Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

נוהל הפעלה רגיל של מעקב וירוס של אוכלוסיית העטלף בטייוואן

Published: August 27, 2019 doi: 10.3791/59421
Automatic Translation
1, 2,3, 1, 1, 1, 1, 1
1Animal Health Research Institute, Council of Agriculture, Executive Yuan, 2Institute of Ecology and Evolutionary Biology, National Taiwan University, 3Bat Conservation Society of Taipei

Summary

פרוטוקול זה מציג נוהל הפעלה מעבדה סטנדרטית עבור בדיקות אבחון של אנטיגנים lyssavirus ירוס בעטלפים בטייוואן.

Abstract

וירוסים בתוך הסוג lyssavirus הם zoonotic פתוגנים, ולפחות שבעה מינים lyssavirus קשורים למקרים אנושיים. בגלל עטלפים הם מאגרי הטבע של רוב lyssaviruses, תוכנית מעקב lyssaviruses של עטלפים נערך בטייוואן מאז 2008 כדי להבין את האקולוגיה של וירוסים אלה עטלפים. בתוכנית זו, ארגונים לא ממשלתיים לשימור ומרכזים מקומיים לבקרת מחלות בעלי חיים שיתפו פעולה לאיסוף עטלפים מתים או עטלפים המתים מחולשה או ממחלות. רקמות המוח של עטלפים הושגו באמצעות נקרופסי ונתון לבדיקה אנטי פלואורסצנט פלורסנט ישירה (FAT) והפוכה תמלול שרשרת פולימראז (RT-PCR) לאיתור של אנטיגנים lyssavirus וחומצות גרעין. עבור ה-FAT, מומלץ לפחות שתי שערי מעלה של אבחון כלבת. עבור ה-RT-PCR, שני סטים של התחל (JW12/N165-146, N113F/N304R) משמשים כדי להגביר רצף חלקי של הגן הנואופפרוטאין ליקיה. תוכנית ההשגחה הזאת עוקבת אחר. וירוסים וסוכני zoonotic אחרים בעטלפים טייוואן בת lyssavirus נמצא בשני מקרים של pipistrelllllllllllllllllllllllllllllllllllla ממצאים אלה צריכים ליידע את הציבור, אנשי הבריאות, ומדענים של הסיכונים הפוטנציאליים של יצירת קשר עם עטלפים וחיות בר אחרות.

Introduction

וירוסים בתוך הסוג Lyssavirus הם zoonotic פתוגנים. יש לפחות שבעה מינים ליסביסםקשורים למקרים אנושיים1. בנוסף 16 מינים בסוג זה1,2,3, טייוואן בת lyssavirus (twblv)4 ו kotalahti בת lyssavirus ירוס5 זוהו לאחרונה עטלפים, אבל המצבים הטקמיים שלהם עדיין לא להיקבע.

עטלפים הם המארחים הטבעיים של מרבית lyssaviruses, למעט מוקדי lyssaviruses וירוס ikoma, אשר עדיין לא זוהו בכל עטלפים1,2,3,6. המידע על lyssaviruses בעטלפים אסיאתי עדיין מוגבל. שניים מהווירוסים הבלתי מאופיינים בעטלפים אסיאתיים (אחד בהודו והאחר בתאילנד)7,שמונה דווחו. אחד מהמקרים האנושיים הקשורים לנשיכת עטלף בסין דווח ב-2002, אבל האבחנה נעשתה רק על ידי התבוננות קלינית9. במרכז אסיה, וירוס lyssavirus נגיף זוהה בתוך העכבר הקטן אוזן אוזניים (Myotis בליית) בקירגיסטאן ב 1991, ו-וירוס ליסרו היתה מזוהה בעטלף השפם (myotis myסטרינוס) בטג'יקיסטן ב 200110. בדרום אסיה, העטלף ליסביססביט היה מזוהה ב שועל ההודי המעופף (פטרפוס medius) בסרי לנקה ב 20153. בדרום מזרח אסיה, מספר מחקרים סרולוגיים על עטלפים בפיליפינים, תאילנד, בנגלדש, קמבודיה, ו וייטנאם הראו משתנה seropreערכיות11,12,13,14, . חמש עשרה למרות Irkut lyssavirus זוהה במחבט גדול יותר-חוטם (Murina leucogaster) במחוז ג ' ילין, סין ב 201216, המינים המדויקים מיקומים של lyssavirus באוכלוסיית העטלף מזרח אסיה נותרו לא ידועים.

