Summary
Neste estudo, apresentamos um protocolo para a diferenciação de células neurais e progenitoras (NPCs) induzidas unicamente pela estimulação de pulso de corrente direta (DC) em um sistema microfluido.
Abstract
Os campos elétricos fisiológicos (EF) desempenham papéis vitais na migração celular, diferenciação, divisão e morte. Este artigo descreve um sistema de cultura celular microfluidic que foi usado para um estudo de diferenciação celular de longo prazo usando microscopia. O sistema microfluido consiste nos seguintes componentes principais: um chip eletrotático opticamente transparente, um aquecedor transparente de óxido de indium (ITO), uma bomba de enchimento de mídia de cultura, uma fonte de alimentação elétrica, um amplificador de energia de alta frequência, um multiplexer EF, um estágio motorizado X-Y-Z programável e um microscópio de contraste de fase invertido equipado com uma câmera digital. O sistema microfluido é benéfico na simplificação da configuração experimental global e, por sua vez, do reagente e do consumo amostral. Este trabalho envolve a diferenciação de células neurais e progenitoras (NPCs) induzidas pela estimulação de pulso de corrente direta (DC). No meio de manutenção de células-tronco, os NPCs do camundongo (mNPCs) se diferenciam em neurônios, astrócitos e oligodenrócitos após a estimulação do pulso DC. Os resultados sugerem que o simples tratamento de pulso dc poderia controlar o destino dos mNPCs e poderia ser usado para desenvolver estratégias terapêuticas para distúrbios do sistema nervoso. O sistema pode ser usado para a cultura celular em múltiplos canais, para estimulação de EF de longo prazo, para observação morfológica celular e para aquisição automática de imagens de lapso de tempo. Este sistema microfluido não só encurta o tempo experimental necessário, mas também aumenta a precisão do controle sobre o microambiente.
Introduction
As células precursoras neurais (NPCs, também conhecidas como células-tronco neurais e progenitoras) podem ser como um candidato promissor para a estratégia terapêutica neurodegenerativa1. Os NPCs indiferenciados têm capacidade de autoconexão, multi potência e capacidade proliferativa2,3. Um estudo anterior relatou que a matriz extracelular e os mediadores moleculares regulam a diferenciação do NPC. O fator de crescimento epidérmico (EGF) e o fator básico de crescimento do fibroblasto (bFGF) promovem a proliferação do NPC, mantendo assim o estado indiferenciado4.
Estudos anteriores relataram que a estimulação elétrica pode regular atividades fisiológicas celulares como divisão5,migração6,7,8,diferenciação1,9,10e morte celular11. Os campos elétricos (EFs) desempenham papéis vitais no desenvolvimento e regeneração do desenvolvimento do sistema nervoso central12,13,14. De 2009 a 2019, este laboratório investigou as respostas celulares à aplicação de EF no sistema microfluido1,6,7,8,15,16,17. Um chip eletrostático multicanal, opticamente transparente e eletrotático (MOE) foi projetado para ser adequado para coloração de imunofluorescência para microscopia conocal. O chip tinha alta transparência óptica e boa durabilidade e permitia a condução simultânea de três experimentos independentes de estimulação e várias condições imunossuís em um único estudo. O sistema microfluido é benéfico na simplificação da configuração experimental global e, por sua vez, do reagente e do consumo amostral. Este artigo descreve o desenvolvimento de um sistema de cultura celular microfluidic que foi usado para um estudo de diferenciação celular de longo prazo.
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Protocol
1. Design e fabricação do chip MOE
- Desenhe padrões para camadas individuais de metacrilato de polimetila (PMMA) e a fita de dupla face usando software apropriado(Figura 1A, Tabela de Materiais). Corte tanto as folhas pmma quanto a fita de dupla face com um escribra de máquina laser CO2 (Figura 1B).
- Ligue o escriba laser CO2 e conecte-o a um computador pessoal. Abra o arquivo de padrão projetado usando o software.
- Coloque as folhas PMMA (275 mm x 400 mm) ou fita dupla face (210 mm x 297 mm) na plataforma do escribra laser(Figura 2A). Concentre o laser na superfície das folhas PMMA ou na fita de dupla face usando a ferramenta de foco automático.
- Selecione o escriba laser como a impressora e, em seguida, "imprima" o padrão usando o escribra laser para iniciar a ablação direta na folha pmma ou fita dupla face e obter padrões individuais na folha ou fita PMMA(Figura 2B).
- Remova a película protetora das folhas pmma e limpe a superfície usando gás nitrogênio.
NOTA: O desenho do padrão PMMA e a usinagem direta da folha pmma foram realizados de acordo com o relatório anterior17. - Para unir várias camadas de folhas pmma, empilhar três peças de folhas pmma de 1 mm (camadas 1, 2 e 3), e uni-las sob uma pressão de 5 kg/cm2 em um conector térmico por 30 min a 110 °C para formar o conjunto do canal de fluxo/estimulação elétrica(Figura 2C).
