Summary
Vi leverer en detaljeret protokol for elektroporation-medieret RNA interferens i insekter af ordren Odonata (guldsmede og damselflies) ved hjælp af blå-tailed damselfly (Ischnura senegalensis: Coenagironidae: Zygoptera) og pied skiflue guldsmed guldsmed (Pseudothemis zonata: Libellulidae: Anptisoera).
Abstract
Guldsmede og damselflies (orden Odonata) repræsenterer en af de mest forfædres insekter med metamorfose, hvor de ændrer deres levesteder, morfologi, og adfærd drastisk fra akvatiske larver til terrestriske / antenne voksne uden pupal fase. Odonata voksne har en veludviklet farve vision og viser en bemærkelsesværdig mangfoldighed i kroppens farver og mønstre på tværs af køn, stadier og arter. Mens mange økologiske og adfærdsmæssige undersøgelser på Odonata er blevet gennemført, molekylære genetiske undersøgelser har været knappe primært på grund af vanskelighederne med at anvende gen funktionelle analyse til Odonata. For eksempel er RNA-interferens (RNAi) mindre effektiv i Odonata, som rapporteret i Lepidoptera. For at løse dette problem, vi med succes etableret en RNAi metode kombineret med in vivo elektroporation. Her giver vi en detaljeret protokol, herunder en video af den elektroporation-medieret RNAi metode som følger: forberedelse af larver, art identifikation, forberedelse af dsRNA / siRNA løsning og injektion nåle, iskold anæstesi af larver, dsRNA / siRNA injektion, in vivo elektroporation, og individuel opdræt indtil voksne fremkomsten. Den elektroporation-medieret RNAi metode gælder for både damselflies (underorden Zygoptera) og guldsmede (underorden Anisoptera). I denne protokol præsenterer vi metoderne for den blå-tailed damselfly Ischnura senegalensis (Coenagrionidae) som et eksempel på damselfly arter og pied skimmer guldsmed Pseudothemis zonata (Libellulidae) som et andet eksempel på guldsmed arter. Som repræsentative eksempler viser vi resultaterne af RNAi rettet mod melaninsyntesegen multicopper oxidase 2. Denne RNAi metode vil lette forståelsen af forskellige genfunktioner involveret i metamorfose, morfosese, farvemønster dannelse, og andre biologiske træk ved Odonata. Desuden kan denne protokol generelt anvendes på ikke-modelorganismer, hvor RNAi er mindre effektivt til genundertrykkelse på grund af ineffektivitet og lav penetrance.
Introduction
Guldsmede og damselflies (rækkefølgen Odonata) er blandt de mest forfædre grupper af insekter, der udviser "metamorfose"1,2. Ved metamorfose, de ændrer deres levested, morfologi, og adfærd drastisk fra akvatiske larver til terrestriske / antenne voksne3. Odonata voksne har en veludviklet farve vision og repræsenterer en bemærkelsesværdig mangfoldighed i kroppens farver og mønstre på tværs af køn, stadierogarter3,4,5. Mens mange økologiske og adfærdsmæssige undersøgelser på Odonata er blevetgennemført 6,7, molekylære genetiske undersøgelser er blevet hæmmet primært af vanskelighederne med at anvende gen funktionelle analyse til Odonata.
Den konventionelle RNA interferens (RNAi) metode, hvor dobbeltstrenget RNA (dsRNA) injiceres for at undertrykke funktionen af genet af interesse8, viste sig at være ineffektiv i Odonata insekter9, som rapporteret i Lepidopteran insekter10. På den anden side, tidligere rapporter har antydet, at elektroporation-medieret RNAi er effektiv i Lepidopteran arter, især i epidermal væv11,12,13. Vi har for nylig konstateret, at den elektroporation-medieret RNAi fungerer effektivt i den lille guldsmed Nannophya pygmaea (Libellulidae: Anisoptera)9, men N. pygmaea er en relativt sjælden art og derfor ikke egnet til molekylære genetiske undersøgelser.
De fleste Odonata arter er klassificeret i en af de to underordener, Zygoptera (damselflies) eller Anisoptera (ægte guldsmede)3. Her fokuserede vi på den blå-tailed damselfly Ischnura senegalensis (Coenagrionidae; Figur 1A) som en repræsentativ Zygopteran art og pied skimmer guldsmed Pseudothemis zonata (Libellulidae; Figur 1B) som en repræsentativ anisopteran art. De to arter er blandt de mest almindelige Odonata arter i naturlige og urbane damme i Japan, herunder dem i Tsukuba City, og vi kan samle mange larver af de to arter i marken. For nylig etablerede vi et laboratorieopdrætssystem for individuelle larver af I. senegalensis, som muliggjorde løbende overvågning af udvikling og morfogenese af Odonata larver i detaljer14.
I denne rapport, vi giver en raffineret metode og en video protokol for elektroporation-medieret RNAi i I. senegalensis og P. zonata. I Japan, I. senegalensis og Ischnura asiatica, som er genetisk tæt, findes ofte sympatrically15, og de er vanskelige at skelne i larver16. Vi beskriver også, hvordan to Ischnura arter kan skelnes ved begrænsning fragment længde polymorfi (RFLP).
Til vurdering af effektiviteten af den elektroporation-medieret RNAi, vælger vi multicopper oxidase 2 gen (MCO2; også kendt som laccase2) som et repræsentativt mål gen, på grund af den synlige fænotype af lysere neglebånd farve ved knockdown af genet udtryk9. MCO2 er kendt for at være afgørende for mørkfaring af epidermis i en række insektarter17,18.