כדי להעריך את הנוכחות של lyssavirus באוכלוסיות בת הטייוואנית, תוכנית מעקב העסקת הן שומן ישיר RT-PCR הופעלה. טייוואן בת lyssavirus זוהה בשני מקרים של pipistrelle יפני (Pipistrellus)4 ב 2016 – 2017. במאמר הנוכחי, הליך מעבדה בתקן הפעלה מוצג עבור lyssavirus ירוס מעקב של אוכלוסיית העטלף בטייוואן. תרשים הזרימה של אבחון ליסביזוירוס במעבדה שלנו מוצג באיור 1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. אמצעי זהירות בטיחות בטיפול בווירוסים

  1. ודא כי כל עובדי המעבדה המטפלים בדגימות העטלף מקבלים טיפול טרוםחשיפה לכלבתמניעה. לעקוב אחר רמות נוגדן הכלבת של העובדים מראש ולבחון אותם מחדש כל 6 חודשים17. הטיפול החיסון נגד כלבת נדרש עבור אלה שרמות הנוגדן שלהם נמוך מ 0.5 IU/mL17.
  2. בהתאם לתקנות אבטחה טיחות של המדינה שבה המעבדה ממוקמת, להבטיח כי ההליכים הבאים מבוצעים במעבדות ברמה אבטחה טיחות מתאימה (למשל, bsl-2 מעבדות בטייוואן ו bsl-3 מעבדות באוסטרליה), וכי עובדים מוסמכים כיום ללבוש ציוד הגנה אישית נאותה18.
    הערה: חיסון נגד כלבת מספק מעט ללא הגנה מפני וירוסים השייכים phylogroups II ו-III18. העובדים חייבים להיות מודעים לכך שמספר פתוגנים zoonotic זוהו בעטלפים19 וצריכים לטפל בדגימות תחת תנאי מעבדה ברמת בטיחות מתאימה עם ציוד הגנה אישי תקין.

2. אוסף דוגמאות

  1. השימוש נמצא מוצא חלש או מטורף חולה או גוויות.
    הערה: בעלי החיים החלשים או החולים מועברים לאגודת השימור של טאיפה לטיפול וטרינרי, בעוד שהגוויות נשלחות ישירות למכון לחקר בריאות החיות. שום עטלפים בריאים לא מורדמים. בתוכנית ההשגחה הזאת
  2. בעזרת מאפיינים מורפולוגיים20, יש אקולוג עטלף שיזהה מיני עטלף.
  3. לבצע ברקוד DNA של מינים בת כאשר lyssavirus חיובית מאובחנת, באמצעות הליכים שפורסמו בעבר21.
  4. שליחת דף מידע של כל קארקאס (אתר אוסף, מינים, סימנים קליניים וכו ').

3. נקרומי עטלף

  1. . הכינו חומרים
    1. הכינו לוח חיתוך נקי ומניחים. פד סופג סטרילי לנקרופסי
    2. הכינו צינורות איסוף לאיסוף אברי עטלף.
    3. הכינו מלקחיים חד פעמיים. ואזמלים לנקרופסי שינוי כלים בין נמק של כל עטלף. הכינו כדורי צמר גפן עם 70% אתנול לניקוי מלקחיים ואזמלים במהלך הדגימה.
    4. הכינו שני מיקרוסקופ לשומן. לאסוף דגימות טריות לתקן אותם בפתרון פורמלין לבדיקה histopathological.
  2. בדקו את כל הפתחים. החיצוניים לפני נקרופסי צלם את התכונות החיצוניות של העטלף, במיוחד את הראש, האוזניים והכנפיים, לבידול מינים.
  3. לאסוף דגימת ספוגית אוראלי. מניחים את המחבט בתוך הלוח שכיבה ולתקן את ראשו של המחבט עם מלקחיים. חותכים את העור לאורך קו האמצע של הcalvaria עם אזמל ומשוך את העור לצדדים לרוחב. חותכים את הגולגולת לאורך קו האמצע של הcalvaria עם אזמל ולפתוח אותו עם מלקחיים כדי לחשוף את רקמת המוח.
  4. להסיר את רקמת המוח מהגולגולת ומניחים אותו על מדכא לשון סטרילי או, ולעשות ריח הרושם מרקמת המוח (ראה שלב 4.2). לאסוף חתיכה קטנה של רקמת מוח טרי ולתקן אותו פורמלין לבדיקה histopathological. מכילים את רקמת המוח הנותרים בצינור עבור חילוץ חומצת גרעין.
  5. מלקחיים נקיים ואזמל עם כדורי צמר גפן לחלח עם 70% אתנול כדי להסיר רקמות שנשמרו בין אוסף הדגימה.
  6. מניחים את המחבט על הלוח בתוך שכיבה בראש ולתקן אותו על הלוח עם מחטים בשני הצדדים של הקצה ואת העקב הזנב.
  7. הזמן את העור לאורך קו האמצע של הגוף מלסת תחתונה לפי הטבעת. הרימו והפרידו את העור ואת רקמות השריר המשמשות בפינצטה. לאסוף את בלוטות הרוק, אשר נמצאים ליד עצם הלסת.
  8. הרם את עצם החזה מעט עם מלקחיים, וחתוך את עצם החזה ואת קיר הבטן לאורך קו האמצע עם אזמל. . תחתוך את הבריח עם אזמל לתקן את הצלעות שמאל וימין ללוח עם מחטים כדי לפתוח את חלל החזה.
  9. הקלט את הנגעים הדוחים ואת דרגת השינוי שלאחר המוות.
  10. הסר את רקמות הקרביים (כלומר, לב, ריאות, כבד, כליות, מעיים) מתוך הגווייה באמצעות מלקחיים ואזמל. לאסוף את דגימות הקרביים לפי הצורך למחקר עתידי.
    הערה: מומלץ לאסוף מדגמים כפולים. יש לאסוף אותו לאבחון מולקולרי, והשני צריך להיות קפוא ב-80 ° c עם או בלי מדיום הובלה ויראלי עבור תרבות ויראלית22.

