Summary
我们提供一个详细的协议，电穿孔中化RNA干扰昆虫的顺序奥多纳塔（龙和水坝自体）使用蓝尾大坝自己（伊施努拉塞内加尔：科埃纳吉罗尼达：Zygoptera）和皮鱼掠食（伪themis zonata：利贝鲁利达：阿诗兰图。
Abstract
苍蝇和水坝（Order Odonata）是最具进化的祖传昆虫之一，它们从水生幼虫到没有幼崽阶段的陆生/空中成年人，急剧改变其栖息地、形态和行为。Odonata 成人拥有发达的色彩视觉，在性别、阶段和物种上表现出显著的身体颜色和图案多样性。虽然对奥多纳塔进行了许多生态学和行为学研究，但分子遗传学研究很少，主要是因为难以将基因功能分析应用于奥多纳塔。例如，如《利皮多普特拉》中所报道的，RNA干扰（RNAi）在奥多纳塔效果较低。为了克服这个问题，我们成功地建立了一种与体内电穿孔相结合的RNAi方法。在这里，我们提供详细的协议，包括电穿孔调解RNAi方法的视频，如下所示：幼虫的制备、物种鉴定、dsRNA/siRNA溶液和注射针的制备、幼虫的冰冷麻醉、dsRNA/siRNA注射、体内电穿孔和个体饲养直至成人出现。电穿孔中占RNAi方法适用于大坝自体（子顺序Zygoptera）和蛾（次顺序 Anisoptera）。在该协议中，我们提出了蓝尾水坝自我伊施努拉 塞内加尔 （Coenagrionidae）的方法，作为水坝物种和鱼皮掠食者伪特米斯佐 纳塔（ 利贝勒利达）作为另一个例子的食虫物种。作为代表性的例子，我们显示了RNAi靶向黑色素合成基因 多分子氧化酶2的结果。此RNAi方法将有助于理解与奥多纳塔的变质、形态生成、颜色模式形成和其他生物特征有关的各种基因功能。此外，此协议一般适用于非模型生物体，其中RNAi由于效率低下和低切青素而在基因抑制方面效果较低。
Introduction
龙和水坝（秩序奥多纳塔）是最祖传的昆虫群体，表现出"变形"1，2。通过变质，它们改变其栖息地，形态和行为急剧从水生幼虫到陆生/空中成人3。Odonata成人有一个发达的颜色视觉，代表了身体颜色和图案跨越性别，阶段和物种3，4，5的显著多样性。虽然对奥多纳塔进行了6、7项生态和行为研究，但分子遗传学研究主要由于难以将基因功能分析应用于奥多纳塔而受阻。
传统的RNA干扰（RNAi）方法，其中双链RNA（dsRNA）被注射，以抑制感兴趣的基因8的功能，结果在奥多纳塔昆虫9无效，如在Lepidopteran昆虫10报告。另一方面，以前的报告已经表明，电穿孔调制的RNAi在利皮多普坦物种中是有效的，特别是在表皮组织11、12、13。我们最近发现，电穿孔的RNAi在微小的南诺菲亚（利贝鲁利达：阿尼索普泰拉）9中有效工作，但N.pygmaea是一个相对罕见的物种，因此不适合分子遗传学研究。
大多数奥多纳塔物种被分为两个子顺序之一，Zygoptera（水坝）或安尼索普特拉（真正的蛾）3。在这里，我们重点介绍了蓝尾水坝的伊施努拉·塞内森西斯（科纳格里尼达;图1A）作为代表的齐戈普坦物种和皮鱼食龙伪特米斯佐纳塔（利贝鲁利达;图1B）作为一个代表的阿尼索普坦物种。这两种物种是日本自然和城市池塘中最常见的奥多纳塔物种之一，包括筑波市的物种，我们可以在野外采集两种物种的许多幼虫。最近，我们建立了一个实验室饲养系统，为个体幼虫的E.塞内加尔，使持续监测的发展，并在莫多纳塔幼虫的形态发生详细14。
在这份报告中，我们为 I.塞内加尔 和P.Zonata的电穿孔调解RNAi提供了一个 精细的方法和视频协议。在日本 ，I. 塞内加尔和 伊施 努拉亚洲，这是基因接近，往往发现共生15，他们很难区分在幼虫16。我们还描述了如何通过限制片段长度多态性 （RFLP） 来区分两个 Ischnura 物种。
为了评估电穿孔介质RNAi的有效性，我们选择多可可氧化酶2基因（MCO2;也称为laccase2）作为代表性靶基因，因为基因表达9被击倒时，具有明显的表型。众所周知，MCO2对于各种昆虫物种17、18的表皮变暗至关重要。
Protocol
注：协议的总体方案如图 1所示。
1. 准备幼虫或水坝。
- 用手网在野外收集幼虫。
