Summary
Здесь мы представляем метод скрининга вирусных агентов против гепатита В, которые подавляют взаимодействие HBx-DDB1 с помощью разделенной системы анализов люциферазы. Эта система позволяет легко обнаруживать белково-белковые взаимодействия и подходит для выявления ингибиторов таких взаимодействий.
Abstract
Существует настоятельная необходимость в новых терапевтических агентах при инфекции, инфицированной вирусом гепатита В (HBV). Хотя в настоящее время доступнынущие нуклеосы (т)ide аналоги мощно подавляют репликацию вируса, они не имеют прямого влияния на выражение вирусных белков, транскрибированных из вирусной ковалентно закрытой круговой ДНК (cccDNA). Поскольку высокая вирусная нагрузка антигена может играть определенную роль в этом хроническом и HBV-связанных канцерогенеза, цель лечения HBV является искоренение вирусных белков. HBV регулятивного белка X (HBx) связывается с хозяином ДНК-связывающего белка 1 (DDB1) белка для деградации структурного поддержания хромосом 5/6 (Smc5/6), в результате активации вирусной транскрипции от cccDNA. Здесь, используя систему проверки дополнения разделенной люциферазы, мы представляем комплексную комплексную систему скрининга для выявления ингибиторов взаимодействия HBx-DDB1. Наш протокол позволяет легко обнаруживать динамику взаимодействия в режиме реального времени в живых клетках. Этот метод может стать ключевым ассеем, чтобы обнаружить новые терапевтические агенты для лечения HBV инфекции.
Introduction
Инфекция вируса гепатита В (HBV) является одной из основных проблем общественного здравоохранения во всем мире, с ежегодными оценками 240 миллионов человек, хронически инфицированных HBV и 90000 смертей из-за осложнений от инфекции, в том числе цирроза и гепатоцеллюлярной карциномы (HCC)1. Хотя нынешние анти-HBV терапевтические агенты, нуклеосы (т) аналоги, достаточно подавляют вирусную обратную транскрипцию, они редко достигают ликвидации вирусных белков, что является долгосрочной клинической целью. Их плохое влияние на устранение вирусного белка из-за их отсутствия прямого влияния на вирусную транскрипцию от эпизомальной вирусной ковалентно закрытой круговой ДНК (cccDNA) минимомосомы в ядре гепатоцитов2.
Транскрипция HBV активируется HBV регулятивным X (HBx) белком3. Недавние исследования показали, что HBx деградирует структурное обслуживание хромосом 5/6 (Smc5/6), фактор ограничения хозяина, который блокирует Транскрипцию HBV от cccDNA, через угон DDB1-CUL4-ROC1 E3 ubiquitin лигазе комплекс4,5,6. Таким образом, решающим шагом в продвижении вирусной транскрипции от cccDNA считается взаимодействие HBx-DDB1. Соединения, способные ингибировать связывание между HBx и DDB1 может блокировать вирусную транскрипцию, и действительно нитазоксанид был определен в качестве ингибитора взаимодействия HBx-DDB1 через систему скрининга, разработанную в нашей лаборатории7.
Здесь мы представляем нашу удобную систему скрининга, используемую для выявления ингибиторов взаимодействия HBx-DDB1, которая использует разделенный люциферазы комплементарный анализ7,8. Сплит luciferase субъединиц сливается с HBx и DDB1, и взаимодействие HBx-DDB1 приносит подразделения в непосредственной близости к форме функционального фермента, который генерирует яркий люминесцентный сигнал. Поскольку взаимодействие между подразделениями обратимо, эта система может обнаруживать быстро диссоциирующие белки HBx-DDB1(рисунок 1). С помощью этой системы можно легко проверить большую библиотеку соединений, что может привести к открытию новых соединений, способных эффективно ингибировать взаимодействие HBx-DDB1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ПРИМЕЧАНИЕ: Схематическое представление сплит-люциферазы асссея показано на рисунке 1A,и процесс проверки изложен на рисунке 1B. Динамика взаимодействия может измеряться в режиме реального времени без клеточного лиза.
