Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Nanoemulsion מיוצב Tripeptide של חומצה אולאית

Published: February 27, 2019 doi: 10.3791/59034
Automatic Translation
1, 1,2, 1,3, 4,5,6, 1,2,3
1Department of Chemistry, Brooklyn College, The City University of New York, 2Ph.D. Program in Chemistry, The Graduate Center of The City University of New York, 3Ph.D. Program in Biochemistry, The Graduate Center of The City University of New York, 4Department of Genetics and Genomic Sciences, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 5Women's Health Research Institute, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 6Laboratory for Translational Research, Western Connecticut Health Network

Summary

פרוטוקול זה מתאר שיטה יעילה לסנתז את nanoemulsion של המספר המשלים acids-platinum(II) האולאית התייצב עם tripeptide ליזין-טירוזין-פנילאלנין (KYF). הצורות nanoemulsion בתנאים סינתטי קלה באמצעות הרכבה עצמית של KYF, לחשב את המשלים שלו.

Abstract

אנו מתארים שיטה לייצר nanoemulsion המורכב על ליבה acids-Pt(II) האולאית וציפוי של ליזין-טירוזין-פנילאלנין (KYF) (KYF-Pt-NE). KYF-Pt-NE מכמס Pt(II) ב- 10 wt. %, קוטרו של 107 ± 27 ננומטר, משטח מטען שלילי. KYF-Pt-NE יציב תוך סרום, פעילים ביולוגית. הבניין של fluorophore כדי KYF מאפשרת הסינתזה של nanoemulsion פלורסנט המתאימה עבור הדמיה ביולוגי. הסינתזה של nanoemulsion מתבצע בסביבה מימית, ולא הצורות KYF-Pt-NE באמצעות הרכבה עצמית של פפטיד KYF קצר ואת המספר של acids-platinum(II) האולאית המשלים. תהליך הרכבה עצמית תלויה על הטמפרטורה של הפתרון, יחס טוחנת סובסטרטים, קצב הזרימה של התוספת המצע. שלבים קריטיים כוללים שמירה על קצב מלהיב אופטימלית במהלך הסינתזה, המתיר מספיק זמן עבור הרכבה עצמית, ריכוז מראש את nanoemulsion בהדרגה ברכז צנטריפוגלי.

Introduction

בשנים האחרונות חלה עניין הולך וגובר בתחומי ההנדסה של חלקיקים כאלה ביו יישומים כמו תרופות ו-3,2,1,bioimaging4. Multifunctionality של מערכות מבוססות nanoparticle מחייבת לעתים קרובות שילוב רכיבים מרובים בתוך אחד ניסוח. אבני הבניין המבוססים על שומנים או פולימרים לעיתים קרובות שונים מבחינת תכונותיהם physicochemical וכן הביו שלהם, biodegradability, דבר שבסופו של דבר שעשוי להשפיע על הפונקציה של ננו-מבנה1, 5,6. חומרים נגזרת ביולוגית, כגון חלבונים ופפטידים, זמן הוכרו מבטיח מרכיבי nanostructures רב תכליתיים עקב שלהם רצף גמישות7,8. פפטידים בעצמם לתוך מאוד מסודרת ארכיטקטורות סופרא מולקולרית ויוצרים לוליינית סרטים9,10, פיגומים סיביים11,12, ועוד רבים, ובכך לסלול את הדרך לבניין nanostructures מבוססי biomolecule היברידית באמצעות מלמטה-למעלה הגישה13.

פפטידים נחקרו עבור יישומים ברפואה וביוטכנולוגיה, במיוחד עבור טיפול נגד סרטן14 ו מחלות לב וכלי דם15 גם לגבי פיתוח אנטיביוטי16,17, מטבולית הפרעות18ולאחר זיהומים19. יש יותר ממאה של קטן-פפטיד הרפוי שעברו ניסויים קליניים20. פפטידים נמצאים קל לשנות מהר לסנתז במחיר נמוך. בנוסף, הם חומר מתכלה, אשר מקל מאוד21,שלהם יישומים ביולוגיים ובתחום הרוקחות22. השימוש של פפטידים רכיבים מבניים כולל ההנדסה של חלקיקים מגיב, מבוססת על פפטיד, מחסני הידרוג עבור שחרור מבוקר23,24,25,26 , 27, ביולוגיים מבוססת על פפטיד28,29,30,31או התקנים ביו-אלקטרוניקה-32,-33,-34. חשוב, פפטידים קצרים אפילו עם שאריות חומצה אמינית שניים או שלושה, הכוללים פנילאלנין נמצאו להנחות תהליכי35,36,37 וליצור מיוצב אמולסיות38 הרכבה עצמית .

תרופות מבוססת פלטינה, בשל יעילות גבוהה שלהם, משמשים משטרי הטיפול רבים של סרטן, גם לבד וגם בשילוב עם סוכנים אחרים,39,40. תרכובות פלטינה לגרום נזק לדנ א על ידי יצירת חוצה קישורים monoadducts, intrastrand או interstrand. נגעים Pt-DNA מזוהים על ידי המנגנונים הסלולר ו, אם לא יתוקן, להוביל אפופטוזיס הסלולר. המנגנון החשוב ביותר, שבו Pt(II) תורמת מוות תאי סרטן, הוא עיכוב של ה-DNA שעתוק41,42. עם זאת, היתרונות של טיפול פלטינה הם הצטמצמו מאת מערכתית רעילות Pt(II) שמפעיל תופעות לוואי חמורות. זה מוביל מינון נמוך יותר קליני של Pt(II)43, אשר לעתים קרובות התוצאות מתחת לרמה תרפויטית ריכוזי פלטינה לכת ה-DNA. כתוצאה מכך, תיקון ה-DNA כי בעקבות תורמת הישרדות cell סרטן ורכישת ההתנגדות Pt(II). הכימותרפיה-ההתנגדות פלטינה היא בעיה רצינית טיפול נגד סרטן, הגורם העיקרי של הטיפול כשל44,45.