4. הבדיקה הישירה של נוגדן פלורסנט (FAT)

  1. הפוך את הריח הרושם של רקמת המוח עבור FAT. בצע את ה-FAT כפי שמתואר בעבר18,23 עם השינויים הבאים.
  2. הפרד בעדינות את רקמת המוח מרקמת העצב המחובר עם מלקחיים והעברת רקמת המוח למקלות לשון סטרילית. חותכים את חתך המוח, כולל את גזע המוח והמוח החלק ה-18,23. לעשות ריח הרושם של רקמת המוח על ידי נגיעה קלה משטח לחתוך של רקמת המוח, ולחץ על השקופית על רקמת העדשה כדי להסיר את הרקמה העודפת.
  3. תקן את השקופיות עם אצטון ב-20 ° c עבור 30 דקות. נגב את השקופיות שנבדקו ואת הפקדים החיוביים והשליליים לפני הצביעת עם המשלים.
  4. שימוש בכל אחד משני התאים הנמכרים מבחינה מסחרית FITC מצובת נגד כלבת אנטיגן מומלץ מאוד23. קבע את ריכוז העבודה של המשלים המסחרי לפני ההכתמים הראשונים. שחרר את השערים מדולל באמצעות מסנן μM 0.45 מזרק על השקופיות ו מודלת את השקופיות ב 37 ° c עבור 30 דקות בתוך חדר רטוב.
  5. סוחטים את עודפי המשלים מהשקופיות ושוטפים את השקופיות עם תמיסת מלח מוזרמת פוספט (PBS) לאחר הדגירה.
  6. שחרר כמות קטנה של 10% גליצרול על השקופיות וכיסוי עם שקופיות כיסוי.
  7. בדוק את השקופיות עם מיקרוסקופ פלורסנט.

5. הפקת חומצת גרעין

  1. הוסף את הנפח המתאים של הגברת -10 (בינוני חיוני מינימלי שיושלם עם 10% סרום בקר עוברי) לרקמת המוח (10% w/v).
  2. המגון אכל את רקמת המוח עם חרוז פלדה 5 מ"מ במכשיר הומוגניצר וצנטריפוגה ב 825 x g עבור 10 דקות.
  3. לחלץ את חומצת הגרעין, הנפח הסופי של אשר הוא 50 μL, בתוך 200 μL של supernatant באמצעות מסחרית הכולל של חומצות גרעין מסחרי ערכת החילוץ עם מכשיר.

6. RT-PCR ואנליזה פיללוגנטית

הערה: מספר קבוצות פריימר פורסמו כדי לזהות את כל lyssaviruses ידועים או lyssaviruses ספציפיים. הפרוטוקול המתואר כאן הוא דוגמה לכך שהמעבדה שלנו משתמשת ואינה יכולה להתאים את כל הצרכים הניסיוניים. בחר צבעי יסוד מתאימים בהתאם לצורכי המעבדה.

