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Developmental Biology

ओडोनाटा में इलेक्ट्रोपॉनेशन-मध्यस्थता आरएनए हस्तक्षेप विधि

Published: February 6, 2021 doi: 10.3791/61952
Automatic Translation
1,2, 1,2,3, 2
1Department of Biological Sciences, Graduate School of Science, The University of Tokyo, 2Bioproduction Research Institute, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST), 3Graduate School of Life and Environmental Sciences, University of Tsukuba

Summary

हम नीले पूंछ वाले डैमसेल्फली(इस्चनुरा सेनेगलःज़िगोप्टेरा) और पिएड स्किमर ड्रैगनफ्लाई(स्यूडोथेमिस ज़ोनटा:लिबेलुलीडी: एनिसोपेरा) का उपयोग करके आदेश ओडोनाटा (ड्रैगनफ्लियों और डैमफ्लियों) की कीड़ों में इलेक्ट्रोपॉशन-मध्यस्थता आरएनए हस्तक्षेप के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं।

Abstract

ड्रैगनफ्लियों और डैमेफ्लियों (ऑर्डर ओडोनाटा) कायापलट के साथ सबसे पैतृक कीड़ों में से एक का प्रतिनिधित्व करते हैं, जिसमें वे अपने आवास, आकृति विज्ञान और व्यवहार को जलीय लार्वा से प्यूपल चरण के बिना स्थलीय/हवाई वयस्कों में काफी बदलते हैं। ओडोनाटा वयस्कों के पास एक अच्छी तरह से विकसित रंग दृष्टि होती है और लिंगों, चरणों और प्रजातियों में शरीर के रंगों और पैटर्न में उल्लेखनीय विविधता दिखाती है। जबकि ओडोनाटा पर कई पारिस्थितिक और व्यवहार अध्ययन किए गए हैं, आणविक आनुवंशिक अध्ययन मुख्य रूप से ओडोनाटा में जीन कार्यात्मक विश्लेषण लागू करने में कठिनाई के कारण दुर्लभ रहे हैं। उदाहरण के लिए, 1000 में ओडोनाटा में आरएनए हस्तक्षेप (आरएनएआई) कम प्रभावी है, जैसा कि लेपिडोप्टेरा में बताया गया है। इस समस्या को दूर करने के लिए, हमने वीवो इलेक्ट्रोपॉरेशन में संयुक्त रूप से एक आरएनएआई विधि की सफलतापूर्वक स्थापना की। यहां हम इलेक्ट्रोपाउशन-मध्यस्थता आरएनएआई विधि का एक वीडियो सहित एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं: लार्वा की तैयारी, प्रजातियों की पहचान, dsRNA/सिरना समाधान और इंजेक्शन सुई की तैयारी, लार्वा की बर्फ-ठंड संज्ञाहरण, dsRNA/सिराना इंजेक्शन, वीवो इलेक्ट्रोपॉरेशन में, और वयस्क उद्भव तक व्यक्तिगत पालन । इलेक्ट्रोपॉरेशन-मध्यस्थता आरएनएआई विधि दोनों डैमेजफ्लियों (सबऑर्डर ज़िगोप्टेरा) और ड्रैगनफ्लियों (सबऑर्डर एनिसोप्टेरा) पर लागू होती है। इस प्रोटोकॉल में, हम ब्लू-पूंछ वाले डैमसेल्फली इस्चनुरा सेनेगल (कोएनग्रिओनिडी) के लिए डीमसेल्फली प्रजातियों और पिड स्किमर ड्रैगनफ्लाई स्यूथेमिस ज़ोनटा (लिबेलुलिडे) के लिए ड्रैगनफ्लाई प्रजातियों के एक अन्य उदाहरण के रूप में तरीके प्रस्तुत करते हैं। प्रतिनिधि उदाहरण के रूप में, हम आरएनएआई के परिणामों को दिखाते हैं जो मेलेनिन संश्लेषण जीन मल्टीकॉपर ऑक्सीडेस 2को लक्षित करते हैं। यह आरएनएआई विधि कायापलट, मॉर्फोजेनेसिस, रंग पैटर्न गठन और ओडोनाटा की अन्य जैविक विशेषताओं में शामिल विभिन्न जीन कार्यों की समझ को सुगम बनाएगी। इसके अलावा, यह प्रोटोकॉल आम तौर पर गैर-मॉडल जीवों पर लागू हो सकता है जिसमें आरएनएआई अक्षमता और कम पेनेट्रेंस के कारण जीन दमन में कम प्रभावी है।

