Summary
Stressende livshændelser svækker kognitiv funktion, hvilket øger risikoen for psykiatriske lidelser. Denne protokol illustrerer, hvordan stress påvirker kognitiv fleksibilitet ved hjælp af en automatiseret operant strategi skiftende paradigme i mandlige og kvindelige Sprague Dawley rotter. Specifikke hjerneområder, der ligger til grund for særlige adfærdsmønstre, diskuteres, og translationel relevans af resultater udforskes.
Abstract
Stress påvirker kognitiv funktion. Hvorvidt stress forbedrer eller forringer kognitiv funktion afhænger af flere faktorer, herunder 1) type, intensitet, og varighed af stressor; 2) type kognitiv funktion under undersøgelse; og 3) timing af stressor i forhold til at lære eller udføre den kognitive opgave. Desuden er kønsforskelle mellem virkningerne af stress på kognitiv funktion blevet bredt dokumenteret. Beskrevet her er en tilpasning af en automatiseret operant strategi skiftende paradigme for at vurdere, hvordan variationer i stress påvirker kognitiv fleksibilitet hos mandlige og kvindelige Sprague Dawley rotter. Specifikt, tilbageholdenhed stress bruges før eller efter træning i denne operant-baserede opgave at undersøge, hvordan stress påvirker kognitive præstationer hos begge køn. Særlige hjerneområder forbundet med hver opgave i dette automatiserede paradigme er veletablerede (dvs. den mediale præfrontale cortex og orbitofrontal cortex). Dette giver mulighed for målrettede manipulationer under eksperimentet eller vurdering af bestemte gener og proteiner i disse regioner efter afslutningen af paradigmet. Dette paradigme giver også mulighed for påvisning af forskellige typer af ydeevne fejl, der opstår efter stress, som hver især har defineret neurale substrater. Også identificeret er forskellige kønsforskelle i udholdenhedsfejl efter en gentagen tilbageholdenhed stress paradigme. Brugen af disse teknikker i en præklinisk model kan afsløre, hvordan stress påvirker hjernen og forringer kognition i psykiatriske lidelser, såsom posttraumatisk stresslidelse (PTSD) og større depressiv lidelse (MDD), som viser markante kønsforskelle i prævalens.
Introduction
Hos mennesker kan stressende livshændelser forringe kognitiv funktion (dvs. kognitiv fleksibilitet1), som angiver evnen til at tilpasse kognitive behandlingsstrategier til nye forhold i miljøet2. Svækkelse i kognition bunder og forværrer mange psykiatriske lidelser, såsom posttraumatisk stresslidelse (PTSD) og major depressiv lidelse (MDD)3,4. Disse lidelser er dobbelt så udbredt hos kvinder5,6,7,8, men det biologiske grundlag for denne forskel er stadig ukendt. Aspekter af udøvende funktion hos mennesker kan vurderes ved hjælp af Wisconsin Card Sortering Task, en demonstration af kognitiv fleksibilitet2. Ydeevnen i denne opgave er nedsat hos patienter med PTSD9 og MDD10, men det neurale grundlag for denne ændring kan kun undersøges ved hjernescanning11.
Fremskridt med at forstå, hvordan stress påvirker hjernen, er blevet gjort ved brug af dyremodeller, især gnavere. Da kognitiv fleksibilitet påvirkes af stressrelaterede sygdomme, er det en usædvanlig relevant fænotype at undersøge hos gnavere. Til dato har de fleste stress neurobiologi litteratur brugt en alternativ kognitiv fleksibilitet paradigme (undertiden benævnt grave opgave)12,13,14,15. Mens denne opgave er blevet grundigt undersøgt, kræver det mere tid og kræfter af eksperimentatoren at træne gnavere. Tilpasset og beskrevet her er en veletableret automatiseret set-shifting protokol16 til at vurdere kognitiv fleksibilitet hos mandlige og kvindelige Sprague Dawley rotter ved hjælp af forskellige stressmodeller17,18. Proceduren kræver minimalt tilsyn af eksperimentatoren og gør det muligt at teste flere rotter samtidigt. Hertil kommer, i modsætning til andre versioner af denne automatiserede opgave19, tilpasningen af dette paradigme kræver kun 3 dages træning og omfatter en effektiv programmeret dataanalyse.
Hvorvidt stress forbedrer eller forringer kognitiv funktion afhænger af stressorens type, intensitet og varighed samt timingen af stressoren i forhold til at lære eller udføre en kognitiv opgave20,21. Protokollen indeholder således stressprocedurer både før og efter operantuddannelsen. Den undersøger også repræsentative resultater fra stressundersøgelser. Desuden har de hjerneregioner, der ligger til grund for særlige aspekter af gearskiftet, været veletablerede2,16,22; rapporten beskriver således også, hvordan man målretter og vurderer bestemte hjerneområder under eller efter stress- og strategiskifteprocedurerne.
Der har været begrænset forskning i direkte undersøgelse af kønsforskelle i kognitiv fleksibilitet18,23. Protokollen beskriver, hvordan man 1) indarbejde både mandlige og kvindelige rotter i den eksperimentelle paradigme, derefter 2) spor estrous cykler før og under procedurerne i frit cykling hunner. Tidligere undersøgelser har vist, at stress før operant træning kan føre til kønsspecifikke underskud i kognitiv fleksibilitet hos rotter17. Især udviser kvindelige rotter forstyrrelser i kognitiv fleksibilitet efter stress, mens kognitiv fleksibilitet forbedres hos hanrotter efter stress17. Interessant nok er et stort kendetegn for stressrelaterede psykiatriske lidelser, som har en kønsdiskriminerende forekomst hos mennesker, kognitiv ufleksibilitet. Disse resultater tyder på, at kvinder kan være mere sårbare over for denne type kognitiv svækkelse end mænd. Brugen af disse teknikker i dyremodeller vil kaste lys over virkningerne af stress på hjernen, og hvordan det forringer kognition i psykiatriske lidelser hos mennesker.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedurer i denne undersøgelse blev godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) på Bryn Mawr College. Opnå IACUC eller på anden måde gældende myndighedsgodkendelse, før du bestiller forsøgsdyr og påbegynder forsøg.
1. Tilberedning af dyr
- Erhverve mandlige og kvindelige voksne Sprague Dawley rotter.
BEMÆRK: Rotterne kan leveres før 65 dage, men begynder først procedurer efter dette punkt for at sikre, at både mænd og kvinder er fuldt modne. - Parhus af samme køn rotter så længe som muligt, da langvarig isolation er en stressor24. For fødevarebegrænsning, singly hus rotter lige før operant strategi skiftende protokol.
