Summary
यहां, हम एंटी-हेपेटाइटिस बी वायरल एजेंटों की स्क्रीनिंग के लिए एक विधि पेश करते हैं जो एक स्प्लिट लूसिफ़ेरेज़ परख सिस्टम का उपयोग करके एचबीएक्स-डीडीबी1 इंटरैक्शन को रोकते हैं। यह प्रणाली प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन का आसानी से पता लगाने की अनुमति देती है और ऐसी बातचीत के अवरोधकों की पहचान करने के लिए उपयुक्त है।
Abstract
हेपेटाइटिस बी वायरस (एचबीवी) संक्रमण के लिए उपन्यास चिकित्सीय एजेंटों की तत्काल आवश्यकता है। हालांकि वर्तमान में उपलब्ध नाभिक (टी) आईडीई एनालॉग शक्तिशाली रूप से वायरल प्रतिकृति को रोकते हैं, लेकिन वायरल सहसंयोजक बंद परिपत्र डीएनए (सीसीसीटीएना) से लिखित वायरल प्रोटीन की अभिव्यक्ति पर उनका कोई सीधा प्रभाव नहीं पड़ता है। चूंकि उच्च वायरल एंटीजन लोड इस पुरानी और एचबीवी से संबंधित कार्सिनोजेनेसिस में भूमिका निभा सकता है, इसलिए एचबीवी उपचार का लक्ष्य वायरल प्रोटीन को समाप्त करना है। एचबीवी नियामक प्रोटीन एक्स (एचबीएक्स) गुणसूत्रों 5/6 (Smc5/6) के संरचनात्मक रखरखाव को नीचा दिखाने के लिए मेजबान डीएनए क्षति-बाध्यकारी प्रोटीन 1 (DDB1) प्रोटीन को बांधता है, जिसके परिणामस्वरूप सीसीसीटीडीएनए से वायरल ट्रांसक्रिप्शन की सक्रियता होती है । यहां, एक विभाजन लूसिफ़ेरेज़ पूरक परख प्रणाली का उपयोग करते हुए, हम एचबीएक्स-डीडीबी1 इंटरैक्शन के अवरोधकों की पहचान करने के लिए एक व्यापक यौगिक स्क्रीनिंग प्रणाली पेश करते हैं। हमारा प्रोटोकॉल जीवित कोशिकाओं के भीतर वास्तविक समय में बातचीत की गतिशीलता का आसानी से पता लगाने में सक्षम बनाता है। यह तकनीक एचबीवी संक्रमण के उपचार के लिए उपन्यास चिकित्सीय एजेंटों की खोज करने के लिए एक महत्वपूर्ण परख बन सकती है।
Introduction
हेपेटाइटिस बी वायरस (एचबीवी) संक्रमण दुनिया भर में एक प्रमुख सार्वजनिक स्वास्थ्य चिंता का विषय है, २४०,०००,००० लोगों के वार्षिक अनुमानों के साथ लंबे समय से एचबीवी से संक्रमित और ९०,००० संक्रमण से जटिलताओं के कारण मौतें, सिरोसिस और हेपेटोसेलुलर कार्सिनोमा (एचसीसी)1सहित । हालांकि वर्तमान एंटी-एचबीवी चिकित्सीय एजेंट, नाभिक (टी) इडालॉग, वायरल रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन को पर्याप्त रूप से रोकते हैं, वे शायद ही कभी वायरल प्रोटीन के उन्मूलन को प्राप्त करते हैं, जो दीर्घकालिक नैदानिक लक्ष्य है। वायरल प्रोटीन उन्मूलन पर उनका खराब प्रभाव हेपेटोसाइट नाभिक2में एपीसोमल वायरल सहसंयोजक रूप से बंद परिपत्र डीएनए (सीसीसीटीएना) मिनीक्रोमोसोम से वायरल ट्रांसक्रिप्शन पर सीधे प्रभाव की कमी के कारण है।
एचबीवी ट्रांसक्रिप्शन एचबीवी रेगुलेटरी एक्स (एचबीएक्स) प्रोटीन3द्वारा सक्रिय है। हाल के अध्ययनों से पता चला है कि एचबीएक्स गुणसूत्रों 5/6 (Smc5/6) के संरचनात्मक रखरखाव को नीचा दिखाता है, एक मेजबान प्रतिबंध कारक है कि सीसीडीएनए से एचबीवी प्रतिलेखन ब्लॉक, एक DDB1-CUL4-ROC1 E3 सर्वव्यापी लिगास परिसर4,5,6अपहरण के माध्यम से । इसलिए, सीसीसीटीएसे वायरल ट्रांसक्रिप्शन को बढ़ावा देने में एक महत्वपूर्ण कदम एचबीएक्स-डीडीबी1 इंटरैक्शन माना जाता है। एचबीएक्स और डीडीबी1 के बीच बाध्यकारी को बाधित करने में सक्षम यौगिकों वायरल ट्रांसक्रिप्शन को अवरुद्ध कर सकता है, और वास्तव में नाइटाज़ोक्सनाइड को हमारी प्रयोगशाला7में विकसित स्क्रीनिंग प्रणाली के माध्यम से एचबीएक्स-डीडीबी1 इंटरैक्शन के अवरोधक के रूप में पहचाना गया था।
