Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

Måling af de potentielle satser for dissimilatorisk nitratreduktion til Ammonium baseret på 14NH4+/15NH4+ Analyser via Sekventiel konvertering til N2O

Published: October 7, 2020 doi: 10.3791/59562
Automatic Translation
1, 2,3, 2, 4, 4, 5, 1
1Department of Applied Chemistry, Graduate School of Engineering, Tokyo University of Agriculture and Technology, 1Department of Biological Sciences, Faculty of Science and Engineering, Chuo University, 2Faculty & Graduate School of Urban Environmental Sciences, Tokyo Metropolitan University, 3Center for Ecological Research, Kyoto University, 4Department of Chemistry, Faculty of Science, Toho University, 5Graduate School of Integrated Arts and Sciences, Hiroshima University

Summary

En række metoder til at bestemme den potentielle DNRA sats baseret på 14NH4+/15NH4+ analyser leveres i detaljer. NH4+ omdannes til N2O via flere trin og analyseres ved hjælp af quadrupole gaskromatografi-massespektrometri.

Abstract

Betydningen af at forstå nitrattens skæbne (NR3−), som er den dominerende N-art, der overføres fra terrestriske til akvatiske økosystemer, har været stigende, fordi den globale kvælstofbelastning er steget dramatisk efter industrialiseringen. Dissimilatoriske nitratreduktion til ammonium (DNRA) og denitrificering er begge mikrobielle processer, der bruger NO3− til respiration. Sammenlignet med denitrificering er der kun i begrænset omfang foretaget kvantitative bestemmelser for DNRA's aktiviteter. Dette har ført til en utilstrækkelig forståelse af DNRA's betydning i NR3− transformationer og reguleringsfaktorerne i denne proces. Formålet med dette dokument er at tilvejebringe en detaljeret procedure for måling af den potentielle DNRA-rate i miljøprøver. Kort sagt kan den potentielle DNRA-rate beregnes ud fra den 15N-mærkede ammonium (15NH4+) akkumuleringsrate i 15NO3− tilsat inkubation. Bestemmelsen af de 14NH4+ og 15NH 4+ koncentrationer,der er beskrevet i dette papir, består af følgende trin. For det første udvindesNH 4+ i prøven og fanges på et forsuret glasfilter som ammoniumsalt. For det andet eluteres det fangne ammonium og oxideres til NO3− via persulfatoxidation. For det tredje konverteres NO3− til N2O via en N2O-reduktasedetændig denitrifier. Endelig analyseres den konverterede N2O ved hjælp af et tidligere udviklet firedobbelt gaskromatografi-massespektrometrisystem. Vi anvendte denne metode til salt marsh sedimenter og beregnet deres potentielle DNRA satser, viser, at de foreslåede procedurer giver mulighed for en enkel og hurtigere bestemmelse i forhold til tidligere beskrevne metoder.

Introduction

Den kunstige syntese af kvælstofgødning og dens udbredte anvendelse har i høj grad forstyrret den globale kvælstofcyklus. Det anslås , at overførslen af reaktivt kvælstof fra jordbaserede til kystbaserede systemer er fordoblet siden førindustrielletider 1. En betydelig del af gødningen, der anvendes på et givet felt, vaskes væk fra jorden til floder eller grundvand, primært som NR3− 2. Dette kan forårsage miljøproblemer såsom drikkevandsforurening, eutrofiering og dannelse af hypoxi. NO3− fjernes i vandmiljøer fra eller bevares i økosystemet via biologisk assimilation og forskellige mikrobielle dissimilatoriske processer. Denitrificering og anammox er kendt for at være større mikrobielle fjernelsesprocesser for NO3−. Denitrificering er den mikrobielle reduktion af NO3− til gasformige N-produkter (NO, N2O og N2) kombineret med oxidering af en elektrondonor, såsom organiske stoffer, hvilket reducerer risikoen for ovennævnte problemer. Anammox producerer også N2 fra NO2− og NH4+; derfor fjerner den uorganiske N fra et økosystem. Omvendt arbejder DNRA på at bevare N i et økosystem. det er almindeligt accepteret, at DNRA primært udføres af fermentative bakterier eller chemolithoautotrofiske bakterier, og at de reducerer dissimilatory NO3− til biotilgængelige og mindre mobile NH4+.

Undersøgelser af DNRA er primært blevet udført i marine eller flodmundinger økosystemer, såsom oceaniske eller flodmundinger sedimenter og vand, salt eller brakvand marsh jord, og mangrove jord. Kyst- eller havøkosystemer er vigtige som reservoirer til fjernelse af NO3− fra terrestriske økosystemer, og i tidligere undersøgelser har DNRA vist sig at bidrage over et meget bredt udvalg af NO3− fjernelse (0-99%)3,4,5,6,77,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18.9 Endvidere er eksistensen af DNRA blevet påvist i en lang række miljøer, herunder ferskvandsmiljøer19, rismarkeljord20og skovjord21. Mens disse undersøgelser har vist, at DNRA potentielt kan sammenlignes med denitrificering for NO3− fjernelse, er undersøgelser, der måler DNRA-aktiviteten, stadig meget begrænsede sammenlignet med dem, der måler denitrificering.