- Efter 1 uges akklimatering begynder forsigtigt at håndtere rotter i 3-5 minutter om dagen. Saml kropsvægten af hver rotte. Derudover, hvis interesseret i at vurdere, hvordan gonadal hormoner kan påvirke resultaterne, indsamle vaginal lavage for kvindelige rotter (beskrevet i afsnit 2).
- Begræns (fra mad) dyr, der vil blive kørt i operant strategi skiftende paradigme mindst 3 dage før uddannelsen begynder, så de med succes lære opgaven. Sørg for, at vand altid er frit tilgængeligt. Der bør føres skriftlige optegnelser for hvert dyr for at dokumentere dagligt fødevare- og væskeforbrug, hydreringsstatus og eventuelle adfærdsmæssige og kliniske ændringer, der anvendes som kriterier for midlertidig eller permanent fjernelse af et dyr fra en protokol (Morton 2000; NRC 2003b).
- Hvis du anvender en stressprocedure i mere end 3 dage før træning, skal du justere fødevarebegrænsningen, så den svarer til antallet af stressdage (f.eks. 5 dages tilbageholdenhed plus fødevarebegrænsning25).
- Hver dag leverer 80% af det normale daglige fødeindtagelse (dvs. 4 g mad pr. 100 g kropsvægt)26. Brug den daglige vægt indsamling for rotten til at beregne, hvor meget mad til at give hver dag.
- Fortsæt fødevarebegrænsningen gennem trænings- og testdagene. Placer dog ikke mad i hjemmeburet, før rotten har afsluttet træning eller test for dagen, ellers vil de ikke være motiveret til at udføre opgaverne for en madpille belønning. Sørg for, at timingen af madlevering til rotter efter afslutningen af opgaven er temmelig uforudsigelig, da dette hjælper med at undgå reduceret motivation til at udføre i operantkammeret (til fordel for blot at vente på mad i hjemmeburet bagefter).
BEMÆRK: Dyr, der gennemgår tilbageholdenhedsstressparadigmet, udviser ikke betydeligt større vægttab end kontrol, ustresserede forsøgspersoner. Men, forskellige stress procedurer kan selv fremkalde vægttab, hvilket resulterer i rotter, der modtager mindre mad end unstressed kolleger under kropsvægt-baseret fødevarebegrænsning. Dette kan udgøre en yderligere, forvirrende stressor. Hvis dette synes at være tilfældet, alternativt bruge en fast mængde mad givet til hvert emne, uanset vægt27.
2. Vaginal lavage
BEMÆRK: Gonadalhormoner (dvs. østrogen og progesteron) er kendt for at påvirke stressresponset og kognitionen28,29,30. Disse hormoner svinger over den estrøse cyklus af kvindelige rotter31. Hvis du er interesseret i at spore den estrøse cyklus af frit cykling kvindelige gnavere til at korrelere med stress eller kognitiv fleksibilitet data, indsamle vaginal lavage som beskrevet nedenfor. Der foreligger ikke repræsentative data, der overvejer det estrøse cyklusstadium.
- For at opnå vaginal lavage prøver fra kvinder, samle varmt vand i et rent bægerglas, et glas pipette, en "lavage" dias (mikroskop dias med akrylmaling cirkler til at holde lavage prøve), og en tom bægerglas.
- Fyld pipetten med en lille mængde varmt vand (~ 0,5 mL), og indsæt derefter spidsen i skeden af den kvindelige rotte (ved at løfte ved halen). Udvis det sterile vand 2x-3x og udstød den opsamlede væske på et mikroskopisk dias. Overløb ikke lavage slide cirkel.
- Udvis overskydende væske i det tomme bægerglas. Mærk lavageslidte med rottenumre, og læg prøverne fra hver rotte i den rækkefølge, så det er klart, hvilken prøve der tilhører hver rotte.
- Skyl pipetten grundigt ved at pipetter rent varmt vand og dispensere det i "overskydende" bægerglas flere gange, før du fylder pipetten for at prøve den næste rotte.
- Forsigtigt bære lavage dias til et brightfield mikroskop til billede af lavage prøve og klassificere dagen inden for estrous cyklus som beskrevet i Becker et al31.
BEMÆRK: Ideelt set bør lavaging gøres i et par uger for korrekt at spore en kvindes cyklus og bør udføres på et meget lignende tidspunkt hver dag for at kontrollere for døgnrytmer. Denne procedure skal helst udføres før stress og operant strategiskifteprocedurer. Brugen af vatpinde og steril saltvand kan også bruges som et alternativ til denne øjendråber teknik. Data for hunrotter kan analyseres post hoc i henhold til estrous cyklus dag (overveje dage med cyklus, når stress udføres og / eller dag i cyklus, når test opstår).
3. Udstyr og software
- Brug operantkamre til adfærdstræning og test.
- Sørg for, at kamrene indeholder mindst to løftestænger, der kan trækkes tilbage, med to stimuluslys ovenfor, et huslys og en dispenser til forstærkning til disse opgaver.
- Kontroller, at håndtagene er på hver side af det centrale forstærkningsleveringsområde med et stimuluslys over hvert håndtag.
- Brug husets lys til at belyse kammeret uden at forstyrre påvisning af lys stimulus (det er bedst, hvis husets lys er på bagsiden af kammeret, modsat håndtag og stimulus lys).
- Brug støvfri mad pellets (her, 45 mg pellets anvendes: 18,7% protein, 5,6% fedt, og 4,7% fiber) for forstærkning i fødevarer-begrænset rotter. Brug ikke pellets med højt indhold af saccharose eller fedt (medmindre der er interesse for, hvordan stress påvirker velsmagende fødeindtagelse).
- Kontroller præsentationen af stimuli, løftestangdrift og dataindsamling fra en computer med software, der kan betjene kammeret (Materialetabel).
BEMÆRK: Kontakt forfatterne for at få oplysninger om kodning af programmer, der bruger denne software. MED-PC scripts er inkluderet som supplerende filer. Denne software indsamler oplysninger om dyrets svar for hvert forsøg (hvilket håndtag er trykket, om det er korrekt / forkert / intet svar, og ventetid at træffe valget). Ud fra disse oplysninger kan brugerne beregne forskellige målpunkter i adfærdsparadigmet som beskrevet i afsnittet adfærdsanalyse. - Udfør træning/test på samme tidspunkt hver dag for at kontrollere for døgnrytmer i stresshormoner32 (og andre relevante foranstaltninger).