Protocol
BEMÆRK: Protokollernes overordnede skema er vist i figur 1.
1. Forberedelse af larver af guldsmede eller damselflies.
- Indsamle larver i feltet ved hjælp af en hånd net.
BEMÆRK: I. senegalensis larver ofte klamrer sig til vandplanter flyder på vandoverfladen, mens P. zonata larver ofte ophold blandt blade kuld i bunden. I Tsukuba City er den sidste instar larver af I. senegalensis findes hovedsageligt fra marts til juni, og de af P. zonata fra maj til juni. I. senegalensis larver kan opdrættes fra æg ilaboratoriet 14, men larverne indsamlet i marken har klart højere succesrate for voksne fremkomsten. - Artsidentifikation ved begrænsning af fragmentets polymorfi (RFLP) af PCR-forstærkede produkter.
BEMÆRK: Dette trin er kun nødvendigt, hvis arten er vanskelig at identificere fra udseendet af larverne, som i I. senegalensis.- Hold en af halegællerne på en larve ved hjælp af saft. Derefter falder larven af sin halegælle selv (forårsager autotomy).
BEMÆRK: Larver af Zygopteran damselflies har normalt tre halebarler (Figur 1A). Når de bliver angrebet af et rovdyr, kan de tage deres egne hale gæller for at undslippe. Hvis halegarnen ikke er tilgængelig, dissekeres en del af benet. - Sæt en hale gælle i 100 μL PBS opløsning [0,8% NaCl, 0,02% KCl, 0,115% Na2HPO4,og 0,02% KH2PO4 (w / v)] og homogenisere med en hånd mixer ved hjælp af en depositle.
- Drej blandingen ned med 5.000 x g i 10 sekunder, og motiv 0,5 μL af supernatanten til PCR-forstærkning ved hjælp af DNA polymerase og primere til at forstærke den interne transskriberede spacer 1 (ITS1) region af det nukleare DNA.
BEMÆRK: Udfør PCR i henhold til producentens protokol. Kombinationen af ITS-F0 (5'- GGA AAG ATG GCC AAA CTT GA -3') og 5.8S-AS1 (5'- GCC GGC CCT CAG CCA G -3') primere kan forstærke ITS1-regionen i næsten alle Odonata-arter19. - Der inkuberes blandingen af 1 μL PCR-forstærket produkt, 0,3 μL 10x M Buffer, 0,1 μL DraI-restriktionsenzym og 1,6 μL vand ved 37 °C i 1 time.
BEMÆRK: Vælg de bedste restriktionsenzymer, afhængigt af kombinationen af arter. Hvis der ikke findes nogen restriktionsenzymer, der er egnede til artsidentifikation, skal du bekræfte ved HJÆLP AF DNA-sekvensering. - 2 μL af produkterne med læssefarve på 2% agarosegel og kør elektroforese.
BEMÆRK: Det er vanskeligt at identificere arter, når der anvendes 1% eller 1,5% agarosegel. - Kontroller elektroforesemønsteret for at identificere arten (figur 2).
BEMÆRK: RFLP-mønstre er arts- og populationsafhængige. I Tsukuba befolkning, I. asiatica har et stort bånd på 400-500 bp, mens I. senegalensis har et stort bånd på ca 200 bp og en ekstra bånd på mindre end 100 bp (en pilespids i figur 2). ITS1-regionen findes i flere kopier i genomet, og i Ischnura arter, mikrosatellit polymorfi i ITS1 regionen er ofte til stede i samme person, påvirker mønster af RFLPs.
- Hold en af halegællerne på en larve ved hjælp af saft. Derefter falder larven af sin halegælle selv (forårsager autotomy).
- Bag de indsamlede larver i laboratoriet, indtil de anvendes til RNAi.
- Placer hver larver separat i hver brønd af en 12-brønd plade med ca 3 ml vand.
BEMÆRK: I. senegalensis larver skal holdes individuelt, fordi de ofte kannibalize hinanden, mens P. zonata larver kan holdes i en gruppe, fordi de sjældent kannibalize. - Foder I. senegalensis larver med Artemia saltlage rejer hver dag og P. zonata larver med blodorm og / eller Tubifex orme mindst to gange om ugen, indtil de vokser til den passende udviklingsmæssige fase for RNAi.
BEMÆRK: Hyppig fodring er afgørende for at øge succesraten for voksnes opståen. - Skift vandet, så snart det bliver snavset med afføring eller rester.
BEMÆRK: Hyppige vandskift er også vigtigt at øge succesraten for voksne fremkomst. - Bedømmer den rette udviklingsfase for RNAi.
BEMÆRK: De sidste instar larver af I. senegalensis kan inddeles i fem udviklingstrin14,20. Den første fase (fase A, før vingerne begynder at udvide) eller den anden fase (fase B) af den endelige instar larver er egnet til RNAi eksperimenter, når man overvejer den klare fænotype af RNAi efter voksne fremkomst (se Diskussion). I P. zonata, den endelige instar larver før fløj ekspansion (svarende til fase A af I. senegalensis)blev anvendt i denne undersøgelse.
- Placer hver larver separat i hver brønd af en 12-brønd plade med ca 3 ml vand.
2. Forberedelse af dsRNA/siRNA-opløsning og injektionsnåle til RNAi.
BEMÆRK: Vælg enten lille interfererende RNA (siRNA) (trin 2.1) eller dobbeltstrenget RNA (dsRNA) (trin 2.2) som opløsning for RNAi.
