Summary
ここでは、子宮頸部マウスモデルにおける非縫合カフ技術を用いたマウスにおける異所性大動脈移植のプロトコルを提示する。このモデルは、慢性同種移植片血管症(CAV)の基礎病理を研究するために使用することができ、その形成を防ぐために新しい治療薬を評価するのに役立ちます。
Abstract
強力な免疫抑制プロトコルの導入により、急性拒絶反応の予防と治療において明確な進歩が可能である。しかし、移植された固体臓器の長期的な結果のわずかな改善のみが過去数十年間観察することができた。この文脈において、慢性同種移植片血管障害(CAV)は依然として心臓、腎臓および肺移植における後期臓器不全の主な原因を表す。
これまでのところ、CAV開発の根本的な病因は不明のままで、効果的な治療戦略が現在欠落している理由を説明し、基礎となる病態生理学を研究するために関連する実験モデルの必要性を強調し、CAV形成。以下のプロトコルは、改変された非縫合カフ技術を用いたマウスヘテロトピック子宮頸動脈移植モデルを説明する。この技術では、胸部大動脈のセグメントが右一般的な頸動脈に配置される。非縫合カフ技術を使用することで、容易に学び、再現可能なモデルを確立することができ、縫合された血管マイクロ解毒の可能な不均一性を最小限に抑えます。
Introduction
過去60年間にわたり、固体臓器移植は実験的な手順から末期臓器不全1の治療のための標準的なケアへと進化してきた。抗菌剤の改善、外科技術、免疫抑制連隊の進歩により、固形臓器移植の早期成功率は過去数十年にわたって有意に増加した2.
しかしながら、長期移植片生存率は同様に改善されていない3.CAVの開発は、長期生存を制限する主な要因4、5、6である。この病理は、平滑筋細胞からなる同心円錐形層の形成によって特徴付けられるもので、移植された固体器官の血管の進行性の狭窄および連続した不灌流につながる。心臓移植レシピエントにおいて、CAV病変は移植後3年後の患者の最大75%で診断することができる7。
CAVの病態生理学はまだ完全には理解されていない。これは、多数の免疫学的および非免疫学的因子に関連しているようで、その後の内皮活性化および機能不全8による内皮損傷につながる。これまでのところ、CAVの予防のための因果治療オプションは存在せず、CAVの形成および潜在的な治療を研究するために再生可能な小動物モデルの必要性を強調する。
マウス大動脈移植モデルを用いると、病変のようなCAVは移植後4週間で見ることができる。これらの病変は、主に血管平滑筋細胞からなる、それによって、ヒト病理に似ている。多種多様なトランスジェニックマウスとノックアウトマウスのため、移植関連病理におけるマウスモデルの使用は、新しい治療オプションを特定し、その発達を理解するユニークな機会を提供します。しかし、移植された血管の直径が小さいため、マウスモデルの使用は、一般的に長い学習曲線および初期の高い合併症率9に関連している。非縫合カフ技術の導入により、操作のこの最も困難な部分が容易になり、アナストモシスの直径が一定に保たれます10、11。
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Protocol
すべての実験は、ドイツの動物福祉法(TierSchG)のガイドラインに従って行った。(AZ: 55.2-1-54-2532.Vet_02-80-2015)
1. 動物用住宅
- 実験では、レシピエント動物としてC57BL/6マウスを有する20〜25gの男性C57BL/6およびBALB/cマウスを、ドナー動物としてBALB/cマウスを使用します。
- 健康監視のためのFELASAガイドラインに従って、バリア病原体のない施設で動物や家を購入する12.