注：I. 塞内加尼西斯幼虫经常粘在水面上漂浮的水植物上，而P.zonata幼虫则经常停留在底部的叶子垃圾中。在筑波市，主要从3月至6月发现伊塞内加尼西斯的星体幼虫，从5月到6月发现P.Zonata的幼虫。一、在实验室14日可从卵子中饲养幼虫，但该田中采集的幼虫在成人出现成功率明显较高。 - 通过限制PCR放大产品的片段长度多态性（RFLP）进行物种识别。
注：这一步是必要的，只有当物种是难以识别从幼虫的外观，如 在 I. 塞内加尔。- 用钳子握住幼虫的一个刺。然后，幼虫从它的胸刺本身脱落（导致自体切除术）。
注：Zygopteran水坝的幼虫通常有三个考达尔刺（图1A）。当他们被捕食者攻击时，他们可以脱掉自己的刺来逃跑。如果考达尔刺不可用，则解剖腿部的一部分。 - 将一个果刺放入 100 μL 的 PBS 溶液 [0.8% NaCl， 0.02% KCl， 0.115% Na2HPO4，和 0.02% KH2PO4 （w/v）] 与使用矿床的手动搅拌机均匀化。
- 在5000 x g下旋转混合物10秒，使用DNA聚合酶和底塑剂将0.5μL的上经液分解，以放大核DNA的内部转录空间器1（ITS1）区域。
注：根据制造商的协议执行 PCR。ITS-F0（5'-GGA AAG ATG GCC AAA CTT GA-3'）和5.8S-AS1（5'-GCC GGC CCT CAG CCA G-3'）底像的组合可以放大几乎所有奥多纳塔物种19中的 ITS1 区域。 - 孵育1 μL的PCR扩增产品、0.3μL的10x M缓冲液、0.1μL的DraI限制酶和1.6μL的水在37°C下1小时。
注：根据物种的组合，选择最佳限制酶。如果没有适合物种鉴定的限制酶，请通过DNA测序进行确认。 - 在2%的加糖凝胶上装载染料，并运行电泳，对产品进行2μL的装载。
注：使用1%或1.5%的阿加罗斯凝胶时，很难识别物种。 - 检查电泳模式以识别该物种（图2）。
注：RFLP 模式与物种和种群相关。在筑波种群中 ，I.asiatica 的主要波段为 400-500 bp， 而 I. 塞内加尔 人的主要波段约为 200 bp，另外的波段小于 100 bp（图 2中的箭头 ）。ITS1区域存在于基因组中的多个拷贝中， 在 Ischnura 物种中，ITS1 区域内的微卫星多态性通常存在于同一个体中，从而影响 RFLP 的模式。
- 用钳子握住幼虫的一个刺。然后，幼虫从它的胸刺本身脱落（导致自体切除术）。
- 在实验室中将收集的幼虫后部，直到用于RNAi。
- 将每个幼虫分别放入一个12井板的每个井中，并配有约3 mL的水。
注 ：I. 塞 内加尼西斯幼虫必须单独保存，因为它们经常互相食人， 而P.佐 纳塔幼虫可以保存在一组，因为它们很少吃人。 - 每天用阿特米亚盐水虾喂养一号幼虫，每周至少两次用血虫和/或图比菲克斯蠕虫喂养，直到它们生长到适合RNAi的发育阶段。
注：频繁喂食对提高成人的成功率至关重要。 - 一旦水被粪便或剩菜弄脏，请尽快更换。
注：频繁的换水对提高成人的成功率也很重要。 - 判断RNAi的适当发展阶段。
注：I.塞内加尔的星体幼虫可以分为五个发育阶段14，20。第一阶段（A阶段，在翅膀开始膨胀之前）或最后星幼虫的第二阶段（阶段B）适合RNAi实验，在成年后考虑RNAi的清晰表型时（见讨论）。在P.Zonata中，在翅膀扩张之前（与一级体（I.塞内加尔的一阶段相对应）的最终星体幼虫被用于本研究。
- 将每个幼虫分别放入一个12井板的每个井中，并配有约3 mL的水。
2. 为RNAi制备dsRNA/siRNA溶液和注射针。
注：选择小干扰RNA（siRNA）（步骤2.1）或双链RNA（dsRNA）（步骤2.2）作为RNAi的溶液。
- siRNA溶液的制备
- 设计siRNA使用siDirect程序版本2.0（http://sidirect2.rnai.jp/）21，遵循之前在Lepidopteran昆虫22中报道的指南。
- 获得商业合成的siRNA。
