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Biochemistry

उच्च थ्रूपुट कुल आंतरिक प्रतिबिंब फ्लोरेसेंस और डायरेक्ट स्टोचेस्टिक ऑप्टिकल पुनर्निर्माण माइक्रोस्कोपी एक फोटोनिक चिप का उपयोग कर

Published: November 16, 2019 doi: 10.3791/60378
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 1
1Department of Physics and Technology, UiT The Arctic University of Norway, 2Vascular Biology Research Group, Department of Medical Biology, UiT The Arctic University of Norway

Summary

चिप आधारित सुपर-रिज़ॉल्यूशन ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी के लिए एक उपन्यास दृष्टिकोण है और लागत प्रभावशीलता और थ्रूपुट में लाभ प्रदान करता है। यहां टीआईआरएफ माइक्रोस्कोपी और लोकलाइजेशन बेस्ड सुपर रेजोल्यूशन माइक्रोस्कोपी के लिए चिप तैयार करने और इमेजिंग के प्रोटोकॉल दिखाए गए हैं ।

Abstract

कुल आंतरिक प्रतिबिंब फ्लोरेसेंस (टीआईआरएफ) का उपयोग आमतौर पर एकल अणु स्थानीयकरण आधारित सुपर-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोपी में किया जाता है क्योंकि यह ऑप्टिकल सेक्शनिंग के कारण इसके विपरीत बढ़ाता है। पारंपरिक दृष्टिकोण उत्तेजना और संग्रह दोनों के लिए उच्च संख्यात्मक अपर्चर माइक्रोस्कोप TIRF उद्देश्यों का उपयोग करना है, जो देखने के क्षेत्र और थ्रूपुट को गंभीर रूप से सीमित करता है। हम ऑप्टिकल वेवगाइड के साथ इमेजिंग के लिए टीआईआरएफ उत्तेजना पैदा करने के लिए एक उपन्यास दृष्टिकोण प्रस्तुत करते हैं, जिसे चिप-आधारित नैनोस्कोपी कहा जाता है। इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य यह प्रदर्शित करना है कि पहले से निर्मित सेटअप में चिप-आधारित इमेजिंग कैसे की जाती है। चिप आधारित नैनोस्कोपी का मुख्य लाभ यह है कि उत्तेजना और संग्रह के रास्ते वियुग्मित हैं। इमेजिंग तो एक कम आवर्धन लेंस के साथ किया जा सकता है, देखने के बड़े क्षेत्र TIRF छवियों में जिसके परिणामस्वरूप, संकल्प में एक छोटी सी कमी की कीमत पर । लिवर सिनुसोइडल एंडोथेलियल कोशिकाओं (एलएसईसी) को प्रत्यक्ष स्टोचस्टिक ऑप्टिकल पुनर्निर्माण माइक्रोस्कोपी(डीस्टॉर्म) का उपयोग करके चित्रित किया गया था, जिसमें पारंपरिक सुपर-रेजोल्यूशन माइक्रोस्कोप के बराबर संकल्प दिखाया गया था। इसके अलावा, हम एक कम आवर्धन लेंस के साथ एक 500 μm x 500 μm क्षेत्र इमेजिंग द्वारा उच्च थ्रूपुट क्षमताओं का प्रदर्शन करते हैं, जो 76 एनएम का संकल्प प्रदान करते हैं। इसके कॉम्पैक्ट कैरेक्टर के जरिए चिप बेस्ड इमेजिंग को सबसे आम माइक्रोस्कोप में रेट्रोफिट किया जा सकता है और इसे ऑन-चिप सेंसिंग, स्पेक्ट्रोस्कोपी, ऑप्टिकल ट्रैपिंग आदि जैसी अन्य ऑन-चिप ऑप्टिकल तकनीकों के साथ जोड़ा जा सकता है । तकनीक इस प्रकार आदर्श रूप से उच्च थ्रूपुट 2डी सुपर-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग के लिए अनुकूल है, लेकिन बहु-मॉडल विश्लेषण के लिए भी महान अवसर प्रदान करती है।

Introduction

एकल अणु स्थानीयकरण माइक्रोस्कोपी के प्रारंभिक प्रदर्शन के बाद से,विभिन्नचुनौतियों को हल करने के लिए कई विविधताएं विकसित की गई हैं 1,2,3। एक चुनौती है कि बनी हुई है, हालांकि, देखने के बड़े क्षेत्र dSTORM इमेजिंग है । कई डीस्टॉर्म सेटअप नमूना उत्तेजित करने और इसे छवि देने के लिए एक ही उद्देश्य लेंस का उपयोग करते हैं। देखने के क्षेत्र को बढ़ाने के लिए, कम आवर्धन लेंस की आवश्यकता होती है। कम आवर्धन और कम संख्यात्मक एपर्चर (एनए) ऑब्जेक्टिव लेंस में आमतौर पर क्षेत्र की एक बड़ी गहराई होती है, जिसके परिणामस्वरूप विमान के सिग्नल में वृद्धि होती है जो स्थानीयकरण परिशुद्धता को कम कर देगी। TIRF उद्देश्यों आमतौर पर बाहर के विमान फ्लोरेसेंस को कम करने के द्वारा छवि विपरीत बढ़ाने के लिए उपयोग किया जाता है । टीआईआरएफ के माध्यम से, उत्तेजना एक इवेनसेंट फील्ड4के माध्यम से सतह से लगभग 150 एनएम की ऑप्टिकल मोटाई तक सीमित है। टीआईआरएफ ऑब्जेक्टिव लेंस को एक बड़े एनए की आवश्यकता होती है जिसके परिणामस्वरूप एक छोटा क्षेत्र-दृश्य (एफओवी) (जैसे, 50 x 50 माइक्रोन2),जो थ्रूपुट को काफी सीमित करता है। हालांकि, एक इवांका फील्ड जेनरेट करने के वैकल्पिक तरीके हैं ।