- Forberedelse af siRNA-opløsningen
- Design siRNA ved hjælp af siDirect program version 2,0 (http://sidirect2.rnai.jp/)21,efter de retningslinjer, der tidligere er rapporteret i Lepidopteran insekter22.
- Få kommercielt syntetiseret siRNA.
BEMÆRK: Sekvenserne af siRNA rettet mod MCO2-genet af I. senegalensis, der anvendes i denne undersøgelse, var som følger: 5'- GCA CUU UCC GUU AUC AAU AUA -3' for sense strand og 5'- UAU UGA UAA CGG AAA GUG CUC -3' for antisense-streng. Som en negativ kontrol var sekvenserne af siRNA rettet mod forstærket grønt fluorescerende protein (EGFP) gen som følger: 5'- GCA UCA AGG UGA ACU UCA AGA -3' for sense strand og 5'- UUG AAG UUC ACC UUG AUG CCG -3' for antisense strand11. - SiRNA'en fortyndes til 100 μM med injektionsbuffer [100 mM CH3COOK, 2 mM Mg(CH3COO)2, 30 mM HEPES-KOH, pH 7.4]22.
- Opbevares ved -80 °C indtil brug.
- Forberedelse af dsRNA-opløsning.
- Vælg en 300-400 bp region for dsRNA ved hjælp af primer3 program version 4.1.0 (http://bioinfo.ut.ee/primer3/)23 og designe primer sæt.
- Få kommercielt syntetiserede primer sæt.
BEMÆRK: For at producere skabeloner til dsRNA syntese, primer sæt, der anvendes i denne undersøgelse var som følger: (5'- GCC TGT CTGT CTT CTT CTT CC -3' for fremad primer og 5'- GGT GTC TGG CGG ACA ACT AT -3' for omvendt primer) for MCO2 gener af I. senegalensis (IsMCO2, tiltrædelse nr. LC589180) og (5'- CCG CAC AGC TCA CTA TTC AA -3' for forward primer og 5'- GGA GGA TTC CTT CAT CGA CA -3' for omvendt primer) for MCO2 gener af P. zonata (PzMCO2, tiltrædelse nr. LC589179). Som en negativ kontrol var primeren indstillet til dsRNA rettet mod β-lactamase (bla)gen på kloningsvektoren (5'- CTA TGT GGC GCG GTA TTA T -3' for forward primer og 5'- CAG AAG TGG TCC TCC TGC AAC T -3' for omvendt primer). - Uddrag RNA fra Odonata larver ved hjælp af en kommercielt tilgængelig RNA ekstraktion kit og udføre cDNA syntese ved hjælp af omvendt transskription i henhold til producentens protokol.
BEMÆRK: cDNA bibliotek forberedt til RNA sekventering analyse kan også bruges. - Forstærke målet sekvenser ved hjælp af syntetiseret cDNA og den designede primer sæt og klone dem ind i kloning vektor ved hjælp af en kommerciel ligase i henhold til producentens protokol.
- Omdan plasmid i E. coli kompetente celler og afhente en enkelt koloni efter natten inkubation.
- PCR-forstærke indsætter regionen ved hjælp af primere på vektoren.
- Bekræft den klonede sekvens af Sanger-sekvens.
- PCR-forstærker indsatsen ved hjælp af vektorprimere , der indeholder T7 polymerasepromotorsekvensen24, 25.
BEMÆRK: I denne undersøgelse blev følgende primere anvendt: T7-F (5' - TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA GAC TAG TCA TAT GGA T - 3') og T7-R (5'- TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA GAC CCG GGG ATC CGA T - 3') 25. - Rens PCR-produktet ved hjælp af PCR-rensesættet i henhold til fabrikantens protokol, dna'et med 50 μL destilleret vand og koncentrat den eluterede DNA-opløsning til ca. 10 μL ved hjælp af en centrifugalfordampator.
- Syntetisere dsRNA ved in vitro transskription i henhold til producentens protokol. Brug i alt 1000 ng skabelon DNA og elute syntetiseret dsRNA med 100 μL el-buffer.
- Strube koncentrationen af dsRNA ved hjælp af et spektrofotometer og bekræfte kvaliteten af dsRNA ved elektroforese på en 1,5% agarose gel.
BEMÆRK: Et enkelt bånd kan ses, når dsRNA syntesen er vellykket. - DsRNA fortyndes til 1000 ng/μL med elutionbuffer og opbevares ved -20 °C indtil brug.
- Forberedelse af injektionsnåle
- Træk i en glaskapillær ved hjælp af en glasnål puller.
- Placer spidsen af den trukket kapillær på en dobbeltklæbende tape og bryde spidsen af kapillær med scer.
- Indstil kapillæren til en injektor.
BEMÆRK: Det er lettere at håndtere kapillæren, hvis du bruger nitrilhandsker. - Sifr.
BEMÆRK: Brug ikke kapillæren gentagne gange, da spidsen af den injicerede kapillær kan blive tilstoppet med snavs, fordi larverne, der er opsamlet i marken, boede i mudderet.
3. siRNA/dsRNA-injektion
BEMÆRK: Proceduren er lidt anderledes for damselflies (trin 3.1) og guldsmede (trin 3.2).
- Injektion til en Zygopteran (damselfly) larver (f.eks.
- Bedøve en larve dækket med et vådt papir på knust is i 50-70 sekunder (Figur 3A-C).