- Fyld den nederste bakke i hver operantkasse med frisk strøelse for at indsamle afføring / affald. Efter hver session skal du dumpe hver bakke, rengøre bakker og kammerinteriør med alkoholservietter eller et IACUC-godkendt desinfektionsmiddel og erstatte med frisk strøelse, før du placerer et nyt dyr i kammeret.
4. Stressprocedurer
- Beslut, om stressproceduren skal udføres før, under og/eller efter træning i det operant strategiskiftende paradigme (f.eks. 5 dages tilbageholdenhedsstress før 3 dages operanttræning vs. 3 dages operanttræning efterfulgt af en enkelt tilbageholdenhed og test).
- Udfør stressproceduren på samme tid dagligt med hensyn til operant træning. (f.eks. 30 minutters tilbageholdenhedsstress, der starter ved 9 A.M., efterfulgt af placering i operantkammeret).
- Udfør stressprocedurerne i et separat rum fra både kolonirummet og strategiskiftende paradigmerum (for at sikre, at der ikke er forvirrende faktorer forbundet med vidnestress)33. Kort, placere rotten i en Kost-stil gennemsigtig fastholdelsesrør og forsegle åbningen, passe på ikke at klemme lemmer eller hale. Mellem hvert emne skal du bruge et IACUC-godkendt desinfektionsmiddel til at rengøre røret i kost-stil. Forkert sanitisering kan efterlade feromoner, der kan påvirke testprotokollen negativt.
BEMÆRK: Vurder, hvor længe den første gruppe rotter vil tilbringe i operantkamrene. Dette vil variere afhængigt af træning vs. testdag; Men efter at have kørt flere kohorter kan der beregnes en gennemsnitlig tid til at fuldføre hver opgave for at estimere fremtidige opgaver. - Afhængigt af hvor mange operantkamre der er tilgængelige, skal du forskud stressproceduren for forsøgspersoner. For eksempel gennemgår fire rotter tilbageholdenhedsstress og placeres i fire operantkamre. En time senere gennemgår yderligere fire dyr stressprocedurer, der skal følges af operanskammeret.
5. Uddannelse
BEMÆRK: Dette paradigme er ændret fra operant sæt-shifting procedure udviklet af Floresco et al. således at det kan være afsluttet i 3 dage19. Træningsprocedurer for rotter kræver 3 dage (1 dag for at lære hver opgave som beskrevet nedenfor). Det er sjældent, at en rotte ikke lærer disse opgaver. Hvis en rotte ikke lærer hver opgave at lære, bør den udelukkes fra den endelige undersøgelse. Se figur 1A for en visuel skildring af det træningsparadigme, der er beskrevet nedenfor.
- Før du placerer rotten i kammeret, skal du sørge for, at der er nok madpiller i dispenseren, og at operantkasserne fungerer korrekt. For at opnå dette skal du indlæse og starte et trænings- eller testdagsprogram i et tomt kammer og manuelt teste, at det korrekte håndtag korrekt leverer en belønning pr. løftestangpresse.
- Træning af rotten til at trykke på hvert håndtag
- Før du placerer rotten i kassen til den første træningsdag, skal du manuelt indstille en madpillebelønning på det korrekte håndtag, som udpeget ved indlæsning af træningsproceduren i hvert kammer.
- Træn rotten ved hjælp af en fast forholdsplan (FR-1), således at hver korrekt løftestangpresse belønnes med en forstærkning. Modvægt den korrekte løftestang om dagen på tværs af forsøgspersoner og/eller forsøgsforhold (forme kun én løftestang ad gangen) ved at udpege den korrekte løftestang ved indlæsning af træningsproceduren på den computer, der betjener kamrene.
- Lad rotten trykke på håndtaget, indtil det når kriteriet ved at trykke på det korrekte håndtag 50x, som regel fuldføre opgaven mellem 30-45 min.
- Den følgende dag tvinge rotten til at udføre denne opgave på den modsatte løftestang ved hjælp af det samme program som den første dag i uddannelse, men udpege den modsatte løftestang som den rigtige. Der er ingen grund til at "forme" håndtaget med en madpille på denne træningsdag. Typisk erhverves dette kriterium hurtigt, efter at rotter har lært at trykke på den første håndtag.
- Træning af rotten til at reagere på lyssignalet
- På den tredje træningsdag skal du belyse lyset over begge håndtag til 15 s forsøg, hvor rotten kan trykke på en af håndtaget for potentielt at modtage en madpille belønning. Under let diskrimination opgave, vil dette program tilfældigt vælge, hvilken løftestang er korrekt på en trial-by-trial basis.
- Hvis rotten trykker på det korrekte håndtag, skal du sørge for, at lysene forbliver tændt i 3 s, og belønningen leveres, efterfulgt af en periode på 5 sekunder, hvor lysene slukkes forud for næste forsøg. Hvis rotten trykker på det forkerte håndtag, skal du sørge for, at der ikke leveres nogen belønning, og at lyset er slukket i 10 s forud for næste forsøg.
- Efter denne sidste dag i uddannelse, beregne "side bias" for at afgøre, om rotten har en præference for venstre eller højre håndtag ved at dividere antallet af presser på en løftestang divideret med det samlede antal håndtag presser. På testdagen starter rotten på sin mindst foretrukne side for at sikre, at den lærer den specifikke beredskabsbelønning i stedet for at reagere på en foretrukken løftestang.
6. Test
BEMÆRK: Se figur 1B for en visuel skildring af testparadigmet beskrevet nedenfor.
- På dag 4 (testdag) placeres rotten i operantkammeret efter stressprocedurer og tester dem i sidediskrimination, sideskift og lette diskriminationsopgaver serielt. Sørg for, at lysdiskriminationsopgaven kun lyser lyset over den "korrekte" løftestang. I hver opgave skal rotter fortløbende opnå otte korrekte forsøg for at fuldføre hver forskelsbehandling uden at trykke på den ikke-tilbagevendte, forkerte løftestang. En forkert løftestangpresse nulstiller denne kæde af forsøg.
- Test rotter ved hjælp af sidediskriminationsopgaven. Brug sidediskriminationsprogrammet, belønne rotten for at trykke på håndtaget på sin mindst foretrukne side som bestemt fra den tredje træningsdag, uanset lyssignalet. Opgaven slutter ved at trykke på den korrekte løftestang 8x fortløbende (undtagen udeladelser).
- Udfør side tilbageførsel test ved at køre rotter ved hjælp af side diskrimination program igen, men denne gang udpege håndtaget modsat den korrekte fra siden diskrimination opgave som korrekt. Sørg for, at rotten belønnes for at trykke på dette håndtag, uanset lyssignalet. Opgaven slutter ved at trykke på den korrekte løftestang 8x fortløbende (undtagen udeladelser).