Introduction

ड्रैगनफ्लियों और डैमेफ्लियों (ऑर्डर ओडोनाटा) कीड़ों के सबसे पैतृक समूहों में से हैं जो "कायापलट"1, 2प्रदर्शितकरतेहैं। कायापलट से, वे जलीय लार्वा से अपने आवास, आकृति विज्ञान और व्यवहार को काफी हद तक बदलतेहैं। ओडोनाटा वयस्कों के पास एक अच्छी तरह से विकसित रंग दृष्टि होती है और लिंगों,चरणों और प्रजातियों3,4,5में शरीर के रंगों और पैटर्न में उल्लेखनीय विविधता का प्रतिनिधित्व करती है। जबकि ओडोनाटा पर कई पारिस्थितिक और व्यवहार अध्ययन आयोजित किए गए हैं6,7,आणविक आनुवंशिक अध्ययन मुख्य रूप से ओडोनाटा में जीन कार्यात्मक विश्लेषण लागू करने में कठिनाई से बाधित हुए हैं।

पारंपरिक आरएनए हस्तक्षेप (आरएनएआई) विधि, जिसमें डबल-फंसे आरएनए (डीएसआरएनए) को ब्याज8के जीन के कार्य को दबाने के लिए इंजेक्ट किया जाता है, ओडोनाटा कीड़े9में अप्रभावी हो गया, जैसा कि लेपिडोपटेरन कीड़े10में बताया गया है। दूसरी ओर, पिछली रिपोर्टों में सुझाव दिया गया है कि इलेक्ट्रोपॉरेशन-मध्यस्थता आरएनएआई लेपिडोपटेरन प्रजातियों में प्रभावी है, विशेष रूप से एपिडर्मल ऊतकों में11,12,13। हमने हाल ही में पाया कि इलेक्ट्रोपॉरेशन-मध्यस्थता आरएनएआई छोटे ड्रैगनफ्लाई नानोफिया पिगमैया (लिबेलुलाइटी: एनिसोपेरा) 9 में प्रभावीढंगसे काम करता है, लेकिन एन पिगमैया एक अपेक्षाकृत दुर्लभ प्रजाति है और इसलिए आणविक आनुवंशिक अध्ययन के लिए उपयुक्त नहीं है।

अधिकांश ओडोनाटा प्रजातियों को दो उप-आदेशों में से किसी में वर्गीकृत किया जाता है, ज़िगोप्टेरा (डैमेफ्लियों) या एनिसोपेरा (ट्रू ड्रैगनफ्लियों)3। यहां हमने नीली पूंछ वाले डैमसेल्फली इस्चनुरा सेनेगल (कोएनग्रिओनिडी) पर ध्यान केंद्रित किया; चित्रा 1A) एक प्रतिनिधि के रूप में ज़िगोप्टरन प्रजातियों और पिड स्किमर ड्रैगनफ्लाई स्यूडोथेमिस ज़ोनटा (लिबेलुलिडी; चित्रा 1B) एक प्रतिनिधि अनीसोपटेरन प्रजातियों के रूप में। दो प्रजातियां जापान में प्राकृतिक और शहरी तालाबों में सबसे आम ओडोनाटा प्रजातियों में से हैं, जिनमें त्सुकुबा शहर के लोग शामिल हैं, और हम क्षेत्र में दो प्रजातियों के कई लार्वा एकत्र कर सकते हैं । हाल ही में हमने आई सेनेगलकेअलग - अलग लार्वा के लिए एक प्रयोगशाला पालन प्रणाली स्थापित की, जिसने ओडोनाटा लार्वा के विकास और मॉर्फोजेनेसिस की निरंतर निगरानी14में सक्षम की ।

इस रिपोर्ट में, हम आई सेनेगलेंसिस और पी ज़ोनटा में इलेक्ट्रोपॉरेशन-मध्यस्थता आरएनएआई के लिए एक परिष्कृत विधि और एक वीडियो प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। जापान में, आई सेनेगलेंसिस और इशुनुरा एशियाटिका,जो आनुवंशिक रूप से करीब हैं, अक्सर15सहजरूप से पाए जाते हैं, और उन्हें लार्वा16में अंतर करना मुश्किल होता है। हम यह भी वर्णन करते हैं कि कैसे दो इस्चनुरा प्रजातियों को प्रतिबंध खंड लंबाई बहुरूपता (आरएफएलपी) द्वारा प्रतिष्ठित किया जा सकता है।