एक ऑप्टिकल वेवगाइड एक संरचना है जो संरचना में युग्मित होने पर प्रकाश को सीमित और मार्गदर्शन करेगी। सबसे अधिक, वेवगाइड फाइबर आधारित दूरसंचार में उपयोग किया जाता है। फोटोनिक इंटीग्रेटेड सर्किट के मुख्य घटक के रूप में 2डी इंटीग्रेटेड वेवगाइड विकसित करने के लिए काफी प्रयास किए गए हैं। प्रौद्योगिकी एक बिंदु है जहां कम नुकसान नैनो संरचित ऑप्टिकल तरंग गाइड गढ़ने नियमित रूप से5किया जा सकता है के लिए उंनत है । आज, दुनिया भर के कई फाउंड्री का उपयोग फोटोनिक एकीकृत सर्किट विकसित करने के लिए किया जा सकता है। वेवगाइड कुल आंतरिक परावर्तन के माध्यम से प्रकाश का मार्गदर्शन भी सतह पर एक इवानसेंट क्षेत्र का प्रदर्शन करते हैं। वेवगाइड संरचना के सावधानीपूर्वक डिजाइन द्वारा, एक उच्च तीव्रता को इवेनसेंट क्षेत्र में प्राप्त किया जा सकता है। वेवगाइड सतह के शीर्ष पर सीधे रखा गया एक नमूना इस प्रकार इमेजिंग अनुप्रयोगों के लिए इवेनसेंट क्षेत्र द्वारा भी प्रकाशित किया जा सकता है। इव्ससेंट क्षेत्र तरंग गाइड की पूरी लंबाई और चौड़ाई के साथ उत्पन्न किया जाएगा, और इस प्रकार इसे मनमाने ढंग से बड़े6बनाया जा सकता है।

हम TIRF डीस्टॉर्म के लिए एक उपन्यास दृष्टिकोण पेश करते हैं जो मनमाने ढंग से बड़े क्षेत्र को देखने की पेशकश करता है। उत्तेजना और संग्रह दोनों के लिए टीआईआरएफ लेंस का उपयोग करने के बजाय, हम ऑप्टिकल वेवगाइड से इवेनसेंट क्षेत्र का उपयोग करके उत्तेजित करते हैं। यह उत्तेजना और संग्रह प्रकाश मार्ग को डिकपल करता है, जो वेवगाइड चिप रोशनी द्वारा प्रदान की गई तरंगदैर्ध्य के लिए ऑप्टिकल सेक्शनिंग से समझौता किए बिना संग्रह प्रकाश पथ के साथ कुल स्वतंत्रता के लिए अनुमति देता है। कम आवर्धन लेंस इस प्रकार TIRF मोड में बहुत बड़े क्षेत्रों की छवि के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, हालांकि एक छोटे एनए पार्श्व संकल्प को कम करेगा । इसके अलावा, मल्टीकलर इमेजिंग को वेवगाइड7का उपयोग करके बहुत सरल बनाया गया है, क्योंकि सिस्टम को पुनः समायोजित किए बिना कई तरंगदैर्ध्य निर्देशित और पता लगाया जा सकता है। यह डीस्टॉर्म के लिए फायदेमंद है, क्योंकि फ्लोरोफोर ब्लिंकिंग को बढ़ाने और मल्टीकलर इमेजिंग के लिए कम तरंगदैर्ध्य का उपयोग किया जा सकता है। यह देखने लायक है कि इवेनसेंट क्षेत्र की प्रवेश गहराई तरंगदैर्ध्य के एक समारोह के रूप में बदल जाएगी, हालांकि यह इमेजिंग प्रक्रिया को कैसे प्रभावित करती है। चिप लाइव सेल इमेजिंग8 के साथ संगत है और माइक्रोफ्लूइडिक्स के एकीकरण जैसे अनुप्रयोगों के लिए आदर्श है। प्रत्येक चिप में दसियों वेवगाइड हो सकते हैं, जो उपयोगकर्ता को विभिन्न परिस्थितियों में छवि बनाने या ऑप्टिकल ट्रैपिंग9 और रमन स्पेक्ट्रोस्कोपी10लागू करने की अनुमति दे सकते हैं।

चिप आधारित प्रणाली दोनों विवर्तन-सीमित और सुपर-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग के लिए समान रूप से अच्छी तरह से काम करती है। इसी तरह का दृष्टिकोण 2005 में एक चश्मे का उपयोग करके इवेनसेंट क्षेत्र उत्तेजना4उत्पन्न करने के लिए पेश किया गया था । फोटोनिक चिप भी evanescent क्षेत्र के माध्यम से उत्तेजित है, लेकिन आधुनिक तरंग चिकित्सा निर्माण तकनीकों के साथ, एक तरंग गाइड के साथ विदेशी प्रकाश पैटर्न उत्पन्न कर सकते हैं । वर्तमान चिप आधारित नैनोस्कोपी कार्यान्वयन केवल 2डी इमेजिंग तक सीमित है, क्योंकि उत्तेजना क्षेत्र तरंग गाइड सतह के अंदर बंद है। भविष्य के विकास के लिए 3 डी अनुप्रयोगों के लिए लक्ष्य होगा। इसके अतिरिक्त, एक ही चिप आधारित माइक्रोस्कोप11का उपयोग करके संरचित रोशनी माइक्रोस्कोपी जैसी अन्य सुपर-रिज़ॉल्यूशन तकनीकें विकसित की जा रही हैं।