- Udfør lysdiskriminationsopgaven, som belønner rotten for at trykke på håndtaget med lyset belyst ovenfor. Hver operanttest er afsluttet, når du trykker på den korrekte løftestang 8x fortløbende (undtagen udeladelser).
BEMÆRK: Baseret på tidligere undersøgelser koder disse opgaver mindst 30 forsøg, uanset på hinanden følgende presser, for at sikre, at rotter har tilstrækkelig tid til at lære reglerne for hver opgave18. Således, hvis rotten fortløbende opnår otte korrekte forsøg, før 30 forsøg har fundet sted, vil opgaven forblive engageret, indtil 30 forsøg er afsluttet.
7. Adfærdsanalyse
BEMÆRK: De data, der er erhvervet for hvert dyr på testdagen, registreres og gemmes automatisk af computeren, så længe et MED-PC-script til hver opgave er startet og har tilladelse til at fuldføre (se supplerende materialer til MED-PC-scripts).
- Åbn dataene for hver testdagsopgave (sidediskrimination, sidediskrimination og let diskrimination) ved hjælp af computerprogrammet. De vigtigste foranstaltninger, der registreres af programmet, er forsøg med kriterium, fejl i kriterium og tid til kriterium. Disse foranstaltninger er beskrevet i detaljer nedenfor.
BEMÆRK: Forfatterne har genereret et MATLAB-script, der giver mulighed for automatisering af analyseprocessen samt analyse af vedholdende vs. regressive fejl (kontaktforfattere til kodeoplysninger for at strømline dataanalyse).- Brug forsøg til kriterium (som henviser til det samlede antal forsøg [ikke inklusive udeladelser], der er nødvendige for, at rotten kan gennemføre otte korrekte forsøg, herunder disse otte forsøg) som den vigtigste indikator for nøjagtighed. Disse data er placeret i den første kolonne i matrix B i en datafil, der genereres af MED-PC-scriptet til en af opgaverne på testdagen.
- Undersøg de samlede fejl, der er begået under hver opgave. Disse data er placeret i den tredje kolonne i matrix B i en datafil, der genereres af MED-PC-scriptet til en af opgaverne på testdagen. Disse fejl er også kategoriseret i vedholdende eller regressive fejl. Der begås udholdenhedsfejl, når rotten fortsætter med at følge den tidligere regel fra den forrige opgave. Regressive fejl begås, efter at den er frakoblet den tidligere regel, men fortsætter med at forsøge at erhverve den nye regel (for flere detaljer om, hvordan disse typer fejl beregnes, henvises til den offentliggjorte metode18).
- Hvis rotten ikke reagerede på en lys cue inden for 15 s, er forsøget kategoriseret som en udeladelse, og det vil ikke tælle med i det samlede antal forsøg til kriterium. Beregn dette ved først at sammenkregne antallet af korrekte svar (placeret i den anden kolonne i matrix B i datafil) og antallet af fejl (placeret i den tredje kolonne i matrix B i datafil). Træk derefter dette tal fra det samlede antal forsøg til kriterium (dette er det sidste tal i den første kolonne i matrix B i en datafil, der er forskellig fra forsøg til kriterium).
- Brug start- og sluttidspunkter, der er registreret af programmet (placeret øverst i en datafil, der genereres af MED-PC-scriptet til en af opgaverne på testdagen) til at beregne tid til kriterium. Ventetiden for den første løftestangpresse kan også beregnes ud fra datafilen ved at trække variablen K (forløbet tid i sekunder fra den første løftestangpresse) fra tid til kriterium.
- Gennemsnitlig data for hver adfærdsmæssig foranstaltning for rotter inden for samme behandlingsgruppe. Udfør passende statistiske analyser (afhængigt af hvor mange variabler der undersøges).
8. Hjernesubstrater
- Bestem et interesseret hjerneområde og / eller aspekt af kognitiv fleksibilitet. For eksempel, hvis stress øger udholdenhedsfejl i side tilbageførselsopgaven, kan orbitofrontal cortex (OFC) være af særlig interesse, da tidligere læsionundersøgelser har indikeret, at denne hjerneregion spiller en rolle i mange former for omvendt læring (dvs. rumlig vending testet i sidesvendingsopgaven)34,35,36. I dette eksempel, ofre rotter efter strategien skiftende paradigme er afsluttet og undersøge c-fos (måling af neural aktivering37) i OFC ved hjælp af beskrevet immunohistokemiske metoder25 og beskrevet kort her.
- Først udtrække hjerner fra dyr og skæres i 40 μm skiver.
- Vask vævet i fosfat-buffered saltvand (PBS) 4x i 5 min hver, derefter inkuberes i 0,3% hydrogenperoxid i 10 min for at slukke endogene peroxidaser.
- Vaskevæv i PBS 2x i 5 min hver, derefter inkubere i mus anti-c-fos primære antistof (1:500), 3% normal æsel serum (NDS), og 0,3% Triton X natten.
- Den næste dag, vaske væv i PBS 3x i 5 min hver, derefter inkubere i biotin-SP-konjugeret æsel anti-mus sary antistof (1:500) i 2 timer.
- Vask væv i PBS 3x i 5 min hver, derefter inkuberes i avidin-streptavidin AB kompleks i 1 time.
- Vaskevæv i PBS 3x i 5 min hver, derefter inkuberes i DAB-opløsning i op til 10 min som væv gennemgår en oxidation kromogen reaktion.
- Vask væv i PBS 3x i 5 min hver, derefter montere hjernen skiver på glas mikroskop dias.
- Coverslip vævet ved hjælp af toluen baseret montering medium og billede ved hjælp af en brightfield mikroskop.
BEMÆRK: Her, som afspejlet i de repræsentative resultater, ofres rotter 30 min efter strategiskifteparadigmet slutter, ca. 60-90 minutter efter tilbageførselsopgaven er afsluttet (afhængigt af hver rottes præstation i lysopgaven). Dette bør repræsentere optimal timing for c-fos udtryk38, afspejler ydeevne i tilbageførsel opgave.
- Alternativt kan man udfylde et bestemt hjerneområde til lægemiddelindsprøjtning eller viral injektion forud for udførelsen af stress eller det operanerede strategiskiftende paradigme.
BEMÆRK: Forskere ønsker måske at undersøge, hvordan manipulere neurale substrater ændrer virkningerne af stress på kognitiv fleksibilitet. For eksempel, forskere kan blokere en bestemt neurotransmitter receptor i præfrontale cortex før test.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den tilpassede automatiserede operant strategi skiftende paradigme skitseret ovenfor blev brugt til at afgøre, om gentagen tilbageholdenhed stress påvirker kognition hos mandlige og kvindelige Sprague Dawley rotter. Repræsentative adfærdsdata er beskrevet i figur 2 nedenfor. Kort sagt udførte kontrol og gentagne gange beherskede rotter denne operant strategiskiftetest, som bestod af en række opgaver: sidediskrimination, sideskift og let diskrimination.
Forsøg med kriterium for hver opgave er afbildet i figur 2A. Typisk var bedre ydeevne på hver opgave repræsenteret ved et reduceret antal forsøg til kriterium. Disse data tyder på, at efter akut tilbageholdenhed, mænd afsluttet side vending opgave i betydeligt færre forsøg end unstressed, kontrol mænd. Omvendt krævede stressede kvinder et betydeligt større antal forsøg for at fuldføre side tilbageførselsopgaven. Disse resultater tyder på, at mænd udviste forbedret ydeevne efter stress, mens kvinder udviste nedsat ydeevne. I lyset af diskriminationsopgaven øgede stress antallet af forsøg til kriterium sammenlignet med kontrol af kvinder og forringede derved ydeevnen hos kvinder, men ikke mænd i denne opgave.
Det samlede antal fejl, der er foretaget for hver opmærksomhedsopgave, er afbildet i figur 2B. I overensstemmelse med antallet af forsøg til kriterium, understregede mænd lavet betydeligt færre fejl end kontrol mænd, mens stressede kvinder lavet flere fejl i side vending opgave. I forbindelse med opgaven med lettere forskelsbehandling begik kvinder desuden også betydeligt flere fejl. Sammenfattende tyder disse data på, at gentagen stress forbedrer kognitiv ydeevne hos mænd, men forringer kognitiv ydeevne hos kvinder.
Totalfejl blev yderligere kategoriseret i vedholdende eller regressive fejl i figur 2C (for en sondring mellem disse to typer fejl henvises til protokollens afsnit 7). Interessant nok lavede stressede mænd færre udholdenhedsfejl i sideskifteopgaven end kontrol af mænd. På den anden side, i både side vending og lys diskrimination opgaver, understregede kvinder lavet et større antal udholdenhedsgivende fejl end kontrol kvinder. Der var ingen forskelle mellem behandlingsgrupperne i antallet af regressive fejl, der blev begået under begge opgaver.
Udeladelser i hvert forsøg og tidspunkt for at nå kriterium er vist i figur 2D (for mere information om, hvordan disse blev beregnet, henvises til afsnit 7 i protokollen). Disse foranstaltninger blev kun evalueret i side tilbageførselsopgaven, da denne opgave udviste de største kønsforskelle. Stressede kvinder lavede en højere procentdel af udeladelser sammenlignet med alle andre behandlingsgrupper. Hertil kommer, mens stress syntes at reducere tiden til at fuldføre side tilbageførselsopgaven hos mænd, stress langvarig færdiggørelse af opgaven hos kvinder. Alt i alt forringede gentagen stress kognitiv fleksibilitet hos kvinder, men ikke mænd.
Hjernesubstrater, der ligger til grund for kognitiv fleksibilitet, er afbildet i figur 3. Da der blev observeret skarpe kønsforskelle i sidesvendingsopgaven, blev de hjerneområder, der ligger til grund for denne opgave, undersøgt for at afgøre, om de udviste lignende kønsforskelle i neural aktivitet. Som tidligere diskuteret, har læsion undersøgelser vist, at orbitofrontal cortex (OFC) medierer side tilbageførsel opgave34. Således c-fos, et mål for neural aktivering37, blev mærket i OFC på 30 min efter afslutningen af strategiskift, som burde have afspejlet ydeevne i side vending opgave38. Det er dog muligt , at OFC også kan spille en rolle i den ekstradimensionale strategiskiftkomponent i denne opgave39. Det er således vigtigt at udføre ofringen på det rette tidspunkt for at afspejle hjerneaktivitet under en bestemt opgave inden for det operante strategiskiftende paradigme. Her fremkaldte stress en betydelig stigning i neuronal aktivering hos OFC hos mænd sammenlignet med kontroller. Men, stress induceret et betydeligt fald i neuronal aktivering i OFC af kvinder i forhold til kontrol. Desuden var OFC-aktivering og forsøg med kriterium negativt korreleret; specifikt var højere OFC-aktivering forbundet med færre forsøg til kriteriet. I modsætning hertil var der ingen sammenhæng mellem OFC aktivering og ydeevne hos kvinder, hvilket tyder på, at OFC blev frakoblet under disse forestillinger.
Figur 1: Skematisk for operant strategi skiftende paradigme under uddannelse og test dage.
Figur 2: Repræsentative adfærdsdata fra operant strategi skiftende paradigme. (A) Forsøg med kriterium for hver opgave på testdagen. I side vending opgave, stress forbedret ydeevne hos mænd, men nedsat ydeevne hos kvinder. I lysdiskriminationsopgaven svækkede stress ydeevnen hos kvinder, mens det ikke påvirkede mænd. (B) Antal fejl for hver opgave på testdagen. Stress reducerede antallet af fejl hos mænd, men øgede fejl hos kvinder i både side vending og let diskrimination opgaver. (C) Udholdenhed og regressiv fejlkategorisering. Stress faldt udholdende fejl hos mænd, men øgede udholdenhedsfejl hos kvinder i både side vending og lys diskrimination opgaver. (D) Procentforsøg udeladt og tid til kriterium i side tilbageførsel opgave. Stress øgede procent udeladelser hos hunrotter. Stress faldt den tid, der kræves af mænd, men øgede den tid, der kræves af kvinder til at fuldføre opgaven. Statistikker blev beregnet ved hjælp af tovejs ANOVA efterfulgt af Tukeys t-test (n = 12 rotter pr. gruppe; fejllinjer repræsenterer SEM; #p ≤ 0,10, * p < 0,05). Dette tal er blevet ændret fra en tidligere publikation17. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Repræsentativ neural aktivering efter operant strategi skiftende paradigme. (A) OFC-aktivering efter strategiskifteopgave. Repræsentative billeder af immunohistokemisk 3,3'-diaminobenzidin (DAB) farvning ved hjælp af et antistof mod c-fos i OFC visualiseret ved hjælp af brightfield mikroskopi, derefter kvantificeret. Stress signifikant øget aktivering (demonstreret af antallet af c-fos-udtrykkende celler) i OFC af mænd, mens det faldt aktivering hos kvinder. Skalalinjen i billedpanelet nederst til højre repræsenterer 200 μm. Statistikker blev beregnet ved hjælp af tovejs ANOVA efterfulgt af Tukeys t-test (n = 12 rotter pr. gruppe, 6-8 afsnit af OFC analyseret pr. rotte; fejllinjer repræsenterer SEM; * p < 0,05). (B) Forsøg til kriterium i side tilbageførsel opgave korreleret med OFC aktivering. Mænd viste en signifikant negativ korrelation, mens kvinder ikke gjorde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollen viser, hvordan man måler virkningerne af stress på kognitiv funktion. Specifikt anvendes et modificeret operant strategiskifteparadigme hos gnavere, som måler kognitiv fleksibilitet (svarende til Wisconsin Card Sorteringsopgaven hos mennesker)1. Kognitiv fleksibilitet angiver evnen til at tilpasse kognitive behandlingsstrategier til nye forhold i miljøet, og det er afgørende for normal daglig funktion2. Da humane undersøgelser af kognitiv fleksibilitet for det meste er begrænset til hjernescanning11, vil brugen af dette paradigme hos dyr i høj grad fremme forståelsen af virkningerne af stress på hjernen og kognition.
Stress kan forringe kognitiv funktion40. Faktisk er dette en af de mest almindelige fænotyper i stressrelaterede sygdomme som PTSD og MDD3,41. Desuden er der stærke kønsforskelle i forekomsten af stressrelaterede psykiatriske sygdomme5,6,7, men der er ringe forståelse for neurobiologien bag disse forudindtagede hændelser. Således kan brugen af denne operant strategi skiftende paradigme i dyr af begge køn bidrage til at fremme den nuværende forståelse af kønsforskelle i psykiatrien.
Denne operant strategi skiftende opgave giver forskerne mulighed for at undersøge centrale aspekter af kognition er relevante for psykiatriske lidelser. For eksempel beregnes der udholdenhedsfejl efter eksperimentel manipulation i dette paradigme. Udholdenhed observeres i stressrelaterede psykiatriske lidelser som PTSD, og det svækker ens evne til at lære et nyt sæt regler, hvilket i sidste ende forringer arbejdshukommelsen3. Målingen af udholdenhedsfejl er således translationelt relevant. Desuden er der konstateret udeladelser i opmærksomhedsopgaver hos patienter med PTSD, hvilket indikerer langsommere kortikale behandling3. Derfor kan udeladelsesdata fra dette paradigme have kliniske modstykker. Alt i alt kognitiv fleksibilitet målt som ved dette eksperimentelle paradigmemodeller nøglefænotyper, der observeres i psykiatriske lidelser.
Dette eksperimentelle paradigme giver også mulighed for præcision i at målrette neurale substrater underliggende kognitiv fleksibilitet. For eksempel har litteraturen indikeret, at den præfrontale cortex (PFC) er en afgørende hjerneregion for kognitiv fleksibilitet3, herunder den mediale præfrontale (mPFC) og orbitofrontal cortex (OFC). Af disse underregioner i PFC er OFC vigtig for ydeevnen i side tilbageførselsopgaven34,35. Disse hjerneområder er også et centralt mål for stress-inducerede funktionelle ændringer42,43. Interessant nok ser den stressmodel, der anvendes her, ud til at spille en rolle i gnaveres efterfølgende præstation i test af kognitiv fleksibilitet; det bør derfor overvejes i udformningen af fremtidige eksperimenter. Disse forskellige reaktioner på stress peger på potentielt nye mekanismer, hvorved kognition påvirkes af stress. Således, målretning specifikke neurotransmittere, proteiner, eller aktivering af disse hjerneområder kan kaste lys over, hvordan stress påvirker kognition hos mandlige og kvindelige gnavere. Forskere kan vælge at manipulere disse neurale substrater på forskellige tidspunkter i forbindelse med stress eller strategiskift, eller alternativt måle neurale substrater efter eksponering for disse adfærdsmæssige paradigmer.
Denne modificerede operant strategi skiftende opgave har klare fordele i forhold til andre kognitive fleksibilitet paradigmer, der anvendes i stress litteratur (dvs. grave opgave12,13,14,15), som kræver mere tid og kræfter af eksperimentatoren til at træne gnavere. Denne procedure kræver minimalt tilsyn af eksperimentatoren og gør det muligt at teste flere rotter samtidigt. Hertil kommer, i modsætning til andre versioner af denne automatiserede opgave19, paradigmet kræver kun 3 dages træning og omfatter en effektiv programmeret dataanalyse.
Den operant strategi skiftende paradigme har visse begrænsninger. En begrænsning er, at den kun kan teste to stimulusdimensioner (f.eks. venstre eller højre håndtag vs. lyssignal), mens graveopgaven12,13,14,15 kan teste en tredje stimulusdimension (f.eks. gravemedier vs. lugt vs. tekstur). Men den opgave, der er beskrevet i denne protokol, giver stadig mulighed for at teste rottens evne til at skifte til forskellige regler, hvilket gør det muligt at teste de kognitive fleksibilitetskonstruktioner. Derudover er det muligt at tilføje andre parametre til operantkamrene for at give mulighed for en tredje stimulus (f.eks. en lugt), men dette kan forlænge den træning, der kræves til opgaven.
Den primære fordel ved denne opgave er dens enkelhed og evne til at parre den med stressende eller farmakologiske manipulationer for yderligere at forstå, hvordan stress påvirker hjernen. Det skal bemærkes, at denne enkelhed kommer med en øget vanskelighed, som fagene står over for, mens de lærer at løfte pressen, sammenlignet med den økologisk relevante graveopgave. Mens denne operant opgave er langt mindre arbejdskrævende, gnavere vil generelt kræve flere forsøg for at erhverve denne opgave. Men både graveopgaven og dette paradigme engagerer lignende neurobiologiske mekanismer og repræsenterer således gyldige muligheder for undersøgelse af kognitiv fleksibilitet16,44. Mens der har været forskellige resultater i litteraturen om virkningerne af stress på kognitiv fleksibilitet ved hjælp af graveopgaven og denne operantprocedure23,25,27,45,46, afspejler den præsenterede metode de komplekse virkninger, som typen, intensiteten og varigheden af en stressor kan have på kognitiv funktion20,21.
En anden begrænsning af opgaven er, at gnavere er anbragt i lukkede uigennemsigtige kasser; således kan andre funktionsmåder end dem, der indsamles via computergrænsefladen, ikke kodes. For eksempel kan et stort antal udeladelser fra en rotte skyldes adfærdsmæssig hæmning forårsaget af stress, eller fordi rotten sover. Desuden kan andre stereotype adfærd, såsom grooming (som er særligt relevant i at studere stress), være interessant at analysere under opgaven. Montering kameraer i operant kamre kan give mulighed for denne type adfærdsmæssige præcision.
Samlet set beskriver denne rapport brugen af stressprocedurer i forbindelse med et operant strategiskiftende paradigme for yderligere at forstå, hvordan stress påvirker hjernen. Det skal bemærkes, at ud over stressprocedurer og kognitiv vurdering hos voksne kan forskning i forskellige udviklingsstadier give afgørende oplysninger om ætiologien af kognitiv ufleksibilitet. Ud over at studere virkningerne af stress på kognitiv fleksibilitet kan dette enkle og effektive operant strategiskiftende paradigme parres med mange eksperimentelle manipulationer for at undersøge, hvordan hjernen tilpasser sig skiftende miljøer. Desuden kan alternative eksperimentelle tilgange bruges til at studere det neurale grundlag for kognitiv fleksibilitet, herunder læsioner, farmakologi, genredigering og elektrofysiologi. Da kognitiv ufleksibilitet er en af de vigtigste fænotyper i psykiatrisk sygdom, skal der udføres mere forskning for yderligere at forstå dens neurobiologiske substrater.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke Hannah Zamore, Emily Saks og Josh Searle for deres hjælp til at etablere denne operant strategi skiftende paradigme i Grafe lab. De vil også gerne takke Kevin Snyder for hans hjælp med MATLAB-koden til analyse.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3 inch glass pipette eye droppers | Amazon | 4306-30-012LC | For vaginal lavage |
| Alcohol Wipes | VWR | 15648-990 | To clean trays in set shifting boxes between rats |
| Biotin-SP-conjugated AffiniPure Donkey Anti-Mouse lgG (H+L), minimal cross reaction to bovine, chicken, goat, guinea pig, hamster, horse, human, rabbit, sheep serum proteins | Jackson ImmunoResearch | 715-065-150 | All other DAB protocol staining materials are standard buffers/DAB and are not specified here, as this is not the main focus of the methods paper |
| C-fos mouse monoclonal primary antibody | AbCam | ab208942 | To stain neural activation in brain areas after set shifting |
| Dustless Food Pellets | Bio Serv | F0021 | For set shifting boxes (dispenser for reward) |
| GraphPad Prism | Used for data analysis | ||
| Leica DM4 B Microscope and associated imaging software | Leica | Lots of different parts for the microscope and work station, for imaging lavage and/or cfos | |
| MatLab | Software; code to help analyze set shifting data, available upon request. | ||
| Med-PC Software Suite | Med Associates | SOF-736 | Software; uses codes to operate operant chambers |
| Operant Chambers | Med PC | MED-008-B2 | Many different parts for the chamber set up and software to work with it; we also wrote a separate code for set shifting, available upon request. |
| Rat Bedding | Envigo | T.7097 | |
| Rat Chow | Envigo | T.2014.15 | |
| Restraint Devices | Bryn Mawr College | Made by our shop | For stress exposure; specifications available upon request. |
| Scribbles 3d fabric paint | Amazon | 54139 | For vaginal lavage |
| Sprague Dawley Rats | Envigo | At least D65 Males and Females | |
| VWR Superfrost Plus Micro Slide | VWR | 48311-703 | For vaginal lavage and/or brain slices/staining for c-fos |
References
- Hurtubise, J. L., Howland, J. G. Effects of stress on behavioral flexibility in rodents. Neuroscience. 345, 176-192 (2016).
- Bissonette, G. B., Powell, E. M., Roesch, M. R. Neural structures underlying set-shifting: Roles of medial prefrontal cortex and anterior cingulate cortex. Behavioural Brain Research. 250, 91-101 (2013).
- Vasterling, J. J., Brailey, K., Constans, J. I., Sutker, P. B. Attention and memory dysfunction in posttraumatic stress disorder. Neuropsychology. 12 (1), 125-133 (1998).
- Bangasser, D. A., Kawasumi, Y. Cognitive disruptions in stress-related psychiatric disorders: A role for corticotropin releasing factor (CRF). Hormones and Behavior. 76, 125-135 (2015).
- Nestler, E. J., et al.
- Keane, T. M., Marshall, A. D., Taft, C. T. Posttraumatic stress disorder: etiology, epidemiology, and treatment outcome. Annual Review of Clinical Psychology. 2, 161 (2006).
- Seeman, M. V. Psychopathology in women and men: focus on female hormones. The American Journal of Psychiatry. 154 (12), 1641-1647 (1997).
- Hodes, G. E., Epperson, C. N. Sex Differences in Vulnerability and Resilience to Stress Across the Life Span. Biological Psychiatry. 86 (6), 421-432 (2019).
- Monika, T. -B., Antoni, F., Piotr, G., Marian, M., Krzysztof, Z. Wisconsin Card Sorting Test in psychological examination of patients with psychiatric disorders. Polski merkuriusz lekarski: organ Polskiego Towarzystwa Lekarskiego. 25, Suppl 1 51-52 (2008).
- Merriam, E. P., Thase, M. E., Haas, G. L., Keshavan, M. S., Sweeney, J. A. Prefrontal cortical dysfunction in depression determined by Wisconsin Card Sorting Test performance. The American Journal of Psychiatry. 156 (5), 780-782 (1999).
- Monchi, O., Petrides, M., Petre, V., Worsley, K., Dagher, A. Wisconsin Card Sorting revisited: distinct neural circuits participating in different stages of the task identified by event-related functional magnetic resonance imaging. The Journal of Neuroscience: the Official Journal of the Society for Neuroscience. 21 (19), 7733-7741 (2001).
- Bulin, S. E., Hohl, K. M., Paredes, D., Silva, J. D., Morilak, D. A. Bidirectional optogenetically-induced plasticity of evoked responses in the rat medial prefrontal cortex can impair or enhance cognitive set-shifting. eNeuro. 7 (1), 0363 (2019).
- Chaby, L. E., Karavidha, K., Lisieski, M. J., Perrine, S. A., Liberzon, I. Cognitive Flexibility Training Improves Extinction Retention Memory and Enhances Cortical Dopamine With and Without Traumatic Stress Exposure. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 13, 24 (2019).
- Drozd, R., Rojek-Sito, K., Rygula, R. The trait 'pessimism' does not interact with cognitive flexibility but makes rats more vulnerable to stress-induced motivational deficits: Results from the attentional set-shifting task. Behavioural Brain Research. 335, 199-207 (2017).
- Birrell, J. M., Brown, V. J. Medial frontal cortex mediates perceptual attentional set-shifting in the rat. The Journal of Neuroscience: the Official Journal of the Society for Neuroscience. 20 (11), 4320-4324 (2000).
- Floresco, S. B., Block, A. E., Tse, M. T. L. Inactivation of the medial prefrontal cortex of the rat impairs strategy set-shifting, but not reversal learning, using a novel, automated procedure. Behavioural Brain Research. 190 (1), 85-96 (2008).
- Grafe, L. A., Cornfeld, A., Luz, S., Valentino, R., Bhatnagar, S. Orexins Mediate Sex Differences in the Stress Response and in Cognitive Flexibility. Biological Psychiatry. 81 (8), 683-692 (2017).
- Snyder, K. P., Barry, M., Valentino, R. J. Cognitive impact of social stress and coping strategy throughout development. Psychopharmacology. 232 (1), 185-189 (2014).
- Brady, A. M., Floresco, S. B. Operant procedures for assessing behavioral flexibility in rats. Journal of Visualized Experiments. (96), e52387 (2015).
- Sandi, C., Pinelo-Nava, M. T. Stress and Memory: Behavioral Effects and Neurobiological Mechanisms. Neural Plasticity. , 1-20 (2007).
- Shansky, R. M., Lipps, J. Stress-induced cognitive dysfunction: hormone-neurotransmitter interactions in the prefrontal cortex. Frontiers in Human Neuroscience. 7, 123 (2013).
- Ragozzino, M. E., Detrick, S., Kesner, R. P. Involvement of the prelimbic-infralimbic areas of the rodent prefrontal cortex in behavioral flexibility for place and response learning. The Journal of Neuroscience: the Official Journal of the Society for Neuroscience. 19 (11), 4585-4594 (1999).
- Liston, C., et al. Stress-induced alterations in prefrontal cortical dendritic morphology predict selective impairments in perceptual attentional set-shifting. The Journal of Neuroscience: the Official Journal of the Society for Neuroscience. 26 (30), 7870-7874 (2006).
- Hatch, A., Wiberg, G. S., Balazs, T., Grice, H. C.
- Grafe, L. A., Cornfeld, A., Luz, S., Valentino, R., Bhatnagar, S. Orexins Mediate Sex Differences in the Stress Response and in Cognitive Flexibility. Biological Psychiatry. 81 (8), 683-692 (2017).
- Animal Care and Use Committee, T. J. H. U. Species Specific Information: Rat. , Available from: http://web.jhu.edu/animalcare/procedures/rat.html (2020).
- Lapiz-Bluhm, M. D. S., et al. Behavioural assays to model cognitive and affective dimensions of depression and anxiety in rats. Journal of Neuroendocrinology. 20 (10), 1115-1137 (2008).
- McEwen, B. S. Permanence of brain sex differences and structural plasticity of the adult brain. Proceedings of the National Academy of Sciences. 96 (13), 7128-7130 (1999).
- Manber, R., Armitage, R. Sex, steroids, and sleep: a review. Sleep. 22 (5), 540-555 (1999).
- Sherwin, B. B. Estrogen and Cognitive Functioning in Women. Endocrine Reviews. 24 (2), 133-151 (2003).
- Becker, J. B., et al. Strategies and methods for research on sex differences in brain and behavior. Endocrinology. 146 (4), 1650-1673 (2005).
- Koch, C. E., Leinweber, B., Drengberg, B. C., Blaum, C., Oster, H. Interaction between circadian rhythms and stress. Neurobiology of Stress. 6, 57-67 (2017).
- Warren, B. L., et al. Neurobiological sequelae of witnessing stressful events in adult mice. Biological Psychiatry. 73 (1), 7-14 (2013).
- McAlonan, K., Brown, V. J. Orbital prefrontal cortex mediates reversal learning and not attentional set-shifting in the rat. Behavioural Brain Research. 146 (1-2), 97-103 (2003).
- Schoenbaum, G., Saddoris, M. P., Stalnaker, T. A. Reconciling the roles of orbitofrontal cortex in reversal learning and the encoding of outcome expectancies. Annals of the New York Academy of Sciences. 1121 (1), 320-335 (2007).
- Meunier, M. Effects of orbital frontal and anterior cingulate lesions on object and spatial memory in rhesus monkeys. Neuropsychologia. 35 (7), 999-1015 (1997).
- Zappulla, R. A., Wang, W., Friedrich, V. L., Grabel, J., Nieves, J. CNS activation patterns underlying motor evoked potentials as demonstrated by c-fos immunoreactivity. Electroencephalography and Clinical Neurophysiology. 43, 155-169 (1991).
- Schoenenberger, P., Gerosa, D., Oertner, T. G. Temporal Control of Immediate Early Gene Induction by Light. PLoS ONE. 4 (12), 8185 (2009).
- Chase, E. A., Tait, D. S., Brown, V. J. Lesions of the orbital prefrontal cortex impair the formation of attentional set in rats. The European Journal of Neuroscience. 36 (3), 2368-2375 (2012).
- Hancock, P. A., Warm, J. S. A dynamic model of stress and sustained attention. Human Performance in Extreme Environments. 7 (1), 15-28 (2003).
- Johnson, P. L., Molosh, A., Fitz, S. D., Truitt, W. A., Shekhar, A. Orexin, stress, and anxiety/panic states. Progress in Brain Research. 198, 133-161 (2012).
- Leuner, B., Shors, T. J. Stress, anxiety, and dendritic spines: what are the connections. Neuroscience. 251, 108-119 (2013).
- Holmes, A., Wellman, C. L. Stress-induced prefrontal reorganization and executive dysfunction in rodents. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 33 (6), 773-783 (2009).
- Placek, K., Dippel, W. C., Jones, S., Brady, A. M. Impairments in set-shifting but not reversal learning in the neonatal ventral hippocampal lesion model of schizophrenia: further evidence for medial prefrontal deficits. Behavioural Brain Research. 256, 405-413 (2013).
- Nikiforuk, A., Popik, P. Long-lasting cognitive deficit induced by stress is alleviated by acute administration of antidepressants. Psychoneuroendocrinology. 36 (1), 28-39 (2011).
- Bondi, C. O., Rodriguez, G., Gould, G. G., Frazer, A., Morilak, D. A. Chronic unpredictable stress induces a cognitive deficit and anxiety-like behavior in rats that is prevented by chronic antidepressant drug treatment. Neuropsychopharmacology. 33 (2), 320-331 (2008).