BEMÆRK: Varigheden af iskold anæstesi afhænger af larverens tilstand; hvis larven begynder at bevæge sig efter 70 sekunders iskold anæstesi, påføres yderligere 70 sekunders iskold anæstesi. For larver, der sjældent bevæger sig (f.eks. - Fastgør to stifter på begge sider af prothorax og fastgør larverne til en fast stander (f.eks. et stykke Styrofoam) (Figur 3D).
BEMÆRK: Juster positionen og antallet af stifter, afhængigt af injektionsstedet. - Strække inter-segmentale membran mellem 7th og 8th abdominal segment for RNAi i maven eller mellem prothorax og synthorax (smeltet mesothorax og metathorax) for RNAi i brystkassen ved hjælp af hænder og scef.
- Hold den intersegmentale membran strakt i hånden.
- Sæt spidsen af den forberedte kapillær ind i den strakte intersegmentale membran (Figur 3D, 3F).
- Injicer 1 μL siRNA/dsRNA-opløsning.
- Bedøve en larve dækket med et vådt papir på knust is i 50-70 sekunder (Figur 3A-C).
- Injektion til en Anisopteran (guldsmed) larver (f.eks P. zonata).
- Tør vandet af larveoverfladen med en køkkenrulle.
- Hvis det er nødvendigt, skal du fastgøre to stifter på begge sider af prothorax og fastgør larverne til en fast stand (f.eks. et stykke Styrofoam) (Figur 3H).
BEMÆRK: Juster positionen og antallet af stifter, afhængigt af injektionsstedet. I tilfælde af P. zonata, er det ikke vigtigt at fastsætte larver med stifter på dette trin. - Stræk den intersegmentale membran mellem det fjerde og femte abdominale segment i hånden.
- Lav et lille hul med en fin nål i den intersegmentale membran mellem det fjerde og femte abdominale segment.
BEMÆRK: Denne procedure er nødvendig for mange anisopteriske (guldsmed) arter, fordi den inter-segmentale membran er for svært at indsætte et glas kapillær direkte. - Sæt spidsen af den forberedte kapillær ind i det forberedte hul (Figur 3I).
BEMÆRK: Som vist i figur 3Hsvarer en del af larvens dorsale side til den voksnes ventrale side, så fænotypen fremstår ventralt, når den behandles som vist i figur 3H-J. - Injicer 1 μL siRNA/dsRNA-opløsning.
4. in vivo elektroporation
- Hvis det er nødvendigt, skal du tilføje flere stifter for at fastgøre larverne til en fast stand (f.eks. et stykke Styrofoam).
- Efter injektion af siRNA/dsRNA-opløsningen påføres to dråber ultralydgel på larveoverfladen ved hjælp af hvilker.
- Anvend elektroderne på ultralydgelen, med den positive elektrode på siden injiceret med siRNA/dsRNA-opløsningen og en negativ elektrode på den modsatte side (Figur 3E, 3G, 3J).
BEMÆRK: Rør ikke direkte ved larvens epidermis for at undgå elektroporationens brændende virkning. - Generer 10 gange elektroporationsimpulser (280 ms/s hver) ved hjælp af en elektroporator.
BEMÆRK: Juster elektroporationsspændingen, afhængigt af art, stadier og væv. I denne undersøgelse, 25 V blev anvendt til I. senegalensis og 45 V til P. zonata. - Tør den resterende gel af på overfladen med en køkkenrulle.
- Hold de behandlede larver hvilende på en våd køkkenrulle i ca. en dag til nyttiggørelse og overføre dem til en opdræt sag den følgende dag.
5. Stedspecifik fænotopisk analyse
- Opbevares individuelt i en petriskål (5 cm i diameter), der indeholder ca. 10 ml vand og et stykke køkkenrulle, og P. zonata opbevares i et plastikbur med engangsint vævet net (eclosionbur14).
- For I. senegalensis, efter larverne stoppe med at spise, flytte dem individuelt ind i en plastik bur med en engangs ikke-vævede mesh.
BEMÆRK: Læg ikke to eller flere larver i samme bur. Ellers vil de cannibalize hinanden umiddelbart efter de bliver voksne. - Efter fremkomsten af den voksne, observere og fotografere fænotypen omkring den region, hvor den positive elektrode blev placeret til elektroporation.
BEMÆRK: Fænotypen vises kun i plastre. Fænotyper er ofte vanskelige at genkende umiddelbart efter fremkomsten på grund af ufuldstændig pigmentering. - For at undersøge effektiviteten af RNAi (f.eks kvantitativ RT-PCR), hvis fænotypen er synlig, dissekere regionen og sammenligne det med regionen uden fænotype.
BEMÆRK: Niveauerne af RNAi fænotype, nemlig størrelse og placering af neglebånd affarvning, udviser ofte betydelig variation mellem individer (se figur 4). - Hold de fremkomne voksne i 100% EtOH til fremtidige analyser.
BEMÆRK: Kropsfarve odonata arter hurtigt svinder efter døden, så det er vigtigt at gemme dem i ethanol, før de dør. Ethanol undertiden misfarver insekter, i sådanne tilfælde, at insekterne er frosset, før de dør.
Representative Results
Vi anvendte ovenstående protokol til elektroporation-medieret RNAi rettet mod MCO2 gen- og negativt kontrolgener (EGFP for siRNA og bla for dsRNA) (i) i maven på I. senegalensis (Figur 4), (ii) i brystkassen af I. senegalensis (Figur 5) og (iii) i maven på P.nata zo ( Figur6). Resultaterne af RNAi-forsøgene er sammenfattet i tabel 1. Da negativt ladede siRNA/dsRNA kun er indarbejdet i positivt ladede celler, blev RNAi fænotyper observeret omkring den region, hvor den positive elektrode blev placeret til elektroporation.