NOTA: Diferentes lotes de folha pmma obtida comercialmente têm temperatura de transição de vidro ligeiramente diferente (Tg). A temperatura de ligação ideal precisa ser testada a incrementos de 5 °C perto do Tg. - Adere 12 peças de adaptadores às aberturas individuais na Camada 1 do conjunto de chips MOE com cola cianoacrilato de ação rápida.
NOTA: Os adaptadores são feitos de PMMA por moldagem por injeção. As superfícies planas na parte inferior são para conexão ao chip MOE. Os adaptadores com rosca de parafuso feminino de 1/4W-28 são para conectar plugues brancos com os dedos apertados, conectores inferiores planos ou adaptadores Luer. Tenha cuidado ao usar cola cianoacrilato de ação rápida. Evite espirrar nos olhos. - Desinfete os substratos PMMA de 1 mm (Camadas 1-3), a fita de dupla face (Camada 4) e o PMMA de grau óptico de 3 mm (Camada 5) usando irradiação ultravioleta (UV) por 30 minutos antes de montar o chip(Figura 1A).
- Adere aos substratos PMMA de 1 mm (Camadas 1-3) no PMMA de grau óptico de 3 mm (Camada 5) com a fita de dupla face (Camada 4) para completar o conjunto PMMA (Camadas 1-5)(Figura 1A).
- Prepare o vidro de cobertura limpo para o conjunto do chip.
- Encha uma diluição dez vezes maior do detergente em um frasco de coloração (veja a Tabela de Materiais),e limpe o vidro da tampa neste detergente usando um limpador ultrassônico por 15 minutos.
- Enxágue completamente o frasco de coloração sob água da torneira corrente para remover todos os vestígios do detergente.
- Continue enxaguando com água destilada para remover todos os vestígios de água da torneira e repita o passo 1.7.2 duas vezes.
- Seque o vidro de cobertura limpo soprando-o com gás nitrogênio.
- Desinfete o conjunto PMMA (Camadas 1-5), a fita de dupla face (Camada 6) e o vidro de capa (Camada 7) usando irradiação UV dentro de um armário de biossegurança por 30 minutos antes de montar o chip(Figura 1A).
- Adere ao vidro de tampa limpo (Camada 7) ao conjunto PMMA (Camadas 1-5) com a fita de dupla face (Camada 6)(Figura 1A).
- Incubar o chip MOE em uma câmara de vácuo durante a noite; utilizar o conjunto de chips MOE para procedimentos subsequentes(Figura 3).
2. Revestimento de poli-L-lysina (PLL) no substrato nas regiões de cultura celular
- Prepare o tubo de politetrafluoroetileno, conector de fundo plano, conector de cone, adaptador cone-Luer, plugue branco apertado de dedos (também chamado de rolha), adaptador Luer, seringa de bloqueio Luer e bung de borracha preta(Figura 4A, Tabela de Materiais). Esterilize todos os componentes acima em uma autoclave a 121 °C por 30 min.
- Sele as aberturas dos adaptadores da ponte ágar(Figura 1A)com os plugues brancos apertados dos dedos. Conecte o conector de fundo plano ao conjunto do chip MOE através dos adaptadores de entrada e saída média(Figura 4B). Conecte o adaptador cone-Luer às torneiras de 3 vias.
- Adicione 2 mL de solução PLL de 0,01% utilizando uma seringa de 3 mL que se conecta à torneira de 3 vias da entrada média(Figura 4B-
). - Conecte uma seringa vazia de 3 mL à torneira de 3 vias da tomada média (Figura 4B-
). - Preencha as regiões de cultura celular com a solução PLL. Bombeie manualmente a solução de revestimento para frente e para trás lentamente. Feche as duas torneiras de três vias para selar a solução dentro das regiões culturais.
- Incubar o chip MOE a 37 °C durante a noite em uma incubadora cheia com 5% de atmosfera de CO2.
).
).3. Preparação da rede de pontes salgadas
- Seguindo o passo 2.6, abra as duas torneiras de 3 vias e limpe as bolhas nos canais, bombeando manualmente a solução de revestimento para frente e para trás no canal usando as duas seringas.
- Desenhe 3 mL de meio completo (meio de manutenção de células-tronco consistindo da mistura de nutrientes M-12 (DMEM/F12) modificada de Dulbecco, 20 ng/mL EGF, e 20 ng/mL bFGF) em uma seringa de 3 mL que se conecta à torneira de 3 vias da entrada média (Figura 4B- e Figura 4B-
). - Adicione 3 mL de meio completo para substituir a solução de revestimento nas regiões de cultura celular. Conecte uma seringa vazia de 5 mL à torneira de 3 vias da tomada média (Figura 4B-
). - Prepare a rede de ponte de sal(Figura 5).
- Corte o bung de borracha preta para produzir uma abertura, e insira os eletrodos de cloreto de prata (Ag)/prata (AgCl) através do bung de borracha preta e na seringa de bloqueio Luer(Figura 4A).
- Substitua o plugue de dedo branco pelo adaptador Luer e injete 3% de agarose quente para encher o adaptador Luer.