DNRA-hastigheden er blevet evalueret ved hjælp af 15N-mærkningsteknikker i forbindelse med dataanalyse via analytiske eller numeriske modeller. En analyseløsning til beregning af DNRA-hastigheden er baseret på stigningen i 15 N-berigelsenaf NH4+ puljen efter tilsætning af 15NO3− som sporstof. kr. N-mærket NO3− tilsættes til en prøve og inkuberes, og DNRA-hastigheden kan derefter beregnes ud fra koncentrations- og isotopforholdsændringerne i NH4+ før og efter en vis periode. I dette dokument beskrives en metode til kvantificering af NH4+koncentrationen og isotopforholdet, som er nødvendigt for at beregne DNRA-hastigheden, i detaljer. Dybest set, den metode, der rapporteres her er en kombination af flere tidligere rapporterede teknikker22,,23,24,25,26 med ændringer føjet til nogle procedurer. Metoden består af en serie på fem komponentprocedurer: 1) inkubation af en miljøprøve med ændring af et stabilt isotopsporingsmiddel, 15NO3−, 2) ekstraktion og nyttiggørelse af NH4+ ved hjælp af en "diffusionsprocedure" med ændringer, 3) persulfatoxidation af NH4+ i prøven bestående af indenlandske NH4+ og 15NH4+ afledt af 15NO3− via DNRA aktivitet, i NO3− og 15NO3−, (4) efterfølgende mikrobiel transformation af NO3− og 15NO3− til N2O-isotopomere via den modificerede denitrifiermetode og (5) kvantificering af N2O-isotopomerne ved hjælp af gaskromatografi-massespektrometri (GC/MS). I det følgende afsnit beskrives først forberedelsen af procedurerne (2) og 4), og derefter beskrives alle fem komponentprocedurer i detaljer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Udarbejdelse af en PTFE-kuvert til kvantitativ opfangning af gasformig NH3

  1. Et 25 mm stykke polytetrafluorethylen (PTFE) på en lille plade aluminiumsfolie (ca. 300 mm x 450 mm, aftørret med ethanol).
  2. Aske et glasfiberfilter (10 mm i diameter med en porestørrelse på 2,7 μm) ved 450 °C i 4 timer i en lyddæmpeovn. Anskaf glasfiberfilteret lidt over midten af båndets længere akse (Figur 1a).
  3. Spot 20 μL af 0,9-mol/L H2SO4 på midten af et GF/D-filter, og fold straks PTFE-båndet med to pincet: fladfrit pincet og ligesluttede pincet. Følgende trin, trin 1.4-1.7, er vist i figur 1 og bør udføres hurtigt.
  4. Vend PTFE-båndet over GF/D-filteret på den stiplede linje, der er vist i figur 1a, for at danne den figur, der er vist i figur 1b.
  5. Hold begge sider ved at folde og derefter trykke tæt på kanten med pincet (Figur 1c). Tryk ikke for hårdt, og skrab ikke PTFE-båndet.
  6. Fold den åbne ende med pincet, og tryk derefter på kanten med pincet (Figur 1d).
  7. Den åbne ende forsegles ved at trykke tæt på kanten med pincet(Figur 1e). GF/D-filteret bør ikke trykkes under denne procedure.

2. Forberedelse af biomassen af en lattergas reduktase mangelfuld denitrifier, Pseudomonas chlororaphis subsp. aureofaciens ATCC13985, for denitrifier metode

  1. Streak en 20% glycerol bestand af Pseudomonas chlororaphis subsp. aureofaciens ATCC13985 på 1/4 styrke tryptone soy bouillon (TSB) agar plader. Pladerne inkuberes ved 25 °C i 2-3 dage.
  2. En enkeltkoloni af P. chlororaphis overføres til et lille reagensglas med 5 ml autoklaveret TSB-medium og dyraerotisk (uden omrystning) i en dag ved 25 °C i mørke, indtil der opnås maksimal vækst dette vil blive brugt som preculture.
  3. 3 ml af prekulturen overføres til en 1-L-flaske med en siliciumgummiprop indeholdende 1 L frisklavet autoklaveret modificeret TSB suppleret med 10 mmol/L KNO323. Inkuber flasken under omrøring med en omrører under mørke forhold ved 25 °C. Efter dyrkning i 8 timer skal siliciumgummiproppen udskiftes med en skruehætte og lukkes tæt. Fortsæt dyrkningen i anoxia natten over.
  4. Centrifuge kulturen ved 18.800 x g i 15 min ved 4 °C for at opnå biomassepiller.
  5. Den pakkede biomasse vaskes tre gange med 30 ml dulbeccos fosfatbufferede saltvand (D-PBS(-), pH 7.5) for helt at fjerne NO3−. Centrifugeringsbetingelserne er de samme som i trin 2.3.
  6. Efter vask suspenderes den pakkede biomasse igen med 30 ml D-PBS(-). Brug 1 ml af suspensionen til at bestemme celletætheden ved måling af OD600. Pipette 1 ml aliquots af de resterende suspension i sterile kryovials indeholdende 0,8 ml 45% glycerol. De tilberedte glycerollagre bevares ved −80 °C indtil brug (se afsnit 6).

3. Eliminering af ilt, nitrit og nitrat fra prøvesedimentet

  1. Der afvejes 3,0 g (vådvægt) af sedimentet i et 20 ml glasglas, og der tilsættes 9,0 ml overfladevand for at hænge det (25% w/w gylle).
  2. Forsegle hætteglasset med en sort butyl gummi prop (vasket med ion-udvekslet vand og steriliseret via autoclaving) og en aluminium hætte.
  3. Fjern affjedringen, og udskift headspace-luften med Ar (>99,99%) ved 0,6 L/min i 20 min. ved hjælp af en mangfoldighed.
  4. Udskift Ar headspace gas med ultra-ren (>99.99995%) Han ved at støvsuge for 90 s og opladning Han for 30 s. Gentag denne procedure fire gange. Indstil headspace gastrykket til 1,5 atm.
  5. Hætteglassene inkuberes ved 20 °C natten over med omrystning ved 150 omdrejningstal under mørke forhold ved hjælp af en konstant temperaturrysteer for at eliminere den resterende ilt, nitrat og nitrit i sedimentaffjedringen og headspace-gassen.