यहां, हम एचबीएक्स-डीडीबी1 इंटरैक्शन के अवरोधकों की पहचान करने के लिए उपयोग की जाने वाली अपनी सुविधाजनक स्क्रीनिंग प्रणाली पेश करते हैं, जो एक विभाजन लूसिफ़ेरेज़ पूरक परख7,8का उपयोग करता है। स्प्लिट लूसिफ़ेरेज उपइकाइयों को एचबीएक्स और डीडीबी1 में जोड़ दिया जाता है, और एचबीएक्स-डीडीबी1 इंटरैक्शन उपइकाइयों को एक कार्यात्मक एंजाइम बनाने के लिए निकटता में लाता है जो एक उज्ज्वल ल्यूमिनेसेंट संकेत उत्पन्न करता है। चूंकि उपइकाइयों के बीच बातचीत उलटा है, इसलिए यह प्रणाली एचबीएक्स-डीडीबी1 प्रोटीन(चित्रा 1)को तेजी से अलग करने का पता लगा सकती है। इस प्रणाली का उपयोग करके, एक बड़े यौगिक पुस्तकालय की आसानी से जांच की जा सकती है, जिसके परिणामस्वरूप एचबीएक्स-डीडीबी1 इंटरैक्शन को कुशलतापूर्वक बाधित करने में सक्षम उपन्यास यौगिकों की खोज हो सकती है।
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Protocol
नोट:स्प्लिट लूसिफ़ेरेज़ परख का एक योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व चित्रा 1एमें दिखाया गया है और परख प्रक्रिया को चित्रा 1बीमें रेखांकित किया गया है । इंटरैक्शन डायनेमिक्स को वास्तविक समय में बिना सेल लिसिस के मापा जा सकता है।
1. सेल तैयारी
- Dulbecco के संशोधित ईगल के माध्यम (DMEM) में सुसंस्कृत HEK293T कोशिकाओं को बनाए रखें 10% v/v भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS), 1x पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ 20% O2 और 5% सीओ2में ३७ डिग्री सेल्सियस पर पूरक ।
- बीज 5 x 106 कोशिकाओं को डीएमईएम के 10 मिलीमीटर के साथ 100 मिमी पकवान में और रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
- निम्नलिखित विधि के अनुसार कोशिकाओं में विभाजित ल्यूसिफ़ेरेस के साथ एचबीएक्स और डीडीबी1 का क्षणिक रूप से 1 μg।
नोट:प्लाज्मिड डीएनए ट्रांससंक्रमित की मात्रा उपयोग किए गए ट्रांसफेक्शन रीजेंट पर निर्भर हो सकती है। लक्ष्य प्रोटीन के लिए जुड़े विभाजन लूसिफेरेज़ की इष्टतम स्थिति पहले से निर्धारित की जानी चाहिए। इस मामले में, एचबीएक्स ने एलबीएक्स (एचबीएक्स-एलजीबिट) के सी-टर्मिनस में एलजीबिट को फ्यूज किया और डीडीबी1 (SmBit-DDB1) के एन-टर्मिनस में एसएमबिट के लिए फ्यूज किया गया, सर्वश्रेष्ठ परिणाम दिए (यानी, प्रतिभाशाली ल्यूसिफ़ेरे सिग्नल)। इस प्रक्रिया को पहले विस्तार से7में सूचित किया गया है ।- एचबीएक्स-एलजीबिट के 1 μg पतला डीएनए प्लाज्मिड और SmBit-DDB1 के 1 μg व्यक्त डीएनए संघनन बफरमेंडीएनए प्लाज्मिड(सामग्री की मेज)व्यक्त करने के लिए 300 μL की कुल मात्रा के लिए।
- बढ़ाने वाले समाधान(सामग्री की तालिका)के 16 μL जोड़ें और 1 एस के लिए भंवर द्वारा मिश्रण।
- 3 न्यूनतम के लिए कमरे के तापमान पर नमूना इनक्यूबेट करें।
- नमूने में ट्रांसफेक्शन रिएजेंट(सामग्री की तालिका)के 60 माइक्रोन जोड़ें और 10 एस के लिए भंवर द्वारा मिश्रण करें।
