Summary
Aquí se presenta un enfoque fosfoproteómico, a saber, detener e ir extracción a base de punta fosfoproteómica, que proporciona alto rendimiento y cobertura profunda de arabidopsis fosfoproteoma. Este enfoque delinea la visión general de la señalización de estrés osmótico en Arabidopsis.
Abstract
La fosforilación proteica es crucial para la regulación de la actividad enzimática y la expresión génica en condiciones osmóticas. La espectrometría de masas (EM) basada en la fosfoproteómica ha transformado la forma de estudiar la transducción de la señal vegetal. Sin embargo, el requisito de una gran cantidad de materiales de partida y el tiempo prolongado de medición de EM para lograr la profundidad de cobertura ha sido el factor limitante para el estudio de alto rendimiento de los cambios fosfoproteómicos globales en las plantas. Para mejorar la sensibilidad y el rendimiento de la fosfoproteómica vegetal, hemos desarrollado un enfoque de extracción de parada e ir (etapa) basado en puntas fosfoproteómicas junto con etiquetado de etiqueta de masa tándem (TMT) para el análisis rápido e integral de la perturbación de la fosforilación vegetal en respuesta al estrés osmótico. Aprovechando la simplicidad y el alto rendimiento de la técnica de punta de etapa, todo el procedimiento tarda aproximadamente una hora utilizando dos consejos para terminar el enriquecimiento de fosfopéptidos, fraccionamiento y pasos de limpieza de muestras, lo que sugiere un fácil de usar y una alta eficiencia del enfoque. Este enfoque no sólo proporciona un análisis de fosfoproteómica vegetal en profundidad (> 11.000 identificación de fosfopéptido) sino que también demuestra la eficiencia de separación superior (< 5% de superposición) entre fracciones adyacentes. Además, se ha logrado la multiplexación utilizando el etiquetado TMT para cuantificar los cambios fosfoproteómicos de las plantas mutantes de decuple de tipo salvaje y snrk2. Este enfoque se ha utilizado con éxito para revelar los eventos de fosforilación de quinasas similares a Raf en respuesta al estrés osmótico, que arroja luz sobre la comprensión de la señalización osmótica temprana en las plantas terrestres.
Introduction
La alta salinidad, las bajas temperaturas y la sequía causan tensiones osmóticas, que es un factor ambiental importante que afecta la productividad de las plantas1,2. La fosforilación proteica es una de las modificaciones post-traslacionales más significativas que median la percepción y la transducción de la señal en respuesta de la planta a la tensión osmótica3,4,5. La proteína quinasa 2s (SnRK2s) relacionada con SNF1 está implicada en la señalización de tensión osmótica6. Nueve de cada diez miembros de la familia SnRK2 muestran una activación significativa en respuesta al estrés osmótico7,8. El snrk2.1/2/3/4/5/6/7/8/9/10 decuple (snrk2-dec) mutante que tiene mutaciones en los diez SnRK2 mostró hipersensibilidad al estrés osmótico. En el mutante snrk2-dec, la acumulación osmótica inducida por estrés de inositol 1,4,5-trisphosphato (IP3),biosíntesis de ácido abscísico (ABA) y expresiones génicas se reducen fuertemente, destacando el papel vital de SnRK2s en las respuestas de estrés osmótico6. Sin embargo, todavía no está claro cómo las quinasas SnRK2s regulan estos procesos biológicos. Perfilar los cambios fosfoproteómicos en respuesta al estrés osmótico es una manera eficiente de cerrar esta brecha y delinear los mecanismos de defensa activados por estrés osmótico en las plantas.
La espectrometría de masas (EM) es una potente técnica para mapear la fosfoproteomavegetal 9. Sin embargo, la caracterización de la fosfoproteómica vegetal sigue siendo un desafío debido al rango dinámico del proteoma vegetal y a la complejidad del lysatovegetal 4. Para superar estos desafíos, desarrollamos un flujo de trabajo fosfoproteómico vegetal universal, que elimina interferencias no deseadas como los pigmentos fotosintéticos y metabolitos secundarios, y permite la cobertura profunda de fosfoproteoma vegetal10. Se han desarrollado varios métodos de enriquecimiento de fosfopéptidos como cromatografía de afinidad de iones metálicos inmovilizados (IMAC) y cromatografía de óxido metálico (MOC) para enriquecer fosfopéptidos antes del análisis de EM11,12,13,14,15,16. Los no fosfopéptidos ácidos que se purifican con fosfopéptidos son las principales interferencias para la detección de fosfopéptidos. Anteriormente, estandarizamos el valor de pH y la concentración de ácido orgánico del búfer de carga IMAC para eliminar la unión de no fosfopéptidos, para obtener más del 90% de especificidad de enriquecimiento pasando por alto el paso de pre-fraccionamiento11.