注：本研究中使用的针对I. 塞内加尔的MCO2 基因的 siRNA序列如下：5'- GCA CUU UCC GUU AU AU AUA -3' 用于感应链，5' - UAU UUGA UAA CGG A GUG CUC -3' 用于反感链。作为负对比，针对增强绿色荧光蛋白（EGFP）基因的siRNA序列如下：5'-GCA UCA AGG UGA ACU UCA AGA-3'用于感应链，5'-UUG AAG UUC ACC UUG AUG CCG-3'用于反感链11。 - 用注射缓冲液稀释siRNA至100μM [100 mM CH3COOK，2 mM Mg（CH3COO）2，30mM HEPES-KOH，pH 7.4]22。
- 储存在-80°C，直到使用。
- 制备 dsRNA 溶液。
- 使用底的是 4.1.0 （http://bioinfo.ut.ee/primer3/）23为 dsRNA 选择一个 300-400 bp 区域，并设计底图集。
- 获得商业合成底剂套件。
注：为了生成 dsRNA 合成的模板，本研究中使用的底像集如下：（5'-GCC TGT CAG TTT CTT CC-3' 表示正向底因，5'-GGT TTC TGG CGG ACA ACT AT-3' 用于反向底因）用于I. LC589180） 和 （5' - CCG CAC AGC TCA TCA TTC AA -3' 用于前向底因和 5' - GGA TTC CTT CAT CGA CA -3' 用于反向底因） 用于P. zonata的MCO2基因（PzMCO2，加入号.LC589179）。作为负对比，用于克隆载体上针对β-乳酸酶（bla）基因的dSRNA的底漆设置为（5'-CTA TGT GGC GCGGGGGGGGGTTA TTA T-3'用于正向底漆，5'-CAG AG TGG TGC TGC AAC TAC T-3'用于反向底漆）。 - 使用市售的RNA提取试剂盒从Odonata幼虫中提取RNA，并根据制造商的协议使用逆转录酶进行cDNA合成。
注：也可用于为RNA测序分析准备的cDNA库。 - 使用合成的cDNA和设计底转集放大目标序列，然后根据制造商的协议使用商业连接体将它们克隆到克隆载体中。
- 将质粒转化为 大肠杆菌的细胞 ，并在隔夜孵育后拾取单个菌落。
- PCR 使用矢量上的底法放大插入区域。
- 通过桑格测序确认克隆序列。
- PCR-放大插入使用含有T7聚合酶启动子序列24，25的矢量底转。
注：本研究使用以下底注：T7-F （5' - TAA TAC GAC TCA CTA 标签 GGA GAC 标签 TCA TAT GGA T - 3'） 和 T7-R （5'- TAA TAC GAC TCA CTA 标签 GGA GAC CCG GG ATC CGA T - 3'） 25。 - 根据制造商的协议使用PCR纯化套件对PCR产品进行净化，用50μL的蒸馏水洗脱DNA，并使用离心蒸发器将洗脱DNA溶液浓缩到约10μL。
- 根据制造商的协议，通过体外转录合成 dsRNA。使用总共1000纳克模板DNA和洗脱合成的dsRNA与100μL的洗脱缓冲液。
- 使用分光光度计测量 dsRNA 的浓度，并在 1.5% 的 agarose 凝胶上通过电泳确认 dsRNA 的质量。
注：当dsRNA合成成功时，可以看到一个波段。 - 用洗脱缓冲液稀释 dsRNA 至 1000 ng/μL，并储存在 -20°C，直到使用。
- 注射针的准备
- 使用玻璃拔针器拉玻璃毛细管。
- 将拉毛细管的尖端放在双面胶带上，用钳子击碎毛细管的尖端。
- 将毛细管设置为喷油器。
注：如果您戴亚硝酸盐手套，处理毛细管更容易。 - 将 siRNA/dsRNA 溶液加载到准备好的毛细管中。
注：不要反复使用毛细管，因为注射毛细管的尖端可能会被污垢堵塞，因为在田间收集的幼虫生活在泥浆中。
3. 西RNA/dSRNA注射
注：对于大坝自带（步骤 3.1）和蛾（步骤 3.2），程序略有不同。
- 注射到齐戈普坦（自丹）幼虫（例如 ，I. 塞内加内西斯）。