  1. הכינו את מגיב אחד RT-PCR כדלקמן: להוסיף 5 μL של חומצות גרעין שחולצו לתערובת התגובה המכילה 2.5 μL של מאגר התגובה 10x, 0.5 μL של קדימה והפוך התחל (10 μM של כל אחד), 4 μL של 1.25 מ"מ dNTP, 0.3 μL של מעכב RNase (40 U/ , 0.3 μL של היפוך הטרנסקריפטאז (10 U/μL), 0.4 μL של DNA פולימראז (5 U/μL), ו 11.5 μL של מים מטופלים DEPC.
    הערה: מערכת התחל המשמשת בפרוטוקול זה היא JW12 (5 '-ATGTAACACCYCTACAATG-3 ') ו-N165-146 (5 '-הגלוטטקקטה-3 ')24. שינוי ההכנה של ריאגנטים ותנאי רכיבה על אופניים על פי סטים התחל בשימוש.
  2. בצע את הרכיבה על אופניים בתנאים הבאים: דגירה ב 42 ° c עבור 40 דקות; הדנטורציה ראשונית ב 94 ° c עבור 10 דקות; 35 מחזורים של 94 ° c עבור 30 s, 55 ° צ' עבור 30 s, ו 72 ° צ' עבור 30 s; ולבסוף, הארכה נוספת ב 72 ° c עבור 10 דקות.
  3. השתמש בערכות תחל אחרות או יותר כדי להגדיל את הרגישות האבחונית.
    1. השימוש N113F (5 '-gtaggatgctggg-3 ') ו-N304R (5 '-שימוש ב-3 ')25,26 כדי להכין את אחד השלבים RT-PCR מגיב כדלקמן: להוסיף 5 μl של חומצות גרעין שחולצו לתערובת תגובה המכילה 5 μl של מאגר 10x, 5 μl של התחל קדימה ואחורה (4 μM של כל אחד), 5 μL של 1.25 מ"מ dNTP, 0.5 μL של RNase מעכב (40 U/μL), 0.2 μL של היפוך ההמרה (10 U/μl), 1 μL של דנ א פולימראז (5 U/μl), ו-23.3 μL של מים מטופלים DEPC.
    2. בצע את הרכיבה על אופניים בתנאים הבאים: דגירה ב 42 ° c עבור 40 דקות; הדנטורציה ראשונית ב 95 ° c עבור 5 דקות; 35 מחזורים של 95 ° c עבור 1 דקות, 55 ° צ' עבור 1 דקות ו -20 s, 72 ו-c ° צלזיוס עבור 1 דקות; ולבסוף, הארכה נוספת ב 72 ° c עבור 10 דקות.
      הערה: בהתאם לצורכי המעבדה, בחר צבעי יסוד מתאימים לאבחון. N113F תוכנן במקור עבור הגברה וירוס כלבת, אבל זה לא יכול לעבוד טוב עבור lyssaviruses אחרים. הקבוצה של N113F ו N304R עובד היטב עבור וירוס כלבת (משתנה הגירית החמוס טייוואן) ו-lyssavirus ירוס בובת טייוואן. זה יהיה קל יותר להשיג רצפים שלמים של נואופלפרוטאין באמצעות סט של JW12 ו N304R התחל אם הווירוס lyssavirus ירוס מוגבר על ידי שני סטים לעיל התחל.
  4. לנתח את מוצר ה-PCR ב-2% האגג ג'ל ולהמחיש על ידי תאורה UV אור.
  5. רצף את מוצר ה-PCR באמצעות שירות רצף מסחרי.
  6. הזן או העלה את הרצף לדף האינטרנט של כלי היישור המקומי של נוקלאוטיד בסיסי חיפוש (הפיצוץ). בחר "אחרים (nr וכו ')" מסד הנתונים ולהזין את האורגניזם כמו Lyssavirus. בחר את האלגוריתם ממגיית האחרון והפעל את הפיצוץ.

7. בידוד וירוס

הערה: בצע בידוד וירוסים כאשר אחד מהם הוא ה-FAT או 2) ה-RT-PCR מציין חיוביות.

  1. המגון להפוך את הדגימה של המוח ב 10% (w/v) השעיה ב-זיכרון 10. צנטריפוגה ב 825 x g עבור 10 דקות.
  2. איחסן 200 μL של סופרנטנט עם השעיה של 3 x 106 mna (עכבר נוירובלסטומה) תאים 1 מ ל של הגברת -10 עבור 1 h ב 37 ° צ' עם 1% CO2. להעביר את המוח המגון הבולם התא לתוך 25 ס מ2 בקבוקון ולהוסיף 6 מ ל של זיכרון 10.
  3. לטפח 1 מ ל של המוח המגון המגון הבולם תא בתוך 4 היטב טפלון מצופה זכוכית שקופיות עם קוטר 6 מ"מ באותו זמן.
  4. לאחר 3 – 4 ימים של דגירה ב 37 ° צ' עם 1% CO2, לתקן את התאים על השקופית 4 טוב עם 100% אצטון (v/v).
  5. הכתם את השקופיות עם שני נוגדנים מצופי כלבת מעלה FITC בעקבות הצעדים 4.4 – 4.7. התאים נגועים כאשר ההכללות התאיים הם נחקרים. הקלט את אחוז התאים הנגועים.
  6. בצע טריסיזציה ותת-תרבות של תרבית התא שחוסנו כאשר השקופיות מוכתמות כשלילי:
    1. להסיר בינוני לשטוף את הבקבוקון עם 5 מ ל של PBS.
    2. להוסיף 1 מ ל טריפסין לבקבוקון ולהכות בחוזקה את החלק התחתון של הבקבוקון.
    3. הוסף 6 מ ל של זיכרון 10 והשהה מחדש את התאים.
    4. לשים את ההשעיה התא לתוך הבקבוקון רקמה חדשה (6 מ ל) על 4 שקופית גם (1 mL).
  7. חזור על שלבים 7.4 – 12.3 עד 100% הנגועים.
  8. לאסוף את סופרנטנט לאחר 24 שעות של דגירה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