- 8 न्यूनतम के लिए कमरे के तापमान पर नमूना इनक्यूबेट करें।
- ऊष्मायन के दौरान, डिश (चरण 1.2 में तैयार) से संस्कृति माध्यम को एस्पिरेट करें, और फॉस्फेट-बफर्ड लवण (पीबीएस) के 5 मिलील के साथ कोशिकाओं को धोएं। आकांक्षा द्वारा पीबीएस निकालें और DMEM के 7 mL जोड़ें।
- ट्रांसफेक्शन कॉम्प्लेक्स युक्त ट्यूब में डीएमईएम के 3 mL जोड़ें। पाइपिंग द्वारा मिलाएं और 10 सेमी डिश में सेल पर ट्रांसफेक्शन कॉम्प्लेक्स जोड़ें।
- 10 घंटे के लिए 5% सीओ2 के तहत एक इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
- कोशिकाओं को 5 x 104 कोशिकाओं/अच्छी तरह से 50 माइक्रोन में 50 माइक्रोन ऑफ मीडियम/वेल में निम्नलिखित विधि के अनुसार सफेद 96 वेल प्लेट में रीसीड करें।
- खर्च सेल संस्कृति माध्यम और पीबीएस के 5 mL के साथ धोने कोशिकाओं को हटा दें ।
- आकांक्षा द्वारा पीबीएस निकालें, 0.25% ट्राइप्सिन-ईडीटीए के 1 एमएल जोड़ें, और कोशिकाओं को अलग करने के लिए 5 मिन के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
- डीएमईएम के 4 एमएल जोड़ें और कई बार सेल परत की सतह पर पाइपिंग करके माध्यम को तितर-बितर करें। सेल निलंबन को ट्यूब पर स्थानांतरित करें।
- कमरे के तापमान पर 5 न्यूनतम के लिए 500 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र कोशिकाएं।
- सुपरनेट को त्यागें और पीबीएस के 1 mL में सेल पैलेट को फिर से निलंबित करें।
- कमरे के तापमान पर 5 न्यूनतम के लिए 500 x ग्राम पर सेल निलंबन को केंद्रित करें और सुपरनेट को त्यागें।
- बफर सेल कल्चर मीडियम(टेबल ऑफ मैटेरियल्स)के साथ सेल पैलेट को पतला करें 10% एफबीएस के साथ 1.0 x 106 कोशिकाओं/mL के सीडिंग घनत्व के लिए पूरक ।
- एक 96 अच्छी तरह से प्लेट के प्रत्येक कुएं में सेल निलंबन के 50 μL पिपेट और इनक्यूबेटर के लिए कोशिकाओं को वापस।
- 10 घंटे के लिए 5% सीओ2 के तहत 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट कोशिकाओं।
2. कंपाउंड स्क्रीनिंग
- ऊष्मायन के दौरान, स्क्रीनिंग यौगिकों(सामग्री की तालिका)और विलायक (डिमेथिल सल्फासऑक्साइड [DMSO]) को 13.5 x एकाग्रता पर पतला करें। उदाहरण के लिए, यदि स्टॉक 10 mM है और स्क्रीनिंग एकाग्रता 10 माइक्रोन है, तो बफर सेल संस्कृति माध्यम के 73.1 माइक्रोन में स्टॉक समाधान के 1 माइक्रोन जोड़ें।
- प्रत्येक कुएं में ल्यूमिनेसेंट सब्सट्रेट(सामग्री की तालिका)के 12.5 माइक्रोन जोड़ें और कमरे के तापमान पर 5 न्यूनतम के लिए इनक्यूबेट करें।
नोट:नकारात्मक नियंत्रण के रूप में, प्लेट के दोनों सिरों पर कुओं (यानी, कॉलम 1 और 12) में कोई ल्यूमिनेसेंट सब्सट्रेट नहीं होना चाहिए। - एक ल्यूमिनोमीटर(सामग्री की तालिका)का उपयोग करके बेसलाइन ल्यूमिनेसेंस को मापें।
- प्रारंभिक माप के तुरंत बाद, यौगिकों के 5 μL जोड़ें और नियंत्रण DMSO प्रत्येक अच्छी तरह से कदम 2.1 में पतला।
नोट:अंतिम एकाग्रता 10 माइक्रोन होगी। - 2 घंटे के लिए हर 30 मिन को मापें ल्यूमिनेसेंस मूल्य।
नोट:थाली कमरे के तापमान पर अंधेरे में इनक्यूबेटेड किया जाना चाहिए। - बेसलाइन संकेतों को सामान्य करने के बाद नियंत्रण डीएमएसओ उपचार के साथ तुलना करके निरोधात्मक प्रभावों की गणना करें।