Protocol

1. पॉलीडिमेथिलसिलोक्साने (पीडीएम) परत की तैयारी

  1. सिल्गार्ड 184 मोनोमर और क्यूरिंग एजेंट का 10:1 मिश्रण तैयार करें।
  2. मिश्रण को वैक्यूम कक्ष में तब तक रखें जब तक कि हवा के बुलबुले न चले जाएं।
  3. 3.5 इंच (व्यास) पेट्री डिश के केंद्र में 1.7 ग्राम पीडीएम मिश्रण डालें।
  4. पेट्री डिश को स्पिन कोटर के वैक्यूम चक पर रखें।
  5. स्पिन कोट 900 आरपीएम पर 20 एस के लिए पेट्री डिश, 75 आरपीएम/एस के त्वरण के साथ।
  6. कम से कम 2 घंटे के लिए 50 डिग्री सेल्सियस पर हॉटप्लेट पर डिश का इलाज कराएं।

2. नमूना तैयारी

  1. वेवगाइड सफाई
    1. डिटर्जेंट ध्यान (सामग्री की तालिका) के सफाई डिटर्जेंट ध्यान(सामग्री की तालिका)के 1% कमजोर पड़ने के 100 मीटर की तैयारी deionized (DI) पानी में।
    2. चिप को एक ग्लास पेट्री डिश में एक वेफर ट्वीज़र का उपयोग करके रखें और डिटर्जेंट समाधान के साथ पूरी तरह से कवर करें।
    3. पेट्री डिश को 10 मिन के लिए 70 डिग्री सेल्सियस पर गर्म प्लेट पर रखें।
    4. जबकि अभी भी गर्म थाली पर, एक क्लीनरूम ऊतक झाड़ू के साथ सतह रगड़ें।
    5. पेट्री डिश से चिप निकालें। डीआई पानी के कम से कम 100 मीटर के साथ कुल्ला।
    6. आइसोप्रोपेनॉल के कम से कम 100 मीटर के साथ कुल्ला करें, इस बात का ध्यान रखें कि वाष्पीकरण के दाग को रोकने के लिए विलायक सतह पर सूखन नहीं करता है।
    7. डीआई पानी के कम से कम 100 मीटर के साथ कुल्ला। चिप को नाइट्रोजन बंदूक से सूखा उड़ाएं।
  2. चैंबर की तैयारी
    1. पेट्री डिश (सेक्शन 1) में 150 माइक्रोन पॉलीडिमेथिलसिलॉक्सने (पीडीएम) की एक परत तैयार करें।
    2. पीडीएम परत से 1.5 सेमी x 1.5 सेमी फ्रेम काटने के लिए स्केलपेल का उपयोग करें।
    3. एक ट्वीजर के साथ पेट्री डिश से फ्रेम लिफ्ट। इसे एक साफ और पॉलिश चिप पर फ्लैट जमा करें। अब सेल सीडिंग के लिए सैंपल तैयार है।
  3. फ्लोरोसेंट लेबलिंग
    1. निम्नलिखित रसायन तैयार करें: फॉस्फेट-बफरेड नमकीन समाधान, रंगे समाधान (ओं), डीस्टॉर्म इमेजिंग बफर।
    2. सेल सीडिंग के बाद चिप को मीडिया से निकाल ें।
    3. पीडीएमएस चैंबर के बाहर से किसी भी अतिरिक्त तरल पदार्थ को हटाने के लिए एक पिपेट का उपयोग करें।
    4. एक ही समय में साफ पीबीएस के लगभग 60 माइक्रोन जोड़ने जबकि एक पिपेट के साथ पीडीएम चैंबर के अंदर से वर्तमान तरल पदार्थ निकालें।
      नोट- चैंबर में जोड़ी गई राशि को चैंबर साइज के हिसाब से बदलना होगा। सेल की सतह से सभी मीडिया को न हटाने के लिए सावधान रहें।
    5. पीबीएस को स्वच्छ पीबीएस के 60 माइक्रोन के साथ बदलें और इसे 1 मिन के लिए इनक्यूबेट करें।
    6. पिछले कदम दोहराएं, दे यह 5 मिन के लिए इस बार इनक्यूबेट ।
    7. पीबीएस निकालें और इसे रंग समाधान के 60 माइक्रोन के साथ बदलें। नमूना लगभग 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट करने के लिए छोड़ दें, इसे प्रकाश से बचाएं।
      नोट: इस कदम को काफी बदलना पड़ सकता है, फ्लोरोसेंट रंग का इस्तेमाल किया पर निर्भर करता है । हम इस प्रयोग के लिए सेल झिल्ली लेबल करने के लिए सेलमास्क डीप रेड का उपयोग करते हैं
    8. 2.3.3-2.3.5 चरणों में पीबीएस के साथ नमूना धोएं।
    9. पीबीएस निकालें और एक ही समय में इमेजिंग बफर के 40 μL के साथ इसे बदलें।
      नोट: विभिन्न फ्लोरोसेंट रंगों के लिए कई अलग-अलग इमेजिंग बफर हैं।
    10. शीर्ष पर एक कवरस्लिप रखें, नीचे हवा के बुलबुले को बनाने से रोकें। किसी भी अतिरिक्त मीडिया को हटाने के लिए इमेजिंग चैंबर के खिलाफ कवरस्लिप को धीरे से दबाएं।
    11. कवरस्लिप के बाहर किसी भी अतिरिक्त मीडिया को हटाने के लिए एक पिपेट का उपयोग करें। सूखे विसर्जन मीडिया अवशेषों द्वारा गठित क्रिस्टल से बचने के लिए एक पानी नम झाड़ू के साथ कवरस्लिप के बाहर क्षेत्र को साफ करें।