פיתחנו nanosystem יציב המכיל את הסוכן Pt(II) על מנת לספק אפקט מיגון ב מחזור מערכתי, להפחית את תופעות הלוואי Pt II-induced. המערכת מבוססת על ליבת acids-Pt(II) האולאית התייצב עם tripeptide KYF כדי ליצור את nanoemulsion (KYF-Pt-NE)46. אבני הבניין של KYF-Pt-NE, חומצות אמינו tripeptide, כמו גם של חומצה אולאית, בעלי מעמד בדרך כלל מזוהה בתור בטוחה (גרא) ועם המזון והתרופות האמריקני (FDA). KYF-Pt-NE מוכן באמצעות שיטה של nanoprecipitation47. בקיצור, המספר המשלים acids-Pt(II) אולאית הוא מומס של הממס האורגני ולאחר מכן נוסף dropwise פתרון KYF מימית (איור 1) ב- 37 מעלות צלזיוס. הפתרון הוא זז במשך מספר שעות לאפשר הרכבה עצמית של KYF-Pt-נברסקה Nanoemulsion זה מרוכזים 10 רכזים צנטריפוגלי kDa ושטף שלוש פעמים עם מים. שינוי כימי של KYF עם fluorophore מאפשרת הסינתזה של פלורסנט FITC-KYF-Pt-NE מתאימים עבור הדמיה הביו-רפואית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. סינתזה של המספר המשלים Acids–Platinum(II) האולאית

  1. הפעלה של ציספלטין
    1. להשעות 50 מ"ג (0.167 mmol) של ציספלטין ב 4 מ ל מים (למשל, nanopure) ב 60 מעלות צלזיוס.
    2. הוספת dropwise 55.2 מ"ג (0.325 mmol) AgNO3 0.5 מיליליטר מים אל הפתרון של ציספלטין ומערבבים את התגובה כבר לפחות שעתיים ב 60 מעלות צלזיוס. התמיסה לבן של AgCl יהוו המציין את ההתקדמות של התגובה.
    3. כדי לקבוע אם התגובה הפעלת הושלמה, לבצע את הבדיקה עם 10% HCl לנוכחות של יון Ag+ ללא פתרון. הבדיקה צריך להיות שלילי (אין התמיסה AgCl נוספים צריך טופס).
    4. Centrifuge את תערובת התגובה ב x 3,220 g 10 דקות ולהסיר את התמיסה לבן של AgCl.
    5. לאסוף את תגובת שיקוע ולסנן אותו באמצעות מסנן מזרק 0.2 מ מ. לבדוק את תגובת שיקוע לנוכחות של פלטינה על-ידי החלת 2-3 טיפות של הפתרון באמצעות פיפטה פסטר SnCl2 קריסטלים. הבדיקה היא חיובית אם צבע קומפלקס קואורדינטות של פח עם פלטינה צהוב/כתום כהה.
    6. השתמש את תגובת שיקוע Pt(II) מופעל עבור השלב השני.
  2. התגובה של חומצה אולאית עם Pt(II) מופעל
    1. להשעות 94.2 מ"ג חומצה אולאית (0.333 mmol) ב- 3 מ ל מים ב 60 מעלות צלזיוס.
    2. להוסיף 13.3 מ ג (0.333 mmol) של NaOH 1 מ"ל של מים, ומערבבים עם הפתרון של Pt(II) מופעל משלב 1.1
    3. מערבבים את התגובה כבר שעתיים ב 60 מעלות צלזיוס, הבא בטמפרטורת החדר למשך הלילה. המוצר הגולמי הוא התמיסה חום/צהוב שמנוני.
    4. Centrifuge את תערובת התגובה ב x 3,220 g 10 דקות ולהסיר את תגובת שיקוע. יבש את המוצר הגולמי 25 ° c באמצעות המאדה. לטהר את המוצר על ידי מספר שוטף עם acetonitrile. הצבע הסופי של המספר המשלים acids–Pt(II) אולאית טהורה הוא צהוב חיוור.