- 在碎冰上用湿纸覆盖的幼虫麻醉50-70秒（图3A-C）。
注：冰冷麻醉的持续时间取决于幼虫的状况;如果幼虫在70秒的冰冷麻醉后开始移动，则额外应用70秒的冰冷麻醉。对于很少移动的幼虫（例如 ，P.Zonata），这个程序不是必要的。 - 在 prothorax 的两侧连接两个针脚，将幼虫固定在固定支架上（例如，一块发泡胶）（图 3D）。
注：根据喷射位置调整引脚的位置和数量。 - 在腹部的 RNAi 的第 7 和 8 腹部段之间或用手和钳子在胸腔中为 RNAi 拉伸的 prothorax 和 synthorax（熔融间索托拉克斯和 metathorax）之间的段间膜。
- 保持部际膜用手拉伸。
- 将准备好的毛细管的尖端插入拉伸的分段膜（图3D，3F）。
- 注射1 μL的siRNA/dsRNA溶液。
- 在碎冰上用湿纸覆盖的幼虫麻醉50-70秒（图3A-C）。
- 注射到阿尼索普坦（龙）幼虫（例如 ，P. 佐纳塔）。
- 用纸巾擦去幼虫表面的水。
- 如果需要，在 prothorax 的两侧连接两个针脚，将幼虫固定在固定支架上（例如，一块发泡胶）（图 3H）。
注：根据喷射位置调整引脚的位置和数量。就 P.Zonata而言，在这一步用针脚固定幼虫是没必要的。 - 用手拉伸第 4 个和 5 个腹部段之间的段间膜。
- 在第4至第5腹部之间的分段膜上用细针做一个小孔。
注：对于许多 Anisopteran（龙）物种来说，此过程是必要的，因为分段间膜太难直接插入玻璃毛细管。 - 将准备好的毛细管的尖端插入准备好的孔中（图3I）。
注：如图3H所示，幼虫的侧侧部分与成人的腹侧相对应，因此，如图3H-J所示，当治疗时，表型会VENTR。 - 注射1 μL的siRNA/dsRNA溶液。
4. 体内电穿孔
- 如果需要，添加更多的针脚将幼虫固定在固定支架上（例如，一块发泡胶）。
- 注射siRNA/dsRNA溶液后，使用钳子在幼虫表面涂抹两滴超声波凝胶。
- 将电极放在超声波凝胶上，侧端的正极注入siRNA/dsRNA溶液，另一侧为负极（图3E、3G、3J）。
注：不要直接触摸幼虫的表皮，以免电穿孔的燃烧效果。 - 使用电穿孔器生成 10 次电穿孔脉冲（每个脉冲 280 ms/s）。
注：根据种类、阶段和组织，调整电穿孔电压。在这项研究中，25V应用于 第一，塞内加尔 ，45V到 P.佐纳塔。 - 用纸巾擦去表面的剩余凝胶。
- 将经过处理的幼虫放在湿纸巾上约一天，以进行恢复，并在第二天将其转移到饲养箱中。
5. 特定于站点的表型分析
- 将I. 塞内加尔单独放在含有约 10 mL 水和一条纸巾的培养皿中，并保留P. zonata 与一次性无纺网（封闭笼14）。
- 对于 我来说，在幼虫停止进食后，将它们单独移动到一个塑料笼子里，用一次性无纺布网。
注意：不要将两个或两个多幼虫放在同一个笼子里。否则，他们成年后就会立即互相蚕食。 - 成人出现后，观察并拍摄正极放置用于电穿孔的周围表型。
注：表型仅出现在补丁中。由于色素沉着不全，表型在出现后往往难以立即识别。 - 为了检查RNAi的效率（例如，定量RT-PCR），如果表型是可见的，解剖区域，并将其与没有表型的区域进行比较。
注：RNAi表型的水平，即角质层脱色的大小和位置，在个体之间往往表现出相当大的差异（见图4）。 - 保持出现的成年人在100%EtOH为未来的分析。
注：奥多纳塔物种的身体颜色在死后会迅速褪色，因此在它们死亡前将它们储存在乙醇中非常重要。乙醇有时会使昆虫变色，在这种情况下，昆虫在死亡前就被冷冻了。
Representative Results
我们应用上述协议，将上述协议应用于针对MCO2基因和阴性对照基因的电穿孔调调RAI（EGFP表示siRNA，bla表示dsRNA）（i）在I.塞内加尔的腹部（图4），（ii）在I.塞内加尔的胸部（图5），和（三）在P.Zonata的腹部（图6）。RNAi实验的结果见表1。由于带负电荷的siRNA/dsRNA只被整合到带正电荷的细胞中，因此在正极被放置用于电穿孔的周围观察到RNAi表型。
