Summary
סדרה של שיטות כדי לקבוע את שיעור DNRA פוטנציאלי מבוסס על 14NH4+/15NH4+ ניתוחים מסופק בפירוט. NH4+ מומר N2O באמצעות מספר שלבים וניתח באמצעות ספקטרומטריה גז quadrupole כרומטוגרפיה-מסה.
Abstract
החשיבות של הבנת גורלה של חנקה(מס'3), שהיא מין ה-N הדומיננטי המועבר מהמערכות האקולוגיות הימיות, הולכת וגוברת משום שמטעני החנקן העולמיים גדלו באופן דרמטי בעקבות התיעוש. הפחתת חנקה דיסציפליטורית אמוניום (DNRA) ו denitrification הם שני תהליכים מיקרוביאליים המשתמשים NO3- לצורך הנשימה. בהשוואה להכחשת, החלטות כמותיות של פעילות DNRA בוצעו רק במידה מוגבלת. זה הוביל להבנה לא מספקת של החשיבות של DNRA ב NO3- טרנספורמציות ואת הגורמים ויסות של תהליך זה. מטרת נייר זה היא לספק הליך מפורט למדידת קצב DNRA הפוטנציאלי בדגימות סביבתיות. בקצרה, ניתן לחשב את שיעור ה-DNRA הפוטנציאלי מקצב ההצטברות של 15N-label (15NH4+) ב- 15NO3- דגירה נוספת. הקביעה של 14NH4+ ו 15NH4+ ריכוזים המתוארים במאמר זה מורכבת מהצעדים הבאים. ראשית, NH4+ בדגימה מופק ולכוד על מסנן זכוכית חומצית כמו מלח אמוניום. שנית, אמוניום הלכוד הוא מחומצן ומחומצן מספר3- באמצעות חמצון שכנוע. שלישית, מספר3- מומר ל- N2O באמצעות מכחיש לקוי של N2O reductase. לבסוף, N 2 Oהמרהמנותח באמצעות מערכת ספקטרומטריה גז quadrupole שפותחה בעבר כרומטוגרפיה-מסה. יישם שיטה זו למשבעים בביצות מלח וחשבנו את שיעורי ה-DNRA הפוטנציאליים שלהם, כך שההליכים המוצעים מאפשרים קביעה פשוטה ומהירה יותר בהשוואה לשיטות שתוארו קודם לכן.
Introduction
הסינתזה המלאכותית של דשן חנקן והיישום הנרחב שלה דאגה מאוד למחזור החנקן העולמי. ההערכה היא כי העברת חנקן תגובתי מהדרך למערכות החוף הוכפלה מאז טרום תעשייתיכפול 1. חלק ניכר מדשנים המיושמים על שדה נתון נשטף מהאדמה לנהרות או מי תהום, בעיקר כ-NO3- 2. הדבר עלול לגרום לבעיות סביבתיות כגון זיהום מי שתייה, eutrophication, והיווצרות היפוקסיה. NO3- בסביבות מים מוסר או נשמר במערכת האקולוגית באמצעות התבוללות ביולוגית ותהליכי התפכחות מיקרוביאלית שונים. דניטריפיקציה ואנלוקס ידועים כתהליכי הסרה מיקרוביאליים עיקריים עבור מספר3-. דניטריפיקציה היא הפחתהמיקרוביאליתשל NO 3- למוצרי N גזים (לא, N 2 O ו-N2)יחד עם חמצון של תורם אלקטרונים, כגון חומרים אורגניים, ובכך מפחיתים אתהסיכוןלבעיות הנ"ל. אנלוקס מייצרת גם את N2 מ-NO2- ו-NH4+; לכן, הוא מסיר N לא מאורגני ממערכת אקולוגית. לעומת זאת, DNRA פועלת כדי לשמור על N במערכת אקולוגית; מקובל כי DNRA מבוצע בעיקר על ידי חיידקים מותססים או חיידקים chemolithoautotrophic, כי הם להפחיתדיסמיליטוריוםמס ' 3- כדי bioavailable ופחות נייד NH4+.
מחקרים על DNRA בוצעו בעיקר במערכות אקולוגיות ימיות או שפך, כגון מעיעי אושיאניק או שפך ומים, מלח או אדמת ביצות ממאכלית, ואדמת מנגרובה. מערכות אקולוגיות חופיות או ימיות חשובות כמאגרים להסרתמספר 3- ממערכות אקולוגיות ארציות, ובמוקרים קודמים DNRA הוצגלתרום על מגוון רחב מאודשל לא 3- הסרה (0-99%)3,4,5,,,6,7,,,,8,,9,,10,11,12,13,,14,15,,16,,17,,18., יתר על כן, קיומו של DNRA הוכח במגוון רחב של סביבות כולל סביבותמים מתוקים 19, אדמת אורזאורז 20, וקרקעות יער21. בעוד מחקרים אלה הראו כי DNRA הוא פוטנציאל דומה להכחדה עבור לא3- הסרה, מחקרים המודדים את פעילות DNRA עדיין מוגבלים מאוד בהשוואה לאלה מדידת denitrification.