NOTA: Para a preparação da agarose quente, dissolva 3 g de pó de agarose em 100 mL de salina tamponada com fosfato (PBS) e esterilize em uma autoclave a 121 °C por 30 min. - Conecte a seringa de bloqueio Luer ao adaptador Luer. Injete 3% de agarose quente através do bung de borracha preta para encher a seringa de bloqueio Luer usando a seringa com agulha. Deixe de 10 a 20 minutos para a agarose esfriar e solidificar.
NOTA: Para aumentar a capacidade de volume da agarose, a seringa de bloqueio Luer é montada no adaptador Luer(Figura 4 e Figura 5). Em seguida, os eletrodos grandes são inseridos na seringa de bloqueio Luer. O eletrodo é capaz de fornecer uma estimulação elétrica estável para o experimento a longo prazo.
).
).4. Preparação de mNPCs
- Cultura os mNPCs1 no meio completo em um frasco de cultura celular 25T a 37 °C em uma incubadora cheia com 5% de atmosfera de CO2. Subcultura as células a cada 3-4 dias, e realizar todos os experimentos com células que sofreram 3-8 passagens da fonte original.
- Transfira a suspensão celular para um tubo cônico de 15 mL, e gire as neurosferas a 100 × g por 5 min. Aspire o supernasciente e lave as neurosferas com 1x PBS (DPBS) de Dulbecco. Desça as neuroesferas a 100 × g por 5 min.
- Aspire o 1x DPBS e, em seguida, resuspenda as neurosferas no meio completo. Misture bem e suavemente.
- Adicione 1 mL da suspensão da neurosfera usando uma seringa de 1 mL que se conecta à torneira de 3 vias da tomada (Figura 4B- ).
5. Instalação do sistema microfluido para estimulação de pulso DC(Figura 6)
- Instale o chip MOE sem célula no aquecedor ITO transparente que está preso em um estágio motorizado X-Y-Z programável.
NOTA: A temperatura da superfície da ITO é controlada por um controlador de derivativos integrais proporcionais e mantida a 37 °C. Um termopar do tipo K é fixado entre o chip e o aquecedor ITO para monitorar a temperatura das regiões de cultura celular dentro do chip. O chip MOE é instalado em um estágio motorizado X-Y-Z programável e é adequado para aquisição automática de imagens de lapso de tempo em seções de canais individuais. A fabricação do aquecedor ITO e a configuração do sistema de aquecimento da cultura celular foram descritas anteriormente18,19. - Infundir os mNPCs bombeando manualmente no chip MOE através da tomada média. Incubar o chip MOE semeado por células no aquecedor ITO de 37 °C por 4 h.
- Após 4h, bombeie o meio completo através do chip MOE através da entrada média a uma vazão de 20 μL/h usando uma bomba de seringa.
NOTA: Os mNPCs são cultivados e mantidos no chip por mais 24 horas antes da estimulação EF para permitir o apego e o crescimento das células. O líquido de resíduos é coletado em uma seringa vazia de 5 mL conectada à torneira de 3 vias da tomada, mostrada como "resíduo" na Figura 6A. A configuração do sistema microfluido MOE é mostrada na Figura 6. Este sistema microfluido fornece um suprimento contínuo de nutrição para as células. O meio fresco completo é continuamente bombeado para o chip MOE para manter um valor constante de pH. Portanto, as células podem ser cultivadas fora de uma incubadora de CO2. - Use fios elétricos para conectar um multiplexer EF ao chip MOE através dos eletrodos Ag/AgCl no chip. Conecte um multiplexer EF e um gerador de função a um amplificador para saída de pulsos DC de ondas quadradas com uma magnitude de 300 mV/mm a uma frequência de 100 Hz a 50% de ciclos de serviço (50% de tempo de tempo e 50% de tempo de folga)(Figura 6B).
- Conecte os fios elétricos ao multiplexer EF. Conecte os fios elétricos ao chip MOE através dos eletrodos Ag/AgCl.
- Conecte o multiplexer EF ao amplificador usando fios elétricos. Conecte o gerador de função ao amplificador e ao osciloscópio digital.
NOTA: O multiplexer EF é um circuito que inclui a impedância da câmara de cultura no circuito e conecta todas as câmaras individuais em uma rede eletrônica paralela. Cada uma das três câmaras de cultura é eletricamente conectada em série a um resistor variável (Vr) e um amômetro (mostrado como μA na Figura 6A) no multiplexer. A corrente elétrica através de cada câmara de cultura é variada controlando o Vr, e a corrente é mostrada no amômetro correspondente. A força do campo elétrico em cada região de cultura celular foi calculada pela Lei de Ohm, I= σEA, onde eu sou a corrente elétrica, σ (definida como 1,38 S·m-1 para DMEM/F1220) é a condutividade elétrica do meio cultural, E é o campo elétrico, e A é a área transversal da câmara eletrotática. Para a dimensão da região da cultura celular mostrada na Figura 1,a corrente elétrica é de ~87 mA e ~44 mA para pulso DC e DC a 50% do ciclo de responsabilidade, respectivamente.