नोट:डुप्लिकेट या ट्रिपलेट में प्रत्येक यौगिक की स्क्रीनिंग भिन्नता को कम कर सकती है।
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Representative Results
इस प्रोटोकॉल के उपयोग के बाद प्रतिनिधि परिणाम चित्रा 2ए, बीमें दिखाए जाते हैं। सिग्नल-टू-बैकग्राउंड अनुपात 80 से अधिक था और जेड फैक्टर9 (उच्च थ्रूपुट स्क्रीनिंग के लिए गोल्ड स्टैंडर्ड क्वालिटी इंडेक्स) 0.5 से अधिक था, यह दर्शाता है कि यह परख प्रणाली उच्च थ्रूपुट स्क्रीनिंग के लिए स्वीकार्य थी। नियंत्रण (केवल DMSO) की तुलना में 40% अवरोध के लिए सीमा निर्धारित करने के साथ, हमने नाइटाज़ोक्सनाइड को उम्मीदवार दवा7के रूप में पहचाना। इस प्रणाली का उपयोग करके, बेहतर उम्मीदवार दवाओं अन्य, बड़े यौगिक पुस्तकालयों की स्क्रीनिंग द्वारा पाया जा सकता है।
चित्रा 1: एचबीएक्स-डीडीबी1 इंटरैक्शन के स्प्लिट लूसिफ़ेरेज़ विश्लेषण का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। (A)विभाजन लुसिफेरेस पूरक परख प्रणाली का उपयोग करके एचबीएक्स-डीडीबी1 बाध्यकारी का सिद्धांत अंतर्निहित पता लगाना । अलग ल्यूसिफ़ेरेस सबयूनिट्स, एलजीबिट और एसएमबिट, क्रमशः एचबीएक्स और डीडीबी1 में जुड़े हुए हैं। एचबीएक्स-डीडीबी1 इंटरैक्शन उपइकाइयों को एक कार्यात्मक एंजाइम बनाने के लिए निकटता में लाता है जो एक ल्यूमिनेसेंट सिग्नल उत्पन्न करता है। उपइकाइयों के बीच बातचीत उलटा है। (ख)स्प्लिट लूसिफ़ेरास परख । एलजीबिट और डीडीबी1 से जुड़े एचबीएक्स की अभिव्यक्ति के लिए प्लाज्मिड्स के सह-ट्रांसफेक्शन के बाद, कोशिकाओं को 96 अच्छी प्लेट में फिर से वरीयता दी गई थी। ल्यूमिनेसेंट सब्सट्रेट के अलावा एक सेल lysis कदम के बिना ल्यूसिफ़ेरेगतिविधि की माप सक्षम बनाता है। स्क्रीनिंग यौगिकों को जोड़ने के बाद लूसिफ़ेरास गतिविधियों को मापा जा सकता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 2: विभाजन लूसिफ़ेरेज़ परख के सफल परिणाम। (क)प्रतिनिधि बेसलाइन ल्यूमिनेसेंट एक ९६ अच्छी प्लेट से संकेत । लूसिफ़ेरेज़ तीव्रता संख्या और रंगों द्वारा दर्शाई जाती है। कॉलम 1 और 12 नियंत्रण हैं जिसमें ल्यूमिनेसेंट सब्सट्रेट नहीं जोड़ा गया था। जेड का फैक्टर 05 से ज्यादा था। (ख)स्क्रीनिंग यौगिकों को 96 अच्छी प्लेट में शामिल करने के बाद सापेक्ष लूसिफ़ेरेज गतिविधि के स्तर का प्रतिनिधि समय-श्रृंखला परिणाम। एक्स-एक्सिस बेसलाइन ल्यूसिफ़ेरेज गतिविधि के मानकीकरण के बाद नियंत्रण (डीएमएसओ) की तुलना में गणना किए गए निरोधात्मक प्रभावों का प्रतिनिधित्व करता है। सबसे प्रभावी यौगिक नाइटाज़ोक्सनाइड था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
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Discussion
हमने एचबीएक्स-डीडीबी1 बाध्यकारी अवरोधकों को खोजने के लिए एक स्प्लिट लूसिफ़ेरेज़ परख का उपयोग करके एक सुविधाजनक स्क्रीनिंग विधि विकसित की। कोशिका ओं की आवश्यकता के बिना जीवित कोशिकाओं में वास्तविक समय में बातचीत की गतिशीलता का पता लगाया जा सकता है। एचबीएक्स-डीडीबी1 इंटरैक्शन के अवरोध से एसएमसी5/6 की बहाली होती है, जिसके परिणामस्वरूप वायरल ट्रांसक्रिप्शन, प्रोटीन अभिव्यक्ति और सीसीसीसीडीएनए उत्पादन7का दमन होता है। एंटीवायरल कार्रवाई का यह उपन्यास तंत्र वर्तमान एचबीवी उपचारों की अपर्याप्तता को दूर कर सकता है।