2. סינתזה של KYF-Pt-NE, את התווית על-ידי FITC Nanoemulsion FITC-KYF-Pt-NE

  1. סינתזה של tripeptide את KYF ולא את tripeptide שכותרתו fluorescently FITC-KYF
    1. לסנתז את KYF באמצעות פפטיד של מצב מוצק רגיל כימיה. המשתמשים בתקן הבאים צימוד התנאים לצירוף כל חומצת אמינו: וואנג שרף (2.19 mmol), חומצת אמינו Fmoc מוגן (4.38 mmol), 2-(1H-Benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethylaminium tetrafluoroborate (TBTU) (4.38 mmol) ו- diisopropylethylamine (DIPEA) (8.76 mmol). להמיס את חומצות אמינו עם TBTU dimethylformamide (DMF) ו- DIPEA.
    2. משרים 5.7 גר' Fmoc-L-Phe-4-alkoxybenzyl-אלכוהול-שרף (0.382 meq/g) ב 25 מיליליטר DMF 1 שעה לפני השימוש.
    3. Deprotect הקבוצה אמין של חומצה אמינית L-פנילאלנין עם 15 מ"ל של 20% פתרון פיפרידין/DMF במשך 5 דקות, למחוק את הממס וחזור לשטוף את מחזור 20 דקות.
    4. לשטוף את השרף עבור 1 דקות עם ממיסים הבאים: DMF, אלכוהול איזופרופיל (IPA), DMF, IPA, DMF, IPA, DMF, DMF. להתעלם הממס לשטוף אחרי זה.
    5. לבצע את הבדיקה קייזר כדי לקבוע הנוכחות של קבוצה2 NH חינם על השרף (ראה substeps) ואם חיובי (הזרע שרף הוא סגול), להוסיף את חומצת אמינו Fmoc-L-טירוזין ולבצע את צימוד בין לילה.
      1. להכין קייזר בדיקת פתרונות בקבוקים נפרד.
      2. להמיס 5 גר' ninhydrin ב 100 מ של אתנול.
      3. להמיס 80 גר' של פנול, 20 מ של אתנול.
      4. לערבב 2 מ ל תמיסת אשלגן עם מימית 0.001 M
        98 מ של פירידין.
      5. להוסיף 2-3 טיפות של כל קייזר לבחון פתרונות לדוגמה, חום במים רותחים במשך 5 דקות.
    6. על זוגיות מוצלחת של חומצה אמינית שניה, לבצע את הבדיקה קייזר, ואם שלילי. המשך עם פרוטוקול deprotection (שלבים 2.1.3 כדי 2.1.5). חזור על התהליך עם חומצת אמינו ביותר Fmoc-פנילאלנין.
      1. על צימוד של כל חומצות האמינו, לשטוף השרף עבור 1 דקות 5 מ של DMF, IPA, DMF, מתנול, דיכלורומתאן דיאתיל אתר, לאחר כל כביסה למחוק הממס. שמור את השרף עיבוד נוסף.
      2. השתמש חצי של השרף על השלבים הבאים (2.1.7-2.1.9) כדי לשנות את פפטיד עם FITC. כדי לקבל tripeptide KYF שלא שונתה, בצע את ההליך החל 2.1.10.
    7. לשנות את חומצת אמינו N-מסוף של KYF ל- KYF-N3 עם 6-azidohexanoic חומצה. לשם כך, מערבבים 1 g (0.382 mmol) של וואנג KYF שרף ו 120.1 מ"ג (0.764 mmol) של חומצה 6-azidohexanoic עם 245.2 מ"ג (0.764 mmol) של TBTU ו מ"ג 197.1 (1.528 mmol) של DIPEA ב- 30 מ של DMF. מערבבים את התגובה בין לילה בטמפרטורת החדר.
    8. להשיג את KYF-FITC של הסינתזה של KYF-N3 עם propargyl fluorescein באמצעות תגובת לחץ. לשם כך, מערבבים 253 mg (0.097 mmol) של KYF-N3 וואנג שרף עם 3.78 מ"ג (0.019 mmol) של קואי מוצק 71.9 מ"ג (0.193 mmol) של propargyl fluorescein, 2.24 מ ג (0.017 mmol) של DIPEA. התגובה צריך לשנות צבע מירוק לחום.
    9. לאחר 24 שעות, לשטוף את שרף 1דקות לסירוגין עם 5 מ ל DMF ו IPA חמש פעמים, מתנול שלוש פעמים, DMF ומים מים שלוש פעמים, ועם דיכלורומתאן דיאתיל אתר שלוש פעמים. להתעלם הממס לשטוף אחרי זה.
    10. קליב את KYF-FITC או KYF פפטיד של השרף עם פתרון של חומצה trifluoroacetic (TFA) / triisopropylsilane (טיפים) /H2O-היחס של 95/2.5/2.5 מעל 3 שעות.
    11. לזרז את פפטיד גולמי ב קר דיאתיל אתר, שלוש פעמים עם אתר קר, ומייבשים אז תחת שואב האבק.
  2. סינתזה של nanoemulsion FITC KYF-מיוצב עם Pt(II) (FITC-KYF-Pt-NE), KYF-Pt-NE
    1. להמיס 10 מ ג (0.0126 mmol) acids–Pt(II) האולאית המספר המשלים ב- 1.5 מ ל אלכוהול איזופרופיל ומקום של מזרק 5 מ.
    2. הכנס את המזרק עם המספר המשלים acids–Pt(II) האולאית משאבת מזרק ולהגדיר את זרימת 0.1 mL/min.
    3. כדי לסנתז את FITC-KYF-Pt-NE, להמיס 1 מ ג (0.00105 mmol) של FITC-KYF, 1 מ ג (0.00219 mmol) של KYF (יחס 1:2 טוחנת של FITC-KYF:KYF) ב- 20 מ ל מים ולהתאים את הטמפרטורה של הפתרון 37 מעלות צלזיוס. לכסות את הקירות של המיכל ברדיד אלומיניום, כדי למנוע photobleaching של fluorophore FITC. לסנתז את KYF-Pt-NE, לפזר 2 מ ג (0.0044 mmol) של KYF tripeptide ב- 20 מ ל מים, להתאים את הטמפרטורה של הפתרון 37 מעלות צלזיוס.
    4. להוסיף את המספר המשלים האולאית acids–Pt(II) dropwise הפתרון של tripeptide FITC-KYF/KYF או KYF. לבצע שלב זה מתחת למכסה המנוע.
    5. מערבבים את הפתרון ללילה בטמפרטורת החדר להתאדות ממיסים אורגניים ולאפשר הרכבה עצמית של FITC-KYF-Pt-NE או KYF-Pt-נברסקה
    6. לרכז את FITC-KYF-Pt-NE או KYF-Pt-NE ברכז צנטריפוגליות (10k MWCO), ולא תשטוף שלוש פעמים עם 4 מ"ל של המים nanopure.
    7. לאחסן את הפתרונות מימית של KYF-Pt-NE, FITC-KYF-Pt-NE ב 4 º C.
    8. ניתוח תוכן פלטינה בעזרת ספקטרוסקופיית בליעה אטומית (AAS), בעקבות המדריך של היצרן48.
      1. להתכונן עקומת כיול תקני פלטינה תמיסת HCl 10% (טווח אפקטיבי של AAS הוא בין 100 ל 1200 ppb (חלקים לביליון)).
      2. להמיס 50 µL של KYF-Pt-NE פתרון של שלב µL 2.2 ל-100 של aqua regia (תערובת 3:1 של חומצת מלח מרוכזת, חומצה חנקתית) ומשאירים בטמפרטורת החדר במשך הלילה. הוסף µL 850 של מים להגיע נפח דגימה הסופי של 1 מ"ל. לנתח את הדגימה באמצעות AAS. ריכוז החומצה הסופי צריך להיות 10% כל הדגימות שנותחה.
      3. להקליט את הקריאה של ריכוז נק' ב- ppb, לחשב את התוכן פלטינה הסופי המדגם (חשבון עבור מדגם דילול ונפח הראשונית של nanoemulsion).

