド コーティング ナノエマルション;「KYF-白金-ね」-Pt(II); を含む KYF トリペプチド コーティング ナノエマルションCispt-シスプラチン。Pt-オレイン酸-オレイン酸 acids–Pt(II) 共役。(C) 血清中 KYF Pt NE 安定性。この図は、2514-2519ナノ診断化学2018 年、29 から許可を適応されています。46著作権 2018年アメリカの化学社会。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
ナノエマルション合成で重要な手順は、基板のモル比を調整、オレイン酸 acids–Pt(II) 追加中の温度と流量制御の維持、自己組織化のための十分な時間を提供すること、使用して製品を浄化、遠心濃縮器列。これらのパラメーターに影響を与える KYF Pt NE; の形態とサイズしたがって、特に適切なモル比を維持し、正しく合成条件を調整することが重要です。
ナノエマルション合成 (ステップ 3) の際に基板の比は、自己組織化プロセスの重要な製品の最終的なサイズを決定します。KYF オレイン酸 acid-Pt(II) のモル比は 1:3 と水で KYF tripepide の最適濃度は 0.2 mM。さらに、3.1 の手順でオレイン酸 acid-Pt(II) 共役を溶解するために使用される有機溶剤は水、ろ過システムとの互換性と混和性で、室温で簡単に蒸発します。
重要な手順の 1 つは、KYF ソリューション (ステップ 3.4) オレイン酸 acid-Pt(II) 共役の滴下です。流れはならない低速 0.1 mL/min 以下と 0.2 mL/min より速くないサブ最適な速度は、ナノエマルションの沈殿物を引き起こすことができるので。また、オレイン酸 acids–Pt(II) 共役は 600 rpm で炒め皿に混合物を攪拌しながら 37 ° C で KYF ソリューションに追加する必要があります。オレイン酸 acid-Pt(II) のすべてが追加されて、部屋の温度や攪拌速度 150 rpm に減少でソリューションしておきます。ステップ 3.5 は室温で実施されなければなりません。最適の時間、自己集合 KYF Pt NE (ステップ 3.5) は 24 時間。
製品は、ナノエマルションを事前に集中されている間に沈殿させるかもしれないリスクがあります。したがって、ナノエマルション遠心濃縮、遠心分離される前に追加の水で希釈、2,465 x gよりも高速スピンをお勧めします。因数で遠心濃縮器に希釈したナノエマル ジョンを追加して、次の部分を追加する前に、フィルターで、ナノエマルションを混合する必要があります。
オレイン酸以外の脂肪酸誘導体とフォーム ナノエマル ジョンに能力はテストされていないと、まだ決められることです。将来のアプリケーションは、オレイン酸と co アセンブリを容易にするために異なるペプチドの使用を含めることができます。非プラチナ製剤とオレイン酸抱合体は、ナノエマル ジョンの潜在的なコアとして使用もあります。
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Disclosures
著者には、利益相反を開示するはありません。
Acknowledgments
我々 は感謝して SC2CA206194 を付与国立がん研究所からの財政支援を認めます。競合する金銭的な利益が宣言されていません。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-(1H-benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium tetrafluoroborate (TBTU) |
ANASPEC INC.: | AS-20376 | SPPS |
| 4-well chamber confocal dish | Lab-Tek II, Thermo Fisher Scientific | 154526 | For imaging |
| 6-bromohexanoic acid | Chem-Impex INT’L INC. | 24477 | Click modification for peptide |
| A2780 | Generously doanted by professor John Martignetti from The Mount Sinai Hospital | Ovarian cancer cell line | |
| Barnstead Nanopure | Thermo Fisher | D11901 | water filtration system |
| BUCHI rotavapor R-3 | Buchi | Z568090 | For solvent removal and sample drying |
| Centrifuge 5810 R | eppendorf | 5811F | For platinum complex separation |
| Cis-dichlorodiamineplatinum (II) 99% | Acros Organics | 19376-0050 | in vitro tests |
| CP70 | Generously doanted by professor John Martignetti from The Mount Sinai Hospital | Ovarian cancer cell line | |
| Digital water bath | VWR | 97025-134 | For warming up media for cell culture |
| Dynamic Light Scattering (DLS) | Brookhaven Instrument Corporation | For nanoparticle size measurments | |
| ES-2 | ATCC | CRL-1978 | ovarian cancer cell line |
| Fmoc-L-Lys(Boc)-OH 99.79% | Chem-Impex INT’L INC. | 00493 | SPPS |
| Fmoc-L-Phe 4-alkoxybenzyl alcohol resin (0.382 meq/g), | Chem-Impex INT’L INC. | 01914 | SPPS |
| Fmoc-LTyr(tBu)-OH 98% | Alfa Aesar | H59730 | SPPS |
| HERACELL 150i CO2 incubator | Thermo Scientific Fisher | incubator | |
| High pressure syringe pump | New Era | 1010-US | For platinum complex addition in nanoparticle synthesis |
| Hotplate/stirrer | VWR | 12365-382 | For sample stirring and heating |
| LAMP-1 Antibody(cojugated with Alexa Fluor 647) | Santa Cruz Biotechnology | sc-18821 AF647 | For imaging |
| N,N-diisopropylethylamine (DIPEA) | Oakwood Chemical | 005027 | SPPS |
| Ninhydrin 99% | Alfa Aesar | A10409 | Kaiser test |
| Oleic acid | Chem-Impex INT’L INC. | 01421 | For platinum complex synthesis |
| OV90 | ATCC | CRL-11732 | Ovarian cancer cell line |
| PBS | Corning | 21-031-CV | For cell wash |
| Permount mounting medium | Fisher Chemical | SP15-100 | For imaging |
| Phenol | Fisher Chemical | A92500 | Kaiser test |
| Phosphotungstic acid | Fisher Chemical | A248-25 | negative stain for TEM |
| Piperidine 99% | BTC | 219260-2.5L | SPPS |
| Platinum AAS standard soultion | Alfa Aesar | 88086 | 1000ug/ml for calibration curve |
| Propargyl bromide 97% | Alfa Aesar | L10595 | For alkyne modification of fluoresceine |
| Scientific biological cabinet | Thermo Scientific Fisher | 1385 | Bio-hood for cell culture |
| Self-Cleaning Vacuum System | Welch | 2028 | Vacuum pump for rotavapor |
| Silver nitrate | Acros Organics | 19768-0250 | Cisplatin activation |
| SKOV3 | ATCC | HTB-77 | Ovarian cancer cell line |
| Sodium hydroxide | Fisher Scientific | S313-1 | For platinum complex synthesis |
| Tin (II) chloride | Sigma Aldrich | 208256 | Test for Platinum presence |
| TOV21G | ATCC | CRL-11730 | Ovarian cancer cell line |
| Trifluoroacetic acid 99% (TFA) | Alfa Aesar | L06374 | SPPS |
| Triisopropylsilane (TIPS) | Chem-Impex INT’L INC. | 01966 | SPPS |
| Triton-X | Sigma Aldrich | T8787-100ML | For imaging |
| Uranine powder 40% | Fisher Scientific | S25328A | For alkyne modification of fluoresceine |
| Vivaspin 20 (10000 MWCO) | Sartorious | VS2001 | For Nanoparticle wash and condensation |
| VWR Inverted Microscope | VWR | 89404-462 | For cell culture monitoring |
References
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