हालांकि जीवित कोशिकाओं में प्रोटीन-प्रोटीन बातचीत की जांच करने के लिए कई तरीके उपलब्ध हैं, लेकिन इन बातचीत की जांच करना मुश्किल10रहते हैं । हमारी प्रक्रिया सरल है और केवल एक कम समय के लिए एक ९६ अच्छी तरह से थाली स्क्रीन की आवश्यकता है । इसके अलावा, स्क्रीनिंग की गुणवत्ता एक उच्च जेड स्कोर के साथ संतोषजनक थी, उच्च थ्रूपुट स्क्रीनिंग9के लिए गोल्ड स्टैंडर्ड क्वालिटी इंडेक्स । हमारी परख रोबोट स्वचालन11 के लिए उपयुक्त हो सकता है और दवा की खोज के लिए एक कुशल परख है ।
जबकि यहां वर्णित प्रोटोकॉल HEK293T सेल लाइन का इस्तेमाल किया क्योंकि इसकी उच्च ट्रांसफेक्शन प्रभावकारिता और उच्च प्रसार क्षमता उच्च थ्रूपुट स्क्रीनिंग के लिए उपयुक्त हैं, इस स्क्रीनिंग विधि को संशोधनों के बिना अन्य सेल लाइनों (जैसे, हेपग्2) का उपयोग करके किया जा सकता है7। यौगिकों की स्क्रीनिंग के लिए एक यथार्थवादी रणनीति के रूप में, HEK293T कोशिकाओं को पहली स्क्रीनिंग में इस्तेमाल किया जा सकता है जिसके बाद दूसरी सत्यापन स्क्रीनिंग में हेपजी 2 कोशिकाएं हैं। कुछ यौगिकों को विभिन्न सेल लाइनों में महत्वपूर्ण परिणाम नहीं दिखा सकते हैं जब प्रभाव अप्रत्यक्ष तंत्र पर निर्भर होते हैं।
जैसा कि हमारा इरादा एक उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग विधि विकसित करना था, बाद में सत्यापन अध्ययन इस बात की पुष्टि करने के लिए आवश्यक हैं कि क्या पहचाने गए यौगिक इंटरैक्शन अवरोधकों के रूप में कार्य करते हैं। इस परख में ल्यूमिनेसेंट संकेतों के कम स्तर हमेशा एचबीएक्स-डीडीबी1 इंटरैक्शन के अवरोध के अनुरूप नहीं होते हैं। साइटोटॉक्सिकिटी परीक्षण, सह-इम्यूनोप्रिसिप्रिफिकेशन अध्ययन, और आगे एंटी-एचबीवी प्रयोग7प्रभावों की पुष्टि करने के लिए महत्वपूर्ण हैं।
यद्यपि हमने पहले अपेक्षाकृत छोटे पैमाने पर यौगिक पुस्तकालय7की स्क्रीनिंग करके एचबीएक्स-डीडीबी1 इंटरैक्शन के अवरोधक के रूप में नाइटाज़ोक्सनाइड की पहचान की थी, लेकिन बहुत बड़े यौगिक पुस्तकालयों की स्क्रीनिंग से जुड़े आगे के अध्ययनों को आसानी से उपन्यास यौगिकों की पहचान करने के लिए किया जा सकता है जो प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन को अधिक कुशलता से बाधित करने में सक्षम हैं। इस तरह की आगे की स्क्रीनिंग करते समय, नाइटाज़ोक्सनाइड को परख के लिए सकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। इसके अलावा, यहां वर्णित प्रणाली को अन्य प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन पर लागू किया जा सकता है। प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन दवालक्ष्य12का एक महत्वपूर्ण वर्ग है । दरअसल, कई अन्य वायरस मेजबान कारकों के साथ बातचीत करने के लिए दोहराने या उनकी रोगजनकताव्यक्त 13,14। विभाजन लूसिफ़ेरेज़ आधारित परख यहां वर्णित है, जो वायरल और मेजबान प्रोटीन के बीच बातचीत लक्ष्य, एचबीवी और अंय संक्रामक रोगों के लिए इलाज विकसित करने के लिए एक नई रणनीति प्रदान कर सकते हैं ।