4. Tid kursus eksperiment til bestemmelse af DNRA sats

  1. Udskift headspace gas med frisk ultra-ren Han ved hjælp af samme procedure som i trin 3.5, men uden de fire gentagelser.
  2. Der tilsættes mærkede og ikke-mærkede underlag til hvert hætteglas i henhold til tabel 1 gennem butylgummiproppen med en gastæt sprøjte. Fjern de tidligere forberedte substratopløsninger i tilstrækkeligt store glashætteglas ved hjælp af ultrapurt Han med hovedrummets tryk indstillet til 1,5 atm for at undgå luftforurening. Undgå utilsigtet injektion af enhver mængde luft under injektionsprocedurerne.
  3. Inkuber hætteglas ved 20 °C ved omrystning ved 150 omdrejninger i minuttet. Substraterne hældes i hvert hætteglas i henhold til tabel 1 og inkuberes i 1 time, 3 timer og 5 timer. Efter inkubationen standses, udsættes sedimentsuspensionen i hætteglassene efter følgende procedurer: trin 4.4-4.9.
  4. Fjern aluminiumshætten og butylgumproppen fra hvert hætteglas. Derefter tilsættes KCl (ashed ved 450 °C i 4 timer) til sedimentsuspensionen op til en endelig koncentration på ca. 2 mol/L for at sikre genindvinding af NH4+ fra sedimentet. Luk hætteglassene med en butyl gummiprop og en aluminiumslukning.
  5. Sedimentet rystes ved 150 omdrejninger i 1 time ved 4 °C under mørke forhold for at udtrække NH4+.
  6. Hele sedimentsuspensionen i hætteglasset overføres til et 50 ml plastcentrifugerør, og centrifugeres ved 10.000 x g i 10 min ved 4 °C.
  7. Skyl den indvendige væg af en friskåbnet 10-ml engangssprøjte, og fastgør den til et friskåbnet engangscelluloseacetatmembranfilter (porestørrelse 0,22 μm, 25 mm i diameter). Skyl derefter membranfilteret med 1 ml supernatant. Placer den skyllede sprøjtefilterenhed på en 20 ml langmundet polypropylenflaske (PP).
  8. Den resterende supernatant filtreres gennem et acetatmembranfilter i 20-ml PP-flasken. Ekstrakterne opbevares ved −20 °C indtil videre analyse.

5. Indfangning af diffus NH4+ i 2M H2SO4 absorberet til GF/D-filteret i PTFE-konvolutten og persulfatoxidation af NH4+ til NO3−

  1. Der forbered standardopløsninger på 14NH4Cl med koncentrationsgradienter på 0 μmol/L, 10 μmol/L, 40 μmol/L, 100 μmol/L, 200 μmol/L, 400 μmol/L og 500 μmol/L. For 15N-ratioanalysen fastgør den samlede koncentration af NH4+ til 200 μmol/L og klargør isotopforhold på 100:0 99.5:0.5, 99:1, 93:7, 90:10, 50:50 og 10:90 med rene 14NH4Cl og 15NH4Cl standardløsninger.
  2. 30 mg MgO (sokels ved 450 °C i 4 timer) overføres til et 20 ml glasglas, og PTFE-konvolutten i hætteglasset sættes i.
  3. Der overføres 5 ml prøve eller standard til hætteglasset med MgO og PTFE-konvolutten, og lukkes straks med en grå butylgummiprop. Seal med en aluminiumshætte. Hvis koncentrationen af NH4+ forventes at overstige 500 μmol/L, fortyndes prøven til under 500 μmol/L.
  4. Hætteglassene rystes ved 150 omdr./min. i 3 timer ved 4 °C under mørke forhold.
  5. Fjern aluminiumshætten og butylgummiproppen. Tag PTFE kuverten ud af hætteglasset ved hjælp af punkt-ended pincet, grundigt skylle kuverten og pincet med ion-vekslede vand, tørre dem med en aftørring papir, og derefter placere konvolutten på en frisk aftørring papir.
  6. Åbn PTFE kuvert med et par pincet (brug af både flat-ended og punkt-ended pincet anbefales) i den nøjagtige omvendte rækkefølge af foldning udføres i trin 1.4-1.7.
  7. Hold det perifere område af GF/D-filteret, hvor H2SO4 formodes at være upåagtet med den flade pincet, og overfør det til et 11-ml skruedækselsglas med en PTFE-foret hætte. Skyl pincet med ion-udvekslet vand, og tør dem med aftørring papir.
  8. Gentag trin 5.5-5.7 for de resterende konvolutter.
  9. Der tilsættes 1 ml ionbyttet vand til hvert af reagensglassene, skruehætten lukkes, og skruehætten fastholdes uden at ryste i mindst 30 minutter ved stuetemperatur for helt at elutere NH4+ fra GF/D-filteret. I dette trin skal du udføre følgende trin (trin 5.10) parallelt.
  10. Der klargør persulfatoxiderende opløsning (POR) reagens25,26.
    1. Da det ikke kan opbevares, forberedes den nøjagtige mængde POR, der er nødvendig til behandling af en enkelt dag med prøver.
    2. For at forberede POR til behandling af 50 prøver hældes 100 ml ionbyttet vand i en 200-ml skruedækselflaske og tilsættes 1,52 g NaOH (nitrogenblandingsanalysekvalitet), 3 g borsyre og 5 g K2S2O8 (nitrogen- og fosforanalysekvalitet) i den rækkefølge. Umiddelbart efter tilsætning af hvert reagens rystes opløsningen, indtil den er helt opløst.
    3. Hvis det er nødvendigt, lægges flasken i blød i varmt vand for at hjælpe opløsningen af kemikalierne; der bør dog lægges vægt på forurening af NO3− fordi postevand normalt indeholder NO3−.
  11. Efter trin 5.8 åbnes skruehætten, der tilsættes 2 ml POR reagens til reagensglasset, og røret lukkes tæt med en skruelåg for at undgå tab eller kontaminering under de følgende trin.
  12. Reagensglassene anbringes på et stativ, pak dem ind i dobbeltlaget aluminiumsfolie, og de skal adklaves automatisk i 1 time ved 121 °C. Hold rørene i opretstående stilling under dette trin, og undgå hurtige temperaturændringer efter endt autoklavering.