La pérdida de muestras en el proceso de varios pasos de enriquecimiento y fraccionamiento de fosfopéptidos dificulta la sensibilidad de la identificación de fosfopéptidos y la profundidad de la cobertura fosfoproteómica. Las puntas stop-and-go-extraction (puntas de escenario) son puntas de pipeta que contienen pequeños discos para tapar el extremo de la punta, que se pueden incorporar con cromatografía para el fraccionamiento de péptidos y limpieza17. La pérdida de muestras durante el procedimiento de la punta del escenario se puede minimizar evitando la transferencia de muestras entre los tubos. Hemos implementado con éxito la punta de etapa en Ga3+-IMAC y Fe3+-IMAC para separar péptidos fosforilados múltiples de baja abundancia de péptidos fosforilados, que mejoraron la profundidad del fosfoproteoma humano15. Además, el uso de alta punta de etapa de fase invertida de pH (Hp-RP) ha demostrado la mayor cobertura del proteoma de membrana humana en comparación con la del intercambio de cationes fuertes (SCX) y la cromatografía de intercambio de aniones fuertes (SAX)18. Por lo tanto, la integración de las técnicas de punta de etapa IMAC y Hp-RP puede aumentar la cobertura de fosfoproteoma vegetal con simplicidad, alta especificidad y alto rendimiento. Hemos demostrado que esta estrategia identificó más de 20.000 sitios de fosforilación de plánexas arabidopsis, lo que representa una mayor profundidad de fosfoproteoma vegetal19.
Aquí, informamos de un protocolo fosfoproteómico basado en la punta de etapa para la elaboración de perfiles fosfoproteómicos en Arabidopsis. Este flujo de trabajo se aplicó para estudiar la perturbación fosfoproteómica de plántulos mutantes de tipo salvaje y snrk2-dec en respuesta al estrés osmótico. El análisis fosfoproteómico reveló los sitios de fosforilación implicados en la activación de la quinasa y la señalización de estrés osmótico temprano. El análisis comparativo de datos de fosfoprotemas mutantes de tipo salvaje y snrk2-dec llevó al descubrimiento de una cascada de quinasa similar a Raf (RAF)-SnRK2 que desempeña un papel clave en la señalización de estrés osmore en plantas altas.
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Protocol
1. Preparación de muestras
- Cosecha las plándas tratadas con control y estrés (1 g) en una lámina de aluminio y el flash congela las muestras en nitrógeno líquido.
NOTA: Por lo general, se observa una mayor concentración de proteínas a partir de plándas de dos semanas de antigüedad que la de plantas maduras. Un gramo de plándalo genera aproximadamente 10 mg de lisato proteico, que es suficiente para el análisis de EM. Todos los pasos de centrifugación tienen lugar a 16.000 x g en el paso 1. - Moler plándas congeladas en un polvo fino usando un mortero y pestle lleno de nitrógeno líquido.
- Añadir 1 ml de tampón de lisis ((6 M guanidina-HCl en Tris-HCl de 100 mM, pH 8.5) con tris de 10 mM (2-carboxetil)clorhidrato de fosfina (TCEP), 40 mM 2-cloroacetamida (CAA), inhibidor de la proteasa e inhibidor de la fosfatasa cócteles) al mortero y mezclar con la ayuda de pestle.
- Transfiera la planta a un tubo de 1,5 ml y caliente a 95 °C durante 5 minutos.
- Coloque el tubo sobre hielo durante 10 minutos. Sonice el tubo en hielo durante 10 s, haga una pausa de 10 s y repita tres veces.
- Centrífuga el tubo durante 20 min y alícuota 150 μL de lysato vegetal en un tubo de 1,5 ml.
- Añadir 600 μL de 100% metanol en el tubo. Vórtice y girar por el tubo.
- Añadir 150 μL de cloroformo al 100% en el tubo. Vórtice y girar por el tubo.
- Añadir 450 μL de ddH2O en el tubo. Vórtice y centrífuga el tubo durante 3 min.
- Deseche la capa acuosa superior. Añadir 600 μL de 100% metanol en el tubo. Centrífuga el tubo durante 3 minutos y luego deseche la solución.
- Lave pellets proteicos con 600 μL de 100% metanol. Deseche la solución y seque al aire el pellet proteico.
- Pellets proteicos resuspend en 600 μL de tampón de digestión (desoxicolato sódico de 12 mM (SDC)/12 mM de sarcosinato de lauroilo sódico (SLS) en Tris-HCl de 100 mM, pH 8.5). Sonice el tubo hasta que se homogeneice la suspensión.
- Mida la concentración de proteínas utilizando un kit BCA y ajuste la concentración a 4 μg/μL con el búfer de digestión. Transfiera 100 μL del lisato (400 proteínas de μg) a un nuevo tubo.
- Añadir 292 μL de bicarbonato de trietillammonio de 50 mM (TEAB) y 8 μL de Lys-C (2,5 Unidades/ml) al tubo. Incubar el tubo a 37 °C durante 3 h.
- Añadir 100 μL de 50 mM TEAB con 8 μg de trippsina al tubo. Incubar el tubo a 37 °C durante 12 h.
- Añadir 25 μL de ácido trifluoroacético (TFA) al tubo al 10%. Vórtice y centrífuga el tubo durante 20 min a 4 °C.
- Transfiera el sobrenadante a una columna de desalada condicionada para desalar. Seque el eluato con un concentrador de centrífuga de vacío.
NOTA: Activa la resina con 1 ml de metanol seguido de 1 ml de 0,1% de TFA en acetonitrilo al 80% (ACN). Lave el disolvente orgánico con al menos 3 ml de 0,1% de TFA en 5% ACN. Cargue muestras de péptidos acidificados preparadas en el paso 1.16 en la columna y luego lave la columna con al menos 3 ml de 0.1% de TFA en 5% ACN. Es posible que se necesiten más lavados para muestras con altas concentraciones de sal. Elute los fosfopéptidos con 1 ml de 0,1% de TFA en 80% ACN.
2. Etiquetado de etiqueta de etiqueta de masa tándem (TMT)
- Resuspend los péptidos secos en 100 μL de 200 mM 4-(2-hidroxietil)-1-piperazineethanesulfonic ácido (HEPES), pH 8.5.
- Disolver el reactivo TMT de cada canal (0,8 mg) en 40 μL de ACN anhidra. Vórtice el tubo reactivo TMT durante 5 minutos y girarlo hacia abajo.
- Transfiera 40 μL de TMT al tubo de muestra e incubar durante 1 h a temperatura ambiente.
NOTA: En este experimento, el canal 126 a 128 fue etiquetado con tres réplicas biológicas de plantas sin tratamiento de manitol, y el canal 129 a 131 fueron etiquetados con tres réplicas biológicas de plantas con tratamiento de manitol. - Añadir 8 μL de 5% hidroxilamina e incubar durante 15 min.
- Mezclar 6 muestras en un tubo de 5 ml y añadir 14 μL de 10% de TFA.
- Añadir 3.876 μL de 0,1% de TFA al tubo. Vórtice y girar hacia abajo.
- Transfiera la solución a una columna de desalting condicionada para desalar. Seque el eluato con un evaporador.
3. Preparación de la punta de etapa de la IMAC
- Utilice una aguja de extremo contundente de 16 G para penetrar en un disco frit de polipropileno.
NOTA: Sujete la cortadora perpendicular a la superficie del disco y enrolle el cortador un par de veces para asegurarse de que el disco está completamente excizado. Coloque el disco en una placa De Petri para su almacenamiento. Coloque la aguja en una punta de pipeta de 200 μL y empuje el frit en la punta usando un émbolo. - Presione suavemente el encrespamiento en la punta con un émbolo para tapar el extremo de la punta.
- Coloque el disco frit en puntas con la misma presión, lo que proporciona una mejor reproducibilidad. La reproducibilidad de la producción de puntas de etapa es importante para la presión de retroceso constante, que afecta el tiempo de los pasos de centrífuga y la reproducibilidad entre las réplicas técnicas.
- Si las puntas del escenario muestran una alta presión de espalda durante el paso de acondicionamiento, deseche las puntas para evitar posibles obstrucciones de la punta al cargar muestras. Podría ser que el disco podría haber sido presionado demasiado duro en posición.
- Invierta la columna de giro Ni-NTA y colóquela en un tubo de 1,5 ml.
- Utilice un émbolo para presionar suavemente el frit de las cuentas Ni-NTA y empuje las cuentas en el tubo.
NOTA: Asegúrese de empujar el frit suavemente para evitar la posible pérdida de cuentas o adsorción en la columna de giro.
4. Preparación de la punta de etapa hp-rp
- Prepare la punta de etapa hp-RP como se describe para la punta de etapa IMAC mediante un disco C8.
NOTA: No aplique una fuerza grande al disco porque puede dar lugar a un frit densamente embalado y aumentar la presión posterior de la punta del escenario. Todos los pasos de centrifugación tienen lugar a 1.000 x g durante 5 minutos en el paso 4. - Suspender 1 mg de cuentas C18 en 100 μL 100% metanol y pasar la solución de cuentas a través de la punta.
- Añadir 20 μL de buffer 8 (80% ACN/20% 200 mM NH4HCO2,pH 10.0) a la punta del escenario y pasar el buffer 8 a través de la punta por centrifugación.
- Agregue 20 μL de buffer A (200 mM NH4HCO2)a la punta de etapa y pase el buffer A a través de la punta por centrifugación.
NOTA: Equilibre la centrífuga durante el uso y asegúrese de que la punta de la etapa Hp-RP no esté completamente seca.
5. Preparación del adaptador de giro
- Utilice pinzas de extremo afilado para perforar un agujero en el centro de la tapa de un tubo de 1,5 ml.
- Inserte la punta de etapa IMAC o la punta de la etapa Hp-RP en el orificio del adaptador de giro.
NOTA: Asegúrese de que la punta del escenario no esté cerca de la parte inferior del adaptador de giro.
6. Enriquecimiento de fosfopéptido usando la punta de etapa de IMAC
- Suspenda las cuentas Ni-NTA de 10 mg con 400 μL de búfer de carga (6% ácido acético (AA), pH 3.0) y cargue toda la solución de cuentas en por punta. Pase la solución a través de la punta por centrifugación.
NOTA: Todos los pasos de centrifugación tienen lugar a 200 x g durante 3 minutos en el paso 6 además del paso 6.8. - Cargue 100 μL de ácido etilenodiaminetetraacético de 50 mM (EDTA) para quitar los iones de níquel de la punta de etapa IMAC y pasar la solución a través de la punta por centrifugación.
- Cargue 100 μL de búfer de carga a la punta del escenario y pase la solución a través de la punta por centrifugación.
- Cargue 100 μL de 50 mM FeCl3 en un 6% AA a la punta del escenario y pase la solución a través de la punta por centrifugación. Los iones Fe3+ se quelarán a la punta del escenario de IMAC.
- Cargue 100 μL de búfer de carga para acondicionar la punta del escenario y pasar la solución a través de la punta por centrifugación.
- Cargue 100 μL de búfer de carga con péptidos de muestra preparados en el paso 2.7 hasta la punta del escenario y pase la solución a través de la punta por centrifugación.
NOTA: Tome un nuevo tubo como adaptador de espín para recoger el flujo de la muestra y almacenar el flujo en el congelador para su análisis futuro. - Cargue 100 μL de búfer de lavado (4,5% AA y 25% ACN) a la punta del escenario y pase la solución a través de la punta por centrifugación.
- Realice el segundo lavado con búfer de carga. Cargue 100 μL de búfer de carga a la punta del escenario y pase la solución a través de la punta utilizando centrífuga de 1000 × g durante 3 minutos.
NOTA: Asegúrese de que el búfer de lavado se reemplaza por el búfer de carga en la punta del escenario para eliminar la pérdida de fosfopéptidos durante el paso de elución. Eequilibrar la punta de la etapa IMAC antes de la elución de fosfopéptido para asegurar que la concentración de ACN esté por debajo del 5%. - Recorta la punta de la etapa IMAC en la parte delantera con una tijera y coloca la punta de la etapa IMAC recortada dentro de la punta hp-RP. Asegúrese de que las dos capas de puntas del escenario no toquen la tapa de la centrífuga.
7. Fraccionamiento de fosfopéptido usando la punta de etapa Hp-RP C18
- Añadir 100 μL de tampón de elución (fosfato de amonio de 200 mM (NH4H2PO4)) a la punta de etapa IMAC recortada y pasar la solución a través de las dos capas de puntas de etapa por centrifugación.
NOTA: Si la solución no pasa a través de la punta del escenario, aumente la velocidad de giro hacia abajo. Todos los pasos de centrifugación tienen lugar a 1.000 x g durante 5 minutos en el paso 7. Todos los búferes Hp-RP se enumeran en la Tabla 1. - Deseche la punta de la etapa IMAC usando una pinza y agregue 20 μL de Buffer A a la punta de etapa Hp-RP y pase el búfer a través de la punta por centrifugación.
NOTA: Asegúrese de que todo el búfer de elución pase a través de la punta de la etapa IMAC antes de descartarla. - Añadir 20 μL de Buffer 1 a elute fracción 1 y recoger el eluato en un nuevo tubo por centrifugación. Repita el proceso con buffers 2, 3, 4, 5, 6, 7 y 8 para recoger cada fracción en un tubo nuevo. Seque el eluato final de cada fracción utilizando un concentrador de vacío.
NOTA: Prepare búferes de fraccionamiento nuevos. Tome 8 tubos nuevos como adaptador de espín de cada fracción. Recoge el eluato de cada fracción en un adaptador de espín diferente. Los fosfopéptidos no son estables en condiciones básicas, por lo que secan los elutos por un concentrador o acidificados por un 10% de TFA inmediatamente.
8. Análisis y análisis de datos LC-MS/MS
- Añadir 5 μL de ácido fórmico (FA) del 0,1% y analizar la muestra mediante un espectrómetro de masas.
- Ejecute un degradado de 90 minutos con 6-30% buffer B (80% ACN y 0.1% FA) para cada fracción.
- Fragmente los 10 péptidos etiquetados como top 10 mediante disociación de energía de alta colisión (HCD). Complete una búsqueda de base de datos para identificar sitios de fosforilación.
- Cargue los archivos sin procesar en el software MaxQuant, asigne un nombre a los experimentos y establezca fracciones y PTM.
NOTA: El tutorial del software MaxQuant se puede encontrar en https://www.maxquant.org/. - Seleccione reporter ion MS2 en el tipo de ejecución LC-MS/MS y 6plex TMT como etiquetas isobáricas. Habilite el filtro mediante la función PIF y establezca el PIF mínimo como 0,75.
- Seleccione Acetil (proteína N-término), Oxidación (M) y Fosfo (STY) en el panel de modificaciones variables. Seleccione Carbamidomethyl (C) como modificaciones fijas.
- Establece el modo de digestión como específico, selecciona Trypsin/P como enzima de digestión y dos escotes perdidos.
- Establezca psm falsa tasa de descubrimiento (FDR) y proteína FDR como 0.01. Establezca la puntuación mínima para péptidos modificados como 40.
- Agregue la base de datos Arabidopsis thaliana al panel de archivos fasta y ejecute la búsqueda de bases de datos.
- Cargue el archivo txt de los sitios de Fosfo (STY) en el software Perseus mientras se realiza la búsqueda.
NOTA: Los tutoriales detallados del software Perseus se pueden encontrar en https://www.maxquant.org/perseus/. - Filtre los sitios de fosforilación inversa. Filtre los sitios de fosforilación no localizados utilizando una probabilidad de localización del 75% como corte.
- Utilice las intensidades de los sitios de fosforilación para el análisis estadístico.
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Representative Results
Para demostrar el rendimiento de este flujo de trabajo, explotamos la punta de etapa de IMAC junto con el fraccionamiento de punta de etapa Hp-RP para medir los cambios fosfoproteómicos en plándela mutantes de tipo salvaje y snrk2-dec con o sin tratamiento de manitol durante 30 minutos. Cada muestra se realizó en triplicatos biológicos y el flujo de trabajo experimental se representa en la Figura 1. Los péptidos digeridos (400 μg) de cada muestra fueron etiquetados con un canal TMT-6plex, agrupados y desalados. Los fosfopéptidos se enriquecieron aún más usando una punta de etapa IMAC, y los fosfopéptidos purificados fueron posteriormente fraccionados en ocho fracciones por una punta de etapa Hp-RP. Cada fracción fue analizada mediante un análisis de gradiente LC de 90 minutos. Los archivos sin procesar fueron buscados usando un motor de búsqueda contra la base de datos Arabidopsis thaliana.
Se identificaron un total de 11.077 fosfopéptidos únicos correspondientes a 3.630 fosfoproteínas con 6.852 sitios localizados de fosforilación (Clase I, probabilidad de localización > 0,75), lo que indica la amplia cobertura de fosfoprotema Arabidopsis. Se identificaron un total de 8.107 y 7.248 fosfopéptidos a partir de muestras mutantes de tipo salvaje y snrk2-dec, respectivamente. Esto ilustra la eficacia del flujo de trabajo al proporcionar una cobertura en profundidad para delinear la visión global de la transducción de señal en Arabidopsis. Comparamos el número de fosfopéptidos identificados en 8 fracciones. En las primeras dos fracciones se identificaron algunos fosfopéptidos, la fracción 1 y 2. Sin embargo, la mayoría de los fosfopéptidos se distribuyeron uniformemente en el resto 6 fracciones(Figura 2A),lo que sugiere que este enfoque proporciona la capacidad de separar fosfopéptidos complejos de la planta fosfoproteoma. Para demostrar aún más la eficiencia de separación de este flujo de trabajo, evaluamos la superposición de fosfopéptidos entre dos fracciones adyacentes (eq. F1 a F2). Menos del 5% de los fosfopéptidos se superponen en las fracciones adyacentes, lo que indica una sólida eficiencia de fraccionamiento de la punta de etapa Hp-RP (Figura 2B).
Utilizando los datos obtenidos por el flujo de trabajo, comparamos los perfiles fosfoproteómicos de tipo salvaje y mutante snrk2-dec tras el tratamiento con manitol. Un total de 433 y 380 sitios de fosforilación se incrementaron después del tratamiento con manitol en muestras mutantes de tipo salvaje y snrk2-dec, respectivamente (Figura 3). Entre ellos, 312 fosfositos mostraron inducción (FDR < 0.01) en tipo salvaje, pero no en plantas mutantes snrk2-dec. El análisis de La Ontología Génica (GO) reveló que la función de la fosforilación y activación de la proteína quinasa, la regulación del proceso metabólico de fosfato, la transducción de la señal, se enriquecen significativamente en las fosfoproteínas dependientes de SnRK2. Curiosamente, el término GO relacionado con el desarrollo de la raíz también se enriqueció en el grupo dependiente de SnRK2, consistente con el fenotipo de retardación del crecimiento de la raíz bajo tensión osmótica6. También identificamos 116 fosfositos regulados por el tratamiento con manitol tanto en el tipo salvaje como en el mutante snrk2-dec. Estas fosfoproteínas eran independientes de SnRK2, o candidatos que median la señalización activada por estrés osmótico antes de la activación de SnRK2s. Observamos que varios RAFs del subgrupo B4 como RAF18 (AT1G16270), RAF24 (AT2G35050) y RAF42 (AT3G46920), estaban significativamente regulados por el estrés osmótico. Otro estudio reveló que las quinasas de la RAF se activan rápidamente por el estrés osmótico y son necesarias para la fosforilación y activación de SnRK2s20.
Figura 1: Flujo de trabajo del método fosfoproteómico basado en puntas de etapa. La proteína fue extraída y digerida de plándalo mutante de tipo salvaje y snrk2-dec tratado con o sin manitol. Los péptidos digeridos de cada réplica fueron etiquetados con un canal TMT6-plex único. Los fosfopéptidos se agruparon y luego se enriquecieron con una punta de etapa de IMAC. Los fosfopéptidos purificados fueron separados por una punta de etapa Hp-RP. Cada fracción fue analizada por espectrómetro de masas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Perfil fosfoproteómico de plángrafos mutantes de decuple de tipo salvaje y snrk2 por punta de etapa IMAC y fraccionamiento Hp-RP. (A) El número de fosfopéptidos identificados por fracción. B) La eficiencia de separación de la cromatografía Hp-RP basada en puntas de etapa. La superposición entre las fracciones adyacentes se representa por el porcentaje del mismo péptido identificado en las fracciones adyacentes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Cuantificación de los cambios fosfoproteómicos en respuesta al estrés osmótico. Las parcelas volcánicas muestran el cambio de tronco2 de los sitios de fosforilación en (A) de tipo salvaje y (B) plándas mutantes snrk2-dec en respuesta al tratamiento con manitol. El círculo negro representa los sitios de fosforilación quinasa inducidos por manitol. El círculo rojo indica los sitios de fosforilación de los RAFs regulados en respuesta al manitol. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Buffer A | Formato de amonio de 200 mM (NH4HCO2), pH 10.0. | |
| Búfer B | 100% ACN. | |
| Búfer 1 | 5% Buffer B, 95% Buffer A. | |
| Buffer 2 | 8% Buffer B, 92% Buffer A. | |
| Buffer 3 | 11% Buffer B, 89% Buffer A. | |
| Buffer 4 | 14% Buffer B, 86% Buffer A. | |
| Buffer 5 | 17% Buffer B, 83% Buffer A. | |
| Buffer 6 | 20% Buffer B, 80% Buffer A. | |
| Buffer 7 | 23% Buffer B, 77% Buffer A. | |
| Buffer 8 | 80% Buffer B, 20% Buffer A. | |
Tabla 1: Búferes para el fraccionamiento de punta de etapa Hp-RP.
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Discussion
El rango dinámico y la complejidad del proteoma vegetal y el fosfoproteoma siguen siendo un factor limitante a la profundidad de los análisis de fosfoproteómica. A pesar de la capacidad del análisis LC-MS/EM de una sola ejecución para identificar 10.000 sitios de fosforilación21,22,la cobertura de todo el fosfoproteoma vegetal sigue siendo limitada. Por lo tanto, se requiere un flujo de trabajo fosfoproteómico que proporcione alta sensibilidad y eficiencia de separación superior en la generación de perfiles de la vista global de las redes de señalización de plantas en respuesta al estrés ambiental. La cromatografía comercial basada en columnas de cromatografía líquida de alta presión (HPLC) es un método común para reducir la complejidad del péptido antes del análisis de EM23,24. Sin embargo, los tediosos pasos de recolección de muestras y el gran volumen de elución son los principales desafíos de los métodos basados en HPLC en términos de sensibilidad y rendimiento. la punta de la etapa es un enfoque alternativo para ejecutar el pre-fraccionamiento o enriquecimiento del péptido para trabajos de alta sensibilidad y alto rendimiento. Este nuevo flujo de trabajo fosfoproteómico que explota el etiquetado isórico junto con el enriquecimiento y fraccionamiento de fosfopéptidos proporciona una mejor cobertura y profundidad de la fosfoproteómica vegetal sobre otros flujos de trabajo fosfoproteómicos25,26.
El valor de pH de las muestras es el factor crucial que determina la especificidad de enriquecimiento de fosfopéptidos. El valor de pH puede verse afectado por el paso anterior de preparación de la muestra, por lo que es esencial comprobar el valor de pH antes de la carga de la muestra. Si se cambia el pH, añadir ácido acético o hidróxido de sodio a las muestras para ajustar el pH a 3.0. Ejecutamos este protocolo para la elución simultánea y carga de fosfopéptidos en la punta de la etapa C18. Por lo tanto, es importante equilibrar la punta de la etapa IMAC antes de la elución de fosfopéptido para asegurar que la concentración de ACN está por debajo del 5%.
El número de fracciones depende de la complejidad y los tamaños de muestra. Por lo general, 5 a 8 fracciones son suficientes para proporcionar una amplia cobertura de identificación de fosfopéptidos en las plantas. La concentración de ACN en búferes de fraccionamiento se puede ajustar de acuerdo con la hidrofobicidad de las muestras. La mayoría de los fosfopéptidos se eluden de cuentas C18 utilizando el rango de 5% a 25% concentración de ACN. Los fosfopéptidos suelen ser más hidrófilos en comparación con péptidos no fosforilados debido a las cargas negativas adicionales del grupo de fosfato. Sin embargo, etiquetar reactivo TMT en N-terminus de péptido conduce a un aumento de la hidrofobicidad de péptidos etiquetados27,que puede explicar por qué se identificaron menos fosfopéptidos en las dos primeras fracciones en nuestro caso (Figura 2A). Por lo tanto, se puede utilizar una prueba utilizando un reactivo TMT-cero y una coartada de muestras para evaluar el número de fracciones y la concentración acn en cada búfer de fraccionamiento. Los búferes optimizados pueden resultar en una mejor eficiencia de separación de fosfopéptidos etiquetados TMT-6plex.
Las limitaciones del fraccionamiento basado en puntas de etapa son el número de fracciones y la capacidad de las puntas. Es difícil ampliar el número de fracciones en la separación de puntas de etapa porque se utilizan búferes de degradado discontinuos para el fraccionamiento de punta de etapa. Por otro lado, se puede aplicar un degradado continuo a las columnas HPLC para lograr un número de fracción alto. La capacidad de los consejos es otro factor que limita la aplicación de consejos escénicos. Para el análisis de fosfoproteómica a gran escala (> 10 proteínas mg) es mejor utilizar el enriquecimiento basado en HPLC con una longitud de columna más larga llena de más cuentas C18 y fraccionamiento, que está más allá de la escala analítica de las puntas de etapa. En conjunto, el enriquecimiento y fraccionamiento de fosfopéptidos basados en la punta de etapa es un método útil para análisis de fosfoproteómica de pequeña y mediana escala. Este enfoque se puede integrar con el etiquetado isobárico para lograr la cuantificación multiplexada. Los resultados también demostraron que podría utilizarse para la elaboración de perfiles y cuantificaciones de fosfoproteómica vegetal en profundidad. Este flujo de trabajo es aplicable a otras especies y diferentes tipos de tejidos para la delineación de redes de señalización especializadas.
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Disclosures
Los autores no declaran conflicto de intereses.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por el Programa de Investigación estratégica prioritaria de la Academia China de Ciencias, Grant XDB27040106.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL tube | eppendorf | 22431081 | Protein LoBind, 1.5 mL, PCR clean, colorless, 100 tubes |
| 200 µL pipet tip | Gilson | F1739311 | |
| 2-chloroacetamide | Sigma-Aldrich | C0267 | |
| acetic acid | Sigma-Aldrich | 5438080100 | |
| acetonitrile | Sigma-Aldrich | 271004 | |
| ammonium hydroxide | Sigma-Aldrich | 338818 | |
| ammonium phosphate monbasic | Sigma-Aldrich | 216003 | |
| BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23227 | |
| blunt-ended needle | Hamilton | 90516 | Kel-F hub (KF), point style 3, gauge 16 |
| C18-AQ beads | Dr. Maisch | ReproSil-Pur-C18-AQ 5 µm | |
| C8 Empore disk | 3 M | 2214 | 47 mm |
| Centrifuge | eppendorf | 22620444 | |
| chloroform | Sigma-Aldrich | CX1058 | |
| data analysis software | Perseus 1.6.2.1 | https://maxquant.net/perseus/ | |
| ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | ||
| formic acid | Sigma-Aldrich | 5330020050 | |
| Frits | Agilent | 12131024 | Frits for SPE Cartridges |
| Guanidine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 50933 | |
| H2O | Sigma-Aldrich | 1153334000 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Iron (III) chloride | Sigma-Aldrich | 157740 | |
| LTQ-orbitrap | Thermo Fisher Scientific | Velos Pro | |
| mass spectrometer | Thermo Fisher Scientific | LTQ-Orbitrap Velos Pro | |
| methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | |
| nano LC | Thermo Fisher Scientific | Easy-nLC 1000 | |
| Ni-NTA spin column | Qiagen | 31014 | |
| N-Lauroylsarcosine sodium salt | Sigma-Aldrich | L9150 | |
| plunger | Hamilton | 1122-01 | Plunger assembly N, RN, LT, LTN for model 1702 (25 μl) |
| search engine software | MaxQuant 1.5.4.1 | https://www.maxquant.org | |
| SEP-PAK Cartridge 50 mg | Waters | WAT054960 | |
| sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | |
| SpeedVac | Thermo Fisher Scientific | SPD121P | |
| TMT 6-plex | Thermo Fisher Scientific | 90061 | |
| Triethylammonium bicarbonate buffer | Sigma-Aldrich | T7408 | |
| Trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | 91707 | |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Sigma-Aldrich | C4706 | |
| Trizma hydrochloride | Sigma-Aldrich | T3253 |
References
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