מ 2014 עד מאי 2017, 332 בת גוויות מ -13 מינים נאספו עבור מעקב. . שני בדיקות חיוביות במקרה העטלף הראשון, את הרושם המוח נבדק שלילי באמצעות שומן עם אחד המסחרי FITC מצועם כלבת נגד נוגדנים (איור 2), בעוד RT-בדיקות העסקת כל אחת מערכות התחל (JW12/N165-146, N113F/N304R) הניב תוצאות חיוביות (איור 3). רצף של 428 bp של אמפליקון (מוגבר עם N113F/N304R והמכיל את הגן החלקי של נואופלפרוטאין) הושג. הרצף שלו היה נתון לביצוע שאילתות הפיצוץ של מסד הנתונים GenBank. התוצאה הראתה כי הרצף היה דומה lyssaviruses עם זהויות של פחות מ 79% (איור 4), תמיכה הזהויות של lyssaviruses שאותרו.

מאוחר יותר, שני וירוסים lyssaviruses בודדים בהצלחה משני המוחות האלה, ואת וירוסים אושרו על ידי FAT (איור 5) והרצף. Lyssavirus שזוהו הוגדר כמו טייוואן העטלף lyssavirus (TWBLV) מבוסס על ניתוח רצף4. במקרה השני, התוצאות שהתקבלו מהשומנים המעסיקים כל אחד משני הנוגדנים המסחריים FITC-מצומדת נגד כלבת לא עקביים, כפי שמתואר במקרה הראשון.

Figure 1
איור 1: טבלת האבחון של העטלף ליסביסוירוס.
תרשים זרימה המציג את התהליך הנוכחי ואת שיטות האבחון שבהם השתמשו המעבדה שלנו כעת. בידוד וירוס צריך להתבצע כאשר או בדיקת נוגדן ישירה או הפוך תגובת שרשרת פולימראז הוא חיובי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: שומן ישיר עם שני נוגדנים מסחריים FITC-מצופיים נגד כלבת של דחיסת המוח השלם מ-TWBLV מושפע עטלף מניב תוצאות לא עקביות.
מספר מקרה: 2016-2300: (א) השומן עם מגיב A (5x דילול), מפגין אותות חיוביים ירוק תפוח. (ב) השומן עם מגיב B, מראה תוצאה שלילית (20x דילול). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: המוצרים של RT-בדיקות העסקת שתי סטים פריימר.
התחל להשתמש בנתיבים 1 עד 3 היה JW12/N165-146, ואת גודל המוצר הצפוי היה 111 זוגות בסיס. התחל להשתמש בנתיבים 4 עד 6 היה N113F/N304R, ואת גודל המוצר הצפוי היה 521 זוגות בסיס. שתי הבדיקות של המדגם (נתיבים 1 ו-4) היו חיוביות. M = 100 הסולם DNA bp; נתיבים 1 ו-4 = מדגם נבדק; נתיבים 2 ו-5 = בקרות חיוביות; נתיבים 3 ו-6 = שלילי שולט. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: תוצאת הפיצוץ של המוצר N113F/N304R של העטלף נגוע TWBLV.
תוצאות הפיצוץ הראו כי המקרה היה דומה ביותר ל lyssavirus, אבל הזהות עם lyssavirus במסד הנתונים היה רק 79%. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: השוואה של התפלגות אנטיגן lyssavirus ירוס של בידוד וירוסים של TWBLV עם שני מצובי כלבת מעלה FITC.
את המוח 10% תחליב (TWBLV נגוע) חוסנו לתוך העכבר בתאי נוירובלסטומה לבידוד וירוסים. השומנים בוצעו במעבר העשירי והוכתם בשני נוגדנים נגד כלבת בעלי FITC. התפלגות אנטיגן של תאים נוירובלסטומה של העכבר עם שני שערי מצובי כלבת הראו הבדלים משמעותיים. (א) השומן עם מגיב (5 x דילול). (ב) השומן עם מגיב ב (5 x דילול). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הליך זה תקן מעבדה הפעלה (SOP) מספק תהליך טורי לבדיקת דגימות עטלף לנוכחות של אנטיגנים lyssavirus בטייוואן. השלבים העיקריים כוללים את התעסוקה של FAT ו RT-PCR. הבחירה של דגימות מתאימות ובידוד מוצלח של הנגיף הם גם חשובים. בנוסף, פתרון בעיות מסוימות נערך במהלך הניטור של lyssaviruses העטלף. ההבדל העיקרי היה בעלי החיים המטרה. בתחילה (2008 – 2009), חיות היעד של מעקבים העטלף lyssavirus ירוס היו עטלפים חיים, אשר נלכדו באי Kinmen בטייוואן ולאחר מכן נבדק על lyssavirus לאחר המתת חסד. רוב העטלפים הלכודים היו בריאים ובלתי צפויים לשאת lyssavirus, וגישה זו לניטור לא היה אנושי. לכן, בשנה השלישית, רק עטלפים מתים או גוססים, נאספו והרחיבו את אזור המעקב מהאזור לאומי. לאחר שמונה שנים של ניטור רציפה, המארז lyssavirus הראשון זוהה לבסוף בטייוואן.