קצב DNRA הוערך באמצעות 15 טכניקות תיוגN בשילוב עם ניתוח נתונים באמצעות מודלים אנליטיים או מספריים. פתרון אנליטי אחד לחישוב קצב ה-DNRA מבוסס על העלייה בהעשרת 15N של מאגר NH4+ לאחר תוספת של 15NO3- כמעקב. 15 .15.15 N-מתויג מספר3- מתווסף לדוגמה ודגירה, ולאחר מכן ניתן לחשב את שיעור DNRA מן הריכוז ושינויים יחס איזוטופ ב- NH4+ לפני ואחרי פרק זמן מסוים. במאמר זה, שיטה לכמת את הריכוז NH4+ ואת יחס איזוטופ, אשר נדרשים כדי לחשב את קצב DNRA, מתואר בפירוט. בעיקרון, השיטה שדווחה כאן היא שילוב של מספר טכניקותשדווחו בעבר 22,23,24,25,26 עםשינויים שנוספו כמה הליכים. השיטה מורכבת מסדרה של חמישה הליכים רכיבים: (1) דגירה של מדגם סביבתי עם התיקון של מעקב איזוטופ יציב, 15NO3-, (2) חילוץ ושחזור של NH 4+ באמצעות"הליךדיפוזיה" עם שינויים, (3) חמצון persulfate של NH4+ בדגימה, המורכב מ-NH4 הילידים+ ו-15NH4+ נגזר מ- 15NO3- באמצעות פעילות DNRA, לתוך מספר 3- ו- 15NO3- ,(4) טרנספורמציה מיקרוביאלית עוקבת של מספר3- ו- 1 5NO3- ל- N2O isotopomers באמצעות שיטת המכחיש שונה, ו-(5) כימות של האיזוטופומרים N+ 2O באמצעות ספקטרומטריה כרומטוגרפיה-מסה גז (GC/MS). בסעיף הבא, תחילה, מתוארת ההכנה לנוהגים (2) ו- (4) ולאחר מכן, לאחר מכן, כל חמשת נהלי הרכיבים מתוארים בפירוט.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת מעטפת PTFE ללכידת גזים כמותיים NH3
- מניחים פיסת 60 מ"מ של קלטת polytetrafluoroethylene (PTFE) (25 מ"מ רוחב) על גיליון קטן של רדיד אלומיניום (כ 300 מ"מ x 450 מ"מ בגודל, מנגב עם אתנול).
- אפר מסנן סיבי זכוכית (10 מ"מ קוטר עם גודל נקבוביות של 2.7 μm) ב 450 מעלות צלזיוס עבור 4 שעות בתנור עמום. מניחים את מסנן סיבי הזכוכית מעט מעל נקודת האמצע של הציר הארוך יותר של הקלטת(איור 1a).
- ספוט 20 μL של 0.9-mol / L H2SO 4 במרכז מסנן GF / D, ומיד לקפל את קלטת PTFE באמצעות שתי פינצטה: פינצטה חותמת שטוחה פינצטה ישר. השלבים הבאים, שלבים 1.4-1.7, מוצגים באיון 1 ויש לבצעם במהירות.
- הפוך את קלטת PTFE מעל מסנן GF/D בקו המקוע המוצג באיון 1a כדי ליצור את הצורה המוצגת באיון 1b.
- אטמו את שני הצדדים על ידי קיפול ולאחר מכן לחיצה הדוקה על הקצה עם פינצטה(איור 1c). אל תלחץ חזק מדי, ואל תגרד את קלטת PTFE.
- מקפלים את הקצה הפתוח עם פינצטה, ולאחר מכן לחץ על הקצה עם פינצטה(איור 1d).
- אטמו את הקצה הפתוח על ידי לחיצה הדוקה על הקצה עם הפינצטה(איור 1e). אין ללחוץ על מסנן GF/D במהלך הליך זה.
2. הכנת הביומסה של תחמוצת החנקן reductase מכחיש לקוי, Pseudomonas כלורורפאיס subsp. aureofaciens ATCC13985, עבור שיטת המכחיש
- רצף של 20% מניות גליטרול של פסאודומונס כלורואפיס subsp. aureofaciens ATCC13985 על 1/4 כוח טריפטון מרק ים (TSB) צלחות אגר. דגירה את הצלחות ב 25 מעלות צלזיוס במשך 2-3 ימים.
- להעביר מושבת יחידים של P. כלורוראפיס לנבחנה קטנה המכילה 5 מ"ל של TSB אוטומטי ותרבות aerobically (מבלי לרעוד) במשך יום ב 25 ° C בחושך עד להשגת צמיחה מקסימלית; זה ישמש כקדם תרבות.
- להעביר 3 מ"ל של preculture לבקבוק 1-L עם פקק גומי סיליקון המכיל 1 L של TSB שונה autoclaved טרי בתוספת 10 mmol / L KNO323. דגירה הבקבוק תוך כדי תסיסה באמצעות מערבל בתנאים חשוכים ב 25 מעלות צלזיוס. לאחר הטיפוח במשך 8 שעות, החליפו את פקק גומי הסיליקון בכובע בורג וצרו היטב. המשיכו את הטיפוח באנוקסיה בן לילה.
- צנטריפוגה התרבות ב 18,800 x g עבור 15 דקות ב 4 ° C כדי לקבל כדורי ביומסה.
- לשטוף את הביומסה ארוז שלוש פעמים עם 30 מ"ל של תמיסת מלח פוספט של Dulbecco אגירה (D-PBS(-), pH 7.5), כדי לחסל לחלוטין את מספר3-. תנאי הצנטריפוגה זהים לתנאים בשלב 2.3.
- לאחר הכביסה, להשעות מחדש את הביומסה ארוז עם 30 מ"ל של D-PBS(-). השתמש 1 מ"ל של המתלה כדי לקבוע את צפיפות התא על-ידי מדידת OD600. פיפט 1 מ"ל aliquots של המתלים הנותרים לתוך cryovials סטרילי המכיל 0.8 מ"ל של 45% גליטרול. שמור על מלאי גליטרול מוכן ב- 80 °C עד לשימוש (ראה סעיף 6).
3. חיסול חמצן, ניטריט, וחניטה מהמום המדגם
- לשקול 3.0 גרם (משקל רטוב) של מום לתוך בקבוקון זכוכית 20 מ"ל ולהוסיף 9.0 מ"ל של מים על פני השטח כדי להשעות אותו (25% w / w slurry).
- אטמו את הבקבוקון עם בפקק גומי בוטיל שחור (שטף במים בחילופי יון ועיקור באמצעות autoclaving) וכובע אלומיניום.
- טהר את המתלים והחלף את אוויר מרחב הראש ב- Ar (>99.99%) ב 0.6 L/min במשך 20 דקות באמצעות סעפת.