6. Bestemmelse af NO3− konverteret fra NH4+ ved denitrifier-metoden ved hjælp af quadrupol GC/MS

  1. Der blandes 100 ml steril 40-mmol/l fosfatbuffer (pH 7.2) og 100 ml steril 30-mmol/l-glucose aseptisk (20-mmol/L fosfat og 15-mmol/L-glucose; endelig).
  2. Der tilsættes en 1/7,2 volumen af glycerolbestand p. chlororaphis til 200 ml af fosfat-bufferet glukoseopløsning i en 300-ml Erlenmeyerkolbe, og fjern den med en ultra-ren Han (>99,995%) stream i 1 time.
  3. Der dispenseres 2,0 ml af denitrifieraffjedringen i hvert 5 ml hætteglas. Cap hætteglas med en grå butyl gummi prop og en aluminium lukning.
  4. Udskift headspace luft med ultra-ren Han ved støvsugning i 3 min og opladning af Han i 1 min. Indstil headspace gas positivt tryk til 1,3 atm for at undgå utilsigtet luftforurening.
  5. Der indsprøjtes 1 ml af en prøve eller standard gennem butylgummiproppen med en engangssprøjte på 1 ml. Bemærk den nøjagtige mængde af den faktisk injicerede prøve.
  6. Hætteglassene inkuberes natten over ved 25 °C under mørke forhold.
  7. Indsprøjt 0,3 ml 6-mol/LL NaOH for at stoppe denitrificeringen og absorbere headspace CO2, hvilket ellers vil forstyrre N2O-analysen alvorligt af GC/MS, fordi CO2 og N2O har samme molekylvægt.
  8. Mængden af 44N2O, 45N2O og 46N2O bestemmes i headspace-gassen ved hjælp af quadrupole GC/MS med en modificeret injektionsport25. De driftsbetingelser , der anvendes til GC/MS-analysen, er vist i tabel 2.

7. Dataanalyse

  1. Kalibreringskurven for NH4+koncentrationen udspringer af det lineære forhold mellem den kendte koncentration på 14NH4+ og de målte signalintensiteter for den samlede producerede 44N2O + 45N2O + 46N2O. Kalibreringskurven for 15N-indholdet udspringer af det lineære forhold mellem detkendte atom % ( dvs . , 15N/14N+.15N) og det beregnede atom % ved hjælp af en tidligere angivet ligning27. Koncentrationen af 15NH4+ beregnes ved at gange den samlede NH4+ med forholdet 15N på NH4+.
  2. Den potentielle DNRA-sats beregnes ved hjælp af ligninger, der leveresandre steder 28,29,30.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De repræsentative resultater, der præsenteres i dette dokument, stammer fra 15N-opsporingsforsøg med saltmarskedimenter. Den samplede saltmose blev nyoprettet i kølvandet på jordskælvet i Great East Japan i 2011 i Moune-området i Kesen-numa by i Miyagi-præfekturet, Japan. I september 2017 blev overfladesedimenter (0-3 cm) indsamlet to steder i de subtidale og tidevandszoner. Først, umiddelbart efter indsamling, sedimentet blev sigtet gennem en 4-mm mesh til at fjerne planterødder, skaller vragrester, og murbrokker og derefter homogeniseret. Prøverne blev opbevaret ved 4 °C, indtil DNRA-analysen blev udført.

Inkubationsprocedurerne for koncentrationerne 15NO3− og samtidig bestemmelse af koncentrationerne af 14NH4+ og 15NH4+ blev udført som beskrevet i protokolafsnittet. Der blev observeret en stigning i 15NH4+ koncentration i hele inkubationstiden for alle sedimenter (figur 2). Vi beregnede DNRA-satserne ved at dividere akkumuleringshastigheden på 15NH4+ med isotopforholdet for NO3− pulje29. De beregnede satser var inden for intervallet 24,8-177 nmol-N g−1 tør jord h−1 (tabel 3) og var sammenlignelige med værdier, der blev fundet i tidligere undersøgelser. Dette interval af opnåede satser er højere end de rapporterede værdier , der stammer fra lignende miljøer , herunder fra tidevandssedimenter17, saltmoser5,16og andre flodmundinger18,33,34samt fra eutrofiske miljøer såsom en lavvandet flodmunding i North Carolina31 og Shanghai byflodnet32. Omvendt fernandes et al.13 rapporterede højere potentielle DNRA satser i økologisk rige mangrove jord i Indien. Generelt er DNRA menes at være begunstiget af et højt forhold mellem tilgængelige C til elektron acceptors35,36,37. Prøverne, der viste de repræsentative resultater, blev udtaget fra en saltmose, der for nylig var skabt af et jordskælv, og som oprindeligt var blevet brugt som dyrkningsmark. Denne særlige egenskab ved prøverne kan bidrage til den observerede høje DNRA-hastighed. I overensstemmelse med denne spekulation var DNRA-raten i tidevandszonen, som er rig på organiske forbindelser (ikke vist) sammenlignet med undertidszonen, højere end i undertidszonen (figur 2, tabel 3).