1. Подготовка клеток
- Поддержание культивированных клеток HEK293T в модифицированной среде Орла Dulbecco (DMEM) дополнены 10% v/v сыворотки крупного рогатого скота (FBS), 1x пенициллина/стрептомицина при 37 КК в 20% O2 и 5% CO2.
- Семя 5 х 106 ячеек в 100 мм блюдо с 10 мл DMEM и инкубировать при 37 градусов по Цельсию в одночасье.
- Переходно пресловуто 1 мкг HBx и DDB1 с разделенными люциферасами в клетки в соответствии со следующим методом.
ПРИМЕЧАНИЕ: Количество плазмидной ДНК трансфицируется может зависеть от трансфекционного регента используется. Оптимальное положение сплит-люциферазы, сросанного с целевым белком, должно быть определено заранее. В этом случае HBx, слитый с LgBit на C-терминах HBx (HBx-LgBit) и DDB1, слитый с SmBit на N-термине DDB1 (SmBit-DDB1), обеспечил наилучшие результаты (т.е. самые яркие сигналы люциферазы). Этот процесс был сообщен ранее подробно7.- Разбавить 1 мкг HBx-LgBit, выражающий плазмид ДНК и 1 мкг SmBit-DDB1, выражающий плазмид ДНК(Таблица материалов)в буфере конденсации ДНК(Таблица материалов) в общей объеме 300 зл.
- Добавьте 16 зл усилитель раствора(Таблица материалов)и перемешайте путем вихря в течение 1 с.
- Инкубировать образец при комнатной температуре в течение 3 мин.
- Добавьте 60 кЛ трансфекционного реагента(Таблица материалов)в образец и смешайте путем вихря в течение 10 с.
- Инкубировать образец при комнатной температуре в течение 8 мин.
- Во время инкубации, аспирируют культурную среду из тарелки (подготовленной в шаге 1.2) и мыть клетки с 5 мл фосфат-буферизированного соления (PBS). Удалить PBS по аспирации и добавить 7 мл DMEM.
- Добавьте 3 мл DMEM в трубку, содержащую трансфекционные комплексы. Смешайте путем пипетки и добавьте трансфекционные комплексы на клетку в тарелке 10 см.
- Инкубировать клетки при 37 градусах Цельсия в инкубаторе под 5% CO2 на 10 ч.
- Пересить клетки в белый 96 хорошо пластины на 5 х 104 клетки / хорошо в 50 Л л среднего / хорошо в соответствии со следующим методом.
- Удалите отработанные среды культуры клеток и мыть клетки с 5 мл PBS.
- Удалить PBS по аспирации, добавить 1 мл 0,25% трипсин-EDTA, и инкубировать при 37 градусов по Цельсию в течение 5 минут, чтобы отделить клетки.
- Добавьте 4 мл DMEM и разогнать среду, несколько раз протянив по поверхности слоя клетки. Перенесите суспензию клетки в трубку.
- Центрифуги клетки при 500 х г в течение 5 мин при комнатной температуре.
- Откажитесь от супернатанта и отрепримите клеточные гранулы в 1 мл PBS.
- Центрифуги яточной подвески на 500 х г в течение 5 минут при комнатной температуре и отбросить супернатант.
- Разбавить клеточные гранулы с буферизированной средой культуры клеток(Таблица Материалов)дополнены 10% FBS к плотности посева 1,0 х 106 клеток/мл.
- Пипетка 50 зл клеточной подвески в каждой скважине 96 хорошо пластины и вернуть клетки в инкубатор.
- Инкубировать клетки при 37 градусах Цельсия под 5% CO2 на 10 ч.
2. Комплексный скрининг
- Во время инкубации разбавить скрининговые соединения(Таблица материалов)и растворитель (диметилсульфоксид (DMSO) при концентрации 13,5x. Например, если запас составляет 10 мМ, а концентрация скрининга составляет 10 мкм, добавьте 1 кЛ стокового раствора к 73,1 л буферизированной среды культуры клеток.