- 濃縮ネスティング材料を持つ標準的なマクロロンケージにマウスを保管してください。12時間の昼/夜のサイクルで水とペレット食品へのアドリビタムアクセスを提供します。
- 室温を22±2°C、相対湿度を55±5%に保ちます。
2. 受取人の準備
- まず、ミダゾラム(5mg/kg;5mg/mL)、メデトミジン(0.5 mg/kg;1mg/mL)およびフェンタニル(0.05 mg/kg;0.05 mg/mL)の腹腔内注射でレシピエント動物(C57BL/6)を麻酔する。
メモ:麻酔の正しい深さに達する必要があります 5- 10 分で.- 後ろ足を鉗子でつまんで反射神経をチェックし、麻酔の深さを確認します。
- 小動物用の電気毛抜きで頸部横領域のすべての毛髪をクリップし、綿棒で眼軟膏を塗布して、処置中に目が乾燥するのを防ぎます。
- 顕微鏡の下の加熱パッドの上に動物をスフィンの位置に置き、皮膚感受性石膏ストリップで手術台に脚を穏やかにテープで留める。
- 頭を後ろに傾け、アルコールで手術場を数回スクラブします。
- 小さなはさみで右下下下に頸部切開から皮膚切開を行います。
- 血管ペディクルの双極焼灼を介して顎下腺の右下葉を取り除き、その後のマイクロはさみで切除する。
- 上部と下部の双極性焼灼を介して右胸鎖ドマスト筋を取り除き、その後マイクロシブで切除し、一般的な頸動脈にアクセスします。
- 周囲の結合組織を細かい鉗子で引き離すことによって、一般的な頸動脈を可能な限り遠くまで、そして近接的に動員する。
- 一般的な頸動脈の中央付近の間の距離を最小限に抑えて2つの7-0シルク合字を結び、合字間の細かいマイクロはさみで一般的な頸動脈を横断します。
- 近位の結びつき端を袖口に通し、小さな動脈クランプで固定します。
注:この手順で使用した袖口は、外径0.610mm、壁厚さ0.0254mmのポリイミドのチューブからマイクロシザーで切断されました。完成した袖口の長さは半分で、カフスプロセスに使用され、フルシリンダーで、残りの半分はハーフシリンダーです。 - 合字を細かいマイクロはさみでできるだけ取り除き、血管壁に損傷を与えないように注意しながら、30G針でヘパリン化生理線(50 IU/mL)でルーメンを洗い流します。
- 細かい血管拡張剤を使用して開いたルーメンをディストし、ポリイミドチューブの上にそっと引っ張ることによって、カフの上に頸動脈の切り株をエヴァート。
- すぐに緩く前に結ばれた7-0シルクループで永遠の頸動脈を固定します。
注:カフ処理をより滑らかで簡単にするために、手術前に直径約1.5mmの4 7-0シルクループをゆるくプレタイ。 - 頸動脈のもう一方の端で同じ手順(2.10-2.13)を実行します。
- レシピエント動物を脇に置き、大動脈セグメントが剥離するまで生理食合い場に潤いを与えます。
3. ドナー操作
- ドナーマウス(BALB/c)をレシピエント動物と同じ方法で麻酔する。
- 後ろ足を鉗子でつまんで反射神経をチェックし、十分な麻酔を確認します。
- 小動物用の電気毛切りク切りで腹部および胸部領域のすべての毛髪をクリップし、綿棒で眼軟膏を塗布して、処置中に目が乾燥するのを防ぎます。
- 顕微鏡の下の加熱パッドの上に動物をスフィンの位置に置き、皮膚感受性石膏ストリップで手術台に脚を穏やかにテープで留める。
- アルコールで手術場を数回スクラブします。
- 小さなはさみで中腹腹開腹を行い、腸をわずかに上に押して下大静脈(IVC)を露出させる。
- 30G針を使って1mLのヘパリン化生理行きに劣った大静脈(IVC)を注入する。
- 腹部大動脈とIVCを小さなはさみで腎動脈の下に切り取り、ドナー動物を排泄する。ゆるやかに血液を吸収するために腹部に圧縮を置きます。
- はさみで肋骨の両側転用で胸郭切除を行い、前胸壁を外科的クランプで頭蓋を傾けて、メディスティヌムを露出させる。
- IVCと食道をマイクロハサミで横隔膜の真上に切ります。
- 切り取られたIVC/食道を保持する鉗子でそれらを上方に傾け、その後、後方の胸部の胸部大腸へのアクセスを得るために、彼らのベースからマイクロシザーでそれらを切除することによって、心臓と肺を取り除きます。
- 肋間動脈に損傷を与えないように注意しながら、周囲の結合組織と脂肪を細かい鉗子で引き離すことによって、周囲の組織から胸部大動脈を動員する。
- 双極性焼灼鉗子で胸部大動脈からすべての枝を焼灼し、マイクロはさみを使用して横隔膜と大動脈弓の間の大動脈セグメントを切除する。
- 切除した大動脈セグメントを30G針でヘパリン化生理食合いで洗い流し、血管壁に損傷を与えない注意を払いながら、残りの血液や血栓を除去し、移植片をレシピエント動物に移す。