Figure 1
Figur 1: Udarbejdelse af en PTFE-kuvert til opfangning af gasformig NH3. Den PTFE-konvolut, der anvendes i diffusionsproceduren, fremstilles ved at folde PTFE-tape efter instruktionerne i paneler (A)–(E). Det forsylede filter inde i konvolutten opfanger den gasformige NH3. Disse trin bør udføres hurtigt. Detaljerede oplysninger findes i trin 1.2-1.7 i protokolafsnittet. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Ændring i 15NH4+ koncentration via anaerob inkubation af sedimenter. Sedimentprøvernes 15N-sporstofinkubationer blev udført i to eksemplarer. Koncentrationen af 15N-NH4+ er vist i nmol pr tørvægt af sediment. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Et eksempel på kalibreringskurve med lav koncentration N2O. Topareal af N2O blev opnået ved summen af toparealet m/z 44, m/z 45 og m/z 46. Konfigurationer til GC/MS-analyse vises i tabel 2. Klik her for at få vist en større version af dette tal.

kr. N-mærkede og ikke-mærkede underlag, der tilsættes hvert hætteglas
100 mM 100 mM
NH4Cl K15NR.
Volumen (μL) af 100 mM lageropløsning tilsat hvert hætteglas 24 60
Endelig koncentration (μmol/L)* >230§ 570
*de viste værdier beregnes ved at antage, at vandindholdet i sedimentet er 50 %
§afhængigt af baggrund ammonium koncentration

Tabel 1: Kombinationer af substrater, der er ændret til hætteglas, der bevarer ca. 11 ml sedimentsuspension. sediment suspension. Prøverne blev fremstillet i to eksemplarer og underkastet yderligere analyser efter 1 time, 3 timer og 5 timers inkubation.

Udstyr
quadrupole GCMS Shimadzu GCMS-QP2010 Ultra
Kolonne CP-PoraBONDQ 25m; φ 0,32 mm; filmtykkelse, 5 μm
Analytiske betingelser
kolonne temp 40 °C
injektion port temp 100 °C
carrier gasstrøm Samlet strømningshastighed, 47,1 ml•min-1
strømningshastighed i kolonne, 2,10 ml•min-1
sprit-forhold 20
detektionsspænding 1,5 kv.
Følsomhed n2O
nedre registreringsgrænse ** 1.42 pmol
nedre kvantificeringsgrænse (LOQ)* 16.58
*LOD og LOQ blev bestemt ved en lineær sammenhæng mellem en seriel fortynding af N2O (0,97, 1,94, 2,91, 4,75, 9,50, 14,3 ppm) i Han, tilsvarende svar i topområdet og S/N-forholdet. LOD og LOQ blev beregnet som koncentrationer svarende til henholdsvis S/N=3 og S/N=10.

Tabel 2: Betingelser for GC/MS-analysen.

Sediment DNRA sats berigelse af NR3- *
nmol-N g-1 time-1 i første 0%
Tidevandsskifte 1 177 99.9
Tidevand 2 129 99.0
Deltid 1 39.3 99.9
Deltid 2 24.8 99.0
* samme som atom% af tilsat KNO3; fuldstændig eliminering, og der blev ikke tidligere testet nitrificering under anvendte inkubationsbetingelser.

Tabel 3: Potentielle DNRA-rater for de testede tidevands- og subtidale sedimenter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Koncentrations- og isotopforholdet for NH4+ for DNRA-analysen blev kvantificeret ved hjælp af flere metoder. Koncentrationerne og isotopforholdet for NH4+ måles generelt separat. NH4+ koncentrationen måles typisk ved hjælp af koloimetriske metoder , herunder en autoanalyser4,10,15,16,17. Isotopforholdsmålingen har store variationer afhængigt af metoden til NH4+ konvertering, fældefangst og instrumentering til analysen. Typiske metoder omfatter følgende:

(1) NH4+ i prøven omdannes til NH3 via tilsætning af MgO eller NaOH. Efter at være flyttet fra væskefasen til gasfasen fangesNH 3 på et forsuret glasfilter eller i en syreopløsning. Efter tørring forbrændes filteret og analyseres som N2 ved hjælp af et elementært analysator/isotopforholdsmassespektrometer (EA-IRMS)11,18,22,38. Alternativt indsamles den tilfangetagne NH4+ i en syreopløsning på en adsorbent (f.eks. zeolit) og forbrændes og analyseres via EA-IRMS10,12.

(2) NH4+ oxideres til N2 via hypobromitoxidation. Isotopsammensætningen af den udviklede N2 måles via IRMS4,14,39 ellermembranintroduktionsmassespektrometri (MIMS)16,17.