- Sujeito os mNPCs a pulsos DC quadrados com uma magnitude de 300 mV/mm na frequência de 100 Hz para 48h. Bombeie continuamente o meio completo a uma taxa de 10 μL/h para fornecer nutrição adequada às células e manter um valor constante de pH no meio.
6. Ensaios de imunofluorescência de mNPCs após estimulação de DC pulsada
NOTA: Nesta etapa, todo o reagente é bombeado através da entrada média usando uma bomba de seringa.
- Após 3, 7 ou 14 dias in vitro (DIV) culminando após a semeadura1, lave as células com 1x PBS a uma vazão de 25 μL/min por 20 minutos.
- Fixar as células com 4% de paraformaldeído (PFA). Bombeie 4% PFA no chip a uma vazão de 25 μL/min por 20 min para substituir o PBS 1x. Para substituir o PFA de 4%, lave as células com 1x PBS a uma vazão de 25 μL/min por 20 minutos.
- Bombeie 0,1% Triton X-100 no chip a uma vazão de 50 μL/min por 6 min para permeabiliizar as células. Reduza a vazão para 50 μL/h por mais 30 minutos para reagir com as células. Para substituir o Tritão X-100 de 0,1%, lave as células com 1x PBS a uma vazão de 50 μL/min por 6 min.
- Bloqueie as células com PBS contendo 1% de albumina de soro bovino (BSA) para reduzir a ligação de anticorpos não específicos. Bombeie 1% BSA no chip a uma vazão de 50 μL/min por 6 min. Reduza a vazão para 100 μL/h e bombee por 1h.
- Bombeie os anticorpos para imunossuer dupla no chip a uma vazão de 50 μL/min por 6 min, e incubar o chip por 18h a 4 °C. Lave as células com 1x PBS a uma vazão de 50 μL/min por 15 min.
- Bombeie os anticorpos secundários conjugados pela Alexa Fluor no chip a uma vazão de 50 μL/min por 6 min. Reduza a vazão para 50 μL/h e bombeie os anticorpos por 1h à temperatura ambiente no escuro. Lave as células com 1x PBS a uma vazão de 50 μL/min por 15 min.
- Para coloração nuclear, bombeie Hoechst 33342 para dentro do chip a uma taxa de fluxo de 20 μL/min por 10 minutos à temperatura ambiente no escuro. Lave as células com 1x PBS a uma vazão de 50 μL/min por 15 min.
- Após a imunostenção, observe as células usando um microscópio de fluorescência confocal.
7. Análise de imagens e processamento de dados
- Analise as imagens fluorescentes utilizando software com ferramentas de medição incorporadas (ver a Tabela de Materiais).
- Compare os núcleos hoechst-neutralizado (número total de células) nos grupos de controle e tratamento, e calcule a porcentagem de células expressando cada marcador fenotípico.
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Representative Results
A configuração detalhada do chip MOE é mostrada na Figura 1. O chip microfluido fornece uma abordagem benéfica para reduzir o tamanho da configuração experimental, o volume da amostra e o volume de reagentes. O chip MOE foi projetado para realizar três experimentos independentes de estimulação de EF e várias condições de imunossuagem simultaneamente em um único estudo(Figura 3). Além disso, o chip MOE, que possui alta transparência óptica, é adequado para exames de microscopia confocal. O chip MOE também foi projetado para investigar os efeitos de diferentes condições de cultura celular (por exemplo, estimulação múltipla de EF, várias drogas, diferentes substratos de revestimento, várias séries de células) simultaneamente em um único experimento.
Os mNPCs foram expostos a pulsos DC de ondas quadradas (magnitude 300 mV/mm a uma frequência de 100 Hz). A estimulação de pulso DC foi conduzida por 48 h. As células diferenciadas foram imunos detidas com Tuj1 (classe III específica do neurônio β-tubulina), proteína ácida fibrilar glial (GFAP para identificar astrócitos) e marcador oligodendrocyte O4. Após o tratamento de pulso DC, os mNPCs expressaram um número significativamente alto de neurônios (células Tuj1+) no DIV 7. No DIV 3, os astrócitos (células GFAP+) estavam presentes em níveis relativamente mais altos nos grupos de estimulação do que no grupo de controle (CTL). Em comparação com o grupo CTL, os oligodendrócitos (células O4+) foram significativamente maiores no grupo de estimulação em DIV 7 e DIV 14(Figura 7). Esses resultados mostram que a estimulação do pulso DC resultou em mNPCs diferenciando-se em neurônios, astrócitos e oligodenrócitos simultaneamente no meio de manutenção de células-tronco. Esses resultados sugerem que o sistema microfluido MOE é adequado para um estudo de diferenciação celular de longo prazo por microscopia.