在I.塞内加尔和P.Zonata中，当MCO2 RNAi与电穿孔结合执行时（表1），黑色、棕色和红褐色出现在放置正极区域周围的斑块中（图4、图5和图6中的白色箭头和虚线），如之前在N.pygea9中报告。相比之下，在注射控制基因（EGFP siRNA或bla dsRNA）（图4，图5和图6，表1）时，在电穿孔位点周围 未观察到表皮效应。此外，注射MCO2基因而不进行电穿孔对成人色素沉着没有影响（图4，表1），表明电穿孔对奥多纳塔的RNAi至关重要。应该注意的是，蓝色、绿色和黄色的色度不受参与角质层黑色素合成的MCO2基因的RNAi的影响，这合理反映了这样一个事实，即这些身体颜色归因于表皮细胞中通过透明角质层26可见的色素颗粒。如图4所示，接受siRNA治疗和dsRNA治疗的个体之间没有显著表型差异，而接受同一RNAi治疗的不同个体在RNAI表型的大小和位置上观察到显著差异（例如，比较图4中的两个ISMCO2 dsRNA 示例）。
为了确定最适合RNAi治疗的发育阶段，我们比较了RNAi治疗在五个形态阶段（A-E阶段）的表型结果（图7A）。在A和B阶段注射时，所有出现的成年人都观察到由MCO2 RNAi引起的黑色素色素沉着的抑制（图7C）。当注射在C和D阶段时，在一些出现的成年人中肯定观察到黑色素色素沉着的抑制，但其他成年人表现出由伤口引起的异常着色（图7B）。
图1：在奥多纳塔电穿孔的RNAI方法。A.伊什努拉塞内加尔人（科纳吉里奥尼达）作为具有代表性的水坝物种。B.伪特米斯佐纳塔 （利贝鲁利达） 作为代表性的龙类物种。C.协议的总体方案。蓝色和橙色的框分别表示国际符号和P.Zonata的协议。紫色框表示适用于这两个物种的常见协议。请单击此处查看此图的较大版本。
图2：基于 Ischnura 物种的限制片段长度多态性 （RFLP） 物种鉴定的代表性 结果。 箭头表示 I. 塞内加尔 - 特定波段。1， 2， 4： I. 亚洲， 3： I. 塞内加尔， M： 100 基对梯子标记. 请单击此处查看此图的较大版本。
图3：奥多纳塔电介质RNAI方法。A-C. 冰冷麻醉的 我. 塞内加内西斯.箭头表示幼虫。 A. 用湿纸把幼虫放在碎冰上。 B. 冰上幼虫的放大视图。 C. 覆盖着冰上湿纸的幼虫。 D-G. RNAi方法为 I. 塞内加尔。 D. 注射到胸部。 E. 胸部电穿孔。 F. 注射到腹部。 G. 腹部电穿孔。 H-J. RNAi 方法， 用于 P. zonata。 H. 在腹部打个小洞。 I. 注射到腹部。 J. 腹部电穿孔。箭头表示打孔或注射的点。*，-：正/负侧电极。数字表示腹部部分。 请单击此处查看此图的较大版本。
图4：在I.塞内加尔的腹部的RNAi表型的占线视图。白色箭头表示抑制黑色素化的区域。请单击此处查看此图的较大版本。
图5：RNAi表型的横向和后向视图，在I.塞内加尔的胸。白色箭头和虚线表示抑制色素沉着的区域。请单击此处查看此图的较大版本。
图6：在P.Zonata腹部的RNAi表型的 通风视图。 白色箭头和虚线表示抑制黑色化的区域。 请单击此处查看此图的较大版本。
图7：阶段依赖的IsMCO2 RNAi 效应在 I.塞内加尔的终星中。A.在这项研究中，复合眼在五个形态阶段（A-E阶段）的形态变化和成人出现天数。括号中的数字来自上一个报表14。B.伤口引起的色素沉着异常。箭头表示电穿孔位点。C.RNAi在五个形态阶段对I.塞内加尔的成人色素沉着的影响。条形上的数字表示个人数。请单击此处查看此图的较大版本。
| 物种 | I. 塞纳尼森西斯 | P.佐纳塔 | |||||||||
| 注入区域 | 腹部 | 胸 | 腹部 | ||||||||
| 锡尔纳/德纳 | 西纳尔 | 德斯纳 | 德斯纳 | 德斯纳 | |||||||
| 目标基因 | IsmCO2 | 埃及政府 | IsmCO2 | IsmCO2 | Bla | IsmCO2 | Bla | PzMCO2 | PzMCO2 | Bla | |
| 穿孔 | + | + | + | - | + | + | + | + | - | + | |