I både I. senegalensis og P. zonatadukkede hæmning af melaninpigmentering (dvs. sort, brun og rødbrun) op i pletter omkring det område, hvor den positive elektrode blev placeret (hvide pilespidser og stiplede linjer i figur 4, Figur 5og Figur 6), da MCO2 RNAi blev udført i kombination med elektroporation (tabel 1), som tidligere rapporteret i N. pymagea9. Derimod blev der ikke observeret fænotopypiske virkninger omkring elektroporationsstedet, når kontrolgenet blev injiceret (EGFP siRNA eller bla dsRNA) (Figur 4, Figur 5og Figur 6, Tabel 1). Desuden havde injektion af MCO2-genet uden elektroporation ingen effekt på voksenpigmentering (figur 4, tabel 1), hvilket indikerer, at elektroporation er afgørende for RNAi i Odonata. Det skal bemærkes, at den blå, grønne og gule farve ikke er påvirket af RNAi af MCO2 gen, der er involveret i melanin syntese i neglebånd, som plausibelt afspejler det faktum, at disse kropsfarver tilskrives pigment granulat til stede i epidermale celler, der er synlige gennem den gennemsigtige neglebånd26. Som vist i figur 4blev der ikke konstateret bemærkelsesværdige fænokripiske forskelle mellem de personer, der blev udsat for siRNA-behandling og dsRNA-behandling, mens der blev observeret en betydelig variation i RNAi-fænotypens størrelse og placering blandt forskellige personer, der blev udsat for samme RNAi-behandling (f. sammenligne to eksempler på IsMCO2 dsRNA i figur 4).
For at bestemme det udviklingsstadiet, der var bedst egnet til RNAi-behandlingen, sammenlignede vi de fænotopypiske konsekvenser af RNAi-behandlingen på fem morfologiske stadier (fase A-E) i den endelige larve instar af I. senegalensis (Figur 7A). Hæmning af melaninpigmentering forårsaget af MCO2 RNAi blev observeret hos alle voksne, når de blev injiceret i fase A og B (Figur 7C). Når injiceres i fase C og D, undertrykkelse af melanin pigmentering blev helt sikkert observeret i nogle opstod voksne, men andre voksne udstillet unormal farvning forårsaget af sår (Figur 7B).
Figur 1: Elektroporation-medieret RNAi metoder i Odonata. A. Ischnura senegalensis (Coenagirionidae) som en repræsentativ damselfly arter. B. Pseudothemis zonata (Libellulidae) som en repræsentativ guldsmed arter. C. Protokollernes overordnede ordning. Blå og orange kasser angiver protokollerne for henholdsvis I. senegalensis og P. zonata. De lilla bokse angiver de fælles protokoller, der anvendes på begge arter. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Et repræsentativt resultat af begrænsningsfragmentlængden polymorfi (RFLP)-baseret artsidentifikation for Ischnura-arter. Arrowhead angiver I. senegalensis-specifikkebånd. 1, 2, 4: I. asiatica, 3: I. senegalensis, M: 100-base par stigen markør. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Elektroporationsmedieret RNAi-metode i Odonata. A-C. Iskold anæstesi af I. senegalensis. Pilespidser angiver en larver. A. Sætte en larve på knust is med et vådt papir. B. Forstørret udsigt over en larve på is. C. En larve dækket med et vådt papir på is. D-G. RNAi metode til I. senegalensis. D. Injektion i brystkassen. E. Elektroporation på brystkassen. F. Injektion i maven. G. Elektroporation på maven. H-J. RNAi metode til P. zonata. H. Laver et lille hul på maven. I. Injektion i maven. J. Elektroporation på maven. Pile angiver det punkt, hvor du laver et hul eller en indsprøjtning. +, -: Positive/negative sideelektroder. Tal angiver mavesegmentet. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Dorsal visninger af RNAi fænotyper på maven af I. senegalensis. Hvide pilespidser angiver områderne med undertrykt melanisering. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Side- og dorsale synspunkter RNAi fænotyper på brystkassen af I. senegalensis. Hvide pilespidser og stiplede linjer angiver områderne for undertrykt pigmentering. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: Ventrale visninger af RNAi fænotyper i maven af P. zonata. Hvide pilespidser og stiplede linjer angiver områderne undertrykt melanisering. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7: Stage afhængige IsMCO2 RNAi effekter under den endelige larve instar af I.senegalensis. A. Morfologiske ændringer i de sammensatte øjne på fem morfologiske stadier (fase A-E) og antallet af dage til voksne fremkomst i denne undersøgelse. Tallene i parentes er fra tidligere rapport14. B. Unormal pigmentering på grund af sår. Pilespids angiver elektroporationsstedet. C. Virkningen af RNAi på fem morfologiske stadier på voksen pigmentering i I. senegalensis. Tallet på linjen angiver antallet af personer. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Arter | I.senegalensis | P.zonata | |||||||||
| Indsprøjtet region | Maven | Brystkassen | Maven | ||||||||
| siRNA/dsRNA | siRNA | dsRNA | dsRNA | dsRNA | |||||||
| Målgen | IsMCO2 | EGFR | IsMCO2 | IsMCO2 | Bla | IsMCO2 | Bla | PzMCO2 | PzMCO2 | Bla | |
| Elektroporation | + | + | + | - | + | + | + | + | - | + | |
| Injiceret larver | 22 | 25 | 30 | 6 | 53 | 12 | 20 | 17 | 5 | 9 | |
| Opstået voksne | 7 | 6 | 13 | 4 | 40 | 11 | 14 | 11 | 2 | 5 | |
| Voksne med mindre pigmenterede områder (forhold) | 7 (100%) |
0 (0%) |
13 (100%) |
0 (0%) |
0 (0%) |
10 (91%) |
0 (0%) |
11 (100%) |
0 (0%) |
0 (0%) |
|
Tabel 1. Virkningen af RNAi på voksen pigmentering i I. senegalensis og P. zonata. Resultater på trin A er vist i I. senegalensis. IsMCO2: multicopper oxidase 2 gen af I. senegalensis, EGFP: Forbedret grøn fluorescerende protein gen, bla: beta lactamase gen fra pGEM-T Easy Vector, PzMCO2: multicopper oxidase 2 gen af P. zonata. Resultaterne for kontrolgenerene repræsenterer det samlede antal eksperimenter, som forfatterne har udført til dato.