3. इमेजिंग प्रक्रिया

  1. कंपोनेंट सेटअप
    नोट: सेटअप के इस संस्करण में तीन मुख्य घटक होते हैं: माइक्रोस्कोप, युग्मन चरण और नमूना चरण। सामग्री की तालिकादेखें।
    1. फिल्टर धारक, सफेद प्रकाश स्रोत, कैमरा और ऑब्जेक्टिव रिवॉल्वर के साथ माइक्रोस्कोप का उपयोग करें।
    2. फाइबर-युग्मित लेजर और युग्मन लेंस के साथ 3-अक्ष पीजो युग्मन चरण का उपयोग करें।
    3. टिप और झुकाव और वैक्यूम धारक के साथ एक-धुरी मैनुअल नमूना चरण का उपयोग करें।
    4. नमूना अनुवाद के लिए 2-अक्ष मोटरचालित चरण पर युग्मन और नमूना चरण दोनों माउंट करें।
  2. वेवगाइड युग्मन
    1. युग्मन उद्देश्य की ओर युग्मन पहलू के साथ वैक्यूम चक पर चिप रखें। सुनिश्चित करें कि चिप युग्मन उद्देश्य से लगभग एक फोकल लंबाई दूर है।
    2. वैक्यूम पंप चालू करें।
    3. लेजर को 1 mW पर चालू करें। मोटे तौर पर चिप ऊंचाई को समायोजित करें ताकि बीम इसके किनारे से टकराती है। लेजर बंद कर दें।
    4. सफेद प्रकाश स्रोत चालू करें। कम आवर्धन ऑब्जेक्टिव लेंस (जैसे 10x) चुनें। माइक्रोस्कोप को वेवगाइड पर केंद्रित करें।
    5. वेवगाइड के साथ माइक्रोस्कोप का अनुवाद यह देखने के लिए करें कि क्या यह ऑप्टिकल पथ के साथ अच्छी तरह से गठबंधन है। माइक्रोस्कोप को युग्मन किनारे पर ले जाएं।
    6. लेजर को 1 mW या उससे कम पर चालू करें। लेजर प्रकाश खोजने के लिए युग्मन किनारे के साथ माइक्रोस्कोप का अनुवाद करें। चिप किनारे पर बीम ध्यान केंद्रित करें।
    7. दिशा में ऑप्टिकल पथ के साथ युग्मन चरण समायोजित करें जो लेजर बीम स्पॉट आकार को तब तक कम कर देता है जब तक कि यह गायब न हो जाए। बीम अब या तो ऊपर या चिप सतह के नीचे है ।
    8. युग्मन चरण ऊंचाई को तब तक समायोजित करें जब तक कि बीम स्पॉट फिर से प्रकट न हो जाए और अधिकतम न हो जाए।
    9. लेजर एक केंद्रित स्थान रूपों जब तक दो पिछले चरणों दोहराएं।
    10. ब्याज की तरंग गाइड करने के लिए केंद्रित स्थान ले जाएँ।
    11. माइक्रोस्कोप को किनारे से थोड़ी दूरी पर अनुवाद करें ताकि केंद्रित बीम स्पॉट अब दिखाई न दे। सफेद बत्ती बंद कर दें।
    12. इसके विपरीत समायोजित। यदि वेवगाइड मार्गदर्शन कर रहा है, तो तरंग गाइड के साथ बिखरे हुए प्रकाश को स्पष्ट रूप से दिखाई देना चाहिए।
    13. बिखरे हुए प्रकाश तीव्रता को अधिकतम करने के लिए युग्मन चरण की कुल्हाड़ियों को समायोजित करें। लेजर बंद कर दें।
    14. सफेद रोशनी चालू करें। यदि आवश्यक हो तो इसके विपरीत समायोजित करें।
    15. इमेजिंग क्षेत्र में नेविगेट करें।
  3. अपवर्तन सीमित इमेजिंग
    1. वांछित इमेजिंग उद्देश्य के साथ ध्यान केंद्रित करें। सफेद रोशनी बंद कर दें।
    2. फ्लोरेसेंस फिल्टर डालें और लेजर पावर को 1 mW में बदल दें।
    3. लगभग 100 सुश्री के लिए कैमरा एक्सपोजर समय सेट करें। सुनिश्चित करें कि युग्मन अभी भी अनुकूलित है।
    4. इमेजिंग के लिए ब्याज के एक क्षेत्र का पता लगाएं। पिज़ो स्टेज लूपिंग को औसत आउट मोड में चालू करें।
      नोट: 50 एनएम के एक कदम आकार के साथ 20 माइक्रोन स्कैन रेंज सबसे तरंग संरचनाओं के लिए उपयुक्त है।
    5. कम से कम 300 छवियों को कैप्चर करें।
    6. एक आभासी ढेर का उपयोग करफिजी के लिए कब्जा कर लिया छवि ढेर लोड। फिजी में छवि मेनू से, ढेर और जेड-प्रोजेक्टचुनें।
    7. प्रोजेक्शन प्रकार की औसत तीव्रताका चयन करके टीआईआरएफ छवि की गणना करें ।
  4. द स्टॉर्म इमेजिंग
    1. लेजर को 1 एमडब्ल्यू पर चालू करें और कैमरा एक्सपोजर समय 30 एमएस पर सेट करें।
    2. इसके विपरीत और ध्यान समायोजित करें।
    3. जब तक निमिष मनाया जाता है तब तक लेजर पावर बढ़ाएं।
      नोट: यह एक समय लग सकता है, evanescent क्षेत्र तीव्रता के आधार पर ।
    4. नमूने के एक छोटे से क्षेत्र पर ज़ूम इन करें।
    5. इसके विपरीत समायोजित।
    6. यह देखने के लिए कुछ छवियों को कैप्चर करें कि क्या ब्लिंक अच्छी तरह से अलग हैं।
    7. इष्टतम निमिष के लिए कैमरा एक्सपोजर समय समायोजित करें।
      नोट: निमिष का अनुकूलन एक जटिल कार्य है, लेकिन बहुत उपयुक्त साहित्य12उपलब्ध है।
    8. पीजो स्टेज लूपिंग चालू करें।
    9. निमिष घनत्व के आधार पर कम से कम 30,000 फ्रेम की छवि ढेर रिकॉर्ड करें।
  5. द तूफान छवि पुनर्निर्माण
    1. फिजी खोलें और आभासी छवियों के रूप में डीस्टॉर्म स्टैक लोड करें।
    2. यदि आवश्यक हो तो इसके विपरीत समायोजित करें।
    3. पुनर्निर्माण के लिए क्षेत्र का चयन करने के लिए आयत उपकरण का उपयोग करें।
    4. फिजी में आंधी13 प्लगइन में ओपन रन विश्लेषण।
    5. डिवाइस के अनुरूप आंधी में बुनियादी कैमरा सेटिंग्स सेट करें। शेष डिफ़ॉल्ट पैरामीटर आमतौर पर संतोषजनक होते हैं।
    6. पुनर्निर्माण शुरू करें।
      नोट: देखने के पूर्ण क्षेत्र के लिए, डेटा को बड़ी फ़ाइल आकार के कारण उपढेर में विभाजित करने की आवश्यकता हो सकती है।
    7. अविशिष्ट स्थानीयकरण को हटाने के लिए पुनर्निर्माण सॉफ्टवेयर द्वारा प्रदान की गई स्थानीयकरण सूची को फ़िल्टर करें। यदि आवश्यक हो तो सेब एक अतिरिक्त बहाव-सुधार।