- החלף את גז מרחב הראש Ar בגז טהור במיוחד (>99.99995%) הוא על ידי שאיבת אבק עבור 90 s וטעינה הוא עבור 30 s. חזור על הליך זה ארבע פעמים. תפעיל את לחץ הגז במרחב הראש ל-1.5 כספומט.
- דגירה הבקבוקונים ב 20 מעלות צלזיוס לילה עם רועד ב 150 סל"ד בתנאים חשוכים באמצעות שייקר טמפרטורה קבוע כדי לחסל את החמצן הנותרים, חנקה, וניטריט בהשעיית משקע וגז headspace.
4. ניסוי קורס זמן לקביעת קצב DNRA
- החלף את גז המרחב הראשי בגז טרי וטהור במיוחד הוא משתמש באותו הליך כמו בשלב 3.5 אך ללא ארבע החזרות.
- הוסף מצעים מסומנים ללא תווית לכל בקבוקון בהתאם לטבלה 1 באמצעות תעצור הגומי בוטיל באמצעות מזרק צמוד. טהר את פתרונות המצע שהוכנו בעבר בקבוקוני זכוכית בגודל הולם באמצעות הוא טהור במיוחד עם הלחץ של מרחב הראש להגדיר 1.5 atm כדי למנוע זיהום אוויר. הימנע הזרקה לא מכוונת של כל כמות של אוויר במהלך הליכי ההזרקה.
- דגירה בקבוקונים ב 20 מעלות צלזיוס עם רועד ב 150 סל"ד. הוסף את ה מצעים לכל בקבוקון לפי טבלה 1 וגיבל עבור שעה אחת, 3 שעות ו- 5 שעות. לאחר הפסקת הדגירה, בכפוף להשעיית מום הבקבוקונים על ההליכים הבאים: שלבים 4.4-4.9.
- הסר את מכסה האלומיניום ואת פקק הגומי בוטיל מכל בקבוקון. לאחר מכן, להוסיף KCl (אפר ב 450 °C עבור 4 שעות) להשעיית משקע עד ריכוז סופי של כ 2 מול / L כדי להבטיחאת ההתאוששותשל NH 4+ מן המשקע. סגור את הבקבוקונים עם בופר גומי בוטיל וסגירת אלומיניום.
- לנער את המשקע ב 150 סל"ד עבור 1 שעה ב 4 ° C בתנאים חשוכים כדי לחלץ את NH4+.
- מעבירים את כל מתלי המשקעים בבקבוקון לצינור צנטריפוגות פלסטיק של 50 מ"ל, וצנטריפוגה ב-10,000 x g למשך 10 דקות ב-4°C.
- לשטוף את הקיר הפנימי של מזרק חד פעמי שנפתח זה עתה 10 מ"ל, ולצרף אותו למסנן קרום אצטט חד פעמי שנפתח טרי (גודל נקבוביות 0.22 μm, 25 מ"מ קוטר). לאחר מכן, לשטוף את מסנן הממברנה עם 1 מ"ל של supernatant. מניחים את יחידת המזרק-מסנן שטיפה על בקבוק פוליפרופילן ברוחב 20 מ"ל (PP).
- לסנן את supernatant הנותרים דרך מסנן קרום אצטט לתוך בקבוק PP 20 מ"ל. אחסן את תמציות תמציות ב -20 °C עד לניתוח נוסף.
5. לכידת NHמפוזר 4+ ב 2M H2 אז4 נספג למסנן GF / D במעטפה PTFE וחמצון שכנוע של NH4+ עד לא3-
- הכן פתרונות סטנדרטיים של 14NH4Cl עם מעברי ריכוז של 0 μmol / L, 10 μmol / L, 40 μmol / L, 100 μmol / L, 200 μmol / L, 400 μmol / L, ו 500 μmol / L. לניתוח יחס 15N, לתקן את הריכוז הכולל של NH4+ כדי 200 μmol / L ולהכין יחסי איזוטופ של 100:0, 99.5:0.5, 99:1, 93:7, 90:10, 50:50, ו 10:90 עם טהור 14NH4Cl ו 15NH4Cl פתרונות סטנדרטיים.
- להעביר 30 מ"ג של MgO (אפר ב 450 מעלות צלזיוס עבור 4 שעות) בקבוקון זכוכית 20 מ"ל, ולמקם את מעטפת PTFE בבקנה.
- העבר 5 מ"ל של מדגם או תקן לתוך הבקבוקון המכיל את MgO ומעטפת PTFE, ומיד סגור עם תעצור גומי בוטיל אפור. אטום עם מכסה אלומיניום. אם הריכוז של NH4+ צפוי לחרוג 500 μmol / L, לדלל את המדגם אל מתחת 500 μmol / L.
- לנער את הבקבוקונים ב 150 סל"ד במשך 3 שעות ב 4 מעלות צלזיוס בתנאים חשוכים.
- הסר את מכסה האלומיניום ואת פקק הגומי של ה-butyl. להוציא את מעטפת PTFE מהמבעון באמצעות פינצטה בנקודה, לשטוף ביסודיות את המעטפה ואת הפינצטה עם מים חילופי יון, לנגב אותם עם נייר ניגוב, ולאחר מכן מניח את המעטפה על נייר ניגוב טרי.
- פתח את מעטפת PTFE עם כמה פינצטה (מומלץ להשתמש הן פינצטה שטוחה והן פינצטה בנקודה) בסדר ההפוך המדויק של הקיפול שבוצע בשלבים 1.4-1.7.
- החזק את האזור ההיקפי של מסנן GF/D, שבו H2SO4 אמור להיות ספוג, עם פינצטה שטוחה, ולהעביר אותו לתוך צינור 11 מ"ל מכסה בורג עם כובע PTFE מרופד. יש לשטוף את הפינצטה במים שהוחלפו ביון, ולנגב אותן בנייר ניגוב.
- חזור על שלבים 5.5-5.7 עבור המעטפות הנותרות.