Discussion
Dødelighed af RNAi behandling
Vi fandt, at dødeligheden af RNAi behandling afhænger stærkt af opdræt historie og tilstand af Odonata larver. Larverne kort efter indsamling i marken er generelt sunde og udviser lav dødelighed efter den elektroporation-medieret RNAi behandling. Derimod har de larver, der opdrættes i laboratoriet i en lang periode (f.eks. en måned), en tendens til at lide under lave succesrater for voksnes opståen. I. senegalensis, i stedet for larver indsamlet i marken, larver opdrættet i laboratoriet fra æg kan anvendes14, men succesraten for RNAi ved hjælp af laboratorieopdrættet larver tendens til at være betydeligt lavere (mange personer døde under metamorfose) end dem, der bruger felt-indsamlede larver. Desuden er hyppig larvefodring og ren vandopdragelse vigtige for at øge succesraten for voksnes opståen og reducere dødeligheden af RNAi-behandlingen.
Effektiviteten af RNAi-behandling
Som beskrevet ovenfor udviste niveauerne af RNAi fænotype, nemlig størrelse og placering af neglebåndsdecoloriseringen, ofte betydelig variation mellem personer, der udsættes for den samme RNAi-behandling (f.eks. figur 4), men niveauerne af fænotypepensypenpicetrance synes at være bemærkelsesværdigt forskellige mellem Odonata-arterne. De observerede fænotopypiske regioner var større og mere fremtrædende i I. senegalensis (Figur 4-5) end i P. zonata (figur 6) og N. pygmaea9. Denne forskel kan skyldes tykkelsen af neglebånd på larve overfladen, i betragtning af at neglebånd af I. senegalensis er tyndere end neglebånd af P. zonata og N. pygmaea). Så vidt vi undersøgte, blev der ikke erkendt nogen klar forskel mellem virkningerne af siRNA og dsRNA (Figur 4, Tabel 1).
Passende udviklingsfase for RNAi
Det skal bemærkes, at korrekt larve iscenesættelse er vigtigt for at udføre RNAi effektivt. Hæmning af voksen pigmentering var forårsaget af MCO2 RNAi før fase D (ca. 3 dage før voksne fremkomst), hvilket er i overensstemmelse med den tidligere rapport om N. pygmaea9. De RNAi fænotyper, der blev observeret ved injektion i fase C og D, var mindre iøjnefaldende end dem, der blev behandlet i fase A og B, hvilket indikerer, at fase C og D kan være for sent til tilstrækkeligt at undertrykke genekspressionen. Den rette timing for RNAi-behandling afhænger af tidspunktet for genekspression, og MCO2-genet udviser forbigående højt udtryk under voksenspiring9som i andre insekter17,18. I stinkbug Plautia stali, RNAi knockdown af MCO2 genet blev observeret fra dag 4 og fremefter efter injektion27, hvilket er i overensstemmelse med de nuværende resultater.
Vores tidligere undersøgelse af I. senegalensis viste, at efter fase B, dage til voksne fremkomsten udviser relativt lille variation blandt de fleste af de endelige instar larver, hvilket tyder på, at fase B kan svare til starten af processen mod voksne fremkomst, hvorefter de udviklingsmæssige processer for metamorfose fortsætte i en præfiks og koordineret måde14. Morfologiske abnormiteter forårsaget af sår blev ofte observeret, når larverne blev RNAi-behandlet i fase C og D (Figur 7B, 7C). Dette vil sandsynligvis være forbundet med en dramatisk progression af metamorfose i disse faser, hvilket tyder på, at RNAi behandling bør undgås fra fase C og videre. Sammenfattende anbefaler vi, at endelige instar larver på trin A eller B (eller på det stadium, før larvevinger udvide betydeligt) bør anvendes til RNAi eksperimenter.