למרות שומן הוא השיטה הנפוצה ביותר עבור אבחון כלבת ומומלץ על ידי oie ו-18, מחקרים מעטים הפגינו תוצאות לא עקביות כאשר שימשו שערי מעלה שונים בשומן5,27. תוצאות דומות לא עקביות הופיעו גם במקרים נגועים TWBLV. ב TWBLV הנגועים בתאי MNA, התוצאות של FAT הראו הבדלים משמעותיים 2 שערי בעלה (איור 5). אחד מהנוגדנים בעלי מצוכי הנגד כלבת לא הגיב היטב, אפילו בריכוזים גבוהים יותר. בגלל וריאציה של אנטיגן lyssavirus בדגימות ואת וריאציה של הנוגדן והאהדה של נוגדנים בשערי מעלה, מומלץ שני שערי מעלה שונים לשמש ב-FAT כדי למנוע תוצאות שליליות שווא ב lyssavirus . אבחנה23,28,29

RT-PCR יכול לספק אבחנה confirmatory עבור תוצאות לא עקביות של FAT. בשל הגיוון הגנטי הגבוה של lyssavirus, מומלץ יותר מאשר פריימר אחד להגדיר RT-PCR לשמש כדי להגדיל את הדיוק של ההקרנה lyssavirus29,30. מערכת תחל שתוכננה מפני גנים שימור מאוד שימור הוא להגדיר הנפוץ ביותר ב lyssavirus ירוס זיהוי29. RT-PCR יכול לשמש גם לאבחון דגימות ריקבון כאשר לא ניתן לבצע שומן31,32. כדי למנוע שליליות שווא למנוע גילוי של lyssavirus הרומן, כלים נוספים מומלצים לאיתור. שני ליסביסבים2 וירוסים4, טייוואן בת lyssaviruses, זוהו במהלך סקר זה העסקת SOP.

בנוסף, אחד הזנים TWBLV מגוונת מאוד ומינים חדשים רומן של lyssavirus נמצאו עטלפים בטייוואן ב 2018 (נתונים שלא פורסמו). הממצאים הוכיחו כי התעסוקה של שומן ו-RT-PCR לזיהוי lyssaviruses בעטלפים הוא שימושי. יש לציין מספר מגבלות של הערכת התחל של ה-RT-PCR שבשימוש בנוהל זה. בקבוצה התחל של N113F/N304R, N113F תוכנן במקור עבור הגברה וירוס כלבת, אבל זה לא יכול לעבוד היטב עבור lyssaviruses אחרים. מספר צבעי יסוד לאיתור lyssavirus פורסמו על ידי חוקרים אחרים29,30 ניתן לבחור על פי צורכי המעבדה.

מאמר זה הוא צעד אחר צעד מבוא מעקב העטלף lyssavirus ירוס בטייוואן. הוא מקווה כי SOP זה יהיה מועיל לחוקרים אשר מעוניינים מעקב lyssavirus העטלף. ככל שחוקרים נוספים לבצע סקרים של עטלפים, lyssaviruses יותר יזהו בעתיד. מפקחת זו של SOP לא רק מבצעת וירוסים אלא גם מסוכנים אחרים של זוונוזות בעטלפים. ממצאים כאלה יכולים ליידע את הציבור, אנשי הבריאות, ומדענים של הסיכונים הפוטנציאליים של מגע עם עטלפים וחיות בר אחרות. זה גם יעזור להגביר את ההבנה של האבולוציה והמקורות של lyssavirus ולהוביל התקדמות משמעותית במחקר המדעי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

אין קונפליקטים של עניין מוצהר.