(3) NH4+ koncentrationen bestemmes ved hjælp af højtydende væskekromatografi uden omdannelse. Da ligevægten i NH4+ og NH3 er lidt anderledes for 15NH4+ og 14NH4+ nær pH-koncentrationen af pK a , kan koncentrationerne på 14NH4+ og 15NH 4+ bestemmes på grundlag af et lille skift i retentionstiden6,19,40.a

Den metode, der er beskrevet i dette papir er stort set den samme som fremgangsmåde (1) anført ovenfor, dvs skridt inddrive NH4+ som NH3 på et glasfilter under alkaliske forhold; Det er dog anderledes med hensyn til følgende sekventielle NH4 +konverteringstrin. Disse konverteringstrin er baseret på tidligere undersøgelser med tilføjede ændringer for at forkorte den nødvendige tid til en række eksperimenter. Først lavede vi et par ændringer til den oprindelige denitrifier metode. Efter biomassen af P. chlororaphis er udarbejdet som tidligere beskrevet23,24, vi dyrker bakterier og bevare den koncentrerede celle suspension som en glycerol bestand. Denne tætte celleaffjedring kan anvendes direkte til isotopanalysen ved at blande den med en bufferopløsning, fordi denitrerende aktivitet allerede er tilstrækkeligt induceret. Selv om der er behov for yderligere undersøgelser, kan denne ændring forbedre analysens reproducerbarhed, fordi den præsenterede metode muliggør massedyrkning af denitrifierceller, som er direkte tilgængelige for analyser. Vi har også ændret sammensætningen af opløsningen til suspension af bakterieceller, fra et medium baseret på TSB til en fosfat-bufferet glukoseopløsning, for at udelukke de unødvendige komponenter såsom peptone i det oprindelige medium. Denne ændring kan reducere kontaminering med tom N, fordi den fosfatbunede glukoseopløsning ikke indeholder N, i modsætning til det oprindelige medium, der blev anvendt i tidligere undersøgelser. dette bør testes ved hjælp af yderligere analyser. I trinopsamlingen NH4+ via diffusionsmetoden forkortede vi inkubationstiden og sænkede temperaturen for at minimere nedbrydningen af organiske N og enhver ugunstig konvertering eller tab af NH4+. Gyldigheden af denne ændring blev kontrolleret ved hjælp af kalibreringskurvens linearitet. Vi kontrollerede også, at den modificerede temperatur og inkubationstid ikke påvirkede genvindingen af NH4+ (data ikke vist).

En anden fordel ved denne metode er, at NH4+ i sidste ende omdannes til N2O, som har en lav atmosfærisk baggrund og kan måles ved hjælp af quadrupole GC / MS, som er billigere og lettere at administrere end IRMS. Under den betingelse, der er vist i tabel2, er CO 2 (m/z 44) og N2O (m/z 44) fuldstændig adskilt af GC. retentionstiden for disse gasser er henholdsvis 1,15 og 1,07 min. Da den atmosfæriske koncentration af N2O er i ppb-orden, kan N2O måles med ubetydelig luftinterferens selv i lave koncentrationer. Kalibreringskurven for N2O passerer næsten gennem oprindelsen, hvilket viser indflydelsen påkoncentrationenaf N 2 O på grund af atmosfærisk kontaminering er meget begrænset (figur 3). Denne metode har også den fordel, at den kan kvantificere de 14NH4+ og 15NH 4+ koncentrationersammen; kanoniske metoder, undtagen fremgangsmåde (3), der er anført ovenfor, kræver individuelle analyser af koncentrationen og isotopforholdet.

Samlet set var grænserne for detektion og kvantificering for NH4+ ved hjælp af denne metode henholdsvis ca. 0,03 μmol og 0,09 μmol, og disse værdier svarer til henholdsvis 6 μmol/L og 18 μmol/L, hvis 5 ml af prøveopløsningen (dvs. sedimentekstraktet i dette tilfælde) anvendes til diffusionsproceduren som beskrevet i dette papir. Selv om det anbefales at anvende den koloimetriske metode til bestemmelse af NH 4+ koncentrationenaf prøver, der har lav NH4+, bestemmer den foreslåede metode effektivt NH4+ isotopforholdet og koncentrationen i prøver med relativt høje koncentrationer af ammonium.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Vi takker Naoto Tanaka for at hjælpe med dataindsamling og udvikling af protokollen. Indsamlingen af prøver blev støttet af JSPS KAKENHI Grant Number 17K15286.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15N-KNO3 SHOKO SCIENCE N15-0197
15N-NH4Cl SHOKO SCIENCE N15-0034
20 mL PP bottle SANPLATEC 61-3210-18 Wide-mouth
Aluminum cap Maruemu 1307-13 No. 20, with hole
Boric acid Wako 021-02195
Centrifuge HITACHI Himac CR21G II
Deoxygenized Gas Pressure & Replace Injector SANSIN INDUSTRIAL IP-12
Disposable cellulose acetate membrane filter ADVANTEC 25CS020AS Pore size 0.22 µm, 25 mm in diameter
Disposable syringe Termo SS-10SZ 10 mL
Disposable syringe Termo SS-01T 1 mL
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (-) NISSUI PHARMACEUTICAL 5913
Gastight syringe VICI Valco Instruments 4075-15010 Series A-2, 100 µL
GC/MS shimadzu GCMS-QP2010ultra
GF/D Whatman 1823-010 10 mm in diameter
Glass vial Maruemu 0501-06 20 mL
Gray butyl rubber stopper Maruemu 1306-03 No.20-S
H2SO4 Wako 192-04696 Guaranteed Reagent
K2S2O8 Wako 169-11891 Nitrogen and Phosphorus analysis grade
KCl Wako 163-03545 Guaranteed Reagent
KNO3 Wako 160-04035 Guaranteed Reagent
NaOH Wako 191-08625 Nitrogen compounds analysis grade
NH4Cl Wako 017-02995 Guaranteed Reagent
Plastic centrifuge tube ASONE 1-3500-22 50 mL, VIO-50BN
Pseudomonas chlororaphis subsp. aureofaciens American Type Culture Collection (ATCC) ATCC 13985 Freeze-dried, the type strain of Pseudomonas aureofaciens
PTFE sealing tape Sigma-Aldrich Z221880 25 mm in width
Reciprocating shaker TAITEC 0000207-000 NR-10
Screw-cap test tube IWAKI 84-0252 11 mL
PTFE-lined cap for test tube IWAKI 84-0262
Tryptic Soy Broth Difco Laboratories 211825