Figura 1: A configuração detalhada do chip eletrotático opticamente transparente multicanal. (A) Visão explodida do conjunto do chip MOE. O chip MOE é composto por folhas PMMA (50 mm x 25 mm x 1 mm), fita dupla face (50 mm x 25 mm x 0,07 mm), adaptadores (10 mm x 10 mm x 6 mm), folha pmma de grau óptico (50 mm x 75 mm x 3 mm), fita dupla face (24 mm x 60 mm x 0,07 mm) e um vidro de capa (24 mm × 60 mm). Há três câmaras de cultura celular no chip MOE. O chip MOE tem orifícios de conexão para a entrada/saída média e as pontes de sal de ágar. As células foram cultivadas na região de cultura celular (largura 3 mm x comprimento 42 mm x altura 0,07 mm). A Figura 1A foi modificada de Chang et al.6. (B) Fotografia do chip MOE composto por adaptadores, folhas PMMA, fita dupla face e vidro de cobertura. Abreviaturas: MOE= eletrostático opticamente transparente multicanalmente transparente; PMMA = metacrilato de polimetila. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Os processos de fabricação e montagem do chip MOE. (A) Os padrões projetados das folhas pmma ou fita dupla face foram fabricados utilizando micromaquintação a laser. (B) As folhas individuais de PMMA foram cortadas por um escribra laser de CO2. (C) As múltiplas camadas das folhas de PMMA limpas foram unidas por um colador térmico. Abreviaturas: MOE= eletrostático opticamente transparente multicanalmente transparente; PMMA = methacrilato de polimetil; CO2 = dióxido de carbono. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Uma fotografia do chip MOE. Este valor foi modificado a partir de Chang et al.6. Abreviação: MOE= eletrostático opticamente transparente multicanal. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Conexão média e elétrica ao chip MOE. (A) Fotografia dos componentes para a rede de fluxo médio e a rede EF no sistema microfluido MOE, incluindo o tubo PTFE, conector de fundo plano, conector de cone, adaptador cone-Luer, plugue branco apertado, adaptador Luer, seringa de trava-luer, bung de borracha preta e os eletrodos Ag/AgCl. (B) Fotografia da configuração para a rede de fluxo médio. Abreviaturas: MOE= eletrostático opticamente transparente multicanalmente transparente; EF = campo elétrico; PTFE = politetrafluoroetileno; Ag = prata; AgCl = cloreto de prata. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Uma fotografia mostrando o chip MOE em um microscópio. Abreviaturas: MOE= eletrostático opticamente transparente multicanalmente transparente; Ag = prata; AgCl = cloreto de prata; ITO = índio-tin-óxido. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: A configuração e o sistema utilizado para a estimulação de pulso DC. (A) A configuração de todo o sistema para a estimulação de pulso DC. As seringas conectadas ao chip MOE foram utilizadas para infusão média e efflux de resíduos. O pulso DC no chip foi fornecido por uma fonte de alimentação conduzida através dos eletrodos Ag/AgCl. A configuração do dispositivo foi instalada no estágio motorizado X-Y-Z de um microscópio de contraste de fase invertido equipado com uma câmera digital. (B) Uma fotografia mostrando a configuração em um banco de laboratório. Abreviaturas: MOE= eletrostático opticamente transparente multicanalmente transparente; Ag = prata; AgCl = cloreto de prata; ITO = índio-estanho-óxido; EF = campo elétrico. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7: Diferenciação das células mNPC no grupo controle (CTL) e no grupo de estimulação de pulso DC no DIV 3, 7 e 14. A porcentagem de neurônios (células Tuj1+), astrócitos (células GFAP+) e oligodendrócitos (células O4+ ) em (A-C) o grupo CTL e (D-F) no grupo de estimulação (pulsos DC). Este valor foi publicado por Chang et al.1. Abreviaturas: CTL: controle; DC = corrente direta; Tuj1 = classe III específica do neurônio β-tubulina; GFAP = proteína ácida fibrilar gliana; O4 = oligodendrocyte marcador O4. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Durante a fabricação do chip MOE, os adaptadores são anexados à Camada 1 do chip MOE com cola cianoacrilato de ação rápida. A cola é aplicada em 4 cantos dos adaptadores e, em seguida, a pressão é aplicada uniformemente sobre os adaptadores. O excesso de cola deve ser evitado para garantir a polimerização completa da cola. Além disso, o conjunto completo de chips MOE é incubado em uma câmara de vácuo. Esta etapa ajuda a remover as bolhas entre a camada PMMA, a fita de dupla face e o vidro de cobertura.
A escolha do material do eletrodo baseia-se no fato de que os íons de cloreto, que estão abundantemente presentes no meio, são os produtos eletrolíticos que fluem pela região da cultura celular. Durante o experimento de estimulação do EF, o pH em torno dos eletrodos permaneceu constante. Uma configuração mais simples usando platina (Pt) como o material eletrodo eletrodo eletrolisa água e gera íons de hidrogênio (H+) e íons hidróxido (OH-) no eletrodo positivo e no eletrodo negativo, respectivamente, induzindo mudanças de pH na região da cultura. Evitar o uso de eletrodos pt contorna o problema das alterações de pH durante o experimento de estimulação EF.