メモ:転送中に受領者のおよそ正しい位置に大動脈移植片を直接置きます。レシピエント動物の移植片の異なる端部を混乱させる問題がある場合は、遠位端の周りの緩い合字が役立つ可能性があります。
4. 着床
- 細かい鉗子で常に閉じる頸動脈の上に近位カフの上にドナー大動脈セグメントの近位端を引っ張り、すぐに緩く固定された7-0シルクループでそれを固定します。
- 遠位、大動脈移植片の自由な端をマイクロはさみでトリムし、移植片の長さが2つの袖口間の距離に収まるようにする。
- 大小突起のもう一方の袖口で手順 4.1 を繰り返し、アナストモシスを完了します。
- 逆行性灌流を可能にするために遠位クランプを取り外します。
- 止血を達成した後、近位クランプを取り外してアナストモシスを完了します。
- 最後に、6-0連続縫合糸で創傷を閉じます。
5. 術後ケア
- 手術後の最初の6時間でマウスを注意深く監視し、移植後の最初の72時間は1日数回監視して合併症を即座に検出します。
- 術後鎮痛の場合は、移植直後にブプレノルフィン(0.05-0.1 mg/kg)を移植したマウスを皮下に注射し、72時間ごとに12時間ごとに適切な長期鎮痛を提供する。
6. 大動脈移植片の説明
- ミダゾラム(5 mg/kg;5 mg/mL)、メデトミジン(0.5 mg/kg;1mg/mL)およびフェンタニル(0.05 mg/kg;0.05 mg/mL)の腹腔内注射で移植動物を麻酔する。
- 後ろ足を鉗子でつまんで反射神経をチェックし、十分な麻酔を確認します。
- 小動物のための電気毛切りク切りと腹部、胸部および子宮頸部領域のすべての髪をクリップします。
- 顕微鏡の下の加熱パッドの上に動物をスフィンの位置に置き、皮膚感受性石膏ストリップで手術台に脚を穏やかにテープで留める。
- アルコールで手術場を数回スクラブします。
- 小さなはさみで中腹腹開腹を行い、腸をわずかに上に押して下大静脈(IVC)を露出させる。
- 30G針を使って1mLのヘパリン化生理行きに劣った大静脈(IVC)を注入する。
- 腹部大動脈とIVCを小さなはさみで腎動脈の下に切り取り、ドナー動物を排泄する。ゆるやかに血液を吸収するために腹部に圧縮を置きます。
- 移植手術中に行われた皮膚切開に対応する小さなはさみで、頸部切開から右下下下下に皮膚切開を行います。
- 遠位および近位カフと一緒に移植された大動脈移植片を識別し、鉗子で周囲の組織を取り除く鈍い。
- マイクロはさみを使用して、2つの袖口の端と一緒に大動脈移植片を剥離するために、袖口で大動脈移植片に共通の頸動脈遠位および近位を切断する。
- 大動脈セグメントを半分に切断し、さらなる分析(凍結断面、パラフィン埋め込み断面、スナップ凍結材料)13、14のために検体を保持する。
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Representative Results
完全MHCミスマッチ移植モデルでは、移植後4週間で同心円錐層が見られる(図2)。この層は、主にSM22(成熟血管平滑筋細胞の選択的マーカー)に対する免疫組織学的染色として血管平滑筋細胞から成り立つ。前に述べたように、これらの血管平滑筋細胞は、慢性同種移植片血管症に見られる病変に対する病理学的である。さらなる分析のために、大動脈セグメントは、エラスティカ・ファン・ギーソン染色によって切り分け、染色されるべきである。ここで、ネオインチマル層は、内部弾性膜の弾性繊維と容易に分化することができ、チュニカ内膜をチュニカ媒体から分割する。
このモデルにおける潜在的な治療効果を評価するために、ネオインチマ-メディア比、ならびに発光断面領域狭窄は、それらの断面試料13、15で測定することができる。説明した非縫合大動脈移植の改変モデルでは、300以上の大動脈移植で>91%の技術的成功率を達成することができます。この高い成功率は、外径0.610mm、壁厚さ0.0254mmのポリイミドチューブから作られたカフを使用して達成することができます。
図1:術中の写真。(A) 結膜頸動脈を切断する。(B) 合字を除去し、ヘパリン化生理線で端を洗い流した後、クランプ頸動脈末端。(C) カフ手順。(D)完了した受信者の準備(両方の頸動脈エンドカフ)。(E)再灌流後の前および(F)移植大動脈セグメント。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:移植後4週間後の移植大動脈セグメントの組織学的標本。(A)SM22(緑色蛍光)およびDAPI(青色蛍光)による代表的な免疫組織学的染色は、血管平滑筋細胞からなる厚い新生細胞を示す。弾性繊維は赤色蛍光(20倍倍)で示されています。(B)エラスティカ・ヴァン・ギーソン染色(10倍倍)。(C)合成移植大動脈セグメント移植4週間後(10倍倍率)。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