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Disclosures
लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
इस काम को शिक्षा मंत्रालय से अनुदान-सहायता द्वारा समर्थित किया गया था, संस्कृति, खेल, विज्ञान, और प्रौद्योगिकी, जापान (#19H03430 और M.O.के लिए #17K09405, और K.S. के #19J11829), एक अनुदान में अभिनव क्षेत्रों पर वैज्ञानिक अनुसंधान के लिए सहायता (#18H05024 से M.O.), जापान एजेंसी से चिकित्सा अनुसंधान और विकास के लिए हेपेटाइटिस पर अनुसंधान कार्यक्रम द्वारा, AMED (M.O., #JP19fk021005), अभिनव विकास और हेपेटाइटिस बी के लिए नई दवाओं के आवेदन पर कार्यक्रम द्वारा (#JP19fk0310102 के केके) से अनुदान से, AMईडी से अनुदान से जापान फाउंडेशन फॉर एप्लाइड एंजाइमोलॉजी और कोबायाशी फाउंडेशन फॉर कैंसर रिसर्च (एमओ) से, जीएसके जापान रिसर्च ग्रांट 2018 (केएस) द्वारा, और मियाकावा मेमोरियल रिसर्च फाउंडेशन (केएस) से अनुदान द्वारा।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture microplate, 96 well, PS, F-BOTTOM | Greiner-Bio-One GmbH | 655098 | |
| DMEM | Sigma Aldrich | D6046 | |
| DMSO | Tocris Bioscience | 3176 | |
| Effectene transfection reagent | Qiagen | 301425 | Includes DNA-condensation buffer, enhancer solution and transfection reagent |
| FBS | Nichirei | 175012 | |
| GloMax 96 microplate luminometer | Promega | E6521 | |
| HBx–LgBit expressing DNA plasmid | Our laboratory | Available upon request | |
| HEK293T cells | American Type Culture Collection | CRL-11268 | |
| NanoBiT PPI starter systems | Promega | N2015 | Includes Nano-Glo Live Cell Reagent |
| Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific | 11058021 | Described as "buffered cell culture medium" in the manuscript |
| PBS | Takara | T900 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma Aldrich | P0781 | |
| Screen-Well FDA-approved drug library V2 version 1.0 | Enzo Life Sciences | BML-2841 | Compounds used here were as follows: mequinol, mercaptopurine hydrate, mesna, mestranol, metaproterenol hemisulfate, metaraminol bitartrate, metaxalone, methacholine chloride, methazolamide, methenamine hippurate, methocarbamol, methotrexate, methoxsalen, methscopolamine bromide, methsuximide, methyclothiazide, methyl aminolevulinate·HCl, methylergonovine maleate, metolazone, metyrapone, mexiletine·HCl, micafungin, miconazole, midodrine·HCl, miglitol, milnacipran·HCl, mirtazapine, mitotane, moexipril·HCl, mometasone furoate, mupirocin, nadolol, nafcillin·Na, naftifine·HCl, naratriptan·HCl, natamycin, nebivolol·HCl, nelarabine, nepafenac, nevirapine, niacin, nicotine, nilotinib, nilutamide, nitazoxanide, nitisinone, nitrofurantoin, nizatidine, nortriptyline·HCl, olsalazine·Na, orlistat, oxaprozin, oxtriphylline, oxybutynin Chloride, oxytetracycline·HCl, paliperidone, palonosetron·HCl, paromomycin sulfate, pazopanib·HCl, pemetrexed disodium, pemirolast potassium, penicillamine, penicillin G potassium, pentamidine isethionate, pentostatin, perindopril erbumine, permethrin, perphenazine, phenelzine sulfate, phenylephrine, phytonadione, pimecrolimus, pitavastatin calcium, and podofilox |