Representative Results

TIRF माइक्रोस्कोपी एक लोकप्रिय तकनीक है क्योंकि यह विमान के बाहर फ्लोरेसेंस को हटा देती है, इसके विपरीत बढ़ जाती है और इस प्रकार छवि की गुणवत्ता में सुधार करती है, और अन्य फ्लोरेसेंस आधारित माइक्रोस्कोपी तकनीकों की तुलना में कम फोटोटॉक्सिक है। पारंपरिक उद्देश्य आधारित दृष्टिकोण की तुलना में, चिप-आधारित माइक्रोस्कोपी सीमित थ्रूपुट के बिना टीआईआरएफ उत्तेजना प्रदान करती है जो आमतौर पर टीआईआरएफ लेंस के साथ होती है। प्रस्तुत सेटअप का अवलोकन चित्र 1 एमें पाया जा सकता है । हम चूहों से निकाले गए जिगर के सिंसुओइडल एंडोथेलियल कोशिकाओं (एलएसईसी) के अपवर्तन-सीमित और डी स्टॉर्मछवियों को प्रस्तुत करते हैं। लेबल माइक्रोट्यूबबुलिन के साथ एलएसईसी की दृश्य छवि का एक बड़ा क्षेत्र भी प्रस्तुत किया जाता है, जो उच्च थ्रूपुट इमेजिंग की क्षमताओं का प्रदर्शन करता है। एक पारंपरिक डीस्टॉर्म सेटअप एक तेल विसर्जन TIRF लेंस (या तो 60x या 100x आवर्धन) का उपयोग करआम तौर पर 50 μm x 50 μm के क्षेत्र की छवियां, जो चित्र 2में चिप आधारित छवि से 100 गुना छोटा है, 25x, 0.8 एनए उद्देश्य के साथ छवि।