3. קונאפוקלית הדמיה של ספיגת הסלולר של FITC-KYF-Pt-NE

  1. זרע 6 שורות תאים סרטן השחלות (A2780 CP70, SKOV3, OV90, TOV21G, ES2), 4 מנות קונאפוקלית טוב-הקאמרית-הצפיפות של 4.7 x 104 תאים לכל תא, מראש תרבות בין לילה ב 37 º C.
  2. לאחר 24 שעות, לשטוף את התאים שלוש פעמים עם פוספט מאגר סליין (הציבורי), דגירה עם FITC-KYF-Pt-NE תא תרבות בינוני (ראה שלב 6.1 תא קו פרטים ספציפיים) למשך 15 דקות ב 37 º C.
  3. לאחר דגירה, מסיר את המדיה, לשטוף את התאים שלוש פעמים עם PBS.
  4. לתקן את התאים עם מתנול קר במשך 5 דקות ב-20 ° C, לשטוף שלוש פעמים עם 1 מ"ל ל- PBS.
  5. Permeabilize התאים עם 1 מ"ל של 0.1% טריטון-X 10 דקות בטמפרטורת החדר, שטיפת שלוש פעמים עם 1 מ"ל ל- PBS.
  6. דגירה התאים במשך 90 דקות עם נוגדנים LAMP1 מצומדת עם אלקסה עבור חיל הים 647 (1 מ"ל) ב- 1:50 דילול ב- PBS בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, לשטוף את התאים 3 פעמים עם PBS.
  7. הפתרון מניות דאפי (1 מ"ג/מ"ל) 1 מ"ג/מ"ל ב- PBS מדולל. לאחר מכן, להוסיף 1 מ"ל של הפתרון מדולל בכל תא, תקופת דגירה של 15 דקות בטמפרטורת החדר. לשטוף את התאים 3 פעמים עם PBS.
  8. הר coverslips בשקופית באמצעות הרכבה בינונית.
  9. תמונה של תאים באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי תא חי-גל עירור של 405 ננומטר, 488 ננומטר, 633 ננומטר. קבע את הפרמטרים זיהוי כדלקמן: עוצמת הלייזר של 0.2%, לא יותר מ-1%, יחידת? רקוב 1 אוורירי, לזכות מאסטר אופסט דיגיטלי 650-750, 0.
  10. תמונה פתוחה בתוכנות ליצירת תמונות. תחת התמונה המוצגת, בחר גרפיקה , בחר סרגל סרגל Insertלהוספת סרגל קנה מידה על התמונה.

4. סמים שחרור ללימודים

  1. לבצע את המחקרים שחרור התרופה ב- PBS. התאימו את ערכי ה-pH של שלושה מאגרי PBS 7.4, 6.8, 5.0 בהתאמה.
  2. לדלל 5 μL של KYF-Pt-NE ב 180 μL pH המתאים PBS המאגר, להעביר 3.5 kDa MWCO דיאליזה מיני גביע, דגירה ב 37 ° C ב- PBS.
  3. להסיר את מאגר כל צינורות דיאליזה מיני 3-2, 4, 6, 24, 48 ו- 140 h, ולמדוד את הריכוזים פלטינה על ידי AAS. להכין כל דוגמאות לפי שלב 2.2.8 אבל לכוונן את עוצמת הקול הסופי לדוגמה כדי 500 µL.

5. תא תרבות שיטות

  1. תרבות תא קווים A2780, CP70, SKOV-3, OV-90, טוב - 21G, ES-2 תא תרבות בינוני (DMEM) בתוספת עם 10% (A2780, CP70, SKOV-3, ES-2) או עם 15% (טוב - 21G, OV-90) העובר סרום שור (FBS), עם-גלוטמין ו פניצילין/סטרפטומיצין. לגדול כל התאים ב- 5% CO2, האווירה רווי מים ב 37 º C.
  2. הזרע 3 x 105 תאים כל צלחת 96-ובכן ותרבות מראש ללילה עבור ניסויים במבחנה הדגירה. הכינו את הפתרונות KYF-Pt-NE, ציספלטין ו carboplatin במים. התאם את הריכוז של Pt(II) ב KYF-Pt-NE כדי להתאים את ריכוז carboplatin, ציספלטין עבור כל קו תא. תקופת דגירה של 72 שעות ב 37 º C.
  3. לאחר דגירה, להעריך את הכדאיות הסלולר באמצעות וזמינותו של ערכי צבע מוחלטים (וזמינותו MTT התפשטות תאים). בקצרה, הסר בינוני ולהוסיף μL 110 של 10% MTT בינוני לכל טוב ואני תקופת דגירה של 2 h ב- 37 מעלות צלזיוס. ואז להוסיף אבקת μL 100 מכל קידוח, תקופת דגירה של 5 שעות ב 37 º C.
  4. בדוק את ספיגת-570 nm באמצעות צלחת הקורא. לנתח את התוצאות באמצעות ניתוח סטטיסטי עם מבחן Z P-test.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

תמונת TEM נציג של KYF-Pt-NE שהוכנו באמצעות פרוטוקול זה מוצג באיור 2A. KYF-Pt-נס הם כדורי במורפולוגיה, ובכן התפזרו, אחידים בגודלם. הקוטר הליבה של KYF-Pt-נס, נמדדו ישירות מתוך שלוש תמונות TEM עם מינימום של 200 מידות הכבוד, הוא 107 ± 27 ננומטר. הקוטר hydrodynamic של KYF-Pt-NE, נותחה באמצעות ספקטרוסקופית אור דינאמי (DLS), נמצאה להיות 240 nm עם מדד polydispersity 0.156. פוטנציאל זטה של KYF-Pt-NE במים נקבע עבור שלושה syntheses עצמאית עם הערך הממוצע של-60.1 mV. היקף הפוטנציאל גבוה מצביע על יציבות colloidal טוב של ניסוח, טעינת משטח שלילי מיוחס מיונן COO– קבוצות השטח של חומצות אולאית. נקודת לגירויי כאב של KYF הוא 8.59, לכן זה טעונה באופן חיובי ב- pH נייטרלי.

היכולת של nanoemulsions לחצות את הממברנה התאית נבדקה באמצעות הקווים תא שכותרתו fluorescently FITC-KYF-Pt-NE השחלות וסרטן. התוצאות מוצגים באיור 2B. זה ניתן לראות בבירור כי FITC-KYF-Pt-נס (ירוק) מופצים בתוך ציטוזול אך לא היו עדיין קשורים עם lysosomes (אדום). תוצאה זו ממחישה כי KYF-Pt-נס הזן תאים, יכול לשמש רכב משלוח סמים תאיים.

היציבות של KYF-Pt-נס, FITC-KYF-Pt-נס הוערכה עם DLS. הקוטר של nanoemulsions במים נמדדה במשך מספר חודשים, התוצאות מוצגים באיור3. הקוטר hydrodynamic של שני ניסוחים עלה בהדרגה במהלך 4 חודשים במחסן, עד 320 nm (KYF-Pt-NE) ו- 240 nm (FITC-KYF-Pt-NE), אבל הממדים הננומטרי נשתמרו. תוצאה זו עולה כי tripeptide KYF מייצבת ביעילות nanoemulsions במשך פרקי זמן ארוכים.