A agarose quente e a agarose sem bolhas são essenciais durante a preparação da rede de pontes de sal. A agarose quente tem alta fluidez e pode ser facilmente injetada na rede de ponte salgada. Conecte a seringa de bloqueio Luer ao adaptador Luer depois de injetar a 3% de agarose quente no adaptador Luer. Durante esta etapa, a agarose será empurrada para dentro da seringa de bloqueio Luer para que uma conexão firme livre de bolhas da rede de ponte de sal possa ser alcançada. Bolhas nas pontes de sal aumentam a resistência elétrica e, portanto, a corrente elétrica prevista não pode ser alcançada. Após a injeção de ágarose, é importante esperar que a agarose esfrie e solidifique à temperatura ambiente por 10-20 minutos para evitar a formação de detritos de agarose solidificada na região da cultura celular.
O chip MOE é colocado em um aquecedor ITO que está bloqueado em um estágio motorizado X-Y-Z programável. Todo o sistema é construído sobre um microscópio de contraste de fase invertido equipado com uma câmera digital para monitorar a diferenciação celular dentro das regiões de cultura celular no chip. É conveniente observar a morfologia celular e a aquisição das imagens automáticas de lapso de tempo no sistema microfluido MOE fora de uma incubadora. Este sistema microfluido não só encurta o tempo experimental necessário, mas também aumenta a precisão do controle sobre o microambiente.
As células mNPC crescem como uma suspensão na mídia cultural. No entanto, os mNPCs que aderiram à placa revestida de PLL no chip MOE são fundamentais para a diferenciação. Neuroesferas formadas por 30-40 células são preferidas para iniciar a diferenciação mNPC. O crescimento excessivo de mNPCs prejudicará a sobrevivência celular durante o processo de diferenciação. Além disso, após a estimulação de DC pulsada, o experimental de coloração de imunofluorescência pode ser afetado pela vazão. Por isso, use várias taxas de fluxo para diferentes etapas para evitar o descolamento das células durante a lavagem.
Neste estudo, uma limitação dessa técnica é que o chip MOE não pode ser reutilizado devido à dificuldade na limpeza completa do chip. No entanto, o chip MOE pode ser colocado sob um microscópio de contraste de fase ou um microscópio confocal de varredura diretamente. O desenho de água apertada do sistema microfluido relatado garante que a evaporação tampão/médio não ocorra, mantendo a concentração precisa do tampão/médio e das propriedades elétricas correspondentes. Ao reduzir os volumes de reagentes e o tempo de operação correspondente, o sistema microfluido MOE fornece uma abordagem eficiente para estudar a diferenciação celular.
Um estudo anterior mostrou que o EGF e o bFGF promovem a sobrevivência, a expansão e a manutenção do NPC no estado indiferenciado4. Neste estudo, os pulsos dc induziram a diferenciação dos mNPCs no meio de manutenção de células-tronco que continham EGF e bFGF. Estudos anteriores relataram que a EF promove a diferenciação dos NPCs em neurônios e/ou astrócitos em meio de diferenciação sem EGF e bFGF14,21,22. Esses resultados mostram que os mNPCs se diferenciaram em neurônios, astrócitos e oligodenrócitos após a estimulação do pulso DC. Eles também sugerem que o simples tratamento de pulso DC poderia controlar o destino dos NPCs. Com maior otimização no tempo de estimulação, força de EF ou ciclo de dever, os pulsos DC podem ser aplicados para manipular a diferenciação do NPC e podem ser usados para o desenvolvimento de estratégias terapêuticas que empregam NPCs para tratar distúrbios do sistema nervoso.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Os autores agradecem ao professor Tang K. Tang, do Instituto de Ciências Biomédicas da Academia Sinica, por sua ajuda no fornecimento de células neurais neurais e progenitoras de camundongos (mNPCs). Os autores também agradecem ao Professor Tang K. Tang e à Sra. Ying-Shan Lee, por sua valiosa discussão sobre a diferenciação dos MNPCs.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mm PMMA substrates (Layers 1-3) | BHT | K2R20 | Polymethyl methacrylate (PMMA), http://www.bothharvest.com/zh-tw/product-421076/Optical-PMMA-Non-Coated-BHT-K2Rxx-xx=-thickness-choices.html |
| 15 mL plastic tube | Protech Technology Enterprise Co., Ltd | CT-15-PL-TW | Conical bottomed tube with cap, assembled, presterilized |
| 3 mL syringe | TERUMO | DVR-3413 | 3 mL oral syringes, without needle |
| 3 mm optical grade PMMA (Layer 5) | CHI MEI Corporation | ACRYPOLY PMMA Sheet | Optical grade PMMA |
| 3-way stopcock | NIPRO | NCN-3L | Sterile disposable 3-way stopcock |
| 5 mL syringe | TERUMO | DVR-3410 | 5 mL oral syringes, without needle |
| Adaptor | Dong Zhong Co., Ltd. | Customized | PMMA adaptor |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9414 | Agarose, low gelling temperature |