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gruber, N., Galloway, J. N. An Earth-system perspective of the global nitrogen cycle. Nature. 451 (7176), 293-296 (2008).
  2. Galloway, J. N., et al. The Nitrogen Cascade. Bioscience. 53 (4), 341-356 (2003).
  3. Rysgaard, S., Risgaard-Petersen, N., Sloth, N. P. Nitrification, denitrification, and nitrate ammonification in sediments of two coastal lagoons in Southern France. Coastal Lagoon Eutrophication and Anaerobic Processes (C.L.E.AN.). Developments in Hydrobiology. Caumette, P., Castel, J., Herbert, R. 117, Springer. Dordrecht. 133-141 (1996).
  4. Christensen, P. B., Rysgaard, S., Sloth, N. P., Dalsgaard, T., Schwærter, S. Sediment mineralization, nutrient fluxes, denitrification and dissimilatory nitrate reduction to ammonium in an estuarine fjord with sea cage trout farms. Aquatic Microbial Ecology. 21, 73-84 (2000).
  5. Tobias, C. R., Anderson, I. C., Canuel, E. A., Macko, S. A. Nitrogen cycling through a fringing marsh-aquifer ecotone. Marine Ecology Progress Series. 210, 25-39 (2001).
  6. An, S. M., Gardner, W. S. Dissimilatory nitrate reduction to ammonium (DNRA) as a nitrogen link, versus denitrification as a sink in a shallow estuary (Laguna Madre/Baffin Bay, Texas). Marine Ecology Progress Series. 237, 41-50 (2002).
  7. Gardner, W. S., et al. Nitrogen fixation and dissimilatory nitrate reduction to ammonium (DNRA) support nitrogen dynamics in Texas estuaries. Limnology & Oceanography. 51 (1), 558-568 (2006).
  8. Preisler, A., et al. Biological and chemical sulfide oxidation in a Beggiatoa inhabited marine sediment. The ISME Journal. 1 (4), 341-353 (2007).
  9. Gardner, W. S., McCarthy, M. J. Nitrogen dynamics at the sediment-water interface in shallow, sub-tropical Florida Bay: why denitrification efficiency may decrease with increased eutrophication. Biogeochemistry. 95 (2-3), 185-198 (2009).
  10. Dong, L. F., et al. Changes in benthic denitrification, nitrate ammonification, and anammox process rates and nitrate and nitrite reductase gene abundances along an estuarine nutrient gradient (the Colne estuary, United Kingdom). Applied and Environmental Microbiology. 75 (10), 3171-3179 (2009).
  11. Koop-Jakobsen, K., Giblin, A. E. The effect of increased nitrate loading on nitrate reduction via denitrification and DNRA in salt marsh sediments. Limnology & Oceanography. 55 (2), 789-802 (2010).
  12. Dong, L. F., et al. Dissimilatory reduction of nitrate to ammonium, not denitrification or anammox, dominates benthic nitrate reduction in tropical estuaries. Limnology & Oceanography. 56 (1), 279-291 (2011).
  13. Fernandes, S. O., Bonin, P. C., Michotey, V. D., Garcia, N., LokaBharathi, P. A. Nitrogen-limited mangrove ecosystems conserve N through dissimilatory nitrate reduction to ammonium. Scientific Reports. 2, 419 (2012).
  14. Behrendt, A., de Beer, D., Stief, P. Vertical activity distribution of dissimilatory nitrate reduction in coastal marine sediments. Biogeosciences. 10 (11), 7509-7523 (2013).
  15. Song, G. D., Liu, S. M., Marchant, H., Kuypers, M. M. M., Lavik, G. Anammox denitrification and dissimilatory nitrate reduction to ammonium in the East China Sea sediment. Biogeosciences. 10 (11), 6851-6864 (2013).
  16. Yin, G., Hou, L., Liu, M., Liu, Z., Gardner, W. S. A novel membrane inlet mass spectrometer method to measure 15NH4+15+ for isotope-enrichment experiments in aquatic ecosystems. Environmental Science & Technology. 48 (16), 9555-9562 (2014).
  17. Zheng, Y., et al. Tidal pumping facilitates dissimilatory nitrate reduction in intertidal marshes. Scientific Reports. 6, 21338 (2016).
  18. Bu, C., et al. Dissimilatory Nitrate Reduction to Ammonium in the Yellow River Estuary: Rates, Abundance, and Community Diversity. Scientific Reports. 7, 6830 (2017).
  19. Scott, J. T., McCarthy, M. J., Gardner, W. S., Doyle, R. D. Denitrification, dissimilatory nitrate reduction to ammonium, and nitrogen fixation along a nitrate concentration gradient in a created freshwater wetland. Biogeochemistry. 87 (1), 99-111 (2008).
  20. Shan, J., et al. Dissimilatory Nitrate Reduction Processes in Typical Chinese Paddy Soils: Rates, Relative Contributions, and Influencing Factors. Environmental Science & Technology. 50 (18), 9972-9980 (2016).
  21. Silver, W. L., Herman, D. J., Firestone, M. K. Dissimilatory nitrate reduction to ammonium in upland tropical forest soils. Ecology. 82 (9), 2410-2416 (2001).
  22. Holmes, R. M., McClelland, J. W., Sigman, D. M., Fry, B., Peterson, B. J. Measuring 15N–NH4+ in marine, estuarine and fresh waters: An adaption of the ammonia diffusion method for samples with low ammonium concentrations. Marine Chemistry. 60 (3-4), 235-243 (1998).