Pt(II) כימוס ויעילות לשחרר nanoemulsion נמדדו עם AAS. ריכוז Pt(II) ב KYF-Pt-NE הוקמה כדי להיות 10 wt.%. Pt(II) שחרור מן KYF-Pt-NE ב- pH 7.4 6.8 (פיזיולוגית), (interstitium של הגידול)49, ו- 5.0 (endosomal)50 מוצג באיור 4A. שחרור Pt(II) היא האיטית ביותר ב- pH 7.4 עם 20.8% בלבד של Pt(II) שוחרר לאחר 4 שעות, ואילו ב- pH 6.8 ו- 5.0 שחרורו היה 32.8% ו- 47.5%, בהתאמה. מגמה זהה גם המשיך אחרי 24 שעות ואחרי 6 ימים. תוצאה זו עולה כי שחרור Pt(II) KYF-Pt-NE pH תלויה, זה יכול להיות עיכוב מחזור מערכתי, מואצת, ברגע nanoemulsions translocate לתוך הגידול.

הפעילות הביולוגית של KYF-Pt-NE הוקמה במבחנה באמצעות הקווים באותו התא סרטן השחלות כמו מחקרי הדמיה. התאים היו מודגרות עם KYF-Pt-NE במשך 72 h, בריכוזים KYF-Pt-NE המתאים IC50 עבור כל קו תא. הכדאיות היה שימוש וזמינותו MTT והשוו התוצאות היו תאים בלבד, KYF-NE, המספר המשלים acids-Pt(II) האולאית, carboplatin של ציספלטין. תוצאות פעילות ביולוגית של KYF-Pt-NE מוצגים באיור 4B. KYF-Pt-NE צמצמה את הכדאיות של שורות תאים isogenic A2780 (Pt רגיש) ואת CP70 (Pt עמיד) מאת 44.3% ו- 46.2% בהתאמה. Carboplatin, אנלוגי הרלוונטית קלינית, ירד הכדאיות על ידי 18.5% (A2780) ו- 9.6% (CP70) בלבד. המגמה זהה של השפעה רבה יותר KYF-Pt-NE על מות תאים נצפתה על פני שורות תאים אחרים גם כן. הכדאיות של תאים טוב - 21G רגיש Pt(II) צומצם ב- 55.9% לאחר דגירה עם KYF-Pt-NE, בעוד carboplatin הביא להורדת הכדאיות על ידי רק 16.5%. בתאים OV-90 בהתנגדות Pt(II) ביניים, הכדאיות הונמך מאת 55.3% (KYF-Pt-NE) ו- 23.9% (carboplatin). שני עמידים סרטן התא הקווים, ES-2 ו- SKOV-3, הראה הפחתה הכדאיות על ידי 45.9% ו- 54.3%, בהתאמה, עבור KYF-Pt-נה, ו- 10.3% (ES-2) ו- 16.8% (SKOV-3) עבור carboplatin.

הפעילות הביולוגית של KYF-Pt-NE לעומת ציספלטין גם נמשל. ציספלטין הוא הסוכן מבוסס-Pt II של הדור הראשון שמפלה כבר לא במרפאה בשל הפרופיל שלה רעילות51. בשתי שורות תא, SKOV-3 וטוב - 21G, ההפחתה הכדאיות היה גדול על ידי 15% ו- 40%, בהתאמה, עבור KYF-Pt-NE מאשר ציספלטין. שורות תאים הנותרים, הפעילות של KYF-Pt-NE מאימון ציספלטין (A2780, CP70, OV-90), או מעט נמוך (ES-2). המספר המשלים acids-Pt(II) האולאית נמצאה גם להיות פעילים ביולוגית. עם זאת, KYF-Pt-NE הראו הפחתה גבוהה יותר הכדאיות יותר לחשב את המשלים שלו ברוב הקווים תא נבדק, המציין את המשמעות של nanoformulation בפעילות Pt(II).

היישומים הביולוגי של מערכות nanoparticulate דורשים יציבות במדיה ביולוגית רלוונטית, ולכן היציבות של KYF-Pt-NE הוערך ב- 20% סרום שור עוברית (FBS), התוצאות מוצגים באיור 4C. גילינו אין עדות KYF-Pt-NE opsonization בנסיוב אחרי יום אחד של דגירה.

Figure 1
איור 1. הרכיבים של nanoemulsions (למעלה), תיאור סכמטי של הכנת nanoemulsion (למטה). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
באיור 2. תמונת TEM של KYF-Pt-NE (א) ומיקרוסקופ קונפוקלי תמונות של ספיגת FITC-KYF-Pt-NE (ירוק) על ידי תאים סרטניים בשחלות (גרעינים כחולות, אדומות lysosomes) (B). גודל ברים הם 10 μm. איור זה הותאם באישור Bioconjugate כימיה 2018, 29, 2514-2519. 46 זכויות יוצרים 2018 אמריקאי כימית בחברה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3. יציבות של KYF-Pt-NE, FITC-KYF-Pt-NE במים. כל נקודה מייצגת את וסטיית של N = 3 ו- p <0.005. איור זה הותאם באישור Bioconjugate כימיה 2018, 29, 2514-2519. 46 זכויות יוצרים 2018 אמריקאי כימית בחברה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
באיור 4. KYF-Pt-NE יציבות ופעילות ביולוגית. Pt(II) (א) שחרור של KYF-Pt-NE במאגר PBS ב- pHs שונים (PBS, 37 ° C). הכדאיות הסלולר של שורות תאים שונים סרטן השחלות לאחר דגירה 72 h עם KYF-Pt-NE (B). כל עמודה מייצגת את וסטיית של N = 3, p <0.005. ריכוז קבוע בכל שורה התא, הם כדלקמן: 4.92 מ"מ (A2780), מ"מ 8.80 (CP70), מ מ 2.46 (טוב - 21 גרם), מ"מ 9.84 (SKOV3), מ"מ 7.38 (ES-2), 19.7 mM (OV-90). הריכוז של המספר המשלים acids–Pt(II) KYF-Pt-NE, האולאית הותאם ביחס לתוכן Pt(II) נמדדת AAS. קיצורים: "Carbpt" – carboplatin; "KYF-נה" – KYF מצופים tripeptide nanoemulsion; "KYF-Pt-NE" – nanoemulsion מצופים tripeptide KYF המכיל Pt(II); Cispt – ציספלטין; Pt-האולאית – המספר המשלים acids–Pt(II) אולאית. (ג) KYF-Pt-NE יציבות בנסיוב. איור זה הותאם באישור Bioconjugate כימיה 2018, 29, 2514-2519. 46 זכויות יוצרים 2018 אמריקאי כימית בחברה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

השלבים הקריטיים של הסינתזה nanoemulsion כוללים התאמת יחס טוחנת סובסטרטים, שמירה על טמפרטורה וזרימת בקרת קצב במהלך הוספת acids–Pt(II) האולאית, מתן זמן מספיק הרכבה עצמית, מטהרים את המוצר באמצעות רכז צנטריפוגלי טורים. פרמטרים אלה משפיעים על גודל של המורפולוגיה של KYF-Pt-ששומר; לכן, חשוב במיוחד לשמור על יחס נאות טוחנת ולהתאים את התנאים סינתטי כראוי.