Nytte og overlegenhed af elektroporation-medieret RNAi metode
Den konventionelle RNAi er en enkel og kraftfuld eksperimentel metode, men nogle insekt slægter som sommerfugle10, bladlus28 og guldsmede9 udviser lav RNAi effektivitet, for hvilke etablering af genfunktion analyse er en stor udfordring. I denne undersøgelse fandt vi, at elektroporation-medieret RNAi kan fremkalde lokale gen undertrykkelse i guldsmede med næsten 100% effektivitet, i det mindste i epidermis, hvis de behandles på passende udviklingsstadier (Tabel 1). For nylig, CRISPR/Cas9-baserede gen knockouts er blevet anvendt med succes på en række insekter, hvilket giver en kraftfuld molekylær genetisk værktøj til ikke-model organismer29. Her påpeger vi dog, at CRISPR/Cas9 helt sikkert er fantastisk, men den elektroporation-medieret RNAi-metode kan være bedre end CRISPR/Cas9 i nogle henseender.
For det første kan den karrosseriregion, hvor RNAi fænotyper vises, nemt styres eksperimentelt ved placeringen af den positive elektrode ved elektroporation. Da den region, hvor genekspressionen undertrykkes, er begrænset omkring den region, hvor den positive elektrode blev placeret, kan RNAi fænotyperne let sammenlignes med kontrolfenotyperne side om side i samme individ. For det andet, sammenlignet med CRISPR/Cas9-metoden, hvor indsprøjtede æg skal opdrættes til voksenalderen for at observere knockout-fænotyperne, er den elektroporation-medieret RNAi overlegen, da genet knockdown fænotyper normalt kan observeres på meget kortere tid. For eksempel tager det tre til fire måneder for I. senegalensis og et til to år for P. zonata fra æg til voksne14,30. Men for at observere RNAi fænotyper inden for den voksne epidermis, det tager mindre end en måned fra dsRNA injektion i den endelige instar larver på trin B til voksne fremkomsten for både I. senegalensis og P. zonata (Figur 7). For det tredje indebærer den elektroporation-medieret RNAi-metode dsRNA-injektion i store larver, hvilket er lettere end mikroinjektion i bittesmå æg, der kræves til CRISPR/Cas9-metoden. Desuden gælder den elektroporationsmedierede RNAi for insektarter, hvis nylagte æg er vanskelige at indsamle. For eksempel lægger hunnerne af P. zonata æg på flydende planter på vandoverfladen under flyvningen, og derfor er det svært at samle deres æg både i marken og i laboratoriet. Derfor forventer vi, at denne protokol kan være generelt gældende for ikke-model organismer, hvor den konventionelle RNAi metode ikke fungerer effektivt.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi takker Minoru Moriyama for teknisk rådgivning og støtter, Bin Hirota og Ryutaro Suzuki for indsamling Odonata larver, og Misa Shinya for nyttige kommentarer til manuskriptet. Dette arbejde blev støttet af JSPS KAKENHI Grant Numbers JP18J21561 til GO og JP18H02491, JP18H04893, JP19H03287 og JP20H04936 til RF.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12-well plate | Violamo | VTC-P12 | For rearing larvae before injection |
| Brine shrimp eggs | JAPAN PET DESIGN | 4975677012396 | |
| Calibrated micropipette (1-5 µL) | Drummond | 2-000-001-90 | |
| Deposit pestle 1.5 mL | Thermo Fisher Scientific | K749520-0090 | |
| Digital high defenition microscope camera | Leica Microsystems | MC170HD | |
| Disposable non-woven mesh | HAKUGEN EARTH | DSC-105A | |
| DNA Ligation Kit Ver.2.1 | Takara Bio | 6022 | |
| DraI | Takara Bio | 1037A | |
| Electrode (1mmφ) | NEPAGENE | CUY650P1 | |
| Electroporator | CellProduce | Cure-gene | |
| Forceps | KOWA Forceps Industry | K-10 No1 | |
| Glass needle puller | NARISHIGE | PN-3 | |
| Hand mixer | AS ONE | 1-229-02 | |
| Hand net | HOGA | IS33-3B | |
| HEPES | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 346-01373 | For injection buffer |
| Insect pin capitate No. 3 | Shiga Konchu Fukyusha | N230 | For fixing larvae |
| KCl | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 163-03545 | For PBS |
| KH2PO4 | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 169-04245 | For PBS |
| KOAc | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 160-03175 | For injection buffer |
| KOH | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 168-21815 | For injection buffer |
| Laboratory Jack (150x150) | AS ONE | 1-4642-11 | For adjusting the position of the manipulator |
| LOGIQLEAN Gel for Ultrasound Hard type | GE Healthcare | 2369385 | |
| Manipulator | Muromachi Kikai Co., Ltd. | SJ-1 | For adjusting the position of the injector and the capillary |
| MEGAscript RNAi kit | Thermo Fisher Scientific | AM1626 | |
| Mg(OAc)2 | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 130-00095 | For injection buffer |
| Na2HPO4 | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 197-02865 | For PBS |
| NaCl | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 191-01665 | For PBS |
| Petri dish (5 cm diameter) | Iwaki | 1010-060 | For rearing injected larvae |
| Pneumatic Injector | NARISHIGE | IM-12 | |
| pT7Blue T-Vector | Novagen | 69820 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | QIAGEN | 28106 | |
| RNAiso Plus | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 9109 | |
| RNeasy Mini Kit | QIAGEN | 74106 | |
| Shiga micro insect pin with stainless headless | Shiga Konchu Fukyusha | N251 | For making a small hole |
| Stereoscopic microscope | Leica Microsystems | S8APO | |
| SuperScript IV Reverse Transcriptase | Thermo Fisher Scientific | 18090010 | |
| TaKaRa Ex Taq | Takara Bio | RR001B | For PCR-amplification from plasmid |
| Tks Gflex DNA Polymerase | Takara Bio | R060B | For PCR-amplification from caudal gill |
References
- Misof, B., et al. Phylogenomics resolves the timing and pattern of insect evolution. Science. 346 (6210), 763-767 (2014).