慢性同種移植片血管障害は、心臓の固形臓器移植後の後期移植片喪失の主な原因であり、腎および肺同種移植片の可能性が高い8.これまでのところ、CAVの形成を防ぐために因果治療レジメンを開発することはできなかった。
CAVの病態生理学は多因子であり、免疫学的および非免疫学的側面16を含む。移植におけるげっ歯類モデルの使用は、固体臓器移植における同種移植片拒絶プロセスの基礎となる病態生理学を理解する上で不可欠であり、拒絶反応を防ぐ新しい治療アプローチを同定するのに役立った17.CAVは、血管平滑筋細胞からなる新生層の形成を特徴とし、臓器機能7のその後の悪化に伴う移植臓器の血管の連続狭窄および不正融合につながる。
記載されたマウス大動脈移植モデルでは、同心円状の新心形成は、移植後4週間で完全にMHC(H-2d〜H-2b)のミスマッチ胸部大動脈移植片で観察することができる。 これらの病変は、主に血管平滑筋細胞からなる(図2)。Shi et al. 199418における移植動脈硬化の最初のマウスモデルについて説明した。彼らは頸動脈セグメントを末端から側縫合まで頸動脈に移植した。1996年、Koulackらは、エンドツーエンドの解剖学19によってインフラレナル大動脈に大動脈セグメントを移植することにより、最初の腹部マウス大動脈移植モデルを確立した。ディートリッヒら、2000年11月に頸動脈に胸部大動脈セグメントを移植するための非縫合カフ技術の使用について最初に説明した。
大動脈セグメントを移植するために微小血管解剖学を使用するマウスモデルと比較して、カフ技術はいくつかの利点を提供する。まず、手順はより簡単で、学習しやすくなります。第2に、移植された大動脈セグメントの虚血時間は一定であり、ドナーの大動脈セグメントの調達が行われる前に解剖学のためにレシピエント動物が最初に調製されるので、寒さと暖かい虚血時間を最小限に抑える。第3に、アナストモシスの直径は、ポリイミドカフの剛性特性により一定に保たれる。したがって、解毒領域の狭窄は無視され得る。
さらに、外科的処置は、腹部切開を伴う技術と比較して、レシピエント動物にとって外傷性が低い。加えて、カフ技術の実施は、レシピ動物11、20、21において同じ技術を用いながら、様々な異なる種類の固形臓器移植の可能性を提供する。
我々は、この微小外科的技術は、文献に記載されている他の大動脈移植モデルよりも学ぶ方が簡単であると確信しているが、手順中にいくつかの可能な落とし穴があります。レシピエント手術中は、切断する前に胸骨膜腫スト筋を適切に焼灼してください。筋肉はよく血管化しており、付随する血管が十分に凝固しないと重度の出血が起こり得る。これらの出血は、筋肉が完全に解剖されると後退するので、制御するのが難しい。また、一般的な頸動脈を動員しながら、動脈自体を直接つかまないようにしてください。
カフ手順自体は、はるかに操作の最も困難な部分であり、最も失敗の影響を受けやすいです。したがって、頸動脈の右長で作業することが不可欠です。初めに、外科医は頸動脈の長さが少なすぎる傾向があり、処置の完了が非常に困難になる。さらに、最初に、外科医は手術場の真ん中に一般的な頸動脈の周りに分割合字を設定する傾向がある。これは、この頸動脈末端セグメントが非常に剛性であり、動員が困難であるため、より頭蓋位置のカフを実行している間に困難につながる可能性があります。一方、一般的な頸動脈のかなりの部分は、鎖骨の下の領域からのわずかな緊張によって動員され得る。したがって、頸動脈を少し近位に連結して、一般的な頸動脈の頭蓋部分により長さを残すことをお勧めします。一般的な頸動脈が解剖され、両端が袖口を通過し、血管クランプで固定されたら、頸動脈の拡張を行う必要があります。操作のこの部分では、これは容器の壁を損傷し、カフ手順中に故障につながる可能性があるため、容器を伸ばし過ぎないようにすることが非常に重要です。牽引が袖口の動脈クランプの位置合わせに沿ってなるように手術フィールド全体を回転させることはプロシージャを容易にする。
大動脈セグメントを調達する間、胸部大動脈の肋間動脈または他の枝を取り除かないようにしてください。一方、移植後の移植片の血栓症のリスクが高い移植片の損傷を防ぐために、胸部大胸部に近づきすぎないように注意してください。