इस विधि में, हम उत्तेजना के लिए बहु-आधुनिक एसआई3एन4 वेवगाइड का उपयोग करते हैं। उपयोग किए गए चिप्स में सिलिकॉन चिप की 2 माइक्रोन ऑक्सीडाइज्ड परत पर जमा 150 एनएम एसआई3एन4 की स्ट्रिप-नक़्क़ाशीदार मार्गदर्शक परत शामिल है। चिप की एक योजनाबद्ध चित्रा 1बीमें पाया जा सकता है । वेवगाइड चौड़ाई 200 और 1000 माइक्रोन के बीच भिन्न हो सकती है। फैब्रिकेशन विवरण कहीं और8पाया जा सकता है। प्रचार मोड के बीच हस्तक्षेप के माध्यम से उत्तेजना प्रकाश एक सजातीय तीव्रता वितरण नहीं होगा, बल्कि एक स्थानिक रूप से अलग पैटर्न । चित्रा 2एक स्पष्ट रूप से दिखाई मोड पैटर्न के साथ एक छवि प्रस्तुत करता है। तरंग गाइड के किनारे पर लेजर बीम की स्थिति के साथ यह हस्तक्षेप पैटर्न बदल जाएगा। अंतिम छवियों में सजातीय उत्तेजना प्राप्त करने के लिए, हम युग्मित पहलू के साथ दोलन करने के लिए एक पीजो चरण का उपयोग करते हैं। इमेजिंग प्रक्रिया के दौरान, हस्तक्षेप पैटर्न की पर्याप्त भिन्नता मौजूद है ताकि उन्हें औसत किया जा सके, छवि में तीव्रता के उतार-चढ़ाव को दूर किया जा सके। छवि स्टैक में कई छवियां शामिल होंगी जैसे कि चित्रा 2एमें, हालांकि विभिन्न पैटर्न के साथ, लेकिन जब औसत हो, तो स्टैक चित्र ा 2बीजैसे सजातीय उत्तेजना के साथ एक छवि प्राप्त करेगा। एक वैकल्पिक दृष्टिकोण व्यापक, एकल आधुनिक तरंग8,14को प्राप्त करने के लिए एडिबेटिक टेपरिंग का उपयोग करना है, जो औसत मोड की आवश्यकता को हटा देता है। हालांकि, 100 माइक्रोन वेवगाइड चौड़ाई प्राप्त करने के लिए एकल-मोड स्थिति को बनाए रखने के लिए कई मिलीमीटर टेपरिंग लंबाई आवश्यक है। बहु-आधुनिक तरंग गाइड इस टेपरिंग आवश्यकता को दरकिनार करते हैं और संरचना चौड़ाई पर कोई सीमा नहीं छोड़ते हैं। रोशनी पैटर्न से परे, मोड का अत्यधिक प्रभावी अपवर्तक सूचकांक संरचित रोशनी माइक्रोस्कोपी11 और उतार-चढ़ाव माइक्रोस्कोपी विधियों7की दिशा में अभूतपूर्व संभावनाओं के लिए अनुमति देता है।

इमेजिंग में पहला कदम एक विवर्तन सीमित छवि इकट्ठा करना है। प्रयोग के परिणामस्वरूप लगभग 300 छवियों का ढेर होता है और अंतिम छवि स्टैक के औसत को लेकर बनाई जाती है। चित्रा 2में, हम 60x, 1.2 एनए पानी विसर्जन उद्देश्य का उपयोग करसेलमास्क डीप रेड के साथ लेबल किए गए एलएसईसी के विवर्तन सीमित और डीस्टॉर्म इमेजिंग पेश करते हैं। चित्रा 2एक अपर्याप्त मोड औसत के कारण अमोजातीय रोशनी से पता चलता है। सफल मोड औसत चित्रा 2बीमें प्रदर्शित किया जाता है । चित्रा 2सी एक ही क्षेत्र की एक डीस्टॉर्म छवि है, जिसमें चित्रा 2डीमें दिखाया गया चिह्नित क्षेत्र है। लिवर ज्योॉइडल एंडोथेलियल कोशिकाओं में प्लाज्मा झिल्ली15में नैनो के आकार के छिद्र होते हैं, जिन्हें यहां देखा जा सकता है। एक फोरियर रिंग सहसंबंध विश्लेषण ने 46 एनएम का संकल्प प्रदान किया।

चित्रा 3 तकनीक की उच्च थ्रूपुट क्षमताओं का प्रदर्शन करते हुए 500 माइक्रोन x 500 माइक्रोन क्षेत्र की डीस्टॉर्म छवि प्रस्तुत करता है। चित्रा 3एकी एक ज़ूम की छवि, एक ठेठ डीस्टॉर्म फील्ड-ऑफ-व्यू के अनुरूप, चित्रा 3बीमें विवर्तन सीमित छवि के साथ एक साथ प्रस्तुत की जाती है। संकल्प का अनुमान लगाने के लिए एक फोरियर रिंग सहसंबंध किया गया था, जिससे 76 एनएम का मूल्य प्राप्त हुआ था।

Figure 1
चित्रा 1: इमेजिंग सिस्टम और वेवगाइड। }इमेजिंग सिस्टम की तस्वीर। नमूना नमूना मंच पर एक वैक्यूम चक पर रखा गया है, युग्मन उद्देश्य की ओर तरंग गाइड के युग्मन पहलू के साथ । एक फाइबर युग्मित लेजर और एक युग्मन उद्देश्य एक 3 डी पीजो चरण के शीर्ष पर रखा गया है। इमेजिंग लेंस के साथ एक लेंस बुर्ज ऊपर से छवि को कैप्चर करता है और इसे कैमरे में रिले करता है। (ख)युग्मन और इमेजिंग लेंस के साथ तरंग गाइड की योजनाबद्ध । युग्मन लेंस जोड़ों तरंग गाइड में प्रकाश । नमूने (नारंगी मोती) एक सील बंद पीडीएमएस चैंबर के अंदर रखे जाते हैं। वेवगाइड के साथ evanescent क्षेत्र नमूना उत्तेजित होगा और इमेजिंग उद्देश्य उत्सर्जित फ्लोरेसेंस पर कब्जा कर लेगा। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: विवर्तन-सीमित और डीस्टॉर्म छवियां। (क)अपर्याप्त मोड औसत के साथ जिगर सिनोइडियल एंडोथेलियल कोशिकाओं की छवि, जिसके परिणामस्वरूप एक स्पष्ट रूप से दिखाई उत्तेजना पैटर्न। (ख)एक ही क्षेत्र में(ए)के रूप में, लेकिन पर्याप्त मोड औसत के साथ, सजातीय उत्तेजना में जिसके परिणामस्वरूप । (C)इनसेट(बी)की सीमित छवि का उल्लंघन ; (D)एक ही क्षेत्र की डीस्टॉर्म छवि । (ई)इनसेट(डी),स्पष्ट रूप से कोशिका के प्लाज्मा झिल्ली में फेनस्ट्रेशन दिखा रहा है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: चूहा LSECs के डीतूफान छवि । (A)एलेक्सा की व्यू डीस्टॉर्म इमेज का बड़ा क्षेत्र चूहा LSECs में 647 दाग ट्यूबलिन। स्केल बार = 50 μm.(B)से बड़ा चिह्नित क्षेत्र(ए)अपवर्तन-सीमित (नीचे बाएं) और डीस्टॉर्म छवि (ऊपर दाएं) की तुलना । (ग)से छोटे चिह्नित क्षेत्र(ए)। स्केल बार = 1 माइक्रोन। छवि में 76 एनएम का संकल्प है। हेले एट अल. 20196से अनुमति के साथ अनुकूलित। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Discussion