  23. Sigman, D. M., et al. A bacterial method for the nitrogen isotopic analysis of nitrate in seawater and freshwater. Analytical Chemistry. 73 (17), 4145-4153 (2001).
  24. Weigand, M. A., Foriel, J., Barnett, B., Oleynik, S., Sigman, D. M. Updates to instrumentation and protocols for isotopic analysis of nitrate by the denitrifier method. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 30 (12), 1365-1383 (2016).
  25. Isobe, K., et al. Analytical techniques for quantifying 15N/14N of nitrate, nitrite, total dissolved nitrogen and ammonium in environmental samples using a gas chromatograph equipped with a quadrupole mass spectrometer. Microbes and Environments. 26 (1), 46-53 (2011).
  26. Miyajima, T., Tanaka, Y., Koile, Y. Determining 15N enrichment of dissolved organic nitrogen in environmental waters by gas chromatography/negative-ion chemical ionization mass spectrometry. Limnology and Oceanography. 3 (3), 164-173 (2005).
  27. Stevens, R. J., Laughlin, R. J., Burns, L. C., Arah, J. R. M., Hood, R. C. Measuring the contributions of nitrification and denitrification to the flux of nitrous oxide from soil. Soil Biology and Biochemistry. 29 (2), 139-151 (1997).
  28. Porubsky, W. P., Velasquez, L. E., Joye, S. B. Nutrient-replete benthic microalgae as a source of dissolved organic carbon to coastal waters. Estuaries and Coasts. 31 (5), 860-876 (2008).
  29. Huygens, D., et al. Mechanisms for retention of bioavailable nitrogen in volcanic rainforest soils. Nature Geoscience. 1 (8), 543-548 (2008).
  30. Rutting, T., Boeckx, P., Muller, C., Klemedtsson, L. Assessment of the importance of dissimilatory nitrate reduction to ammonium for the terrestrial nitrogen cycle. Biogeosciences. 8 (7), 1779-1791 (2011).
  31. Song, B., Lisa, J. A., Tobias, C. R. Linking DNRA community structure and activity in a shallow lagoonal estuarine system. Frontiers in Microbiology. 5, 460 (2014).
  32. Cheng, L., et al. Dissimilatory nitrate reduction processes in sediments of urban river networks: Spatiotemporal variations and environmental implications. Environmental Pollution. 219, 545-554 (2016).
  33. Lisa, J. A., Song, B., Tobias, C. R., Hines, D. E. Genetic and biogeochemical investigation of sedimentary nitrogen cycling communities responding to tidal and seasonal dynamics in Cape Fear River Estuary. Estuarine, Coastal and Shelf Science. 167, A313-A323 (2015).
  34. Deng, F. Y., et al. Dissimilatory nitrate reduction processes and associated contribution to nitrogen removal in sediments of the Yangtze Estuary. Journal of Geophysical Research: Biogeosciences. 120 (8), 1521-1531 (2015).
  35. Tiedje, J. M. Biology of Anaerobic Microorganisms. Zehnder, A. J. B. , John Wiley and Sons. 179-244 (1988).
  36. Tiedje, J. M., Sexstone, A. J., Myrold, D. D., Robinson, J. A. Denitrification: ecological niches, competition and survival. Antonie van Leeuwenhoek. 48, 569-583 (1982).
  37. Hardison, A. K., Algar, C. K., Giblin, A. E., Rich, J. J. Influence of organic carbon and nitrate loading on partitioning between dissimilatory nitrate reduction to ammonium (DNRA) and N2 production. Geochimica et Cosmochimica Acta. , 164 (2015).
  38. Sigman, D. M., et al. Natural abundance-level measurement of the nitrogen isotopic composition of oceanic nitrate: an adaptation of the ammonia diffusion method. Marine Chemistry. 57 (3-4), 227-242 (1997).
  39. Risgaard-Petersen, N., Rysgaard, S., Revsbech, N. P. Combined microdiffusion-hypobromite oxidation method for determining nitrogen-15 isotope in ammonium. Soil Science Society of America Journal. 59 (4), (1995).
  40. Gardner, W. S., Bootsma, H. A., Evans, C., John, P. A. S. Improved chromatographic analysis of 15N:14N ratios in ammonium or nitrate for isotope addition experiments. Marine Chemistry. 48 (3-4), 271-282 (1995).

Tags

Miljøvidenskab nitrogen cyklus dissimilatory nitrat reduktion til ammonium (DNRA) 15N sporstof diffusion metode persulfat oxidation quadrupole GC / MS salt marsh
Måling af de potentielle satser for dissimilatorisk nitratreduktion til Ammonium baseret på <sup>14</sup>NH<sub>4</sub><sup>+</sup>/<sup>15</sup>NH<sub>4</sub><sup>+</sup> Analyser via Sekventiel konvertering til N<sub>2</sub>O
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kuroiwa, M., Fukushima, K.,… More

Kuroiwa, M., Fukushima, K., Hashimoto, K., Senga, Y., Sato, T., Katsuyama, C., Suwa, Y. Measurement of the Potential Rates of Dissimilatory Nitrate Reduction to Ammonium Based on 14NH4+/15NH4+ Analyses via Sequential Conversion to N2O. J. Vis. Exp. (164), e59562, doi:10.3791/59562 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter