Summary
我们为卵子的饲养、微喷射和在基因组编辑后生成和维持突变菌株的火布拉特 热比亚家用菌 株的有效交配提供了详细的协议。
Abstract
火布拉特 热比亚家是 一种无翼的无翼物种，适合研究昆虫的发展机制，导致它们在地球上成功的进化辐射。基因工具（如基因组编辑）的应用是理解基因变化的关键，这些变化是 Evo-Devo 方法中负责进化过渡的关键。在这篇文章中，我们描述了我们目前的协议，以产生和维持 T.国内突变菌株。我们报告一种干注射方法，作为报告的湿注射方法的替代品，使我们能够获得注射胚胎的稳定高存活率。我们还报告了一个优化的环境设置，以配合成人，并获得后代的高效率。我们的方法强调了将每个物种独特的生物学考虑在非传统模型生物中成功应用基因组编辑方法的重要性。我们预测，这些基因组编辑协议将有助于实施 T.家用作为 实验室模型，并进一步加快该物种中有用的遗传工具的开发和应用。
Introduction
热比娅家居属于最基础的昆虫之一，Zygentoma，它保留了祖先的代谢和无翼生命周期。这种基底植物遗传位置和祖先特征为研究地球上昆虫成功背后的机制树立了有吸引力的模型，昆虫覆盖了描述的动物物种1的70%以上。长期以来，由于其作为实验室模型的合适特征，如从胚胎到生殖成人的寿命相对较短（2.5-3.0个月），因此主要用于研究昆虫生理的祖先特征：图1A）和一个简单的繁殖。在过去的三十年里，它的使用已经扩大，以研究各种特征的祖先特征，如身体计划，神经分化，昼夜节律2，3，4。
先进的遗传工具在T.家政的应用可以进一步加速这种贡献，在广泛的研究领域。成功的RNA干扰（RNAi）介制的基因敲击在胚胎，仙女和成人已经报告在T.家庭4，5，6。系统性RNAi的效率仍然高度依赖物种-例如，它通常是高在科洛普泰拉，而它是低在麻风病顺序7。T. 家政的 RNAi 击倒的效率和持续时间尚未评估。除了RNAi，我们之前已经报告了成功的CRISPR/Cas9介质基因敲除在T.国内a8。CRISPR/Cas系统已广泛应用于昆虫的基因组编辑，特别是针对基因敲除。在建立CRISPR/Cas系统组件进入核9的协议后，通过敲击外源构造，可以扩大其用途，用于其他应用，如基因报告器检测、细胞谱系跟踪和转录活性操纵。结合已公布的基因组组装10，在T.家谱中广泛使用和进一步发展CRISPR/Cas为基础的基因组编辑将有助于研究昆虫卓越适应性成功背后的进化机制。在这里，我们描述了胚胎微射和交配成人T.家用，以产生突变株使用CRISPR/Cas9的详细协议。考虑到这种新方法，我们讨论了考虑非传统模型物种的独特生物学对于这些技术的成功应用的重要性。
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Protocol
1. 实验室菌落的维护
- 为了维持野生类型和突变种群，使用大型塑料容器（460 毫米 x 360 mm x 170 mm）与常规人工鱼食、顶部有通风孔的塑料杯中的水、用于隐藏昆虫的折叠纸和用于产卵的分层棉花（图 2A）。将所有 T. 家用 文化保留在 37 °C 孵化器内，并将每个容器内的相对湿度 （RH） 设置为 60%-80%。
注：由于 T.家政 从大气中吸收水蒸气11，因此不需要直接供水。适当的 RH 是由于每个容器内装有通风孔的塑料杯或无盖杯中存在水蒸气而保持的。无需在包含培养物的整个孵化器内加湿。在此协议中描述的条件下，每个发育阶段的大致持续时间显示在 图 1中。发展速度可以通过改变温度和/或RH12来调整。 - 定期添加食物。在水干涸之前加水。
- 鉴于成年人停止在肮脏的环境中产卵和/或人口稠密，至少每3个月将人口转移到一个新的清洁容器（见 讨论）。
2. 鸡蛋收集和微弹射
- 设计指南RNA（gRNA）
- 为每个所需目标设计一个 gRNA 序列，并将 gRNA 序列与基因组组装对比，以检查可能的脱靶识别站点。
- 根据制造商的说明8合成和净化 gRNA。
注：例如，在针对ATP绑定盒式运输机 白色 基因的情况下，设计了20 bp目标序列，并订购了两个合成的DNA寡核苷酸5'-TAATACTACTATAGTAGTAGGTGGAC-3'和5'-TTC-塔卡特卡塔-3'。DNA模板是通过对这两种寡核苷酸进行退化，然后进行PCR放大，然后用T7 RNA聚合酶从模板中体外转录。
- 准备鸡蛋收集殖民地
- 将大约20名男性和20名女性成人转移到一个中等大小的容器（200毫米×150毫米×90毫米），内有食物、水供应、一张折叠纸和一小块分层棉，用于产卵（图2B）。
- 建立几个殖民地，在短时间内获得大量阶段性胚胎，用于基因组编辑。
注：大约20-40个鸡蛋预计将在37°C的8小时后从殖民地收集。 转移的成年人通常需要几天时间才能开始产卵，这可能是由于适应了新的环境。
- 在注射当天，用新的代替容器内的棉花。
- 将 76 毫米 x 5 毫米双面胶带放在常规 76 mm x 26 mm 玻璃滑梯上。
- 8小时后，使用钳子将层分离，从分层棉中收集鸡蛋。
- 使用湿漆刷将双面胶带上的鸡蛋对齐，并在鸡蛋之间保持 2 mm 的距离。所有鸡蛋应定向，使鸡蛋的纵轴面对注射侧（图3A）。在注射过程中，用油漆刷轻轻按压鸡蛋，以牢固地握住鸡蛋。
注：在此协议中，真菌在潮湿和温暖的条件下在受损的注射卵子中快速生长。重要的是保持鸡蛋之间的距离，以防止交叉污染和真菌的扩张。 - 将 gRNA 和 Cas9 蛋白质分别混合到 100 ng/μL 和 500 ng/μL 的最终浓度。使用蒸馏水进行稀释。在室温下孵化混合物10分钟，促进核糖核蛋白复合形成，然后保持混合在冰上。
注：在1%的最终浓度下，中性红可以添加到注射溶液中，以监测注射量。 - 将 gRNA/Cas9 溶液的 2 μL 装载在带微型装载机的玻璃注塑毛细管中。在注射前确保溶液中没有气泡。如有必要，点击针头去除气泡。
注：在这个实验中，一个现成的针头被用来获得一个细针尖（图3B）。一种形状相似的自制针头可以代替。 - 将以前装有 gRNA/Cas9 溶液的玻璃喷射毛细管固定在装有操纵器的支架上，并将支架连接到电子微注射器。
- 优化针尖的形状，用钳子稍微打破它，以防止堵塞和获得更好的耐久性在整个一系列注射（一个适当的针的例子显示在图3C）。
注意：建议在针头堵塞时更换针头。如果钳子再次断裂，可以继续注射同一针，但更宽的尖端会导致更多的卵子损伤，降低其存活率。由于 T.家蛋 柔软易碎，保持细针尖是注射后存活率高的关键。 - 将针头插入鸡蛋纵向轴的中点，并注射少量溶液（见 图3D-H， 以参考注射量）。根据针尖的形状，在注射过程中调整电子微注射器的配置。
注意：建议在注射过程中施加恒定压力，否则粘性鸡蛋含量很容易流入玻璃针，并可能堵塞。解决方案可能是注射短压力脉冲或恒定压力，具体取决于注入的液体量。请记住，当针尖有一个宽开口，太多的溶液被注射到鸡蛋，这会导致致命性（图3F-H）。在这种情况下，通过恒定的压力保持恒定的液体流动，然后将针头插入鸡蛋中并立即将其拉出。如果它导致太多的溢出或鸡蛋爆裂，改变针。 - 将注射的鸡蛋放在一个容器中，其大小与注射鸡蛋的数量相当（+lt;20鸡蛋：小菜;+20个鸡蛋：中型容器），60%-80%RH和37°C。
3. 交配
- 定期检查注射的鸡蛋，用钳子丢弃受损的鸡蛋，以避免真菌生长（图3I，J）。万一鸡蛋上长出太多的真菌，用 70% 的 EtOH 清理鸡蛋表面。
- 孵化前（产蛋后约10天，37°C），将玻璃滑梯与注射的鸡蛋浸入滑石粉中，涂上双面胶带的表面。这将避免孵化的仙女堆叠。将粉末涂层的玻璃滑梯转移到一个中等大小的容器中，内有食物、水和折叠纸，用于隐藏昆虫。
- 在仙女孵化后取下玻璃滑梯。定期供应食物，直到他们成年。
注：个体孵化后大约需要2.0-2.5个月才能成年（图1A）。成人阶段的判断依据是女性发育良好的卵母（图1B）。 - 要与个体交配，请将尽可能多的野生型女性成人从实验室殖民地转移到中型容器，并在 37 °C 下孵育至少 14 天，以确保她们是处女。
注：没有必要从实验室殖民地收集处女，因为成年T.家庭有一个反复的循环的熔融和交配称为"生殖和融色周期"，在此期间，女性扔掉精子与每个摩尔和伴侣再次在下一个受精周期13。 - 将从注射卵子和野性成人发育成小塑料盘（+100 mm x 40 mm）的男性或女性G0成人转移到带食物、折叠纸和一小块棉花的塑料盘上，用于产下G1卵子（图2C';交配盘）。将配菜放在一个更大的容器中，带 60%-80% RH（图 2C）。
注：多个野生类型的成人可以包括在一个菜，以增加成功交配的机会，虽然高成功率已经实现了一对一的配对。
4. 基因型
- 为每个 gRNA 设计 PCR 入门对，以放大 100-200 bp 产品，其中包括 gRNA 所针对的站点。对基因组组装的每个引体序列进行爆炸，以检查其特异性（图 4A中针对白色基因的示例示例）。
- 检查 G0 成人的细菌线转换。
- 卵子产卵五天后，从每个G0成人对收集单独的G1卵子，放入0.2 mL管中（每管1个鸡蛋;将采集的样品储存在-20°C，用于长期储存）。分离棉层收集鸡蛋。
注：建议从每对交配对中至少产生12个G1仙女，以评估生殖系传播的成功率（见 代表结果）。 - 在每个管子中加入 0.25 毫克/mL 蛋白酶 K 溶液（溶解在 Tris-EDTA 缓冲区）的 15 μL，用牙签短暂均质样品，并在 55 °C 下孵育 3 至 16 小时。
- 将样品放在95°C下10分钟，使蛋白酶K失活。
- 将 90 μL 蒸馏水加入每个管子中，并混合好。在包含第 4.1 步设计的引漆的 10 μL PCR 反应组合中使用 2 μL 的超常剂。
注：建议使用针对粗模板优化的DNA聚合酶，以达到足够的PCR放大。 - 要分析 PCR 产品，请使用微芯片电泳系统执行异质多式移动检测 （HMA）（图 3B;参见 Ohde 等人，2018 年）8。
注：突变可以用两种替代方法进行评估：（1）HMA与标准凝胶聚合物，如8%聚丙烯酰胺14：（2）用T7内核酶消化PCR产品，然后消化凝胶电磷酸酶15。 - 只保留G1仙女产生的G0成人，其中含有突变的细菌线，并丢弃其他。
- 卵子产卵五天后，从每个G0成人对收集单独的G1卵子，放入0.2 mL管中（每管1个鸡蛋;将采集的样品储存在-20°C，用于长期储存）。分离棉层收集鸡蛋。
- G1仙女/成人的个体基因成型
- 用吸气器或画笔将G1仙女隔离成24口井板。将 24 井板放置在较大的容器中（例如本协议中使用的中型容器），并配上上述水源，以保持 60%-80% 的 RH（图1D）。保持人工常规鱼食的供应（图1D'）。
注：虽然此步骤可以在仙女和成人阶段的任何时间点执行，但建议在成年后和配对前执行此步骤（+注射后 2.5 个月; 图1B）因为它更容易在一个大容器中维护火炉。需要单独饲养，以跟踪以下步骤上每个G1仙女的基因型。来自同一G0成人的G1仙女可以有不同的突变。 - 用钳子从仙女/成人那里捏取和拉 ceci 和 caudal 灯丝，并将它们收集到含有 50 μL EtOH 的 0.2 mL 管中（将收集的样品存放在 -20 °C 处，以进行长期存储）。
注：组织样本在EtOH中收集，因为它可以防止这些小样本因静电而丢失。如果需要停止昆虫的运动，在采集组织样本时在冰上麻醉仙女/成人。由于 T.家药 在冰上长期冷却后无法存活，因此不要麻醉超过一分钟，并立即将它们移回室温。子宫颈和颅丝的消融不会增加死亡率。 - 将盖子打开的样品管放在热块上 15 分钟，在 70 °C 下蒸发 EtOH。
- 重复步骤 4.2.2-4.2.5 用于基因成型。
- 将观察突变波段模式的 PCR 产品提交到标准桑格测序服务中。
- 保持G1仙女/成人与所需的突变，并丢弃其他（见 图4C 的代表性测序结果）。
- 用吸气器或画笔将G1仙女隔离成24口井板。将 24 井板放置在较大的容器中（例如本协议中使用的中型容器），并配上上述水源，以保持 60%-80% 的 RH（图1D）。保持人工常规鱼食的供应（图1D'）。
- 穿过含有配菜中所需突变的成人，获得下一代，以建立同源突变菌株。
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Representative Results
在我们手中，大约100个鸡蛋可以很好地注射一个单一的注射毛细亚时，它有足够的尖端（图3C）。在产卵后的前8小时内在胚胎中注射gRNA/Cas9核糖核蛋白复合物，导致在gRNA靶点产生因德尔。这会导致注射一代 （G0） 的某些细胞发生胆汁突变，因此在 G0 中通常获得突变马赛克表型。例如，当本协议用于注射旨在瞄准 白色 基因的 gRNA 时，32.6% 的 G0 仙女在其复合眼睛和背部区域（图 5）8中显示色素素局部损失。
使用目前描述的干注射方法，当注射80-120个卵子时，注射胚胎的存活率高达40%-60%。这与以前的湿注射方法形成鲜明对比，即鸡蛋被注射并维持在阿加罗斯板上，偶尔导致存活率低于10%。
对G0成人和变异G1个体的生殖系转化的评估由基因组PCR完成，然后是HMA。在HMA中，野生型和突变等位基因在每个可能的组合中都具有退色性，这通常会导致凝胶电磷化（两个同质和两个异质）14上的四个不同的波段。在 G1 样本中，野生类型和变异样本之间的差频带模式清晰可辨（图 4B）。当我们瞄准 白色 基因8时，39.1%的G0成年人发现了细菌素转化。根据我们的经验，G1仙女中单个G0对变异个体的百分比从25%到100%不等。
为了评估我们的交配环境对交配成功的影响，我们在交配盘中穿越了野生型成人，获得了95.8%的成功率（23/24对）。
图1：T.家政的生命周期。（A） T. 国内每个发展阶段的大致持续时间。（B） 成年女性的多萨尔视图。箭头表示一个发育良好的卵母。请点击这里查看此数字的较大版本。
图2：本协议中使用的人工环境。（A） 一个用于实验室殖民地的大容器，（B） 一个中等大小的收集鸡蛋的容器，（C） 将盘子与大容器中的水供应交配，（C'）一个交配盘，（D） 一个24口井的盘子，在中型容器中供水。盒装区域被放大到（D'），以显示 T. 国内个人 。 请点击这里查看此数字的较大版本。
图 3：T.家蛋 干注射。（A） 鸡蛋对齐在玻璃滑梯上。黑色箭头表示插入针头的点。（B） 用于注射的玻璃针尖的形状。（C） 在（顶部）和（底部）打破尖端之前（顶部）和之后相同的玻璃针。针头中填充了1%的中性红色。箭头表示针尖。鳞条是1毫米（D）未注入的鸡蛋。（E） 注射的好例子。箭头表示注射点。（F-H）溶液从注射部位（F）或注射卵子的对立面（G） 溢出：注射量过大导致爆裂（H）。箭头表示溢出的鸡蛋含量。（I） 通常发育较晚的胚胎。箭头表示彩色复合眼。（J） 注射后3天，碎蛋受损。 请点击这里查看此数字的较大版本。
图4：G1个人的基因成型。（A） PCR 引漆旨在放大包括 gRNA 目标站点的 120 bp 基因组区域。（B） 在变异样本中检测到多个同质和异质DNA带，而单个波段则出现在未混合的样品中。L：DNA阶梯，U：未注解的样本，M：变异样本。（C） 从野生型和异型突变样品中直接测序PCR产品的代表性结果。野生类型和突变 
（）等位基因的序列显示在顶部。（A） 中显示的前引入器用作测序入门。异质突变体（底部）的序列由预测位点（箭头）的两个重叠序列表示。 请点击这里查看此数字的较大版本。
图5：马赛克在用gRNA/Cas9蛋白注射瞄准 白色 基因后，在复合眼睛和背部区域失去色素。（A） 野生类型和（B） 白色 gRNA/Cas9 蛋白质首先注入星仙女。表示眼睛（箭头）和背部区域（箭头）中黑色和粉红色色素的部分损失。比例尺是 200μm。 请单击此处查看此数字的较大版本。
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Discussion
对于成功生成所需的 T.家 用突变体CRISPR/Cas9，首先重要的是收集足够数量的分阶段胚胎进行注射。对于足够数量的 T.家蛋 的不断收集，关键是选择一个适当的大小的容器，以具有较低的人口密度，因为它将有助于成功完成一系列复杂的交配行为，这是重复后，每个成人摩尔13。男性 T.家庭 成人通过精子间接地将其精子转移给女性。斯威特曼（1938年）报告说，从开始交配行为到放置精子磷12，男性成年人需要20至35分钟。其他人对交配对之间相互作用的干扰可能会阻止成功的受精，这在密集的环境中可能更频繁地发生。
虽然鸡蛋在更换容器内的棉花后8小时收集，以收集足够的鸡蛋在我们的协议，更高的基因组编辑效率可以通过收集鸡蛋，并在较短的时间内注射（例如，4小时后产卵），当注射材料有更多的机会被送到大部分核。如果空间允许，可以（1）增加容器的数量或大小，或（2）重复相同的程序，以获得足够数量的注射卵子，从而在较短的时间内注射足够数量的鸡蛋。
注射部位通常被认为是昆虫成功变质的重要场所。 T. 家蛋 通常呈椭圆形，在纵轴的一极含有细菌带。建议在卵子纵轴的中点注射 gRNA/Cas9 混合物，因为由于 T. 家 卵的可变形状，很难识别早期胚胎中形成细菌带的极点。虽然 gRNA/Cas9 溶液没有直接注射到细菌带形成的部位，但我们在高达 39.1% 的 G0 成人8中实现了细菌线转换。
在卵子的微喷射过程中，使用细针尖获得较高的存活率非常重要，其他动物模型也是如此。我们用现成的针头注射后获得的存活率比在 T.家用 鸡蛋中使用自制玻璃针头时要高。然而，通过用自制针头复制细针形状（如 图3B，C所示），可以达到同样高的存活率。根据我们的经验，干注射法的存活率高于先前报告的湿注射法8。我们发现，在干燥的环境中孵化卵子是改善的关键，因为 T.家蛋 和早期仙女对干燥具有抗药性。这是根据以前的报告表明，这个物种更喜欢干燥的环境，特别是在早期发育阶段，湿润的环境甚至可能是有害的16。而不是塑料板，阿加罗斯凝胶可用于快速对齐鸡蛋：然而，将注射的卵子转移到干燥的表面会导致更高的存活率。
最后，我们的方法强调了将 T.1家 独特的生物学考虑在一个成功的基因组编辑中的重要性：保持一个稀疏的环境，收集足够数量的卵子和干燥的环境，使注射胚胎的存活率更高。此处报告的注射、交配和培养维持的基本协议不仅用于通过基因组编辑生成突变菌株，还用于其他遗传工具（如RNAi和转基因）的应用，将有助于了解昆虫早期进化背后的机制。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
TO 和 TD 分别得到 JSPS KAKENHI 赠款编号 19H02970 和 20H02999 的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-well plate | Corning | 83-3738 | |
| Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nuclease V3, 100 µg | Integrated DNA Technologies | 1081060 | |
| Anti-static cleaner | Hozan | Z-292 | for removing static electricity from a 24-well plate |
| Barrier Box 20.7L | AS ONE | 4-5606-01 | Large container |
| FemtoJet 4i | Eppendorf | 5252000013 | Electronic microinjector |
| Femtotip II, injection capillary | Eppendorf | 5242957000 | Glass injection capillary |
| High Pack 2440mL | AS ONE | 5-068-25 | Middle-sized container |
| Incubator | Panasonic | MIR-554-PJ | for 37 °C incubation. No need to humidify inside the incubator. |
| KOD Fx Neo | Toyobo | KFX-101 | PCR enzyme for genotyping. Optimized for an amplification from crude templates. |
| Magnetic stand | Narishige | GJ-8 | for holding the micromanipulator |
| Microloader | Eppendorf | 5242956003 | |
| Micromanipulator | Narishige | MM-3 | |
| Microscope | Olympus | SZX12 | for microinjection. More than 35X magnification is sufficient for the microinjection |
| MultiNA | Shimadzu | MCE-202 | Microchip electrophoresis system |
| NiceTac | Nichiban | NW-5 | Double-sided tape to place eggs on a glass slide |
| Paint brush (horse hair) | Pentel | ZBS1-0 | |
| Plant culture dish | SPL Life Sciences | 310100 | Mating dish and water supplies for a large and middle-sized containers |
| Proteinase K, recombinant, PCR Grade Lyophilizate from Pichia pastoris | Roche | 3115836001 | |
| SZX 12 microscope | Olympus | SZX 12 | More than 35X magnification is sufficient for the microinjection |
| Talcum powder | Maruishi | 877113 | |
| Tetra Goldfish Gold Growth | Spectrum Brands | Artificial regular fish food |
References
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