| Amplifier | A.A. Lab Systems Ltd | A-304 | High voltage amplifier |
| AutoCAD software | Autodesk | Educational Version | Drafting |
| B-27 supplement | Gibco | 12587-010 | B-27 supplement (50x), minus vitamin A |
| Basic fibroblast growth factor (bFGF) | Peprotech | AF-100-18B | Also called recombinant human FGF-basic |
| Black rubber bung | TERUMO | DVR-3413 | From 3 mL oral syringes, without needle |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | B4287 | Blocking reagent |
| Centrifuge | HSIANGTAI | CV2060 | Centrifuge |
| CO2 laser scriber | Laser Tools and Technics Corp. | ILS-II | Purchased from http://www.lttcorp.com/index.htm |
| Cone connector | IDEX Health & Science | F-120X | One-piece fingertight 10-32 coned, for 1/16" OD natural |
| Cone-Luer adaptor | IDEX Health & Science | P-659 | Luer Adapter 10-32 Female to Female Luer, PEEK |
| Confocal fluorescence microscope | Leica Microsystems | TCS SP5 | Leica TCS SP5 user manual, http://www3.unifr.ch/bioimage/wp-content/uploads/2013/10/User-Manual_TCS_SP5_V02_EN.pdf |
| Digital camera | OLYMPUS | E-330 | Automatic time-lapse image acquisition |
| Digital oscilloscope | Tektronix | TDS2024 | Measure voltage or current signals over time in an electronic circuit or component to display amplitude and frequency. |
| Double-sided tape | 3M | PET 8018 | Purchased from http://en.thd.com.tw/ |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium/Ham's nutrient mixture F-12 (DMEM/F12) | Gibco | 12400024 | DMEM/F-12, powder, HEPES |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Gibco | 21600010 | DPBS, powder, no calcium, no magnesium |
| EF multiplexer | Asiatic Sky Co., Ltd. | Customized | Monitor and control the electric current in individual channels |
| Epidermal growth factor (EGF) | Peprotech | AF-100-15 | Also called recombinant human EGF |
| Fast-acting cyanoacrylate glue | 3M | 7004T | Strength instant adhesive (liquid) |
| Flat bottom connector | IDEX Health & Science | P-206 | Flangeless male nut Delrin, 1/4-28 flat-bottom, for 1/16" OD blue |
| Function generator | Agilent Technologies | 33120A | High-performance 15 MHz synthesized function generator with built-in arbitrary waveform capability |
| Goat anti-mouse IgG H&L (Alexa Fluor 488) | Abcam | ab150117 | Goat anti-mouse IgG H&L (Alexa Fluor 488) preadsorbed |
| Goat anti-rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 555) | Abcam | ab150086 | Goat polyclonal secondary antibody to rabbit IgG - H&L (Alexa Fluor 555), preadsorbed |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H3570 | Nuclear staining |
| ImageJ software | National Institutes of Health | 1.48v | Analyze the fluorescent images |
| Indium–tin–oxide (ITO) glass | Merck | 300739 | For ITO heater |
| Inverted phase contrast microscope | OLYMPUS | CKX41 | For cell morphology observation |
| K-type thermocouple | Tecpel | TPK-02A | Temperature thermocouples |
| Luer adapter | IDEX Health & Science | P618-01 | Luer adapter female Luer to 1/4-28 male polypropylene |
| Luer lock syringe | TERUMO | DVR-3413 | For agar salt bridges |
| Mouse anti-GFAP | eBioscience | 14-9892 | Astrocytes marker |
| Oligodendrocyte marker O4 antibody | R&D Systems | MAB1326 | Oligodendrocytes marker |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | P6148 | Fixing agent |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Basic Life | BL2651 | Washing solution |
| Poly-L-Lysine (PLL) | SIGMA | P4707 | Coating solution |
| Precision cover glasses thickness No. 1.5H | MARIENFELD | 107242 | https://www.marienfeld-superior.com/precision-cover-glasses-thickness-no-1-5h-tol-5-m.html |
| Programmable X-Y-Z motorised stage | Tanlian Inc | Customized | Purchased from http://www.tanlian.tw/ndex.files/motort.htm |
| Proportional–integral–derivative (PID) controller | Toho Electronics | TTM-J4-R-AB | Temperature controller |
| PTFE tube | Professional Plastics Inc. Taiwan Branch | Outer diameter 1/16 Inches | White translucent PTFE tubing |
| Rabbit anti-Tuj1 | Abcam | ab18207 | Neuron marker |
| Syringe pump | New Era Systems Inc | NE-1000 | NE-1000 programmable single syringe pump |
| TFD4 detergent | FRANKLAB | TFD4 | Cover glass cleaner |
| Thermal bonder | Kuan-MIN Tech Co. | Customized | Purchased from http://kmtco.com.tw/ |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Permeabilized solution |
| Ultrasonic cleaner | LEO | LEO-300S | Ultrasonic steri-cleaner |
| Vacuum chamber | DENG YNG INSTRUMENTS CO., Ltd. | DOV-30 | Vacuum drying oven |
| White fingertight plug | IDEX Health & Science | P-316 | 1/4-28 Flat-Bottom, https://www.idex-hs.com/store/fluidics/fluidic-connections/plug-teflonr-pfa-1-4-28-flat-bottom.html |
References
- Chang, H. F., Lee, Y. S., Tang, T. K., Cheng, J. Y. Pulsed DC electric field-induced differentiation of cortical neural precursor cells. PLoS One. 11 (6), e0158133 (2016).