Acknowledgments

אנו מודים לטיין-צ'נג לי, יי טאנג לין, צ'יה-ג'ונג טסאי, ו-Ya-Lan Li על עזרתם במהלך המחקר. מחקר זה היה נתמך על ידי גרנט no 107AS-8.7.1-BQ-B2 (1) מן הלשכה של בעלי חיים ובריאות הצמח בידוד, מועצת החקלאות, ההנהלה יואן, טייוואן.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2.5% Trypsin (10x) Gibco 15090046 Trypsin
25 cm2 flask Greiner bio-one 690160
Acetone Honeywell 32201-1L
Agarose I VWR Life Science 97062-250
Alcohol NIHON SHIYAKU REAGENT NS-32294
AMV Reverse Transcriptase Promega M5101
Antibiotic-Antimycotic(100X)  Gibco 15240-062 MEM-10
Blade Braun BA215
Centrifuge eppendorf 5424R
Chemilumineance system TOP BIO CO. MGIS-21-C2-1M
Collection tube Qiagen 990381
Collection tube SSI 2341-SO
Cover slide Muto Pure chemical Co., LTD. 24505
DNA analyzer Applied Biosystems 3700XL
Fetal bovine serum Gibco 10437028 MEM-10
FITC Anti-Rabies Monoclonal Globulin Fujirebio Diagnostic Inc. 800-092 FITC-conjugated anti-rabies antibodies: reagent B
Four-well Teflon-coating glass slide Thermo Fisher Scientific 30-86H-WHITE
Gel Electrophoresis System Major Science MJ-105-R
HBSS (1x) Gibco 14175095 Trypsin
Incubator ASTEC SCA-165DS
Inverted Microscope Olympus IX71
L-Glutamine 200 mM (100x) Gibco A2916801 MEM-10
LIGHT DIAGNOSTICS Rabies FAT reagent EMD Millipore Corporation 5100 FITC-conjugated anti-rabies antibodies: reagent A
MagNA Pure Compact Instrument Roche 03731146001
MagNA Pure Compact NA Isolation Kit 1 Roche 03730964001
MEM (10x) Gibco 11430030 MEM-10
MEM NEAA (100x) Gibco 11140050 MEM-10
MEM vitamin solution Gibco 11120052 MEM-10
NaHCO3 Merck 1.06329.0500 MEM-10
Needle Terumo NN*2332R9
PBS Medicago 09-8912-100
Primer synthesis Mission Biotech
RNasin ribonuclease inhibitor Promega N2111
Sequencing service Mission Biotech
Slide Thermo Scientific AA00008032E00MNT10
Sodium Pyruvate (100 mM) Gibco 11360070 MEM-10
Stainless Steel Beads QIAGEN 69989
Sterile absorbent pad 3M 1604T-2
Syringe filter Nalgene 171-0045
Taq polymerase JMR Holdings JMR-801
Thermal cycler Applied Biosystems 2720
TissueLyser II QIAGEN 85300
Tongue depressor HONJER CO., LTD. 122246
Tweezer Tennyson medical Instrument developing CO., LTD. A0601
Tylosin Tartrate Sigma T6271-10G MEM-10