大動脈セグメントを移植する際、移植片のねじれを防ぐために両端が適切に整列していることを確認してください。さらに、大動脈セグメントは、再灌流中にキンキングを防ぐために正しい長さに短縮する必要があります。移植片を再浸透させる場合は、常により多くの頭蓋クランプを最初に開いて止血を観察してください。完全に凝固していない肋間動脈の小さな出血は、小さな綿棒で穏やかな圧力を加えることによって制御することができる。
移植全体は、レシピエントの準備のために最大30分、ドナーの手術と移植のためにそれぞれ最大15分で1時間未満でする必要があります。
この方法の最も議論された欠点は、実験の期間中にカフがアナストモシスに持続することです。これは、特定の異物反応と血栓症の可能性が高いリスクにつながる可能性があります。.しかしながら、カフ技術で移植された検体の組織病理学的解析は、移植片とチューブ22の軽度の異物反応のみを明らかにした。手順のもう一つの議論された制限は、一般的な頸動脈への胸部大動脈のヘテロトピック配置である。胸部大動脈と一般的な頸動脈の間の血管径が異なるために、直交異方性大動脈間位置と比較して、移植された大動脈セグメントのより乱流の流れが予想される。これは、方法論的な基数の変更につながる可能性があります。しかし、同種移植セグメントは、方法論的ベースのバイアスを排除するネオインティマ形成をほとんど明らかにしていない(図2参照)。
本論文は、研究室における他の研究者によるこのモデルの実装を容易にすることを目的としている。上記の改変により、大動脈移植のこのマウスモデルは、高い成功率を達成しながら、基本的なマイクロサージカルスキルで達成することができます。
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Disclosures
著者らは、競合する財政的利益がないことを宣言する。
Acknowledgments
なし。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Balb-c Mice (H2-d) | Charles River | Strain# 028 | Donor animal |
Bipolar cautery system | ERBE | ICC 50 / 20195-023 | Bipolar cautery |
C57BL/6J (H-2b) | Charles River | Strain# 027 | Recipient animal |
Halsey Needle Holders | FST | 12501-12 | Needle Holder |
Halsted-Mosquito Forceps | AESCULAP | BH111R | Curved Clamp |
Medical Polyimide Tubing | Nordson MEDICAL | 141-0031 | Cuff-Material |
Micro Serrefines | FST | 18055-04 | Micro Vessel Clip |
Micro-Adson Forceps (serrated) | FST | 11018-12 | Standard Forceps |
Micro-Serrefine Clamp Applying Forceps | FST | 18057-14 | Clipapplicator |
S&T Forceps - SuperGrip Tips (Angled 45°) | S&T | 00649-11 | Fine Forceps |
S&T Vessel Dilating Forceps - Angled 10° (Tip diameter 0.2 mm) | S&T | 00125-11 | Vesseldilatator |
Schott VisiLED Set | Schott | MC 1500 / S80-55 | Light |
Stereoscopic microscope | ZEISS | SteREO Discovery.V8 | Microscope |
Student Fine Scissors / Surgical Scissors - Sharp-Blunt | FST | 91460-11 / 14001-12 | Standard Sissors |
Vannas-Tübingen Spring Scissors (curved, 8.5 cm) | FST | 15004-08 | Microsissors (curved) |
Vannas-Tübingen Spring Scissors (straight, 8.5 cm) | FST | 15003-08 | Microsissors (straight) |
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