| 注射幼虫 | 22 | 25 | 30 | 6 | 53 | 12 | 20 | 17 | 5 | 9 | |
| 已出现的成年人 | 7 | 6 | 13 | 4 | 40 | 11 | 14 | 11 | 2 | 5 | |
| 色素区域较少的成年人（比例） | 7 (100%) |
0 (0%) |
13 (100%) |
0 (0%) |
0 (0%) |
10 (91%) |
0 (0%) |
11 (100%) |
0 (0%) |
0 (0%) |
|
表1.RNAi对成人色素沉着的影响在I.塞内加尔和P.Zonata.A阶段的结果在I.IsMCO2： I. 塞内加尔酶的多可可氧化酶 2基因， EGFP：增强的绿色荧光蛋白基因， bla： β乳酸酶基因从 pGEM-T 易向量， PzMCO2：多可可氧化酶2基因P. zonata..控制基因的结果代表了作者迄今进行的实验总数。
Discussion
RNAi 治疗的致命性
我们发现，RNAi治疗的致命性在很大程度上取决于奥多纳塔幼虫的饲养史和状况。在田间采集后不久，幼虫普遍健康，电穿孔调制RNAi治疗后死亡率较低。相比之下，在实验室中长期饲养的幼虫（例如一个月）往往成年的成功率很低。 在I.塞内加尔，而不是在野外收集的幼虫，在实验室中从卵子中饲养的幼虫可以使用14，但RNAi使用实验室饲养的幼虫的成功率往往比使用田间收集的幼虫低得多（许多人在变质过程中死亡）。此外，频繁的幼虫喂养和清洁水养殖对于提高成人的成功率和降低RNAi治疗的致命性非常重要。
RNAi 治疗效率
如上所述，RNAi表型的水平，即角质层脱色的大小和位置，在接受相同RNAi治疗的个体之间经常表现出相当大的差异（例如，图4），但表皮切入水平似乎在奥多纳塔物种之间明显不同。观察到的表型区域在I. 塞内加尔（图4-5）中比在 P. zonata （图6）和N. pygmaea9 中更大、更突出。这种差异可能是由于幼虫表面的角质层厚度，考虑到 I. 塞内加尔的角质层比P. zonata 和 N. pygmaea 的角质层更薄。据我们研究，siRNA和dsRNA的影响之间没有明显差异（图4，表1）。
RNAi 的适当发展阶段
应该注意的是，适当的幼虫分期对于有效执行RNAi非常重要。抑制成人色素沉着是由MCO2 RNAi在D阶段（约3天前成人出现前）引起的，这与上一次关于N.pygmaea9的报告一致。在C和D阶段注射时观察到的RNAi表型不如在A和B阶段治疗的表型明显，这表明C和D阶段可能为时已晚，不足以抑制基因表达。RNAi治疗的适当时机取决于基因表达的时间，MCO2基因在成人出现9期间表现出短暂的高表达，就像其他昆虫17、18一样。在臭虫普劳蒂亚斯塔利，RNAi敲掉MCO2基因从第4天开始注射27后，这是符合目前的结果。
我们先前对一体的研究表明，在B阶段之后，从天到成人出现的大多数最终星体幼虫之间表现出相对较小的变化，这表明B阶段可能与成人出现过程的开始相对应，之后，变质的发育过程以前缀和协调的方式进行14。当幼虫在C和D阶段进行RNAI治疗时，经常观察到伤口引起的形态异常（图7B，7C）。 这可能与这些阶段的变质的戏剧性进展有关，这表明应避免从阶段C和上阶段RNAi治疗。总之，我们建议在阶段 A 或 B（或在幼虫翅膀显著扩张之前）的最终星幼虫应用于 RNAi 实验。
电穿孔介质RNAi方法的有用性和优越性
传统的RNAi是一种简单而有力的实验方法，但一些昆虫谱谱，如蝴蝶10、甲虫28和9，表现出较低的RNAi效率，为此建立基因功能分析是一个重大挑战。在这项研究中，我们发现电穿孔的RNAi可以诱导局部基因抑制在蛾，几乎100%的效率，至少在表皮，如果在适当的发育阶段治疗（表1）。最近，基于CRISPR/Cas9的基因敲除已成功应用于各种昆虫，为非模型生物体29提供了强大的分子遗传工具。然而，在这里，我们指出，CRISPR/Cas9当然是伟大的，但电穿孔调解RNAi方法可能优于CRISPR/Cas9在某些方面。