- הוסף 1 מ"ל של מים חילופי יון לכל אחד מהמבחנות, לסגור את מכסה הבורג, ולשמור אותו מבלי לרעוד לפחות 30 דקות בטמפרטורת החדר כדי לדהים לחלוטין את NH4+ ממסנן GF / D. במהלך שלב זה, לבצע את השלב הבא (שלב 5.10) במקביל.
- הכן את תמיסת השכנוע חמצון (POR) רייגנט25,26.
- מכיוון שלא ניתן לאחסן אותו, הכן את הכמות המדויקת של POR הדרושה לטיפול ביום אחד של דגימות.
- כדי להכין POR לטיפול 50 דגימות, לשפוך 100 מ"ל של מים יון-הוחלפו לתוך בקבוק 200 מ"ל בורג כובע ולהוסיף 1.52 גרם של NaOH (חנקן תרכובת ניתוח כיתה), 3 גרם של חומצה בורי, ו 5 g של K2S2O 8 (חנקן וציון ניתוח זרחן) בסדר זה. מיד לאחר הוספת כל ריאגנט, יש לנער את הפתרון עד שהוא מומס לחלוטין.
- במידת הצורך, להשרות את הבקבוק במים חמים כדי לסייע בפירוק הכימיקלים; עם זאת, יש לשלם את תשומת הלב ביחס לזיהום מספר3- מכיוון שבדרך כלל מי ברז מכילים מספר3.
- לאחר שלב 5.8, פתח את מכסה הבורג, הוסף 2 מ"ל של ריאה של POR למאנון, וסגור את הצינור בחוזקה עם מכסה בורג כדי למנוע אובדן או זיהום בשלבים הבאים.
- עמדו במבחנות על מתלה, עטכו אותם בנייר אלומיניום דו שכבתי, והוצמדו אותם לשעה אחת ב-121°C. שמור את הצינורות במצב זקוף במהלך שלב זה ולהימנע משינויים מהירים בטמפרטורה לאחר סיום autoclaving.
6. קביעת מספר3- מומר מ- NH4+ על-ידי שיטת המכחיש באמצעות quadrupole GC/MS
- לערבב 100 מ"ל של חיץ פוספט סטרילי 40-mmol / L (pH 7.2) ו 100 מ"ל של גלוקוז סטרילי 30-mmol / L באופן אמפטי (20-mmol / L פוספט ו 15-mmol / L גלוקוז; סופי).
- הוסף נפח של 1/7.2 נפח של מלאי גליצרול של P. chlororaphis ל 200 מ"ל של תמיסת גלוקוז פוספט אגירה בקבוקון Erlenmeyer 300 מ"ל, ולטהר עם הוא טהור במיוחד (>99.995%) זרם לשעה אחת.
- לחלק 2.0 מ"ל של השעיית המכחיש לכל בקבוקון 5 מ"ל. מכסים את הבקבוקונים עם בפקק גומי בוטיל אפור וסגירת אלומיניום.
- החלף את האוויר headspace עם אולטרה טהור הוא על ידי שאיבת במשך 3 דקות וטעינת He עבור 1 דקות. הגדר את הגז במרחב הראש לחץ חיובי ל1.3 atm כדי למנוע זיהום אוויר לא מכוון.
- להזריק 1 מ"ל של מדגם או תקן דרך תעצור גומי butyl באמצעות מזרק חד פעמי 1 מ"ל. שים לב לכמות המדויקת של הדגימה שהוזרקה בפועל.
- דגירה הבקבוקונים לילה ב 25 מעלות צלזיוס בתנאים חשוכים.
- להזריק 0.3 מ"ל של 6-mol / LL NaOH כדי לעצור את ההתכחשנותולספוגאת מרחב הראש CO 2 , אשר אחרתברצינות להפריעN 2 O ניתוח על ידי GC / MS כי CO2 ו N2O יש את אותו משקל מולקולרי.
- לקבוע את הכמויות של 44N2O, 45N2O, ו 46N2O בגז headspace באמצעות quadrupole GC/MS עם יציאת הזרקה שונה25. תנאי ההפעלה המשמשים לניתוח GC/MS מוצגים בטבלה 2.
7. ניתוח נתונים
- להפיק את עקומת הכיול עבור NH 4+ ריכוז מהיחסיםליניאריים בין הריכוז הידוע של 14NH4+ ואת עוצמת האות נמדד של סך המיוצר 44N2O + 45N2O + 46N2O. תגזר את עקומת הכיול עבור תוכן 15N ממערכת היחסים ליניארית בין האטום הידוע (כלומר, 15N/14N+15N) לבין האטום המחושב באמצעות משוואהשסופקה קודם לכן 27. לחשב את הריכוז של 15NH4+ על ידי הכפלת סך NH4+ על ידי יחס 15N של NH4+.
- חשב את קצב DNRA הפוטנציאלי באמצעות משוואות המסופקות במקוםאחר 28,29,30.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
התוצאות המייצגות שהוצגו בנייר זה נגזרו מ-15ניסויי מעקב N של מום ביצות מלח. ביצת המלח שנדגמה נוצרה לאחרונה בעקבות רעידת האדמה במזרח יפן הגדולה ב-2011 באזור אמון בעיר קסן-נומה במחוז מיאגי, יפן. בספטמבר 2017 נאספו מום (0-3 ס"מ) בשני אתרים באזורים התת-תתי-דליים והאינטרטידליים. ראשית, מיד לאחר האיסוף, המסיסה נסיפה דרך רשת של 4 מ"מ כדי להסיר שורשי צמחים, פגזים פסולת, והריסות ולאחר מכן homogenized. הדגימות אוחסנו ב-4°C עד לניתוח ה-DNRA.