चिप आधारित इमेजिंग पारंपरिक डीस्टॉर्म इमेजिंग के समान है। छवि की गुणवत्ता इस प्रकार पारंपरिक डीतूफान इमेजिंग के लिए के रूप में एक ही दृष्टिकोण का उपयोग कर अंदाजा लगाया जा सकता है । उपयोगकर्ता के लिए मुख्य अंतर यह है कि पारदर्शी ग्लास स्लाइड का आदान-प्रदान एक अपारदर्शी सी-वेफर के साथ किया जाता है। हालांकि वे बहुत अलग दिखाई देते हैं, नमूना हैंडलिंग व्यावहारिक रूप से एक ग्लास स्लाइड के अनुरूप है। चिप्स काफी मजबूत कर रहे हैं और आसानी से वेफर चिमटी का उपयोग कर संभाला जा सकता है। इमेजिंग प्रक्रिया और छवि पुनर्निर्माण एक नियमित डीतूफान प्रयोग के रूप में ही है । एक कार्यात्मक चिप आधारित माइक्रोस्कोप स्थापित करने के लिए फोटोनिक चिप्स के अलावा कोई विशेष घटकों की आवश्यकता नहीं है । सेट-अप का अधिक विवरण पिछले कार्य6,7में पाया जा सकता है । इस काम में इस्तेमाल होने वाले चिप्स को स्टैंडर्ड फोटोलिथोग्राफी8का इस्तेमाल करते हुए गढ़े गए हैं ।

नमूना तैयार करने में नमूना कक्ष की तैयारी शामिल है। जब चिप के लिए PDMS फ्रेम संलग्न, यह किसी भी छोटे सिलवटों या rips जहां हवा में प्रवेश कर सकता है से बचने के लिए महत्वपूर्ण है । यदि पीडीएस इसे संलग्न करते समय सिलवटों, बस इसे ध्यान से एक tweezer के साथ हटा दें और इसे फिर से संलग्न करें। जब पीडीएम चैंबर के अंदर नमूना तैयार हो जाता है, तो कवरग्लास को इसके खिलाफ दबाया जाना चाहिए, क्षेत्र को सील करना चाहिए। कवरग्लास संलग्न करते समय किसी भी हवा के बुलबुले से बचना महत्वपूर्ण है। यदि एक हवा बुलबुला बनता है, तो धीरे-धीरे कवरग्लास को हटा दें और नमूना कक्ष में पीबीएस जोड़ें ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि नमूना कवर किया गया है। कवर स्लिप की तैयारी और लगाव को फिर से किया जा सकता है।

तरंग गाइड में युग्मन प्रकाश इस कागज में प्रस्तावित प्रोटोकॉल का उपयोग सरल बनाया गया है। हालांकि, कुछ आम चुनौतियां हैं जो युग्मन को सीमित कर सकती हैं । सबसे पहले, अगर चिप ठीक से साफ नहीं किया गया था और किसी भी बचे हुए PBS पूरी तरह से हटा दिया, वहां गंदगी या वेवगाइड पर सघन PBS हो सकता है । इससे बड़ा नुकसान शुरू हो सकता है, जिसके परिणामस्वरूप इमेजिंग क्षेत्र में बहुत कम शक्ति होती है । कवर ग्लास के बाहर क्षेत्र को साफ करने के लिए एक नम झाड़ू का उपयोग करने से बिजली में काफी सुधार हो सकता है। दूसरे, यदि वेवगाइड का युग्मन पहलू क्षतिग्रस्त हो जाता है (उदाहरण के लिए, अनुचित हैंडलिंग द्वारा), युग्मन हानि में भारी वृद्धि हो सकती है। किनारे के ऑप्टिकल निरीक्षण आमतौर पर किसी भी नुकसान आसानी से प्रकट होगा । चिप के पूरे युग्मन पहलू को ध्यान से पॉलिश किया जा सकता है, बहुत एक ऑप्टिकल फाइबर की तरह, और एक चिकनी युग्मन पहलू है, जो तो युग्मित शक्ति बढ़ जाती है दे देंगे ।

प्रकाश के युग्मित होने के बाद, इमेजिंग प्रक्रिया किसी भी पारंपरिक डीस्टॉर्म सेटअप में समान है। यदि छवि में असंगत उत्तेजना है, जैसा कि चित्रा 2एमें प्रदर्शित किया गया है, तो सबसे अधिक संभावना है कि औसत मोड अच्छी तरह से काम नहीं करता था। इसके लिए दो सबसे आम कारण हैं: 1) औसत स्टैक बनाने के लिए बहुत कम छवियां और 2) एक दोलन दूरी से बहुत कम/ बहुत कम छवियों को इकट्ठा करना कुछ उत्तेजना पैटर्न छोड़ सकता है और औसत इस प्रकार समरूप होगा। यह आसानी से औसत ढेर में छवियों की संख्या में वृद्धि करके हल किया जा सकता है। एक दोलन दूरी से बहुत कम भी एक असंगत छवि में परिणाम कर सकते हैं, के रूप में पर्याप्त मोड पैटर्न उत्साहित नहीं हैं । इससे दोलन की दूरी बढ़ाकर और/या स्टेप साइज कम होने से भी आसानी से सुलझाया जा सकता है । इस काम में हमने 20 माइक्रोन से अधिक इनपुट लेजर बीम को स्कैन करने और कम से कम 300 छवियों को प्राप्त करने के लिए एक पीजो चरण का उपयोग किया है। एक अन्य दृष्टिकोण एक अधिग्रहण समय के भीतर इनपुट वेवगाइड पहलू में प्रकाश को स्कैन करने के लिए उच्च गति वाले गैलवो-दर्पण का उपयोग करना हो सकता है, जैसे कि 10-30 सुश्री। यह विकल्प लाइव सेल टीआईआरएफ इमेजिंग के लिए उपयुक्त है, जहां उप-सेलुलर ऑर्गेनेल्स लगातार गति में हैं।

चिप आधारित डीस्टॉर्म एक अभूतपूर्व बड़े क्षेत्र TIRF उत्तेजना प्रदान करता है, जो इसे आदर्श रूप से उच्च थ्रूपुट इमेजिंग के लिए अनुकूल बनाता है। कॉम्पैक्ट चरित्र वाणिज्यिक प्रणालियों के लिए रेट्रोफिटिंग के लिए अनुमति देता है, जहां चिप उल्टे सेटअप या पारदर्शी सब्सट्रेट्स के लिए उल्टा रखा जा सकता है विकसित किया जा सकता है । चिप्स बड़े पैमाने पर गढ़े जाते हैं और कई जरूरतों के अनुरूप संशोधित किया जा सकता है। वर्तमान में, मुख्य प्रतिबंध यह है कि यह 2D तक सीमित है। वाष्पित क्षेत्र केवल तरंग गाइड सतह से लगभग 200 एनएम दूर उपलब्ध है, इसलिए इस क्षेत्र के भीतर केवल फ्लोरोफोरस उत्साहित होंगे। कुल मिलाकर, एकीकृत प्रकाशिकी का क्षेत्र निकट भविष्य में चिप आधारित माइक्रोस्कोपी के लिए कई अवसर प्रदान करता है, नए इमेजिंग प्रश्नों से निपटने के साथ-साथ मौजूदा लोगों को नई संभावनाएं प्रदान करके ।

Disclosures

बीएस अहलूवालिया ने चिप आधारित ऑप्टिकल नैनोस्कोपी के लिए पेटेंट GB1606268.9 के लिए आवेदन किया है। अन्य लेखक कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हितों की घोषणा नहीं करते हैं ।

Acknowledgments

लेखक यूरोपीय अनुसंधान परिषद (अनुदान संख्या ३३६७१६ को बीए) स्वीकार करना चाहते हैं । लेखक भी रिकॉर्डिंग और वीडियो संपादन के साथ उसकी अमूल्य सहायता के लिए Irati Lagfragua शुक्रिया अदा करना चाहते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-axis sample stage Standa 7T173-20
2-axis sample translation stage Mad City Labs Custom order
3-axis NanoMax stage Thorlabs MAX311D
BXFM microscope body Olympus OLY-LSM-037018
CellMask Deep Red, Life technologies ThermoFisher C10046
Cleanroom grade swabs MRC Technology MFS-758
Fiber-coupled laser Cobolt Flamenco
Filter Holder Homemade
Hellmanex III, Hellma Gmbh Sigma-Aldrich Z805939 Cleaning detergent concentrate
Isopropanol Sigma-Aldrich 563935-1L
KL 1600 LED Olympus OLY-LSM-E0433314
Olympus Coupling lens Olympus LMPLFLN 50x/0.5
Orca Flash 4.0 V2 Hamamatsu
PBS tablets Sigma-Aldrich P4417-50TAB Mix according to descriptions
SYLGARD 184 Silicone Elastomer 1.1 kg kit Dow 1673921
Tip-tilt stage Thorlabs APR001
Vacuum holder Thorlabs HWV001
Wafer Tweezers Type 2W Agar scientific AGT5051

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References

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बायोकेमिस्ट्री इश्यू 153 फ्लोरेसेंस टोटल इंटरनल रिफ्लेक्शन फ्लोरेसेंस सुपर-रेजोल्यूशन ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी नैनोस्कोपी वेवगाइड्स इंटीग्रेटेड ऑप्टिक्स
उच्च थ्रूपुट कुल आंतरिक प्रतिबिंब फ्लोरेसेंस और डायरेक्ट स्टोचेस्टिक ऑप्टिकल पुनर्निर्माण माइक्रोस्कोपी एक फोटोनिक चिप का उपयोग कर
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Coucheron, D. A., Helle, Ø. I., Øie, C. I., Tinguely, J. C., Ahluwalia, B. S. High-Throughput Total Internal Reflection Fluorescence and Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy Using a Photonic Chip. J. Vis. Exp. (153), e60378, doi:10.3791/60378 (2019).

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