| SmBit–DDB1 expressing DNA plasmid | Our laboratory | Available upon request | |
| Trypsin-EDTA | Sigma Aldrich | T4049 |
References
- Tang, L. S. Y., Covert, E., Wilson, E., Kottilil, S. Chronic hepatitis B infection: a review. The Journal of the American Medical Association. 319, 1802-1813 (2018).
- Sekiba, K., et al. Hepatitis B virus pathogenesis: Fresh insights into hepatitis B virus RNA. World Journal of Gastroenterology. 24, 2261-2268 (2018).
- Slagle, B. L., Bouchard, M. J. Hepatitis B virus X and regulation of viral gene expression. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 6, a021402 (2016).
- Murphy, C. M., et al. Hepatitis B Virus X Protein Promotes Degradation of SMC5/6 to Enhance HBV Replication. Cell Reports. 16, 2846-2854 (2016).
- Decorsière, A., et al. Hepatitis B virus X protein identifies the Smc5/6 complex as a host restriction factor. Nature. 531, 386-389 (2016).
- Niu, C., et al. The Smc5/6 complex restricts HBV when localized to ND10 without inducing an innate immune response and is counteracted by the HBV X protein shortly after infection. PLoS One. 12, e0169648 (2017).
- Sekiba, K., et al. Inhibition of HBV Transcription From cccDNA With Nitazoxanide by Targeting the HBx-DDB1 Interaction. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 7, 297-312 (2019).
- Eggers, C. T., et al. NanoLuc Complementation Reporter Optimized for Accurate Measurement of Protein Interactions in Cells. ACS Chemical Biology. 11, 400-408 (2015).
- Zhang, J. H., Chung, T. D. Y., Oldenburg, K. R. A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays. Journal of Biomolecular Screening. 4, 67-73 (1999).
- Rao, V. S., Srinivas, K., Sujini, G. N., Kumar, G. N. Protein-protein interaction detection: Methods and analysis. International Journal of Proteomics. 2014. 2014, 147648 (2014).
- Michael, S., et al. A Robotic Platform for Quantitative High-Throughput Screening. ASSAY and Drug Development Technologies. 6, 637-657 (2008).
- Skwarczynska, M., Ottmann, C.
- de Chassey, B., Meyniel-Schicklin, L., Vonderscher, J., André, P., Lotteau, V. Virus-host interactomics: New insights and opportunities for antiviral drug discovery. Genome Medicine. 6, 115 (2014).
- Prasad, M., et al. Virus-Host Interactions: New Insights and Advances in Drug Development Against Viral Pathogens. Current Drug Metabolism. 18, 942-970 (2017).