- Добавьте 12,5 л люминесцентного субстрата(Таблица материалов)к каждой скважине и инкубируйте в течение 5 минут при комнатной температуре.
ПРИМЕЧАНИЕ: Как отрицательный контроль, скважины на обоих концах пластины (т.е. колонны 1 и 12) не должны содержать люминесцентный субстрат. - Измерьте светимость исходного состава с помощью люминометра(Таблица материалов).
- Сразу же после первоначального измерения добавьте 5 зЛ соединений и контролируйте DMSO, разбавленное в шаге 2.1 к каждой скважине.
ПРИМЕЧАНИЕ: Окончательная концентрация будет 10 мкм. - Измерьте значения люминесценции каждые 30 минут в течение 2 ч.
ПРИМЕЧАНИЕ: Пластина должна быть инкубирована в темноте при комнатной температуре. - Рассчитайте ингибирующие эффекты по сравнению с контролем лечения ДМСО после нормализации к исходным сигналам.
ПРИМЕЧАНИЕ: Скрининг каждого соединения в дублировать или тройной может уменьшить вариации.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Репрезентативные результаты после использования этого протокола показаны на рисунке 2A,B. Соотношение сигнала к фону превышало 80, а коэффициент9 (индекс качества золотого стандарта для скрининга с высокой пропускной стоимостью) превышал 0,5, что свидетельствует о том, что эта система анализов является приемлемой для скрининга с высокой пропускной стоимостью. С пороговым набором для ингибирования в размере40%по сравнению с контролем (только DMSO), мы определили нитазоксанид в качестве кандидата препарата 7 . Используя эту систему, лучшие кандидаты наркотиков можно найти путем скрининга других, больших библиотек соединения.
Рисунок 1: Схематическое представление сплит-люциферазы анализа взаимодействия HBx-DDB1. (A) Принцип, лежащий в основе обнаружения связывания HBx-DDB1 с использованием разделенной системы дополнительного ассирования luciferase. Разделенные подразделения люциферазы, LgBit и SmBit, слиты с HBx и DDB1, соответственно. Взаимодействие HBx-DDB1 приводит подразделения в непосредственной близости, образуя функциональный фермент, который генерирует люминесцентный сигнал. Взаимодействие между подразделениями обратимо. (B) Сплит люциферазы ассси. После совместного трансфекции плазмидов для выражения HBx, слитого с LgBit и DDB1, слитых с SmBit, клетки были повторно посеяны в 96 хорошо пластины. Добавление люминесцентного субстрата позволяет измерять активность люциферазы без шага лиза клетки. Люцифераза деятельности могут быть измерены после добавления скрининговых соединений. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Успешные результаты сплит-люциферазы. (A) Представитель базовых люминесцентных сигналов от 96 хорошо пластины. Интенсивность люциферазы представлена числами и цветами. Колонны 1 и 12 являются элементами управления, в которые не был добавлен люминесцентный субстрат. Коэффициент кью превышал 0,5. (B) Представитель временных рядов в результате относительного уровня активности люциферазы после добавления скрининговых соединений в 96 хорошо пластины. X-ось представляет собой ингибирующие эффекты, рассчитанные по сравнению с контролем (DMSO) после стандартизации к исходной активности люциферазы. Наиболее эффективным соединением был нитазоксанид. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Мы разработали удобный метод скрининга с использованием разделенной люциферазы, чтобы найти ингибиторы связывания HBx-DDB1. Динамика взаимодействия может быть обнаружена в режиме реального времени в живых клетках без необходимости в клеточном лизах. Ингибирование взаимодействия HBx-DDB1 приводит к восстановлению Smc5/6, что приводит к подавлению вирусной транскрипции, экспрессии белка и выработке cccDNA7. Этот новый механизм противовирусного действия может преодолеть недостатки текущей терапии HBV.
Хотя ряд методов доступны для исследования белково-белковых взаимодействий в живых клетках, изучение этих взаимодействий остаются трудными10. Наша процедура проста и требует только короткого времени, чтобы экран один 96 хорошо пластины. Кроме того, качество скрининга было удовлетворительным с высоким баллом, индексом качества золотого стандарта для высокопроизводительного скрининга9. Наш ассс может подходить для роботизированной автоматизации11 и является эффективным асссеем для обнаружения наркотиков.