- Wipfler, B., et al. Evolutionary history of Polyneoptera and its implications for our understanding of early winged insects. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (8), 3024-3029 (2019).
- Corbet, P. S. Dragonflies Behavior and Ecology of Odonata. , Cornell University Press. Ithaca, NY. (1999).
- Futahashi, R. Color vision and color formation in dragonflies. Current Opinion in Insect Science. 17, 32-39 (2016).
- Futahashi, R. Diversity of UV reflection patterns in Odonata. Frontiers in Ecology and Evolution. 8 (201), (2020).
- Córdoba-Aguilar, A. Dragonflies and damselflies. Model organisms for ecological and evolutionary research. , Oxford University Press. Oxford. (2008).
- Bybee, S., et al. Odonata (dragonflies and damselflies) as a bridge between ecology and evolutionary genomics. Frontiers in Zoology. 13 (46), (2016).
- Linz, D. M., Clark-Hachtel, C. M., Borràs-Castelles, F., Tomoyasu, Y. Larval RNA interference the red flour beetle, Tribolium castaneum. Journal of Visualized Experiments. 92, 52059 (2014).
- Okude, G., et al. Electroporation-mediated RNA interference reveals a role of multicopper oxidase 2 gene in dragonfly’s cuticular pigmentation. Applied Entomology and Zoology. 53 (3), 379-387 (2017).
- Terenius, O., et al. RNA interference in Lepidoptera: An overview of successful and unsuccessful studies and implications for experimental design. Journal of Insect Physiology. 57, 231-245 (2011).
- Ando, T., Fujiwara, H. Electroporation-mediated somatic transgenesis for rapid functional analysis in insects. Development. 140, 454-458 (2013).
- Nishikawa, H., et al. A genetic mechanism for female-limited Batesian mimicry in Papilio butterfly. Nature Genetics. 47 (4), 405-409 (2015).
- Osanai-Futahashi, M., et al. Positional cloning of a Bombyx pink-eyed white egg locus reveals the major role of cardinal in ommochrome synthesis. Heredity. 116 (2), 135-145 (2016).
- Okude, G., Futahashi, R., Tanahashi, M., Fukatsu, T. Laboratory rearing system for Ischnura senegalensis (Insecta: Odonata) enables detailed description of dragonfly’s larval development and morphogenesis. Zoological Science. 34 (5), 386-397 (2017).
- Ozono, A., Kawashima, I., Futahashi, R. Dragonflies of Japan (3rd edition). , Bunichi-Sogo Syuppan, Co Ltd. Tokyo. (2017).
- Ozono, A., Kawashima, I., Futahashi, R. The Handbook of Japanese Aquatic Insects. Volume 3: Dragonfly larvae. , Bunichi-Sogo Syuppan, Co Ltd. Tokyo. (2019).
- Arakane, Y., Noh, M. Y., Asano, T., Kramer, K. J. Tyrosine metabolism for insect cuticle pigmentation and sclerotization. Extracellular Composite Matrices in Arthropods. , Springer. 165-220 (2016).
- Asano, T., et al. Mini-review an insect-specific system for terrestrialization: Laccase-mediated cuticle formation. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 108, 61-70 (2019).
- Futahashi, R., Okude, G., Sugimura, M., Ugai, S.
- Okude, G., Fukatsu, T., Futahashi, R. Interspecific crossing between blue-tailed damselflies Ischnura elegans and I. senegalensis in the laboratory. Entomological Science. 23 (2), 165-172 (2020).
- Naito, Y., Yoshimura, J., Morishita, S., Ui-Tei, K. siDirect 2.0: updated software for designing functional siRNA with reduced seed-dependent off-target effect. BMC Bioinformatics. 10, 392 (2009).
- Yamaguchi, J., Mizoguchi, T., Fujiwara, H. siRNAs induce efficient RNAi response in Bombyx mori embryos. PLoS ONE. 6 (9), e25469 (2011).
- Untergasser, A., et al.
- Futahashi, R. Whole-mount in situ hybridization of sectioned tissues of species hybrids to detect cis-regulatory changes in gene expression pattern. Methods in Molecular Biology. 772, 319-328 (2011).
- Matsuura, Y., Kikuchi, Y., Miura, T., Fukatsu, T. Ultrabithorax is essential for bacteriocyte development. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (30), 9376-9381 (2015).
- Henze, M. J., Lind, O., Wilts, B. D., Kelber, A. Pterin-pigmented nanospheres create the colours of the polymorphiic damselfly Ischnura elegans. Journal of The Royal Society Interface. 16, 20180785 (2019).
- Nishide, Y., et al. Diversity and function of multicopper oxidase genes in the stinkbug Plautia stali. Scientific Reports. 10 (1), 3464 (2020).
- Christiaens, O., Swevers, L., Smagghe, G. DsRNA degradation in the pea aphid (Acyrthosiphon pisum) associated with lack of response in RNAi feeding and injection assay. Peptides. 53, 307-314 (2014).
- Sun, D., Guo, Z., Liu, Y., Zhang, Y. Progress and prospects of CRISPR/Cas systems in insects and other arthropods. Frontiers in Physiology. 8, 608 (2017).
- Miyakawa, K. A study of the life-history of Pseudothemis zonata (Burm.) (Odonata, Libellulidae) II. Immature stage. Kontyû. 37 (4), 409-422 (1969).