- Li, S., Li, H., Wang, Z. Orientation of spiral ganglion neurite extension in electrical fields of charge-balanced biphasic pulses and direct current in vitro. Hearing research. 267 (1-2), 111-118 (2010).
- Rajnicek, A. M., Robinson, K. R., McCaig, C. D. The direction of neurite growth in a weak DC electric field depends on the substratum: contributions of adhesivity and net surface charge. Developmental biology. 203 (2), 412-423 (1998).
- Kim, Y. H., et al. Differential regulation of proliferation and differentiation in neural precursor cells by the Jak pathway. Stem Cells. 28 (10), 1816-1828 (2010).
- Cunha, F., Rajnicek, A. M., McCaig, C. D. Electrical stimulation directs migration, enhances and orients cell division and upregulates the chemokine receptors CXCR4 and CXCR2 in endothelial cells. Journal of Vascular Research. 56 (1), 39-53 (2019).
- Chang, H. F., Cheng, H. T., Chen, H. Y., Yeung, W. K., Cheng, J. Y. Doxycycline inhibits electric field-induced migration of non-small cell lung cancer (NSCLC) cells. Scientific Reports. 9 (1), 8094 (2019).
- Tsai, H. F., Peng, S. W., Wu, C. Y., Chang, H. F., Cheng, J. Y. Electrotaxis of oral squamous cell carcinoma cells in a multiple-electric-field chip with uniform flow field. Biomicrofluidics. 6 (3), 34116 (2012).
- Huang, C. W., Cheng, J. Y., Yen, M. H., Young, T. H. Electrotaxis of lung cancer cells in a multiple-electric-field chip. Biosensors and Bioelectronics. 24 (12), 3510-3516 (2009).
- Jing, W., et al. Study of electrical stimulation with different electric-field intensities in the regulation of the differentiation of PC12 cells. American Chemical Society Chemical Neuroscience. 10 (1), 348-357 (2019).
- Guo, W., et al. Self-powered electrical stimulation for enhancing neural differentiation of mesenchymal stem cells on graphene-poly(3,4-ethylenedioxythiophene) hybrid microfibers. American Chemical Society Nano. 10 (5), 5086-5095 (2016).
- Manabe, M., Mie, M., Yanagida, Y., Aizawa, M., Kobatake, E. Combined effect of electrical stimulation and cisplatin in HeLa cell death. Biotechnology and Bioengineering. 86 (6), 661-666 (2004).
- Liu, M., et al. Protective effect of moderate exogenous electric field stimulation on activating netrin-1/DCC expression against mechanical stretch-induced injury in spinal cord neurons. Neurotoxicity Research. 34 (2), 285-294 (2018).
- Haan, N., Song, B. Therapeutic application of electric fields in the injured nervous system. Advances in Wound Care. 3 (2), 156-165 (2014).
- Ariza, C. A., et al. The influence of electric fields on hippocampal neural progenitor cells. Stem Cell Reviews and Reports. 6 (4), 585-600 (2010).
- Huang, C. W., et al. Gene expression of human lung cancer cell line CL1-5 in response to a direct current electric field. PLoS One. 6 (10), e25928 (2011).
- Sun, Y. S., Peng, S. W., Lin, K. H., Cheng, J. Y. Electrotaxis of lung cancer cells in ordered three-dimensional scaffolds. Biomicrofluidics. 6 (1), 14102-14114 (2012).
- Hou, H. S., Chang, H. F., Cheng, J. Y. Electrotaxis studies of lung cancer cells using a multichannel dual-electric-field microfluidic chip. Journal of Visualized Experiments. 106, e53340 (2015).
- Cheng, J. Y., Yen, M. H., Hsu, W. C., Jhang, J. H., Young, T. H. ITO patterning by a low power Q-switched green laser and its use in the fabrication of a transparent flow meter. Journal of Micromechanics and Microengineering. 17 (11), 2316-2323 (2007).
- Cheng, J. Y., Yen, M. H., Kuo, C. T., Young, T. H. A transparent cell-culture microchamber with a variably controlled concentration gradient generator and flow field rectifier. Biomicrofluidics. 2 (2), 24105 (2008).
- Fuhr, G., Shirley, S. G. Cell handling and characterization using micron and submicron electrode arrays: state of the art and perspectives of semiconductor microtools. Journal of Micromechanics and Microengineering. 5 (2), 77-85 (1995).
- AChang, K. A., et al. Biphasic electrical currents stimulation promotes both proliferation and differentiation of fetal neural stem cells. PLoS One. 6 (4), e18738 (2011).
- Lim, J. H., McCullen, S. D., Piedrahita, J. A., Loboa, E. G., Olby, N. J. Alternating current electric fields of varying frequencies: effects on proliferation and differentiation of porcine neural progenitor cells. Cell Reprogram. 15 (5), 405-412 (2013).