היחס של סובסטרטים במהלך הסינתזה nanoemulsion (שלב 3) הוא קריטי עבור תהליך הרכבה עצמית וקובעת לגודל הסופי של המוצר. KYF acid-Pt(II) האולאית טוחנת יחס 1:3, ריכוז אופטימלי tripepide KYF במים הוא 0.2 מ מ. בנוסף, הממס האורגני להשתמש כדי להמיס את המספר המשלים acid-Pt(II) האולאית בשלב 3.1 חייב להיות miscible עם מים, תואם עם מערכת סינון, ואת אויר בקלות בטמפרטורת החדר.

אחד השלבים הקריטיים הוא תוספת dropwise המספר המשלים acid-Pt(II) האולאית לפתרון KYF (שלב 3.4). הזרם לא צריכה להיות איטית יותר מאשר 0.1 מ"ל לדקה, לא מהר יותר 0.2 מ ל/דקה, כי מהירות תת אופטימלית יכול לגרום את המשקעים של nanoemulsion. כמו כן, המספר המשלים acids–Pt(II) האולאית צריך להתווסף הפתרון KYF ב 37 מעלות צלזיוס תוך ערבוב את התערובת על מגש stir ב 600 סל ד. לאחר כל acid-Pt(II) האולאית נוספה, יש לשמור את הפתרון-בטמפרטורת החדר ומהירות מלהיב ירד ל 150 סל ד. שלב 3.5 צריכה להתבצע בטמפרטורת החדר. הזמן האופטימלי הרכבה עצמית KYF-Pt-NE (שלב 3.5) הוא 24 שעות.

יש סכנה כי המוצר עשוי לזרז ואילו nanoemulsion להיות מרוכזת מראש. לכן, מומלץ כי nanoemulsion להיות מדולל עם מים נוספת לפני להיות centrifuged, רכז צנטריפוגלי, טוו לא מהר יותר 2,465 x g. להוסיף את nanoemulsions מדולל במסוע צנטריפוגליות-aliquots בין מהדורות, nanoemulsion צריך להיות מעורב במסנן לפני החלק הבא יתווסף.

היכולת nanoemulsions טופס עם חומצות שומן נגזרים מלבד חומצה אולאית לא נבדק והוא עדיין נקבע. יישומים עתידיים עשויים לכלול השימוש של פפטידים שונים כדי להקל על ההרכבה שיתוף עם חומצה אולאית. כמו כן, חומצה אולאית conjugates עם תרופות שאינן מבוססות על פלטינה עשוי לשמש ליבות פוטנציאליות של nanoemulsions.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

מחברים אין ניגוד אינטרסים לחשוף.

Acknowledgments

אנו להכיר בהכרת תודה תמיכה כספית נדיבה של המכון הלאומי לסרטן, הענק SC2CA206194. אין אינטרסים כלכליים מתחרים מוצהרים.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-(1H-benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium
tetrafluoroborate (TBTU)		 ANASPEC INC.: AS-20376 SPPS
4-well chamber confocal dish Lab-Tek II, Thermo Fisher Scientific 154526 For imaging
6-bromohexanoic acid Chem-Impex INT’L INC. 24477 Click modification for peptide
A2780 Generously doanted by professor John Martignetti from The Mount Sinai Hospital Ovarian cancer cell line
Barnstead Nanopure Thermo Fisher D11901 water filtration system
BUCHI rotavapor R-3 Buchi Z568090 For solvent removal and sample drying
Centrifuge 5810 R eppendorf 5811F For platinum complex separation
Cis-dichlorodiamineplatinum (II) 99% Acros Organics 19376-0050 in vitro tests
CP70 Generously doanted by professor John Martignetti from The Mount Sinai Hospital Ovarian cancer cell line
Digital water bath VWR 97025-134 For warming up media for cell culture
Dynamic Light Scattering (DLS) Brookhaven Instrument Corporation For nanoparticle size measurments
ES-2 ATCC CRL-1978 ovarian cancer cell line
Fmoc-L-Lys(Boc)-OH 99.79% Chem-Impex INT’L INC. 00493 SPPS
Fmoc-L-Phe 4-alkoxybenzyl alcohol resin (0.382 meq/g), Chem-Impex INT’L INC. 01914 SPPS
Fmoc-LTyr(tBu)-OH 98% Alfa Aesar H59730 SPPS
HERACELL 150i CO2 incubator Thermo Scientific Fisher incubator
High pressure syringe pump New Era 1010-US For platinum complex addition in nanoparticle synthesis
Hotplate/stirrer VWR 12365-382 For sample stirring and heating
LAMP-1 Antibody(cojugated with Alexa Fluor 647) Santa Cruz Biotechnology sc-18821 AF647 For imaging
N,N-diisopropylethylamine (DIPEA) Oakwood Chemical 005027 SPPS
Ninhydrin 99% Alfa Aesar A10409 Kaiser test
Oleic acid Chem-Impex INT’L INC. 01421 For platinum complex synthesis
OV90 ATCC CRL-11732 Ovarian cancer cell line
PBS Corning 21-031-CV For cell wash
Permount mounting medium Fisher Chemical SP15-100 For imaging
Phenol Fisher Chemical A92500 Kaiser test
Phosphotungstic acid Fisher Chemical A248-25 negative stain for TEM
Piperidine 99% BTC 219260-2.5L SPPS
Platinum AAS standard soultion Alfa Aesar 88086 1000ug/ml for calibration curve
Propargyl bromide 97% Alfa Aesar L10595 For alkyne modification of fluoresceine
Scientific biological cabinet Thermo Scientific Fisher 1385 Bio-hood for cell culture
Self-Cleaning Vacuum System Welch 2028 Vacuum pump for rotavapor
Silver nitrate Acros Organics 19768-0250 Cisplatin activation
SKOV3 ATCC HTB-77 Ovarian cancer cell line
Sodium hydroxide Fisher Scientific S313-1 For platinum complex synthesis
Tin (II) chloride Sigma Aldrich 208256 Test for Platinum presence
TOV21G ATCC CRL-11730 Ovarian cancer cell line
Trifluoroacetic acid 99% (TFA) Alfa Aesar L06374 SPPS
Triisopropylsilane (TIPS) Chem-Impex INT’L INC. 01966 SPPS
Triton-X Sigma Aldrich T8787-100ML For imaging
Uranine powder 40% Fisher Scientific S25328A For alkyne modification of fluoresceine
Vivaspin 20 (10000 MWCO) Sartorious VS2001 For Nanoparticle wash and condensation
VWR Inverted Microscope VWR 89404-462 For cell culture monitoring