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kuzmin, I. V. Basic facts about lyssavirus. Current laboratory techniques in rabies diagnosis, research, and prevention, volume 1. Rupprecht, C. E., Nagarajan, T. , Elsevier. California. 3-21 (2014).
  2. Aréchiga Ceballos, N., et al. Novel lyssavirus in bat, Spain. Emerging Infectious Diseases. 19 (5), 793-795 (2013).
  3. Gunawardena, P. S., et al. Lyssavirus in Indian Flying Foxes, Sri Lanka. Emerging Infectious Diseases. 22 (8), 1456-1459 (2016).
  4. Hu, S. C., et al. Lyssavirus in Japanese Pipistrelle, Taiwan. Emerging Infectious Diseases. 24 (4), 782-785 (2018).
  5. Nokireki, T., Tammiranta, N., Kokkonen, U. -M., Kantala, T., Gadd, T. Tentative novel lyssavirus in a bat in Finland. Transboundary Emerging Diseases. 65 (3), 593-596 (2018).
  6. Banyard, A. C., Evans, J. S., Luo, T. R., Fooks, A. R. Lyssaviruses and bats: emergence and zoonotic threat. Viruses. 6 (8), 2974-2990 (2014).
  7. Pal, S. R., et al. Rabies virus infection of a flying fox bat, Pteropus policephalus in Chandigarh, Northern India. Tropical and Geographical Medicine. 32 (3), 265-267 (1980).
  8. Smith, P. C., Lawhaswasdi, K., Vick, W. E., Stanton, J. S. Isolation of rabies virus from fruit bats in Thailand. Nature. 216 (5113), 384 (1967).
  9. Tang, X. Pivotal role of dogs in rabies transmission, China. Emerging Infectious Diseases. 11 (12), 1970-1972 (2005).
  10. Kuzmin, I. V., et al. Bat lyssaviruses (Aravan and Khujand) from Central Asia: phylogenetic relationships according to N, P and G gene sequences. Virus Research. 97 (2), 65-79 (2003).
  11. Arguin, P. M., et al. Serologic evidence of Lyssavirus infections among bats, the Philippines. Emerging Infectious Diseases. 8 (3), 258-262 (2002).
  12. Lumlertdacha, B., et al. Survey for bat lyssaviruses, Thailand. Emerging Infectious Diseases. 11 (2), 232-236 (2005).
  13. Kuzmin, I. V., et al. Lyssavirus surveillance in bats, Bangladesh. Emerging Infectious Diseases. 12 (3), 486-488 (2006).
  14. Reynes, J. -M., et al. Serologic evidence of lyssavirus infection in bats, Cambodia. Emerging Infectious Diseases. 10 (12), 2231-2234 (2004).
  15. Nguyen, A. T., et al. Bat lyssaviruses, northern Vietnam. Emerging Infectious Diseases. 20 (1), 161-163 (2014).
  16. Liu, Y., Zhang, S., Zhao, J., Zhang, F., Hu, R. Isolation of Irkut virus from a Murina leucogaster bat in China. PLoS Neglected Tropical Diseases. 7 (3), 2097 (2013).
  17. Kaplan, M. M. Safety precautions in handling rabies virus. Laboratory Techniques in Rabies, 4th Ed. Meslin, F. X., Kaplan, M. M., Kiprowski, H. , World Health Organization. Geneva. 3-8 (1996).
  18. World Organization for Animal Health (OIE). Rabies (infection with rabies and other lyssavirus. , Available from: http://www.oie.int/fileadmin/Home/eng/Health_standards/tahm/3.01.17_RABIES.pdf (2019).
  19. Smith, I., Wang, L. F. Bats and their virome: an important source of emerging viruses capable of infecting humans. Current Opinion in Virology. 3 (1), 84-91 (2013).
  20. Corbet, G. B., Hill, J. E. The mammals of the Indomalayan region: a systematic review. , Oxford University Press. Oxford, New York. (1992).
  21. Mayer, F., von Helversen, O. Cryptic diversity in European bats. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 268 (1478), 1825-1832 (2001).
  22. Epstein, J. H., Field, H. E. Anthropogenic epidemics: the ecology of bat-borne viruses and our role in their emergence. Bats and viruses: a new frontier of emerging infectious diseases. Wang, L. F., Cowled, C. , John Wiley & Sons, Inc. Hoboken, New Jersey. 249-280 (2016).
  23. Centers for Disease Control and Prevention. Protocol for postmortem diagnosis of rabies in animals by direct fluorescent antibody testing. , Available from: https://www.cdc.gov/rabies/pdf/rabiesdfaspv2.pdf (2019).
  24. Hayman, D. T. S., et al. A universal real-time assay for the detection of Lyssaviruses. Journal of Virological Methods. 177 (1), 87-93 (2011).
  25. Franka, R., et al. A new phylogenetic lineage of rabies virus associated with western pipistrelle bats (Pipistrellus hesperus). Journal of General Virology. 87 (8), 2309-2321 (2006).
  26. Trimarchi, C. V., Smith, J. S. Diagnostic evaluation. Rabies, 1st ed. Press, A., Jackson, A. C., Wunner, W. H. , Academic Press. San Diego, CA. 307-349 (2002).
  27. Moldal, T., et al. First detection of European bat lyssavirus type 2 (EBLV-2) in Norway. BMC Veterinary Research. 13, 216 (2017).
  28. Robardet, E., et al. Comparative assay of fluorescent antibody test results among twelve European National Reference Laboratories using various anti-rabies conjugates. Journal of Virological Methods. 191 (1), 88-94 (2013).
  29. Hanlon, C. A., Nadin-Davis, S. A. Laboratory diagnosis of rabies. Rabies, 3rd ed. Jackson, A. C. , Academic Press. San Diego, CA. 409-459 (2013).
  30. Fischer, M., et al. A step forward in molecular diagnostics of lyssaviruses--results of a ring trial among European laboratories. PLoS ONE. 8 (3), 58372 (2013).
  31. David, D., et al. Rabies virus detection by RT-PCR in decomposed naturally infected brains. Veterinary Microbiology. 87 (2), 111-118 (2002).
  32. Robardet, E., Picard-Meyer, E., Andrieu, S., Servat, A., Cliquet, F. International interlaboratory trials on rabies diagnosis: an overview of results and variation in reference diagnosis techniques (fluorescent antibody test, rabies tissue culture infection test, mouse inoculation test) and molecular biology techniques. Journal of Virological Methods. 177 (1), 15-25 (2011).

Tags

מדעי הסביבה סוגיה 150 כלבת lyssavirus מעקב עטלף כרבולת הליך הפעלה רגיל טייוואן
נוהל הפעלה רגיל של מעקב וירוס של אוכלוסיית העטלף בטייוואן
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hsu, W. C., Hsu, C. L., Tu, Y. C.,… More

Hsu, W. C., Hsu, C. L., Tu, Y. C., Chang, J. C., Tsai, K. R., Lee, F., Hu, S. C. Standard Operating Procedure for Lyssavirus Surveillance of the Bat Population in Taiwan. J. Vis. Exp. (150), e59421, doi:10.3791/59421 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter