Summary
כאן, אנו מציגים שיטה להקרנה אנטי צהבת B סוכנים ויראליים לעכב את האינטראקציה HBx-DDB1 באמצעות פיצול לוציפראז מערכת שיטת. מערכת זו מאפשרת זיהוי קל של אינטראקציות חלבון-חלבון והיא מתאימה לזיהוי מעכבי של אינטראקציות כאלה.
Abstract
יש צורך דחוף סוכנים טיפוליים חדשניים עבור צהבת B וירוס (HBV) זיהום. למרות שהנוקלאונוס הזמינים כרגע (t) מעכבים שכפול ויראלי, אין להם השפעה ישירה על הביטוי של חלבונים ויראליות ששועתק מתוך דנ א ויראלי סגור DNA עגול (cccDNA). כמו לטעון אנטיגן ויראלי גבוהה עשוי לשחק תפקיד זה כרונית ו-HBV הקשורים קרצינובגנזה, המטרה של הטיפול HBV היא לבער חלבונים ויראלי. החלבון HBV התקינה X (HBx) נקשר ל-DNA מארח נזק מחייב חלבון 1 (DDB1) חלבון כדי לבזות תחזוקה מבנית של כרומוזומים 5/6 (Smc5/6), וכתוצאה מכך הפעלת תמלול ויראלי מ cccDNA. כאן, באמצעות מפוצל לוציפראז מערכת שיטת הטיפול, אנו מציגים מערכת מקיפה הקרנת מתחם כדי לזהות מעכבי של האינטראקציה HBx-DDB1. הפרוטוקול שלנו מאפשר זיהוי קל של הדינמיקה ההדדית בזמן אמת בתוך תאים חיים. טכניקה זו עשויה להפוך להיות מפתח מרכזי כדי לגלות סוכנים טיפוליים חדשניים לטיפול בזיהום HBV.
Introduction
צהבת B וירוס (HBV) זיהום הוא בריאות הציבור העיקרי הדאגה ברחבי העולם, עם הערכות שנתיות של 240,000,000 אנשים באופן כרוני נגוע HBV ו 90,000 מקרי מוות עקב סיבוכים מן הזיהום, כולל שחמת וקרצינומה hepatocellular (HCC)1. למרות שהסוכנים הטיפוליים הנוכחיים אנטי-HBV, הנוקלאואים (t) ide, מעכבים מספיק שעתוק ויראלי, הם לרוב משיגים את חיסול החלבונים הנגידיים, שהיא המטרה הקלינית ארוכת הטווח. ההשפעה הירודה שלהם על חיסול חלבון נגיפי נובע היעדר השפעה ישירה על תמלול ויראלי מ epiזומביים ויראלי סגור DNA מעגלי (cccDNA) מיני כרומוזומי בגרעין hepatocyte2.
תמלול HBV מופעל ע י חלבון התקינה HBV X (HBx)3. מחקרים שנעשו לאחרונה חשפה כי HBx מוחלק תחזוקה מבנית של כרומוזומים 5/6 (Smc5/6), גורם הגבלה מארח כי חוסם hbv תמלול מ cccdna, באמצעות חטיפת DDB1-CUL4-ROC1 E3 אוביקוויב ליגאז קומפלקס4,5,6. לכן, צעד מכריע בקידום תמלול ויראלי מ-cccDNA נחשב לאינטראקציה HBx-DDB1. תרכובות מסוגלות לעכב את הכריכה בין HBx ו-DDB1 עשוי לחסום תמלול ויראלי, ואכן nitazoxanide זוהה כמדכא של האינטראקציה HBx-DDB1 באמצעות מערכת הקרנה שפותחה במעבדה שלנו7.
כאן, אנו מציגים את מערכת ההקרנה הנוחה שלנו משמש לזיהוי מעכבי של HBx-DDB1 אינטראקציה, אשר משתמשת מפוצל לוציפראאז שיטה משלימה7,8. פיצול יחידות משנה מפוצל ל HBx ו DDB1, ואת האינטראקציה HBx-DDB1 מביא את תת היחידות לתוך קרוב ליצור אנזים פונקציונלי שמייצר אות זורח בהיר. כאשר האינטראקציה בין תת היחידות היא הפיכה, מערכת זו יכולה לזהות במהירות HBx-DDB1 חלבונים (איור 1). באמצעות מערכת זו, ספריית מתחם גדול ניתן להקרנה בקלות, אשר עשוי לגרום לגילוי של תרכובות הרומן מסוגל לעכב ביעילות את HBx-DDB1 אינטראקציה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: ייצוג סכמטי של שיטת הפיצול לוציפראז מוצג באיור 1A, ותהליך העיבוד מתואר באיור 1ב. ניתן למדוד את הדינמיקה ההדדית בזמן אמת ללא האפשרות לפירוק תאים.
1. הכנה לתא
- לשמור על התאים הHEK293T תרבותי ב בינונית הנשר שונה ביותר של Dulbecco (DMEM) שיושלם עם 10% v/v העובר סרום (FBS), 1x פניצילין/סטרפטומיצין ב 37 ° c בתוך 20% O2 ו 5% CO2.
- זרע 5 x 106 תאים לתוך צלחת 100 מ"מ עם 10 מ ל של dmem ו-מודטה ב 37 ° c לילה.
- Transfect 1 μg של HBx ו DDB1 עם פיצול לוציטיות לתוך התאים בהתאם לשיטה הבאה.
הערה: כמות העירוי של הדנ א הפלסטי עשויה להיות תלויה בעוצר החצייה שבשימוש. המיקום האופטימלי של מפוצל לוציפראז התמזגו חלבון היעד חייב להיקבע מראש. במקרה זה, HBx התמזגו lgbit ב C-הטרמינוס של HBx (HBx-lgbit) ו DDB1 התמזגו smbit ב-הטרמינוס של DDB1 (smbit-DDB1) סיפק את התוצאות הטובות ביותר (כלומר, אותות ללוציפראז המבריקים ביותר). תהליך זה דווח בעבר בפירוט7.- לדלל 1 μg של HBx-LgBit ביטוי ה-DNA פלאמיד 1 μg של SmBit-DDB1 ביטוי ה-DNA פלמיד (טבלת חומרים) ב-dna עיבוי מאגר (טבלת חומרים) לנפח הכולל של 300 μl.
- הוסף 16 μL של פתרון שיפור (טבלת חומרים) ולערבב על ידי vortexing עבור 1 s.
- מודקון את המדגם בטמפרטורת החדר עבור 3 דקות.
- הוסף 60 μL של העברת מגיב (טבלת חומרים) למדגם ולערבב על ידי vortexing עבור 10 s.
- מודקון את המדגם בטמפרטורת החדר עבור 8 דקות.
- במהלך הדגירה, מטפי את המדיום התרבותי ממנה (מוכן בשלב 1.2), ומכבסת תאים עם 5 מ ל של תמיסת מלח מוזרמת פוספט (PBS). הוצא את PBS על ידי שאיפה והוסף 7 מ ל של DMEM.
- הוסיפו 3 מ ג של DMEM לצינור המכיל את מכלולי החצייה. מערבבים באמצעות ליטוף ומוסיפים את מכלולי ההעברה אל התא בצלחת 10 ס מ.
- דגירה את התאים ב 37 ° c בחממה תחת 5% CO2 עבור 10 h.
- Reseed את התאים לתוך צלחת לבן 96 לוחית בגודל 5 x 104 תאים/גם ב 50 μl של בינוני/טוב בהתאם לשיטה הבאה.
- הסר את המדיום של תרבות התא שהושקע ושטוף תאים עם 5 מ ל של PBS.
- הסר את ה-PBS על ידי השאיפה, להוסיף 1 מ ל 0.25% טריפסין-EDTA, ו מודחלת ב 37 ° c עבור 5 דקות לנתק תאים.
- הוסף 4 מ ל של DMEM ופזר את המדיום על ידי ליטוף מעל פני השטח של שכבת התא מספר פעמים. . העבר את ההשעיה של התא לשפופרת
- בתאי צנטריפוגה ב 500 x g עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר.
- . והשהה מחדש את הגלולה ב-100 מ ל של PBS
- צנטריפוגה את ההשעיה התא ב 500 x g עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר ולהיפטר supernatant.
- לדלל את הגלולה תא עם התרבות התא באגירה בינונית (טבלה של חומרים) שיושלם עם 10% fbs לצפיפות הזריעה של 1.0 x 106 תאים/mL.
- פיפטה 50 μL של תא הבולם לתוך כל באר של 96 צלחת הבאר ולהחזיר את התאים לחממה.
- התאים הדגירה ב 37 ° c תחת 5% CO2 עבור 10 h.
2. הקרנה מורכבת
- במהלך הדגירה, לדלל את תרכובות ההקרנה (טבלת חומרים) ו ממס (diמתיל סולפוקסיד [dmso]) בריכוז 13.5 x. לדוגמה, אם המניה היא 10 מ"מ והריכוז ההקרנה הוא 10 μM, להוסיף 1 μL של פתרון מניות כדי 73.1 μL של התרבות התא באגירה בינונית.
- הוסף 12.5 μL של המצע זורח (טבלה של חומרים) על כל טוב ומארג עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר.
הערה: כפקדים שליליים, הבארות בשני קצות הצלחת (כלומר, עמודות 1 ו-12) לא אמורות להכיל מצע לא זורח. - למדוד את האור הבסיסי באמצעות לומימטר (טבלת חומרים).
- מיד לאחר המדידה הראשונית, להוסיף 5 μL של תרכובות ושליטה DMSO מדולל בשלב 2.1 לכל הבאר.
הערה: הריכוז הסופי יהיה 10 μm. - מדידת ערכי האור כל 30 דקות עבור 2 h.
הערה: הצלחת להיות מודקת בחושך בטמפרטורת החדר. - לחשב את אפקטי העכבות על-ידי השוואה עם טיפול DMSO בקרה לאחר נורמליזציה לאותות בסיסיים.
הערה: הקרנתכל תרכובת בכפולה או בטרילקאט עלולה להפחית את הווריאציה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
תוצאות הנציג בעקבות השימוש בפרוטוקול זה מוצגות באיור 2א, ב. היחס בין האות לרקע היה גדול מ-80 ו-Z פקטור9 (מדד האיכות של הזהב להקרנה בתפוקה גבוהה) היה גדול מ-0.5, והצביע על כך שמערכת שיטה זו הייתה מקובלת עבור הקרנת תפוקה גבוהה. עם הסף שנקבע ל-> 40% עיכוב לעומת הפקד (DMSO בלבד), זיהינו nitazoxanide בתור סם מועמד7. באמצעות מערכת זו, סמים מועמדים טובים יותר ניתן למצוא על ידי הקרנת ספריות אחרות, גדול יותר במתחם.
איור 1: ייצוג סכמטי של ניתוח מפוצל לוציפראז של האינטראקציה HBx-DDB1. (א) העיקרון הבסיסי של HBX-DDB1 כריכה באמצעות מערכת מפוצלת לוציפראז שיטה משלימה. מופרדים לוציפראאז תת יחידות, LgBit ו SmBit, הם התמזגו HBx ו DDB1, בהתאמה. האינטראקציה HBx-DDB1 מביאה את היחידות המשנה לסמיכות כדי ליצור אנזים פונקציונלי שיוצר אות זורח. האינטראקציה בין יחידות המשנה היא הפיכה. (ב) פיצול שיטת לוציפראאז. לאחר העברה שיתוף של פלמידים עבור ביטוי של HBx התמזגו LgBit ו DDB1 התמזגו כדי SmBit, תאים שופרה מחדש לצלחת 96 היטב. התוספת של המצע זורח מאפשר מדידה של פעילות לוציפראז ללא צעד הפירוק התא. פעילויות לוציפראז ניתן למדוד לאחר הוספת תרכובות ההקרנה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: תוצאות מוצלחות של הנתון המפוצל לוציפראז. (א) נציג הבסיס אותות זורח מצלחת 96 היטב. העוצמה הלוציפרראז מיוצגת באמצעות מספרים וצבעים. עמודות 1 ו-12 הן פקדים שבהם המצע זורח לא נוספה. . הפקטור של זי היה גדול מ-0.5 (ב) הנציג זמן הסדרה תוצאה של רמות הפעילות לוציפראז יחסית לאחר תוספת של תרכובות ההקרנה ל 96 צלחת היטב. ציר ה-x מייצג את אפקטי העכבות שחושבו בהשוואה לשליטה (DMSO) לאחר הסטנדרטיזציה לפעילות הלוציפרראז הבסיסית. התרכובת האפקטיבית ביותר. הייתה nitazoxanide אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פיתחנו שיטת הקרנה נוחה באמצעות מפוצל לוציפראז למצוא מעכבי HBx-DDB1 קשירה. הדינמיקה אינטראקציה ניתן לזהות בזמן אמת בתאי החיים ללא צורך בפירוק תאים. עיכוב של HBx-DDB1 אינטראקציה מוביל שחזור של Smc5/6, אשר גורמת לדיכוי של תמלול ויראלי, ביטוי חלבון, ו cccDNA ייצור7. זה מנגנון הרומן של פעולה אנטי ויראליות יכול להתגבר על מחדלים של טיפולים HBV הנוכחי.
למרות שמספר שיטות זמינות לחקירת אינטראקציות חלבונים-חלבונים בתאי החיים, בחינת האינטראקציות הללו נותרות קשות10. ההליך שלנו הוא פשוט דורש זמן קצר למסך 1 96 צלחת היטב. יתר על כן, איכות ההקרנה היה משביע רצון עם ניקוד גבוה Z, מדד הזהב באיכות להקרנה התפוקה הגבוהה הקרנה9. השימוש שלנו עשוי להיות מתאים לאוטומציה רובוטית11 והוא מהווה שיטת פעולה יעילה לגילוי סמים.
בעוד הפרוטוקול המתואר כאן השתמש קו התא HEK293T מכיוון היעילות הגבוהה שלה ויכולת התפשטות גבוהה מתאימים ההקרנה תפוקה גבוהה, שיטת ההקרנה ניתן לבצע באמצעות קווי תאים אחרים (למשל, HepG2) ללא שינויים7. כאסטרטגיה ריאליסטית עבור ההקרנה תרכובות, HEK293T תאים ניתן להשתמש בהקרנה הראשונה ואחריו HepG2 תאים בהקרנה אימות שנייה. ייתכן שחלק מהתרכובות לא יראו תוצאות משמעותיות בקווי תאים שונים כאשר ההשפעות תלויות במנגנונים עקיפים.
כוונתנו הייתה לפתח שיטת הקרנה של תפוקה גבוהה, מחקרי אימות הבאים נחוצים כדי לאשר אם התרכובות המזוהות ישמשו כמעכבי אינטראקציה. רמות נמוכות של אותות זורח בתוך שיטת זה לא תמיד מתאים עיכוב של האינטראקציה HBx-DDB1. בדיקות ציטורעילות, co-immunoprecipitation לימודים, וניסויים נוספים anti-HBV חשובים כדי לאשר את ההשפעות7.
למרות שזיהינו בעבר nitazoxanide כמדכא של האינטראקציה של HBx-DDB1 על-ידי הקרנת ספריה קטנה יחסית בקנה מידה קטן7, מחקרים נוספים הכרוכים בהקרנה של ספריות מורכבות גדולות הרבה יותר ניתן לבצע בקלות כדי לזהות תרכובות הרומן המסוגלים לעכב אינטראקציות חלבון חלבון ביעילות רבה יותר. בעת ביצוע הקרנה נוספת כזו, ניתן להשתמש בnitazoxanide כשליטה חיובית לצורך השימוש. יתר על כן, המערכת המתוארת כאן ניתן להחיל על אינטראקציות חלבון-חלבון אחרות. אינטראקציות חלבונים בחלבון הן מעמד. חשוב של מטרות סמים12 אכן, וירוסים רבים אחרים אינטראקציה עם גורמים מארחים כדי לשכפל או לבטא את הפתוגניות שלהם13,14. שיטת פיצול לוציפראז מבוססת המתוארת כאן, אשר מטרות האינטראקציות בין החלבונים ויראלי ומארחים, עשוי לספק אסטרטגיה חדשה כדי לפתח תרופות HBV ומחלות זיהומיות אחרות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
עבודה זו נתמכת על ידי מענקים בסיוע ממשרד החינוך, התרבות, הספורט, המדע והטכנולוגיה, יפן (#19H03430 ו#17K09405 לשיטת הפעולה, ו #19J11829 ל K.S.), על ידי גרנט-in-Aid עבור מחקר מדעי על אזורים חדשניים (#18H05024 לשיטת הפעולה), על ידי תוכנית מחקר על הפטיטיס מן הסוכנות היפנית למחקר ופיתוח, (כדי שיטת פעולה, #JP19fk021005), על ידי תוכנית על פיתוח חדשני ויישום של תרופות חדשות עבור צהבת B (#JP19fk0310102 K.K.) מ-, על ידי הקרן היפנית עבור אנזיולוגיה שימושית ומקרן קוביאשי לחקר הסרטן (כדי שיטת פעולה), על ידי יפן GSK מחקר מענק 2018 (כדי K.S.), ועל ידי מענק מן הקרן מייקאווה מחקר הזיכרון (כדי K.S.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture microplate, 96 well, PS, F-BOTTOM | Greiner-Bio-One GmbH | 655098 | |
| DMEM | Sigma Aldrich | D6046 | |
| DMSO | Tocris Bioscience | 3176 | |
| Effectene transfection reagent | Qiagen | 301425 | Includes DNA-condensation buffer, enhancer solution and transfection reagent |
| FBS | Nichirei | 175012 | |
| GloMax 96 microplate luminometer | Promega | E6521 | |
| HBx–LgBit expressing DNA plasmid | Our laboratory | Available upon request | |
| HEK293T cells | American Type Culture Collection | CRL-11268 | |
| NanoBiT PPI starter systems | Promega | N2015 | Includes Nano-Glo Live Cell Reagent |
| Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific | 11058021 | Described as "buffered cell culture medium" in the manuscript |
| PBS | Takara | T900 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma Aldrich | P0781 | |
| Screen-Well FDA-approved drug library V2 version 1.0 | Enzo Life Sciences | BML-2841 | Compounds used here were as follows: mequinol, mercaptopurine hydrate, mesna, mestranol, metaproterenol hemisulfate, metaraminol bitartrate, metaxalone, methacholine chloride, methazolamide, methenamine hippurate, methocarbamol, methotrexate, methoxsalen, methscopolamine bromide, methsuximide, methyclothiazide, methyl aminolevulinate·HCl, methylergonovine maleate, metolazone, metyrapone, mexiletine·HCl, micafungin, miconazole, midodrine·HCl, miglitol, milnacipran·HCl, mirtazapine, mitotane, moexipril·HCl, mometasone furoate, mupirocin, nadolol, nafcillin·Na, naftifine·HCl, naratriptan·HCl, natamycin, nebivolol·HCl, nelarabine, nepafenac, nevirapine, niacin, nicotine, nilotinib, nilutamide, nitazoxanide, nitisinone, nitrofurantoin, nizatidine, nortriptyline·HCl, olsalazine·Na, orlistat, oxaprozin, oxtriphylline, oxybutynin Chloride, oxytetracycline·HCl, paliperidone, palonosetron·HCl, paromomycin sulfate, pazopanib·HCl, pemetrexed disodium, pemirolast potassium, penicillamine, penicillin G potassium, pentamidine isethionate, pentostatin, perindopril erbumine, permethrin, perphenazine, phenelzine sulfate, phenylephrine, phytonadione, pimecrolimus, pitavastatin calcium, and podofilox |
| SmBit–DDB1 expressing DNA plasmid | Our laboratory | Available upon request | |
| Trypsin-EDTA | Sigma Aldrich | T4049 |
References
- Tang, L. S. Y., Covert, E., Wilson, E., Kottilil, S. Chronic hepatitis B infection: a review. The Journal of the American Medical Association. 319, 1802-1813 (2018).
- Sekiba, K., et al. Hepatitis B virus pathogenesis: Fresh insights into hepatitis B virus RNA. World Journal of Gastroenterology. 24, 2261-2268 (2018).
- Slagle, B. L., Bouchard, M. J. Hepatitis B virus X and regulation of viral gene expression. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 6, a021402 (2016).
- Murphy, C. M., et al. Hepatitis B Virus X Protein Promotes Degradation of SMC5/6 to Enhance HBV Replication. Cell Reports. 16, 2846-2854 (2016).
- Decorsière, A., et al. Hepatitis B virus X protein identifies the Smc5/6 complex as a host restriction factor. Nature. 531, 386-389 (2016).
- Niu, C., et al. The Smc5/6 complex restricts HBV when localized to ND10 without inducing an innate immune response and is counteracted by the HBV X protein shortly after infection. PLoS One. 12, e0169648 (2017).
- Sekiba, K., et al. Inhibition of HBV Transcription From cccDNA With Nitazoxanide by Targeting the HBx-DDB1 Interaction. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 7, 297-312 (2019).
- Eggers, C. T., et al. NanoLuc Complementation Reporter Optimized for Accurate Measurement of Protein Interactions in Cells. ACS Chemical Biology. 11, 400-408 (2015).
- Zhang, J. H., Chung, T. D. Y., Oldenburg, K. R. A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays. Journal of Biomolecular Screening. 4, 67-73 (1999).
- Rao, V. S., Srinivas, K., Sujini, G. N., Kumar, G. N. Protein-protein interaction detection: Methods and analysis. International Journal of Proteomics. 2014. 2014, 147648 (2014).
- Michael, S., et al. A Robotic Platform for Quantitative High-Throughput Screening. ASSAY and Drug Development Technologies. 6, 637-657 (2008).
- Skwarczynska, M., Ottmann, C.
- de Chassey, B., Meyniel-Schicklin, L., Vonderscher, J., André, P., Lotteau, V. Virus-host interactomics: New insights and opportunities for antiviral drug discovery. Genome Medicine. 6, 115 (2014).
- Prasad, M., et al. Virus-Host Interactions: New Insights and Advances in Drug Development Against Viral Pathogens. Current Drug Metabolism. 18, 942-970 (2017).