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Agrahari, V., Agrahari, V., Mitra, A. K. Nanocarrier fabrication and macromolecule drug delivery: challenges and opportunities. Therapeutic Delivery. 7 (4), 257-278 (2016).
  2. Anselmo, A. C., Mitragotri, S. Nanoparticles in the clinic. Bioengineering & Translational Medicine. 1 (1), 10-29 (2016).
  3. Peer, D., Karp, J. M., Hong, S., Farokhzad, O. C., Margalit, R., Langer, R. Nanocarriers as an emerging platform for cancer therapy. Nature Nanotechnology. 2 (12), 751-760 (2007).
  4. Roy Chowdhury, M., Schumann, C., Bhakta-Guha, D., Guha, G. Cancer nanotheranostics: Strategies, promises and impediments. Biomedicine & Pharmacotherapy. 84, 291-304 (2016).
  5. Jeevanandam, J., Chan, Y. S., Danquah, M. K. Nano-formulations of drugs: Recent developments, impact and challenges. Biochimie. , 99-112 (2016).
  6. Meerum Terwogt, J. M., Groenewegen, G., Pluim, D., Maliepaard, M., Tibben, M. M., Huisman, A., ten Bokkel Huinink, W. W., Schot, M., Welbank, H., Voest, E. E., Beijnen, J. H., Schellens, J. M. Phase I and pharmacokinetic study of SPI-77, a liposomal encapsulated dosage form of cisplatin. Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 49 (3), 201-210 (2002).
  7. Fan, Z., Sun, L., Huang, Y., Wang, Y., Zhang, M. Bioinspired fluorescent dipeptide nanoparticles for targeted cancer cell imaging and real-time monitoring of drug release. Nature Nanotechnology. 11 (4), 388-394 (2016).
  8. Jeong, Y., et al. Enzymatically degradable temperature-sensitive polypeptide as a new in-situ gelling biomaterial. Journal of Controlled Release. 137 (1), 25-30 (2009).
  9. Uesaka, A., et al. Morphology control between twisted ribbon, helical ribbon, and nanotube self-assemblies with his-containing helical peptides in response to pH change. Langmuir. 30 (4), 1022-1028 (2014).
  10. Hwang, W., Marini, D. M., Kamm, R. D., Zhang, S. Supramolecular structure of helical ribbons self-assembled from a B-sheet peptide. Journal of Chemical Physics. 118 (1), 389-397 (2003).
  11. Svobodova, J., et al. Poly(amino acid)-based fibrous scaffolds modified with surface-pendant peptides for cartilage tissue engineering. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 11 (3), 831-842 (2017).
  12. Kumar, V. A., et al. Highly angiogenic peptide nanofibers. ACS Nano. 9 (1), 860-868 (2015).
  13. Romera, D., Couleaud, P., Mejias, S. H., Aires, A., Cortajarena, A. L. Biomolecular templating of functional hybrid nanostructures using repeat protein scaffolds. Biochemical Society Transactions. 43 (5), 825-831 (2015).
  14. Medina, S. H., Schneider, J. P. Cancer cell surface induced peptide folding allows intracellular translocation of drug. Journal of Controlled Release. 209, 317-326 (2015).
  15. Recio, C., Maione, F., Iqbal, A. J., Mascolo, N., De Feo, V. The Potential Therapeutic Application of Peptides and Peptidomimetics in Cardiovascular Disease. Frontiers in Pharmacology. 7, 526 (2016).
  16. McCarthy, K. A., et al. Phage Display of Dynamic Covalent Binding Motifs Enables Facile Development of Targeted Antibiotics. Journal of the American Chemical Society. 140 (19), 6137-6145 (2018).
  17. Lazar, V., et al. Antibiotic-resistant bacteria show widespread collateral sensitivity to antimicrobial peptides. Nature Microbiology. 3 (6), 718-731 (2018).
  18. Czeczor, J. K., McGee, S. L. Emerging roles for the amyloid precursor protein and derived peptides in the regulation of cellular and systemic metabolism. Journal of Neuroendocrinology. 29 (5), (2017).
  19. Branco, M. C., Sigano, D. M., Schneider, J. P. Materials from peptide assembly: towards the treatment of cancer and transmittable disease. Current Opinion in Chemical Biology. 15 (3), 427-434 (2011).
  20. Cheetham, A. G., et al. Targeting Tumors with Small Molecule Peptides. Current Cancer Drug Targets. 16 (6), 489-508 (2016).
  21. Ndinguri, M. W., Solipuram, R., Gambrell, R. P., Aggarwal, S., Hammer, R. P. Peptide targeting of platinum anti-cancer drugs. Bioconjugate Chemistry. 20 (10), 1869-1878 (2009).
  22. Eskandari, S., Guerin, T., Toth, I., Stephenson, R. J. Recent advances in self-assembled peptides: Implications for targeted drug delivery and vaccine engineering. Advanced Drug Delivery Reviews. 110, 169-187 (2017).
  23. Zhou, J., Du, X., Yamagata, N., Xu, B. Enzyme-Instructed Self-Assembly of Small D-Peptides as a Multiple-Step Process for Selectively Killing Cancer Cells. Journal of the American Chemical Society. 138 (11), 3813-3823 (2016).
  24. Sun, J. E., et al. Sustained release of active chemotherapeutics from injectable-solid beta-hairpin peptide hydrogel. Biomaterials Science. 4 (5), 839-848 (2016).
  25. Lock, L. L., Reyes, C. D., Zhang, P., Cui, H. Tuning Cellular Uptake of Molecular Probes by Rational Design of Their Assembly into Supramolecular Nanoprobes. Journal of the American Chemical Society. 138 (10), 3533-3540 (2016).
  26. Kalafatovic, D., Nobis, M., Son, J., Anderson, K. I., Ulijn, R. V. MMP-9 triggered self-assembly of doxorubicin nanofiber depots halts tumor growth. Biomaterials. 98, 192-202 (2016).