הליכי הדגירה עבור 15NO3- והקביעה בו-זמנית של 14NH 4+ ו- 15NH 4+ ריכוזיםבוצעו כמתואר בסעיף הפרוטוקול. עלייה של 15NH 4+ ריכוז לאורךתקופת הדגירה נצפתה עבור כל המ המסוקים (איור 2). חישבנו את שיעורי DNRA על-ידי חלוקת שיעור ההצטברות של 15NH4+ על-ידי יחס האיזוטופ שלמס' 3- מאגר29. התעריפים המחושבים היו בטווח של 24.8-177 nmol-N g-1 אדמהיבשה h -1 ( טבלה 3 )והם היו דומיםלערכים שנמצאו במחקרים קודמים. טווח זה של תעריפים שהושגו גבוה יותר מהערכים המדווחים הנגזרים בסביבות דומות,כולל אלה של מפסקים בין-טודלים 17,ביצות מלח 5,16וסביבותשפך אחרות 18,33,34, כמו גם בסביבות eutrophic כגון שפך נהר רדודבצפון קרוליינה 31 ורשתות הנהר העירונישנגחאי 32. לעומת זאת, פרננדס ואח'13 דיווח על שיעורי DNRA פוטנציאליים גבוהים יותר בקרקעות מנגרובה עשירות באופן אורגני בהודו. באופן כללי, DNRA נחשב מועדף על ידי יחס גבוה של C זמין לאלקטרוניםמקבלים 35,36,37. הדגימות הממחישות את התוצאות המייצגות נלקחו מביצת מלח שנוצרה לאחרונה על ידי רעידת אדמה, ששימשה במקור כשדה טיפוח. מאפיין מסוים זה של הדגימות עשוי לתרום שיעור DNRA גבוה שנצפה. בהתאם לספקולציות אלה, שיעור ה-DNRA באזור הבין-תידלי, העשיר בתרכובות אורגניות (נתונים שאינם מוצגים) בהשוואה לאזור התת-תתי-דלי, היה גבוה יותר מזה באזור התת-תתי-דלי(איור 2, טבלה 3).
איור 1: הכנת מעטפת PTFE ללכידת NH גזים3. מעטפת PTFE המשמשת בהליך דיפוזיה מוכנה על-ידי קיפול קלטת PTFE בהתאם להוראות המוצגות בלוחות (A))–(ה).( המסנן החומצי בתוך המעטפה לוכד את ה-NH3 הגזי. יש לבצע צעדים אלה במהירות. מידע מפורט ניתן בשלבים 1.2-1.7 בסעיף הפרוטוקול. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2: שינוי ב- 15NH4+ ריכוז באמצעות הדגירה אנאירובית של מסיסות. הדגירה 15N מעקב של דגימות מום נערכו בכפילויות. הריכוז של 15N-NH4+ מוצג nmol לכל משקל יבש של מסיסה. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 3: דוגמה לעקומת הכיול של ריכוז נמוך N2O. אזור השיא של N2O הושג על ידי סכום של שטח השיא של m/z 44, m/z 45 ו- m/z 46. תצורות עבור ניתוח GC/MS מוצג בטבלה 2. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
| 15 .15.15 מצעים עם תווית N ו- N שאינם מסומנים בתווית שנוספו לכל בקבוקון | ||
| 100 m | 100 m | |
| NH4Cl | K15לא3 | |
| נפח (μL) של פתרון מניות 100 mM שנוסף לכל בקבוקון | 24 | 60 |
| ריכוז סופי (μmol / L)* | 230§ % | 570 |
| *הערכים המוצגים מחושבים על-ידי הנחה שתכולת המים של המסיסה היא 50% | ||
| §בהתאם לריכוז אמוניום הרקע | ||
טבלה 1: שילובים של מצעים תוקנו בקבוקונים שמירה על כ 11 מ"ל של מתלה משענת מום. הדגימות הוכנו בכפילויות ונבדקות לניתוחים נוספים לאחר שעה, 3 שעות ו-5 שעות של דגירה.
| ציוד | |
| ג'י-אם-אם-סי מרובע | שימאדזו GCMS-QP2010 אולטרה |
| עמודה | CP-PoraBONDQ 25m; φ 0.32 מ"מ; עובי הסרט, 5μm |
| תנאים אנליטיים | |
| טמפרטורת עמודה | 40 °C |
| טמפרטורת יציאת הזרקה | 100 °C |
| זרם גז מוביל | קצב זרימה כולל, 47.1 מ"ל•מינימום-1 קצב זרימה בעמודה, 2.10 מ"ל•מינימום-1 |
| יחס ספריט | 20 |
| מתח זיהוי | 1.5 כ"ס |
| רגישות של N2O | |
| גבול תחתון של זיהוי (LOD)* | 1.42 pmol |
| גבול תחתון של כימות (LOQ)* | 4.58 pmol |
| *LOD ו- LOQ נקבעו על-ידי מערכת יחסים ליניארית ביןדילול סדרתישל N 2 O (0.97, 1.94, 2.91, 4.75, 9.50, 14.3 עמודים לדקה) ב- He, תגובות מתאימות באזור השיא ויחס S/N. LOD ו- LOQ חושבו כריכוזים השווים ל- S/N= 3 ו- S/N=10, בהתאמה. |
טבלה 2: תנאים לניתוח GC/MS.
| משקעים | קצב DNRA | העשרה של מספר3- * |
| nmol-N g-1 שעות-1 | אטום% | |
| אינטרטידל 1 | 177 | 99.9 |
| אינטרטידל 2 | 129 | 99.0 |
| תת-תדלת-1 | 39.3 | 99.9 |
| תת-תדלת-2 | 24.8 | 99.0 |
| *זהה לאטום% מהתוספת KNO3; חיסול מלא ולא ניטריפיקציה תחת תנאי דגירה בשימוש נבדקה בעבר. |
טבלה 3: שיעורי DNRA פוטנציאליים של מ מ מ"מים בין-תידאליים ותת-תתי-דליים שנבדקו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
יחס הריכוז והאיסטופה של NH4+ לניתוח DNRA היה מכמת במספר שיטות. הריכוזים ויחס האיזוטופים של NH4+ נמדדים בדרך כלל בנפרד. הריכוז NH4+ נמדד בדרך כלל בשיטות צבע, כוללאנלייה אוטומטית 4,10,15,,16,17. מדידת יחס האיזוטופ יש וריאציות רחבות בהתאם לשיטה שלה של NH4+ המרה, השמנה, ומכשור לניתוח. שיטות אופייניות כוללות את הפעולות הבאות:
(1) NH4+ בדגימה מומר NH3 באמצעות תוספת של MgO או NaOH. לאחר המעבר מהשלב הנוזלי לשלב הגז, ה-NH3 לכוד על מסנן זכוכית חומצי או בתמיסת חומצה. לאחר הייבוש, המסנן הוא דליק וניתח כמו N2 באמצעות מנתח יסודי / ספקטרומטר מסה יחס איזוטופ (EA-IRMS)11,18,22,38. לחלופין, ה-NH4שנתפסו + בתמיסת חומצה נאסף על adsorbent (למשל, zeolite) והוא התלקח וניתח באמצעות EA-IRMS10,12.