首先，在电穿孔介质RNAi方法中，RNAi表型出现的身体区域可以通过电穿孔时正极的位置进行实验控制。此外，由于基因表达被抑制的区域在正极放置区域周围受到限制，RNAi 表型可以很容易地与同一个体中并排的对照表型进行比较。其次，与CRISPR/Cas9方法相比，注射的卵子必须饲养到成年才能观察到敲除表型，电穿孔调置的RNAi是优越的，因为通常可以在更短的时间内观察到基因敲除表型。例如，I.塞内加尔人需要三到四个月，从卵子到14，30岁的成年人需要一到两年的时间。然而，为了观察成人表皮中的RNAi表型，从dsRNA注射到B阶段最后一次的星体幼虫，到成人出现，需要不到一个月的时间（图7）。第三，电穿孔中显的RNAi方法需要将dsRNA注射到大幼虫中，这比微注射到CRISPR/Cas9方法所需的小鸡蛋中要容易得多。此外，电穿孔的RNAi适用于新产卵难以收集的昆虫物种。例如，P.Zonata的雌性在飞行过程中在水面上的漂浮植物上产卵，因此很难在野外和实验室中采集卵子。因此，我们预计，该协议可能一般适用于传统RNAi方法不能有效工作的非模型生物体。
Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们感谢森山先生的技术建议和支持，滨弘田和铃木瑞太郎收集奥多纳塔幼虫，和米沙信雅对手稿的有益评论。这项工作得到了JSPS KAKENHI授权号码JP18J21561到G和JP18H02491，JP18H04893，JP19H03287和JP20H04936到RF的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12-well plate | Violamo | VTC-P12 | For rearing larvae before injection |
| Brine shrimp eggs | JAPAN PET DESIGN | 4975677012396 | |
| Calibrated micropipette (1-5 µL) | Drummond | 2-000-001-90 | |
| Deposit pestle 1.5 mL | Thermo Fisher Scientific | K749520-0090 | |
| Digital high defenition microscope camera | Leica Microsystems | MC170HD | |
| Disposable non-woven mesh | HAKUGEN EARTH | DSC-105A | |
| DNA Ligation Kit Ver.2.1 | Takara Bio | 6022 | |
| DraI | Takara Bio | 1037A | |
| Electrode (1mmφ) | NEPAGENE | CUY650P1 | |
| Electroporator | CellProduce | Cure-gene | |
| Forceps | KOWA Forceps Industry | K-10 No1 | |
| Glass needle puller | NARISHIGE | PN-3 | |
| Hand mixer | AS ONE | 1-229-02 | |
| Hand net | HOGA | IS33-3B | |
| HEPES | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 346-01373 | For injection buffer |
| Insect pin capitate No. 3 | Shiga Konchu Fukyusha | N230 | For fixing larvae |
| KCl | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 163-03545 | For PBS |