В то время как описанный здесь протокол использовал клеточную линию HEK293T, поскольку его высокая эффективность трансфекции и высокая способность к пролиферации подходят для скрининга с высокой пропускной способностью, этот метод скрининга может быть выполнен с использованием других клеточных линий (например, HepG2) без изменений7. В качестве реалистичной стратегии скрининговых соединений, HEK293T клетки могут быть использованы в первом скрининге следуют hepG2 клеток во втором скрининга проверки. Некоторые соединения могут не показывать значительные результаты в различных клеточных линиях, когда эффекты зависят от косвенных механизмов.
Поскольку наше намерение состояло в том, чтобы разработать метод скрининга с высокой пропускной приличностью, необходимы последующие исследования проверки, чтобы подтвердить, функционируют ли выявленные соединения в качестве ингибиторов взаимодействия. Снижение уровня люминесцентных сигналов в этом обследуется не всегда соответствует ингибированию взаимодействия HBx-DDB1. Тесты на цитотоксичность, исследования со-иммунопреципции и дальнейшие анти-HBV эксперименты важны для подтверждения эффектов7.
Хотя мы ранее определили нитазоксанид в качестве ингибитора взаимодействия HBx-DDB1 путем скрининга относительно небольшой степени соединения библиотеки7, дальнейшие исследования, связанные с скринингом гораздо больших библиотек соединения могут быть легко выполнены для выявления новых соединений, которые способны ингибирования белково-белковых взаимодействий более эффективно. При выполнении такого дальнейшего скрининга, нитазоксанид может быть использован в качестве положительного контроля для проверки. Кроме того, описанная здесь система может быть применена к другим белково-белковым взаимодействиям. Белково-белковые взаимодействия являются важным классом наркотиков цели12. Действительно, многие другие вирусы взаимодействуют с принимающими факторами, чтобы воспроизвести или выразить свою патогенность13,14. Разделенный анализ на основе люциферазы, описанный здесь, который нацелен на взаимодействие между вирусными и принимающими белками, может стать новой стратегией разработки методов лечения ВГВ и других инфекционных заболеваний.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Гранты в помощь от Министерства образования, Культура, спорт, наука и технологии, Япония (#19H03430 и #17K09405 до M.O., и #19J11829 к K.S.), грант-в-помощь для научных исследований по инновационным областям (#18H05024 к M.O.), по исследовательской программе по гепатиту от Японского агентства медицинских исследований и разработок, AMED (до M.O., #JP19fk021005), по программе по инновационному развитию и применению новых препаратов для борьбы с гепатитом B (#JP19fk0310102 к К.) грантов от AM Японский фонд прикладной энзимологии и от Фонда Кобаяси по онкологическим исследованиям (М.О.), GSK Japan Research Grant 2018 (к К.С.), а также грантом Мемориального исследовательского фонда Миякавы (К.С.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture microplate, 96 well, PS, F-BOTTOM | Greiner-Bio-One GmbH | 655098 | |
| DMEM | Sigma Aldrich | D6046 | |
| DMSO | Tocris Bioscience | 3176 | |
| Effectene transfection reagent | Qiagen | 301425 | Includes DNA-condensation buffer, enhancer solution and transfection reagent |
| FBS | Nichirei | 175012 | |
| GloMax 96 microplate luminometer | Promega | E6521 | |
| HBx–LgBit expressing DNA plasmid | Our laboratory | Available upon request | |
| HEK293T cells | American Type Culture Collection | CRL-11268 | |
| NanoBiT PPI starter systems | Promega | N2015 | Includes Nano-Glo Live Cell Reagent |
| Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific | 11058021 | Described as "buffered cell culture medium" in the manuscript |
| PBS | Takara | T900 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma Aldrich | P0781 | |
| Screen-Well FDA-approved drug library V2 version 1.0 | Enzo Life Sciences | BML-2841 | Compounds used here were as follows: mequinol, mercaptopurine hydrate, mesna, mestranol, metaproterenol hemisulfate, metaraminol bitartrate, metaxalone, methacholine chloride, methazolamide, methenamine hippurate, methocarbamol, methotrexate, methoxsalen, methscopolamine bromide, methsuximide, methyclothiazide, methyl aminolevulinate·HCl, methylergonovine maleate, metolazone, metyrapone, mexiletine·HCl, micafungin, miconazole, midodrine·HCl, miglitol, milnacipran·HCl, mirtazapine, mitotane, moexipril·HCl, mometasone furoate, mupirocin, nadolol, nafcillin·Na, naftifine·HCl, naratriptan·HCl, natamycin, nebivolol·HCl, nelarabine, nepafenac, nevirapine, niacin, nicotine, nilotinib, nilutamide, nitazoxanide, nitisinone, nitrofurantoin, nizatidine, nortriptyline·HCl, olsalazine·Na, orlistat, oxaprozin, oxtriphylline, oxybutynin Chloride, oxytetracycline·HCl, paliperidone, palonosetron·HCl, paromomycin sulfate, pazopanib·HCl, pemetrexed disodium, pemirolast potassium, penicillamine, penicillin G potassium, pentamidine isethionate, pentostatin, perindopril erbumine, permethrin, perphenazine, phenelzine sulfate, phenylephrine, phytonadione, pimecrolimus, pitavastatin calcium, and podofilox |
| SmBit–DDB1 expressing DNA plasmid | Our laboratory | Available upon request | |
| Trypsin-EDTA | Sigma Aldrich | T4049 |
References
- Tang, L. S. Y., Covert, E., Wilson, E., Kottilil, S. Chronic hepatitis B infection: a review. The Journal of the American Medical Association. 319, 1802-1813 (2018).
- Sekiba, K., et al. Hepatitis B virus pathogenesis: Fresh insights into hepatitis B virus RNA. World Journal of Gastroenterology. 24, 2261-2268 (2018).
- Slagle, B. L., Bouchard, M. J. Hepatitis B virus X and regulation of viral gene expression. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 6, a021402 (2016).
- Murphy, C. M., et al. Hepatitis B Virus X Protein Promotes Degradation of SMC5/6 to Enhance HBV Replication. Cell Reports. 16, 2846-2854 (2016).
- Decorsière, A., et al. Hepatitis B virus X protein identifies the Smc5/6 complex as a host restriction factor. Nature. 531, 386-389 (2016).
- Niu, C., et al. The Smc5/6 complex restricts HBV when localized to ND10 without inducing an innate immune response and is counteracted by the HBV X protein shortly after infection. PLoS One. 12, e0169648 (2017).
- Sekiba, K., et al. Inhibition of HBV Transcription From cccDNA With Nitazoxanide by Targeting the HBx-DDB1 Interaction. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 7, 297-312 (2019).
- Eggers, C. T., et al. NanoLuc Complementation Reporter Optimized for Accurate Measurement of Protein Interactions in Cells. ACS Chemical Biology. 11, 400-408 (2015).
- Zhang, J. H., Chung, T. D. Y., Oldenburg, K. R. A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays. Journal of Biomolecular Screening. 4, 67-73 (1999).
- Rao, V. S., Srinivas, K., Sujini, G. N., Kumar, G. N. Protein-protein interaction detection: Methods and analysis. International Journal of Proteomics. 2014. 2014, 147648 (2014).
- Michael, S., et al. A Robotic Platform for Quantitative High-Throughput Screening. ASSAY and Drug Development Technologies. 6, 637-657 (2008).
- Skwarczynska, M., Ottmann, C.
- de Chassey, B., Meyniel-Schicklin, L., Vonderscher, J., André, P., Lotteau, V. Virus-host interactomics: New insights and opportunities for antiviral drug discovery. Genome Medicine. 6, 115 (2014).
- Prasad, M., et al. Virus-Host Interactions: New Insights and Advances in Drug Development Against Viral Pathogens. Current Drug Metabolism. 18, 942-970 (2017).