(2) NH4+ מחומצן N2 באמצעות חמצון תת-עורו. ההרכב המיוזוטופי של N2 המפותח נמדד באמצעות IRMS4,14,39 או ספקטרומטריה מסה מבוא ממברנה (MIMS)16,17.
(3) הריכוז NH4+ נקבע באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים ללא כל המרה. בגלל שיווי המשקל של NH4+ ו NH3 הוא שונה במקצת עבור 15NH4+ ו 14NH4+ ליד ה-pH של pKa, 14NH4+ ו 15NH 4+ ריכוזיםניתן לקבוע בהתבסס על משמרת קטנה בזמן השמירה6,19,40.
השיטה המתוארת במאמר זה היא בעצם זהה לגישה (1) המפורטת לעיל, כלומר, השלב מחלים NH4+ כמו NH3 על מסנן זכוכית בתנאים אלקליין; עם זאת, הוא שונה ביחס לצעדי NH 4 +המרהרצף הבאים. שלבי המרה אלה מבוססים על מחקרים קודמים עם שינויים נוספים כדי לקצר את הזמן הנדרש לסדרת ניסויים. ראשית, ביצענו כמה שינויים בשיטת המכחיש המקורית. לאחר הביומסה של P. כלורוראפיס מוכן כפי שתואר קודםלכן 23,24,אנו מגדלים חיידקים ולשמר את מתלי התא מרוכז כמו מלאי גליטרול. מתלה תא צפוף זה יכול לשמש ישירות לניתוח איזוטופ על ידי ערבוב אותו עם פתרון מאגר כי פעילות denitrifying כבר הושרה מספיק. למרות שנדרשת חקירה נוספת, שינוי זה עשוי לשפר את הרבייה של הניתוח מכיוון שהשיטה המוצגת מאפשרת טיפוח המוני של תאים מכחישים, הזמינים ישירות לניתוחים. כמו כן, שינינו את הרכב הפתרון להשעיית התאים החיידקיים, מדיום המבוסס על TSB לתמיסת גלוקוז עם חוצץ פוספט, כדי לא לכלול את הרכיבים המיותרים כגון peptone במדיום המקורי. שינוי זה עשוי להפחית זיהום על ידי N ריק כי תמיסת הגלוקוז פוספט אגירה אינו מכיל N, בניגוד למדיום המקורי בשימוש במחקרים קודמים; זה צריך להיבדק באמצעות ניתוחים נוספים. בשלבאיסוףNH 4+ באמצעות שיטת דיפוזיה, קיצרנו את תקופת הדגירה והורדנו את הטמפרטורה כדי למזער את ההתמוטטות של N אורגני וכל המרה שלילית או אובדן של NH4+. תוקפו של שינוי זה נבדק באמצעות הליניאריות של עקומת הכיול. בדקנו גם כי תקופת הטמפרטורה וה הדגירה ששונתה לא השפיעה על השחזור של NH4+ (הנתונים לא הוצגו).
יתרון נוסף של שיטה זו הוא כי NH4+ מומר בסופו של דבר N2O, אשר יש רקע אטמוספרי נמוך ניתן למדוד באמצעות quadrupole GC/ MS, שהוא פחות יקר וקל יותר לניהול מאשר IRMS. תחת התנאי המוצג בטבלה 2, CO2 (m/z 44) ו- N2O (m/z 44) מופרדים לחלוטין על-ידי GC; זמן השמירה של גזים אלה הוא 1.15 ו- 1.07 דקות, בהתאמה. מאז ריכוז אטמוספרי של N2O הוא בסדר של ppb, N2O ניתן למדוד עם הפרעות אוויר זניח אפילו בריכוזים נמוכים. עקומת הכיול של N 2 O עובר כמעטדרךהמקור, מדגים את ההשפעה עלהריכוזשל N 2 O בשל זיהום אטמוספרי מוגבל מאוד(איור 3). שיטה זו יש גם את היתרון כי הוא יכול לכמת את 14NH4+ ו 15NH4+ ריכוזים יחד; שיטות canonical, למעט גישה (3) המפורטים לעיל, דורשים ניתוחים בודדים עבור הריכוז ואת יחס איזוטופ.