  27. Frederix, P. W., et al. Exploring the sequence space for (tri-)peptide self-assembly to design and discover new hydrogels. Nature Chemistry. 7 (1), 30-37 (2015).
  28. Horsley, J. R., et al. Photoswitchable peptide-based 'on-off' biosensor for electrochemical detection and control of protein-protein interactions. Biosensors and Bioelectronics. 118, 188-194 (2018).
  29. Hoyos-Nogues, M., Gil, F. J., Mas-Moruno, C. Antimicrobial Peptides: Powerful Biorecognition Elements to Detect Bacteria in Biosensing Technologies. Molecules. 23 (7), 1683 (2018).
  30. Xiao, X., et al. Advancing Peptide-Based Biorecognition Elements for Biosensors Using in-Silico Evolution. ACS Sensors. 3 (5), 1024-1031 (2018).
  31. Puiu, M., Bala, C. Peptide-based biosensors: From self-assembled interfaces to molecular probes in electrochemical assays. Bioelectrochemistry. 120, 66-75 (2018).
  32. Wang, J., et al. Developing a capillary electrophoresis based method for dynamically monitoring enzyme cleavage activity using quantum dots-peptide assembly. Electrophoresis. 38 (19), 2530-2535 (2017).
  33. Etayash, H., Thundat, T., Kaur, K. Bacterial Detection Using Peptide-Based Platform and Impedance Spectroscopy. Methods in Molecular Biology. 1572, 113-124 (2017).
  34. Handelman, A., Apter, B., Shostak, T., Rosenman, G. Peptide Optical waveguides. Journal of Peptide Science. 23 (2), 95-103 (2017).
  35. Chen, C., Liu, K., Li, J., Yan, X. Functional architectures based on self-assembly of bio-inspired dipeptides: Structure modulation and its photoelectronic applications. Advances in Colloid and Interface Science. 225, 177-193 (2015).
  36. Reddy, S. M., Shanmugam, G. Role of Intramolecular Aromatic pi-pi Interactions in the Self-Assembly of Di-l-Phenylalanine Dipeptide Driven by Intermolecular Interactions: Effect of Alanine Substitution. Chemphyschem. 17 (18), 2897-2907 (2016).
  37. Marchesan, S., et al. Unzipping the role of chirality in nanoscale self-assembly of tripeptide hydrogels. Nanoscale. 4 (21), 6752-6760 (2012).
  38. Scott, G. G., McKnight, P. J., Tuttle, T., Ulijn, R. V. Tripeptide Emulsifiers. Advanced Materials. 28 (7), 1381-1386 (2016).
  39. Galanski, M., Jakupec, M. A., Keppler, B. K. Update of the preclinical situation of anticancer platinum complexes: novel design strategies and innovative analytical approaches. Current Medicinal Chemistry. 12 (18), 2075-2094 (2005).
  40. Wheate, N. J., Walker, S., Craig, G. E., Oun, R. The status of platinum anticancer drugs in the clinic and in clinical trials. Dalton Transactions. 39 (35), 8113-8127 (2010).
  41. Oberoi, H. S., Nukolova, N. V., Kabanov, A. V., Bronich, T. K. Nanocarriers for delivery of platinum anticancer drugs. Advanced Drug Delivery Reviews. 65 (13-14), 1667-1685 (2013).
  42. Fichtinger-Schepman, A. M., van Oosterom, A. T., Lohman, P. H., Berends, F. cis-Diamminedichloroplatinum(II)-induced DNA adducts in peripheral leukocytes from seven cancer patients: quantitative immunochemical detection of the adduct induction and removal after a single dose of cis-diamminedichloroplatinum(II). Cancer Research. 47 (11), 3000-3004 (1987).
  43. Englander, E. W. DNA damage response in peripheral nervous system: coping with cancer therapy-induced DNA lesions. DNA Repair. 12 (8), 685-690 (2013).
  44. Galluzzi, L., et al. Molecular mechanisms of cisplatin resistance. Oncogene. 31 (15), 1869-1883 (2012).
  45. Boeckman, H. J., Trego, K. S., Turchi, J. J. Cisplatin sensitizes cancer cells to ionizing radiation via inhibition of nonhomologous end joining. Molecular Cancer Research. 3 (5), 277-285 (2005).
  46. Dragulska, S. A., et al. Tripeptide-Stabilized Oil-in-Water Nanoemulsion of an Oleic Acids-Platinum(II) Conjugate as an Anticancer Nanomedicine. Bioconjugate Chemistry. 29 (8), 2514-2519 (2018).
  47. Martinez Rivas,, J, C., et al. Nanoprecipitation process: From encapsulation to drug delivery. International Journal of Pharmaceutics. 532 (1), 66-81 (2017).
  48. Agilent Technologies. Analytical Methods for Graphite Tube Atomizers, User's Guide Manual, 8th edition. , (2012).
  49. Park, S. Y., et al. A smart polysaccharide/drug conjugate for photodynamic therapy. Angewandte Chemie. 50 (7), 1644-1647 (2011).
  50. Canton, I., Battaglia, G. Endocytosis at the nanoscale. Chemical Society Reviews. 41 (7), 2718-2739 (2012).
  51. Lokich, J., Anderson, N. Carboplatin versus cisplatin in solid tumors: an analysis of the literature. Annals of Oncology. 9 (1), 13-21 (1998).

Tags

בביו-הנדסה גיליון 144 Nanoemulsion חומצה אולאית tripeptide טיפול נגד סרטן הדמיה ביולוגי תרופות
Nanoemulsion מיוצב Tripeptide של חומצה אולאית
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dragulska, S. A., Wlodarczyk, M. T., … More

Dragulska, S. A., Wlodarczyk, M. T., Poursharifi, M., Martignetti, J. A., Mieszawska, A. J. A Tripeptide-Stabilized Nanoemulsion of Oleic Acid. J. Vis. Exp. (144), e59034, doi:10.3791/59034 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter