Summary
Proporcionamos un protocolo detallado para la cría, microinjección de huevos y para el apareamiento eficiente del firebrat Thermobia domestica para generar y mantener cepas mutantes después de la edición del genoma.
Abstract
El firebrat Thermobia domestica es una especie ametabolosa y sin alas que es adecuada para estudiar los mecanismos de desarrollo de los insectos que condujeron a su exitosa radiación evolutiva en la Tierra. La aplicación de herramientas genéticas como la edición del genoma es la clave para entender los cambios genéticos que son responsables de las transiciones evolutivas en un enfoque Evo-Devo. En este artículo, describimos nuestro protocolo actual para generar y mantener cepas mutantes de T. domestica. Informamos de un método de inyección en seco, como alternativa al método de inyección húmeda notificado, que nos permite obtener tasas de supervivencia establemente altas en embriones inyectados. También informamos de un entorno optimizado para acoplar adultos y obtener generaciones posteriores con alta eficiencia. Nuestro método subraya la importancia de tener en cuenta la biología única de cada especie para la aplicación exitosa de métodos de edición del genoma a organismos modelo no tradicionales. Predicemos que estos protocolos de edición del genoma ayudarán a implementar T. domestica como modelo de laboratorio y a acelerar aún más el desarrollo y la aplicación de herramientas genéticas útiles en esta especie.
Introduction
Thermobia domestica pertenece a una de las órdenes de insectos más basales, Zygentoma, que conserva un ciclo de vida ancestral ametaboloso y sin alas. Tal posición filogenética basal y características ancestrales establecen a esta especie como un modelo atractivo para estudiar los mecanismos subyacentes al éxito de los insectos en la Tierra, que cubren más del 70% de las especies animales descritas1. T. domestica se ha utilizado durante mucho tiempo principalmente para estudiar las características ancestrales de la fisiología de insectos debido a sus características adecuadas como modelo de laboratorio, como un ciclo de vida relativamente corto (2,5–3,0 meses de embrión a adulto reproductor; Figura 1A) y una cría fácil. En las últimas tres décadas, su uso se ha ampliado para investigar características ancestrales de diversos rasgos como el plan corporal, la diferenciación neuronal y los ritmos circadianos2,3,4.
La aplicación de herramientas genéticas avanzadas en T. domestica podría acelerar aún más esas contribuciones en un amplio área de investigación. Se ha notificado una interferencia exitosa del ARN (ARN) en embriones, ninfas y adultos en T. domestica4,5,6. La eficiencia del RNAi sistémico sigue siendo altamente dependiente de las especies, por ejemplo, generalmente es alta en coleoptera, mientras que es baja en el ordenlepidópteros 7. La eficiencia y duración del derribo de la RNAi en T. domestica aún no ha sido evaluada. Además de RNAi, hemos informado previamente de un exitoso knockout genético mediado por CRISPR/Cas9 en T. domestica8. El sistema CRISPR/Cas se ha aplicado ampliamente para la edición del genoma en insectos, particularmente para el knockout genético específico. Su uso podría ampliarse para otras aplicaciones como el ensayo de reporteros genéticos, el seguimiento del linaje celular y la manipulación de la actividad transcripcional mediante el derribo de construcciones exógenas después del establecimiento de un protocolo para la entrega de componentes del sistema CRISPR/Cas en núcleos9. Combinado con el ensamblaje del genoma publicado10,el uso amplio y el desarrollo posterior de la edición del genoma basado en CRISPR/Cas en T. domestica facilitarían estudios centrados en los mecanismos evolutivos detrás del excepcional éxito adaptativo de los insectos. Aquí, describimos un protocolo detallado para la microinyección embrionaria y para aparear T. domestica adulto para generar una cepa mutante usando CRISPR/Cas9. Teniendo en cuenta este novedoso método, discutimos la importancia de considerar la biología única de las especies modelo no tradicionales para aplicaciones exitosas de estas técnicas.
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Protocol
1. Mantenimiento de colonias de laboratorio
- Para el mantenimiento de poblaciones de wildtype y mutantes, utilice un recipiente de plástico grande (460 mm x 360 mm x 170 mm) con alimentos artificiales regulares para peces, agua en vasos de plástico con un orificio de ventilación en la parte superior, un papel doblado para ocultar los insectos y algodón en capas para poner huevos(Figura 2A). Mantenga todos los cultivos de T. domestica dentro de incubadoras de 37 °C y establezca la humedad relativa (RH) dentro de cada recipiente en 60%-80%.
NOTA: Debido a que T. domestica absorbe vapor de agua de la atmósfera11,no se necesita un suministro directo de agua. El RH adecuado se mantiene debido a la presencia de vapor de agua de vasos de plástico que contienen un orificio de ventilación en la parte superior o de tazas sin tapa dentro de cada recipiente. No hay necesidad de humidificar dentro de toda una incubadora que contiene cultivos. La duración aproximada de cada etapa de desarrollo bajo la condición descrita en este protocolo se muestra en la Figura 1. La velocidad de desarrollo podría ajustarse cambiando la temperatura y/o rh12. - Agregue los alimentos periódicamente. Agregue agua antes de que se seque.
- Transfiera las poblaciones a un nuevo recipiente limpio al menos cada 3 meses, dado que los adultos dejan de poner huevos en un ambiente sucio y/o población densa (ver Discusión).
2. Recolección de huevos y microinjección
- Diseñar un ARN guía (gRNA)
- Diseñe una secuencia de gRNA para cada objetivo necesario y BLAST las secuencias de gRNA en el ensamblaje del genoma para comprobar posibles sitios de reconocimiento fuera de destino.
- Sintetizar y purificar los gRNAs de acuerdo con las instrucciones del fabricante8.
NOTA: Como ejemplo, en el caso de dirigirse al gen blanco transportador de casete de unión a ATP, se diseñó una secuencia objetivo de 20 bp y se ordenaron dos oligonucleótidos de ADN sintetizados 5'-TAATACACTCACTATAGTAAGTGTTGGTGGGAC-3' y 5'-TTCTAGCTCTAAAACATCCCCCAACACTTA-3'. La plantilla de ADN se preparó recocido estos dos oligonucleótidos seguidos de amplificación de PCR y el gRNA se transcribe in vitro de la plantilla con una polimerasa de ARN T7.
- Preparan colonias de recolección de huevo
- Transfiera alrededor de 20 adultos machos y 20 hembras a un recipiente de tamaño mediano (200 mm x 150 mm x 90 mm) con alimentos, suministro de agua, un papel doblado y un pequeño trozo de algodón en capas para la puesta de huevos(Figura 2B).
- Establecer varias colonias para obtener un gran número de embriones escenificados en un corto período de tiempo para ser utilizados para la edición del genoma.
NOTA: Se espera que se recojan entre 20 y 40 huevos de una colonia después de 8 h a 37 °C. Por lo general, los adultos transferidos tardan unos días en empezar a poner huevos, posiblemente debido a la adaptación a un nuevo entorno.
- El día de la inyección, reemplace el algodón dentro de los recipientes por otros nuevos.
- Coloque una cinta de doble cara de 76 mm x 5 mm en una tobogán de vidrio normal de 76 mm x 26 mm.
- Ocho horas más tarde, recoge los huevos del algodón en capas separando las capas usando fórceps.
- Alinee los huevos en la cinta de doble cara con un pincel húmedo y mantenga una distancia de 2 mm entre los huevos. Todos los huevos deben estar orientados para que el eje longitudinal de un huevo se enfrente al lado de la inyección(Figura 3A). Presione suavemente los huevos con un pincel para sujetar firmemente durante la inyección.
NOTA: En este protocolo, el hongo crece rápidamente en huevos inyectados dañados en condiciones húmedas y cálidas. Es importante mantener la distancia entre los huevos para evitar la contaminación cruzada y la expansión del hongo. - Mezcle la proteína gRNA y Cas9 a una concentración final de 100 ng/μL y 500 ng/μL, respectivamente. Utilice agua destilada para diluirla. Incubar la mezcla durante 10 minutos a temperatura ambiente para promover la formación compleja ribonucleoprotein y luego mantener la mezcla en hielo.
NOTA: Rojo neutro a una concentración final del 1% podría añadirse a la solución de inyección para controlar la cantidad inyectada. - Cargue 2 μL de la solución gRNA/Cas9 en un capilar de inyección de vidrio con un microcargador. Asegúrese de que no haya burbujas de aire en la solución antes de la inyección. Si es necesario, toque la aguja para extraer las burbujas.
NOTA: En este experimento, se utiliza una aguja prefabricada para obtener una punta de aguja fina (Figura 3B). En su lugar, se podría utilizar una aguja casera con una forma similar. - Fijar el capilar de inyección de vidrio, previamente cargado con la solución gRNA/Cas9, a un soporte equipado con un manipulador y conectar el soporte a un microinyector electrónico.
- Optimice la forma de la punta de la aguja rompiéndolo ligeramente con fórceps para evitar obstrucciones y obteniendo una mejor durabilidad a lo largo de una serie de inyecciones (se muestra un ejemplo de una aguja adecuada en la Figura 3C).
NOTA: Se recomienda cambiar una aguja cuando está obstruida. Es posible seguir inyectando con la misma aguja si se rompe de nuevo con fórceps, pero una punta más ancha conduce a más daño del huevo y reduce su tasa de supervivencia. Como los huevos T. domestica son blandos y frágiles, mantener una punta fina de aguja es clave para tener una alta tasa de supervivencia después de la inyección. - Inserte la aguja en el punto medio del eje longitudinal de un huevo e inyecte una ligera cantidad de la solución (consulte la Figura 3D-H como referencia sobre la cantidad de inyección). Ajuste la configuración del microinyector electrónico durante la inyección, dependiendo de la forma de la punta de la aguja.
NOTA: Se recomienda aplicar una presión constante durante la inyección, de lo contrario el contenido pegajoso del huevo puede fluir fácilmente en la aguja de vidrio y puede obstruirla. La solución puede ser inyectar un pulso de presión corto o con una presión constante, dependiendo de la cantidad de líquido inyectado. Tenga en cuenta que cuando una punta de aguja tiene una abertura amplia, se inyecta demasiada solución en un óvulo, lo que causa letalidad(Figura 3F-H). En ese caso, mantenga un flujo de líquido constante por presión constante, luego inserte la aguja en un huevo y extraiga inmediatamente. Si causa demasiado desbordamiento o el huevo estalla, cambie la aguja. - Mantenga los huevos inyectados en un recipiente con el tamaño adecuado para el número de huevos inyectados (<20 huevos: plato pequeño; >20 huevos: recipiente de tamaño mediano) con 60%-80% RH y 37 °C.
3. Apareamiento
- Revise los huevos inyectados periódicamente y deseche los huevos dañados con fórceps para evitar el crecimiento fúngico(Figura 3I,J). En caso de que haya demasiado hongo creciendo en un huevo, limpie la superficie del huevo con un 70% de EtOH.
- Antes de eclosionar (aproximadamente 10 días a 37 °C después de la puesta de huevos), sumerja el vaso con los huevos inyectados en polvo de talco para cubrir la superficie de la cinta de doble cara. Esto evitará el apilamiento de ninfas eclosionadas. Transfiera los toboganes de vidrio recubiertos de polvo a un recipiente de tamaño mediano con alimentos, agua y un papel doblado para ocultar los insectos.
- Retire las diapositivas de vidrio después de que las ninfas hayan eclosionado. Suministran alimentos periódicamente hasta que lleguen a la edad adulta.
NOTA: Se tarda aproximadamente 2.0–2.5 meses para que las personas lleguen a la edad adulta después de eclosionar(Figura 1A). La etapa adulta se juzga sobre la base de un ovipositor bien desarrollado en las hembras(Figura 1B). - Para aparear a los individuos, transfiera tantos como sea necesario a adultos hembras de wildtype de una colonia de laboratorio al contenedor mediano e incubarlos durante al menos 14 días a 37 °C para asegurarse de que son vírgenes.
NOTA: No es necesario recoger hembras vírgenes de una colonia de laboratorio porque las T. domestica adultas tienen un ciclo repetido de fundido y apareamiento llamado "ciclo reproductivo y ardiente", durante el cual las hembras tiran espermatozoides con cada muda y se aparean de nuevo en el siguiente ciclo de fertilización13. - Transfiera un adulto G0 macho o hembra que se desarrolló de un huevo inyectado y un(los) adulto(s) de wildtype a un pequeño plato de plástico (Ø 100 mm x 40 mm) con alimentos, un papel doblado y un pequeño trozo de algodón para poner huevos G1(Figura 2C';plato de apareamiento). Mantenga los platos de apareamiento en un recipiente más grande con 60%-80% RH(Figura 2C).
NOTA: Múltiples adultos de wildtype pueden ser incluidos en un plato para aumentar la probabilidad de apareamiento exitoso, aunque se han logrado altas tasas de éxito con emparejamiento uno a uno.
4. Genotipado
- Diseñe pares de imprimación PCR para cada gRNA para amplificar un producto de 100-200 bp que incluye el sitio dirigido por el gRNA. BLAST cada primera secuencia contra el ensamblaje del genoma para comprobar su especificidad (se muestra un ejemplo para la focalización del gen blanco en la Figura 4A).
- Compruebe la transformación germinina de los adultos G0.
- Cinco días después de que se ponen los huevos, recoger huevos G1 individuales de cada par adulto G0 en tubos de 0,2 ml (un huevo por tubo; almacenar muestras recogidas a -20 °C para un almacenamiento a largo plazo). Separe las capas de algodón para recoger los huevos.
NOTA: Se recomienda genotipo de al menos 12 ninfas G1 de cada par de acoplamiento para evaluar el éxito de la transmisión de la línea germinográfica (ver Resultados representativos). - Añadir 15 μL de una solución Proteinasa K de 0,25 mg/ml (disuelta en tampón Tris-EDTA) a cada tubo, homogeneizar brevemente muestras con palillos de dientes e incubar a 55 °C durante 3 a 16 h.
- Inactive la Proteinasa K colocando las muestras a 95 °C durante 10 min.
- Añadir 90 μL de agua destilada a cada tubo y mezclar bien. Utilice 2 μL de sobrenadante en una mezcla de reacción PCR de 10 μL que contenga las imprimaciones diseñadas en el paso 4.1.
NOTA: Se recomienda el uso de una polimerasa de ADN optimizada para plantillas crudas para alcanzar suficiente amplificación de PCR. - Para analizar los productos PCR, realice un ensayo de movilidad heteroduplex (HMA) con un sistema de electroforesis de microchip(Figura 3B;ver Ohde et al., 2018)8.
NOTA: Las mutaciones podrían evaluarse con dos métodos alternativos: (1) HMA con polímeros de gel estándar, como 8% poliacrilamida14; (2) digestión de productos DEP con endonuclease T7 seguido de electroforesis de gel de agarose15. - Mantenga sólo las ninfas G1 resultantes de los adultos G0 que contienen mutaciones en su línea germino y deseche las otras.
- Cinco días después de que se ponen los huevos, recoger huevos G1 individuales de cada par adulto G0 en tubos de 0,2 ml (un huevo por tubo; almacenar muestras recogidas a -20 °C para un almacenamiento a largo plazo). Separe las capas de algodón para recoger los huevos.
- Genotipado individual de ninfas/adultos G1
- Aísle las ninfas G1 en placas de 24 pozos con un aspirador o un pincel. Coloque las placas de 24 pozos en un recipiente más grande (por ejemplo, el recipiente mediano utilizado en este protocolo) con suministro de agua como se describió anteriormente para mantener un RH del 60%-80%(Figura 1D). Mantener el suministro de alimentos artificiales regulares para el pescado(Figura 1D').
NOTA: Aunque este paso se puede realizar en cualquier punto de las etapas de ninfas y adultos, se recomienda realizarlo después de llegar a la edad adulta y justo antes del emparejamiento (>2.5 meses después de la inyección; Figura 1B) porque es más fácil mantener los ignífugos en un recipiente grande. Se requiere una cría individual para rastrear el genotipo de cada ninfa G1 en los siguientes pasos. Las ninfas G1 del mismo adulto G0 pueden tener mutaciones diferentes. - Pellizque y tire de cerci y el filamento caudal de una ninfa/adulto usando fórceps y recogerlos en un tubo de 0,2 ml que contenga 50 μL EtOH (almacene las muestras recogidas a -20 °C para un almacenamiento a largo plazo).
NOTA: Las muestras de tejido se recogen en etoh porque evita la pérdida de estas pequeñas muestras debido a la electricidad estática. Si uno necesita detener el movimiento de los insectos, anestesia ninfa/adulto en hielo al tomar muestras de tejido. Debido a que T. domestica no puede sobrevivir después del enfriamiento a largo plazo en el hielo, no los anestesia durante más de un minuto e inmediatamente los mueva de vuelta a temperatura ambiente. La ablación del cerci y el filamento caudal no causa un aumento de la mortalidad. - Coloque tubos de muestra con las tapas abiertas en un bloque térmico durante 15 minutos a 70 °C para evaporar el EtOH.
- Repita los pasos 4.2.2–4.2.5 para genotipado.
- Envíe los productos PCR en los que se observa un patrón de banda mutante a un servicio de secuenciación Sanger estándar.
- Mantenga las ninfas/adultos G1 con las mutaciones deseadas y deseche las demás (consulte la Figura 4C para obtener un resultado representativo de secuenciación).
- Aísle las ninfas G1 en placas de 24 pozos con un aspirador o un pincel. Coloque las placas de 24 pozos en un recipiente más grande (por ejemplo, el recipiente mediano utilizado en este protocolo) con suministro de agua como se describió anteriormente para mantener un RH del 60%-80%(Figura 1D). Mantener el suministro de alimentos artificiales regulares para el pescado(Figura 1D').
- Cruza a los adultos que contienen las mutaciones deseadas en un plato de apareamiento y obtiene las próximas generaciones para establecer una cepa mutante homocigólica.
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Representative Results
En nuestras manos, alrededor de 100 huevos se pueden inyectar bien con un solo capilar de inyección cuando tiene la punta adecuada(Figura 3C). Inyección de gRNA/Cas9 complejo ribonucleoprotein en embriones dentro de las primeras 8 h después de la puesta de óvulos resulta en indels en el sitio objetivo de gRNA. Esto causa mutaciones biallelicas en algunas células de la generación inyectada (G0) y por lo tanto los fenotipos de mosaico mutantes generalmente se obtienen en G0. Por ejemplo, cuando este protocolo se utilizó para inyectar un ARN diseñado para dirigirse al gen blanco, el 32,6% de las ninfas G0 muestran pérdida parcial de pigmentación en sus ojos compuestos y regiones dorsales (Figura 5)8.
Utilizando el método de inyección seca actualmente descrito, cuando se inyectan entre 80 y 120 óvulos, la tasa de supervivencia de los embriones inyectados es tan alta como 40%-60%. Esto contrasta con el método de inyección húmeda anterior, en el que los huevos se inyectan y se mantienen en una placa de agarose, lo que ocasionalmente resulta en una tasa de supervivencia inferior al 10%.
La evaluación de la transformación de la línea germinante de los adultos G0 y los individuos mutados del G1 fue realizada por PCR genómica seguida de HMA. En HMA, el wildtype y el alelos mutantes recocidos en cada combinación posible, lo que normalmente resulta en cuatro bandas distintas en una electroforesis gel (dos homoduplexes y dos heteroduplexes)14. En las muestras G1, los patrones diferenciales de banda entre el wildtype y las muestras mutadas son claramente distinguibles(Figura 4B). La transformación de la línea germinal se encontró en el 39,1% de los adultos del G0 cuando apuntamos al gen blanco 8. En nuestra experiencia, el porcentaje de individuos mutados en ninfas G1 de un solo par G0 varía del 25% al 100%.
Para evaluar el efecto de nuestro entorno de apareamiento en el éxito del apareamiento, cruzamos adultos de tipo salvaje en un plato de apareamiento y obtuvimos una tasa de éxito del 95,8% (23/24 pares).
Figura 1: El ciclo de vida de T. domestica. (A) Duración aproximada de cada etapa de desarrollo en T. domestica. B) Vista dorsal de una hembra adulta. Arrowhead indica un ovipositor bien desarrollado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Entornos artificiales utilizados en este protocolo. (A) Un recipiente grande para colonia de laboratorio, (B) un recipiente de tamaño mediano para la recolección de huevos, (C) platos de apareamiento con suministros de agua en un recipiente grande, (C') un plato de apareamiento, (D) un plato de 24 pozos con suministro de agua en el recipiente de tamaño mediano. La región en caja se magnifica en (D') para mostrar un individuo T. domestica. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Inyección seca de huevos de T. domestica. (A) Huevos alineados en una diapositiva de vidrio. La flecha negra indica el punto donde se inserta una aguja. (B) Forma de una punta de aguja de vidrio utilizada para la inyección. (C) La misma aguja de vidrio antes (arriba) y después (abajo) rompiendo la punta. Las agujas estaban llenas de 1% de rojo neutro. Punta de flecha indica la punta de la aguja. La barra de escamas es de 1 mm. (D) Huevo sin inyectar. (E) Un buen ejemplo de una inyección. La flecha indica el punto de inyección. (F–H) La solución se desborda del sitio inyectado (F) o del lado opuesto (G) del huevo inyectado; demasiado volumen de inyección causó una explosión (H). La punta de flecha indica el contenido de huevo desbordado. (I) Normalmente desarrollado embrión tardío. Punta de flecha indica el ojo compuesto de color. (J) Huevo dañado encogido 3 días después de la inyección. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Genotipado de individuos G1. (A) Las imprimaciones PCR están diseñadas para amplificar una región genómica de 120 bp que incluye el sitio objetivo de gRNA. (B) Múltiples bandas de DNAs homoduplex y heteroduplex se detectan en muestras mutadas, mientras que las bandas individuales aparecen en muestras nomutadas. L: Escalera de ADN, U: muestras nomutadas, M: muestras mutadas. (C) Resultado representativo de la secuenciación directa de productos DEP a partir de muestras mutantes de wildtype y heterocigógoo. Las secuencias de wildtype y mutantes ( 
) alelo se muestran en la parte superior. La imprimación delantera que se muestra en (A) se utilizó como imprimación de secuenciación. La secuencia de un mutante heterocigógigo (abajo) está indicada por dos secuencias superpuestas del sitio de escote predicho (flecha). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Pérdida de pigmentaciones en mosaico en ojos compuestos y en la región dorsal después de apuntar al gen blanco con inyección de proteína gRNA/Cas9. (A) Wildtype y (B) gRNA blanco/Cas9 inyecidas por proteínas primero ninfas instar. Se indica la pérdida parcial de pigmentaciones negras y rosas en los ojos (punta de flecha) y en la región dorsal (flecha). La barra de escala es de 200 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Para la generación exitosa del mutante T. domestica deseado con CRISPR/Cas9, primero es importante recoger un número suficiente de embriones escenificados para la inyección. Para una recolección constante de un número suficiente de huevos T. domestica, la clave es seleccionar un tamaño adecuado del recipiente para tener una menor densidad de población porque ayudaría a completar con éxito una serie de comportamientos complejos de apareamiento, que se repite después de cada muda adulta13. Un adulto T. domestica macho transfiere su esperma indirectamente a una hembra a través de un espermatoforo. Sweetman (1938) informó que los adultos varones tardan de 20 a 35 minutos desde el inicio del comportamiento de apareamiento hasta la colocación de un espermatozoide12. Es probable que la alteración de la interacción entre un par de apareamiento por otros individuos previene la fertilización exitosa, que podría ocurrir con más frecuencia en un ambiente denso.
Aunque los huevos se recogen 8 h después de reemplazar el algodón dentro de un recipiente para recoger suficientes huevos en nuestro protocolo, la mayor eficiencia de la edición del genoma puede lograrse recogiendo óvulos e inyectándolos en un tiempo más corto (por ejemplo, 4 h después de la puesta de huevos) cuando los materiales inyectados tienen más posibilidades de ser entregados a la gran proporción de núcleos. La inyección a un número suficiente de huevos en un plazo más corto podría realizarse aumentando el número o el tamaño de los envases si el espacio lo permite, o (2) repitiendo el mismo procedimiento para obtener un número suficiente de huevos inyectados.
El lugar de inyección generalmente se considera importante para la transformación exitosa de la línea germinar en insectos. T. Los huevos domésticos suelen tener forma elipsoidal y contienen una banda germinal en un polo de su eje longitudinal. Se recomienda inyectar la mezcla gRNA/Cas9 en el punto medio del eje longitudinal del huevo porque es difícil identificar el polo donde se forma una banda germinal en embriones tempranos debido a la forma variable del huevo T. domestica. Aunque la solución gRNA/Cas9 no se inyecta directamente en el sitio de la formación de bandas germinales, hemos logrado la transformación de la línea germinista en hasta el 39,1% de los adultos G08.
Durante la microinyección de los huevos, es importante utilizar una punta de aguja fina para obtener una alta tasa de supervivencia, como es el caso de otros modelos animales. Obtuvimos una mayor tasa de supervivencia después de la inyección con agujas ya hechas que cuando usamos agujas de vidrio caseras en huevos T. domestica. Sin embargo, una tasa de supervivencia igualmente alta podría lograrse replicando la forma fina de la aguja con agujas caseras (como se muestra en la Figura 3B,C). Según nuestra experiencia, el método de inyección en seco resulta en una tasa de supervivencia más alta que el método de inyección húmeda previamente reportado8. Descubrimos que la incubación de huevos en un ambiente seco es clave para esta mejora, aprovechando el hecho de que los huevos de T. domestica y las ninfas tempranas son resistentes a la desecación. Esto es de acuerdo con informes anteriores que sugieren que esta especie prefiere un ambiente seco particularmente durante las primeras etapas de desarrollo y que un ambiente húmedo puede incluso ser perjudicial16. En lugar de una placa de plástico, un gel de agarose se puede utilizar para una alineación rápida de los huevos; sin embargo, la transferencia de los huevos inyectados a una superficie seca conduce a una mayor tasa de supervivencia.
En conclusión, nuestro método subraya la importancia de tener en cuenta la biología única de T. domestica para una edición exitosa del genoma: mantener un ambiente escaso para recoger un número suficiente de óvulos y un entorno seco para tener una mayor tasa de supervivencia de embriones inyectados. Los protocolos básicos de inyección, apareamiento y mantenimiento de cultivos aquí reportados se utilizan no sólo para generar cepas mutantes con edición del genoma, sino también para aplicaciones de otras herramientas genéticas como el RNAi y la transgénesis y ayudarán a entender los mecanismos subyacentes a la evolución temprana de los insectos.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
To y TD fueron apoyados por los números de subvención JSPS KAKENHI 19H02970 y 20H02999, respectivamente.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-well plate | Corning | 83-3738 | |
| Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nuclease V3, 100 µg | Integrated DNA Technologies | 1081060 | |
| Anti-static cleaner | Hozan | Z-292 | for removing static electricity from a 24-well plate |
| Barrier Box 20.7L | AS ONE | 4-5606-01 | Large container |
| FemtoJet 4i | Eppendorf | 5252000013 | Electronic microinjector |
| Femtotip II, injection capillary | Eppendorf | 5242957000 | Glass injection capillary |
| High Pack 2440mL | AS ONE | 5-068-25 | Middle-sized container |
| Incubator | Panasonic | MIR-554-PJ | for 37 °C incubation. No need to humidify inside the incubator. |
| KOD Fx Neo | Toyobo | KFX-101 | PCR enzyme for genotyping. Optimized for an amplification from crude templates. |
| Magnetic stand | Narishige | GJ-8 | for holding the micromanipulator |
| Microloader | Eppendorf | 5242956003 | |
| Micromanipulator | Narishige | MM-3 | |
| Microscope | Olympus | SZX12 | for microinjection. More than 35X magnification is sufficient for the microinjection |
| MultiNA | Shimadzu | MCE-202 | Microchip electrophoresis system |
| NiceTac | Nichiban | NW-5 | Double-sided tape to place eggs on a glass slide |
| Paint brush (horse hair) | Pentel | ZBS1-0 | |
| Plant culture dish | SPL Life Sciences | 310100 | Mating dish and water supplies for a large and middle-sized containers |
| Proteinase K, recombinant, PCR Grade Lyophilizate from Pichia pastoris | Roche | 3115836001 | |
| SZX 12 microscope | Olympus | SZX 12 | More than 35X magnification is sufficient for the microinjection |
| Talcum powder | Maruishi | 877113 | |
| Tetra Goldfish Gold Growth | Spectrum Brands | Artificial regular fish food |
References
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