בסך הכל, הגבולות של זיהוי וכמות עבור NH4+ באמצעות שיטה זו היו כ 0.03 μmol ו 0.09 μmol, בהתאמה, וערכים אלה שווים 6 μmol / L ו 18 μmol / L, אם 5 mL של הפתרון לדוגמה (כלומר, תמצית מעשע במקרה זה) משמש עבור הליך דיפוזיה כמתואר בנייר זה. למרות באמצעות השיטה צבע מומלץ לקבוע NH 4+ ריכוז של דגימות שיש להם NHנמוך 4+, השיטה המוצעת קובעת ביעילות את יחס NH4+ איזוטופ ואת הריכוז בדגימות עםריכוזיםגבוהים יחסית של אמוניום.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
לסופרים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
אנו מודים לנאוטו טנאקה על שעזר לאיסוף נתונים ולפתח את הפרוטוקול. אוסף הדגימות נתמך על ידי JSPS KAKENHI גרנט מספר 17K15286.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15N-KNO3 | SHOKO SCIENCE | N15-0197 | |
| 15N-NH4Cl | SHOKO SCIENCE | N15-0034 | |
| 20 mL PP bottle | SANPLATEC | 61-3210-18 | Wide-mouth |
| Aluminum cap | Maruemu | 1307-13 | No. 20, with hole |
| Boric acid | Wako | 021-02195 | |
| Centrifuge | HITACHI | Himac CR21G II | |
| Deoxygenized Gas Pressure & Replace Injector | SANSIN INDUSTRIAL | IP-12 | |
| Disposable cellulose acetate membrane filter | ADVANTEC | 25CS020AS | Pore size 0.22 µm, 25 mm in diameter |
| Disposable syringe | Termo | SS-10SZ | 10 mL |
| Disposable syringe | Termo | SS-01T | 1 mL |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (-) | NISSUI PHARMACEUTICAL | 5913 | |
| Gastight syringe | VICI Valco Instruments | 4075-15010 | Series A-2, 100 µL |
| GC/MS | shimadzu | GCMS-QP2010ultra | |
| GF/D | Whatman | 1823-010 | 10 mm in diameter |
| Glass vial | Maruemu | 0501-06 | 20 mL |
| Gray butyl rubber stopper | Maruemu | 1306-03 | No.20-S |
| H2SO4 | Wako | 192-04696 | Guaranteed Reagent |
| K2S2O8 | Wako | 169-11891 | Nitrogen and Phosphorus analysis grade |
| KCl | Wako | 163-03545 | Guaranteed Reagent |
| KNO3 | Wako | 160-04035 | Guaranteed Reagent |
| NaOH | Wako | 191-08625 | Nitrogen compounds analysis grade |
| NH4Cl | Wako | 017-02995 | Guaranteed Reagent |
| Plastic centrifuge tube | ASONE | 1-3500-22 | 50 mL, VIO-50BN |
| Pseudomonas chlororaphis subsp. aureofaciens | American Type Culture Collection (ATCC) | ATCC 13985 | Freeze-dried, the type strain of Pseudomonas aureofaciens |
| PTFE sealing tape | Sigma-Aldrich | Z221880 | 25 mm in width |
| Reciprocating shaker | TAITEC | 0000207-000 | NR-10 |
| Screw-cap test tube | IWAKI | 84-0252 | 11 mL |
| PTFE-lined cap for test tube | IWAKI | 84-0262 | |
| Tryptic Soy Broth | Difco Laboratories | 211825 |
References
- Gruber, N., Galloway, J. N. An Earth-system perspective of the global nitrogen cycle. Nature. 451 (7176), 293-296 (2008).
- Galloway, J. N., et al.
- Rysgaard, S., Risgaard-Petersen, N., Sloth, N. P. Nitrification, denitrification, and nitrate ammonification in sediments of two coastal lagoons in Southern France. Coastal Lagoon Eutrophication and Anaerobic Processes (C.L.E.AN.). Developments in Hydrobiology. Caumette, P., Castel, J., Herbert, R. 117, Springer. Dordrecht. 133-141 (1996).
- Christensen, P. B., Rysgaard, S., Sloth, N. P., Dalsgaard, T., Schwærter, S. Sediment mineralization, nutrient fluxes, denitrification and dissimilatory nitrate reduction to ammonium in an estuarine fjord with sea cage trout farms. Aquatic Microbial Ecology. 21, 73-84 (2000).
- Tobias, C. R., Anderson, I. C., Canuel, E. A., Macko, S. A. Nitrogen cycling through a fringing marsh-aquifer ecotone. Marine Ecology Progress Series. 210, 25-39 (2001).
- An, S. M., Gardner, W. S. Dissimilatory nitrate reduction to ammonium (DNRA) as a nitrogen link, versus denitrification as a sink in a shallow estuary (Laguna Madre/Baffin Bay, Texas). Marine Ecology Progress Series. 237, 41-50 (2002).
- Gardner, W. S., et al. Nitrogen fixation and dissimilatory nitrate reduction to ammonium (DNRA) support nitrogen dynamics in Texas estuaries. Limnology & Oceanography. 51 (1), 558-568 (2006).
- Preisler, A., et al. Biological and chemical sulfide oxidation in a Beggiatoa inhabited marine sediment. The ISME Journal. 1 (4), 341-353 (2007).
- Gardner, W. S., McCarthy, M. J. Nitrogen dynamics at the sediment-water interface in shallow, sub-tropical Florida Bay: why denitrification efficiency may decrease with increased eutrophication. Biogeochemistry. 95 (2-3), 185-198 (2009).
- Dong, L. F., et al. Changes in benthic denitrification, nitrate ammonification, and anammox process rates and nitrate and nitrite reductase gene abundances along an estuarine nutrient gradient (the Colne estuary, United Kingdom). Applied and Environmental Microbiology. 75 (10), 3171-3179 (2009).
- Koop-Jakobsen, K., Giblin, A. E. The effect of increased nitrate loading on nitrate reduction via denitrification and DNRA in salt marsh sediments. Limnology & Oceanography. 55 (2), 789-802 (2010).
- Dong, L. F., et al. Dissimilatory reduction of nitrate to ammonium, not denitrification or anammox, dominates benthic nitrate reduction in tropical estuaries. Limnology & Oceanography. 56 (1), 279-291 (2011).
- Fernandes, S. O., Bonin, P. C., Michotey, V. D., Garcia, N., LokaBharathi, P. A. Nitrogen-limited mangrove ecosystems conserve N through dissimilatory nitrate reduction to ammonium. Scientific Reports. 2, 419 (2012).
- Behrendt, A., de Beer, D., Stief, P. Vertical activity distribution of dissimilatory nitrate reduction in coastal marine sediments. Biogeosciences. 10 (11), 7509-7523 (2013).
- Song, G. D., Liu, S. M., Marchant, H., Kuypers, M. M. M., Lavik, G. Anammox denitrification and dissimilatory nitrate reduction to ammonium in the East China Sea sediment. Biogeosciences. 10 (11), 6851-6864 (2013).
- Yin, G., Hou, L., Liu, M., Liu, Z., Gardner, W. S. A novel membrane inlet mass spectrometer method to measure 15NH4+15+ for isotope-enrichment experiments in aquatic ecosystems. Environmental Science & Technology. 48 (16), 9555-9562 (2014).
- Zheng, Y., et al. Tidal pumping facilitates dissimilatory nitrate reduction in intertidal marshes. Scientific Reports. 6, 21338 (2016).
- Bu, C., et al. Dissimilatory Nitrate Reduction to Ammonium in the Yellow River Estuary: Rates, Abundance, and Community Diversity. Scientific Reports. 7, 6830 (2017).
- Scott, J. T., McCarthy, M. J., Gardner, W. S., Doyle, R. D. Denitrification, dissimilatory nitrate reduction to ammonium, and nitrogen fixation along a nitrate concentration gradient in a created freshwater wetland. Biogeochemistry. 87 (1), 99-111 (2008).
- Shan, J., et al. Dissimilatory Nitrate Reduction Processes in Typical Chinese Paddy Soils: Rates, Relative Contributions, and Influencing Factors. Environmental Science & Technology. 50 (18), 9972-9980 (2016).
- Silver, W. L., Herman, D. J., Firestone, M. K. Dissimilatory nitrate reduction to ammonium in upland tropical forest soils. Ecology. 82 (9), 2410-2416 (2001).
- Holmes, R. M., McClelland, J. W., Sigman, D. M., Fry, B., Peterson, B. J. Measuring 15N–NH4+ in marine, estuarine and fresh waters: An adaption of the ammonia diffusion method for samples with low ammonium concentrations. Marine Chemistry. 60 (3-4), 235-243 (1998).
- Sigman, D. M., et al. A bacterial method for the nitrogen isotopic analysis of nitrate in seawater and freshwater. Analytical Chemistry. 73 (17), 4145-4153 (2001).
- Weigand, M. A., Foriel, J., Barnett, B., Oleynik, S., Sigman, D. M. Updates to instrumentation and protocols for isotopic analysis of nitrate by the denitrifier method. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 30 (12), 1365-1383 (2016).
- Isobe, K., et al. Analytical techniques for quantifying 15N/14N of nitrate, nitrite, total dissolved nitrogen and ammonium in environmental samples using a gas chromatograph equipped with a quadrupole mass spectrometer. Microbes and Environments. 26 (1), 46-53 (2011).
- Miyajima, T., Tanaka, Y., Koile, Y. Determining 15N enrichment of dissolved organic nitrogen in environmental waters by gas chromatography/negative-ion chemical ionization mass spectrometry. Limnology and Oceanography. 3 (3), 164-173 (2005).
- Stevens, R. J., Laughlin, R. J., Burns, L. C., Arah, J. R. M., Hood, R. C. Measuring the contributions of nitrification and denitrification to the flux of nitrous oxide from soil. Soil Biology and Biochemistry. 29 (2), 139-151 (1997).
- Porubsky, W. P., Velasquez, L. E., Joye, S. B. Nutrient-replete benthic microalgae as a source of dissolved organic carbon to coastal waters. Estuaries and Coasts. 31 (5), 860-876 (2008).
- Huygens, D., et al. Mechanisms for retention of bioavailable nitrogen in volcanic rainforest soils. Nature Geoscience. 1 (8), 543-548 (2008).
- Rutting, T., Boeckx, P., Muller, C., Klemedtsson, L. Assessment of the importance of dissimilatory nitrate reduction to ammonium for the terrestrial nitrogen cycle. Biogeosciences. 8 (7), 1779-1791 (2011).
- Song, B., Lisa, J. A., Tobias, C. R. Linking DNRA community structure and activity in a shallow lagoonal estuarine system. Frontiers in Microbiology. 5, 460 (2014).
- Cheng, L., et al. Dissimilatory nitrate reduction processes in sediments of urban river networks: Spatiotemporal variations and environmental implications. Environmental Pollution. 219, 545-554 (2016).
- Lisa, J. A., Song, B., Tobias, C. R., Hines, D. E. Genetic and biogeochemical investigation of sedimentary nitrogen cycling communities responding to tidal and seasonal dynamics in Cape Fear River Estuary. Estuarine, Coastal and Shelf Science. 167, A313-A323 (2015).
- Deng, F. Y., et al. Dissimilatory nitrate reduction processes and associated contribution to nitrogen removal in sediments of the Yangtze Estuary. Journal of Geophysical Research: Biogeosciences. 120 (8), 1521-1531 (2015).
- Tiedje, J. M. Biology of Anaerobic Microorganisms. Zehnder, A. J. B. , John Wiley and Sons. 179-244 (1988).
- Tiedje, J. M., Sexstone, A. J., Myrold, D. D., Robinson, J. A. Denitrification: ecological niches, competition and survival. Antonie van Leeuwenhoek. 48, 569-583 (1982).
- Hardison, A. K., Algar, C. K., Giblin, A. E., Rich, J. J. Influence of organic carbon and nitrate loading on partitioning between dissimilatory nitrate reduction to ammonium (DNRA) and N2 production. Geochimica et Cosmochimica Acta. , 164 (2015).
- Sigman, D. M., et al. Natural abundance-level measurement of the nitrogen isotopic composition of oceanic nitrate: an adaptation of the ammonia diffusion method. Marine Chemistry. 57 (3-4), 227-242 (1997).
- Risgaard-Petersen, N., Rysgaard, S., Revsbech, N. P. Combined microdiffusion-hypobromite oxidation method for determining nitrogen-15 isotope in ammonium. Soil Science Society of America Journal. 59 (4), (1995).
- Gardner, W. S., Bootsma, H. A., Evans, C., John, P. A. S. Improved chromatographic analysis of 15N:14N ratios in ammonium or nitrate for isotope addition experiments. Marine Chemistry. 48 (3-4), 271-282 (1995).