| KH2PO4 | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 169-04245 | For PBS |
| KOAc | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 160-03175 | For injection buffer |
| KOH | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 168-21815 | For injection buffer |
| Laboratory Jack (150x150) | AS ONE | 1-4642-11 | For adjusting the position of the manipulator |
| LOGIQLEAN Gel for Ultrasound Hard type | GE Healthcare | 2369385 | |
| Manipulator | Muromachi Kikai Co., Ltd. | SJ-1 | For adjusting the position of the injector and the capillary |
| MEGAscript RNAi kit | Thermo Fisher Scientific | AM1626 | |
| Mg(OAc)2 | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 130-00095 | For injection buffer |
| Na2HPO4 | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 197-02865 | For PBS |
| NaCl | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 191-01665 | For PBS |
| Petri dish (5 cm diameter) | Iwaki | 1010-060 | For rearing injected larvae |
| Pneumatic Injector | NARISHIGE | IM-12 | |
| pT7Blue T-Vector | Novagen | 69820 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | QIAGEN | 28106 | |
| RNAiso Plus | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 9109 | |
| RNeasy Mini Kit | QIAGEN | 74106 | |
| Shiga micro insect pin with stainless headless | Shiga Konchu Fukyusha | N251 | For making a small hole |
| Stereoscopic microscope | Leica Microsystems | S8APO | |
| SuperScript IV Reverse Transcriptase | Thermo Fisher Scientific | 18090010 | |
| TaKaRa Ex Taq | Takara Bio | RR001B | For PCR-amplification from plasmid |
| Tks Gflex DNA Polymerase | Takara Bio | R060B | For PCR-amplification from caudal gill |
References
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