इलेक्ट्रोपॉर्मेशन-मध्यस्थता आरएनएआई की प्रभावशीलता का मूल्यांकन करने के लिए, हम जीन अभिव्यक्ति 9 के नॉकआउट पर पालर क्यूटिकल रंग के दृश्यमान फेनोटाइप के कारण, एक प्रतिनिधि लक्ष्य जीन के रूप में मल्टीकॉपर ऑक्सीडेस 2 जीन(MCO2,जिसे लैक्केस 2के रूप में भी जानाजाताहै) का चयन करते हैं। 17,18कीट प्रजातियों की एक किस्म में एपिडर्मिस के अंधेरे के लिए MCO2 को आवश्यक मानाजाताहै ।

Protocol

नोट: प्रोटोकॉल की समग्र योजना चित्रा 1में दिखाया गया है ।

1. ड्रैगनफ्लियों या डैमफ्लियों के लार्वा की तैयारी।

  1. एक हाथ जाल का उपयोग कर क्षेत्र में लार्वा ले लीजिए।
    नोट: I. सेनेगलस लार्वा अक्सर पानी की सतह पर तैरते पानी के पौधों पर चिपक जाते हैं, जबकि पी ज़ोनाटा लार्वा अक्सर नीचे पत्ती के कूड़े के बीच रहते हैं। त्सुकुबा शहर में, आई सेनेगलनेसिस के अंतिम इंस्टार लार्वा मुख्य रूप से मार्च से जून तक पाए जाते हैं, और मई से जून तक पी ज़ोनाटा के। I. सेनेगलेन्सिस लार्वा को प्रयोगशाला14में अंडों से पाला जा सकता है, लेकिन क्षेत्र में एकत्र लार्वा में वयस्क उद्भव की स्पष्ट रूप से उच्च सफलता दर होती है।
  2. पीसीआर-प्रवर्धित उत्पादों के प्रतिबंध खंड लंबाई बहुरूपता (आरएफएलपी) द्वारा प्रजातियों की पहचान।
    नोट: यह कदम केवल तभी आवश्यक है जब प्रजातियों को लार्वा की उपस्थिति से पहचानना मुश्किल हो, जैसा कि I. सेनेगल में होताहै।
    1. संदंश का उपयोग करके लार्वा के कौडल गिलों में से एक को पकड़ो। फिर, लार्वा अपने कौडल गिल से ही गिर जाता है (ऑटोटॉमी के कारण)।
      नोट: जाइगोप्टेरन डैमफ्लियों के लार्वा में आमतौर पर तीन कौडल गिल्स(चित्रा 1A) होतेहैं। जब वे एक शिकारी द्वारा हमला कर रहे हैं, वे बचने के लिए अपने स्वयं के कौडल गहरे नाले ले जा सकते हैं । अगर कौंडल गिल उपलब्ध नहीं है तो पैर का एक हिस्सा विच्छेदित कर दिया जाता है।
    2. पीबीएस समाधान के 100 माइक्रोन में एक कौडल गिल रखो [0.8% NaCl, 0.02% KCl, 0.115%एनए 2एचपीओ4,और 0.02% KH2पीओ4 (w/v)] और एक जमा पेस्टल का उपयोग कर हाथ मिक्सर के साथ होमोजेनाइज करें।
    3. 10 सेकंड के लिए 5,000 x ग्राम पर मिश्रण को स्पिन करें, और परमाणु डीएनए के आंतरिक लिखित स्पेसर 1 (ITS1) क्षेत्र को बढ़ाने के लिए डीएनए पॉलीमरेज और प्राइमर का उपयोग करके पीसीआर-प्रवर्धन के लिए सुपरनेट के विषय 0.5 माइक्रोन।
      नोट: निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार पीसीआर करें। आईटीएस-एफ0 (5'-जीजीए एएजी एटीजी जीसीसी एएए सीटीटी जीए-3') और 5.8S-AS1 (5'-जीसीसी जीजीसी सीसीटी सीसीसीए जी-3') प्राइमर का संयोजन लगभग सभी ओडोनाटा प्रजातियों में ITS1 क्षेत्र को बढ़ा सकता है19।
    4. पीसीआर-एम्पलीड उत्पाद के 1 माइक्रोन, 10x एम बफर के 0.3 माइक्रोन, ड्राई प्रतिबंध एंजाइम के 0.1 माइक्रोन, और 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 1.6 माइक्रोन पानी का मिश्रण करें।
      नोट: प्रजातियों के संयोजन के आधार पर सबसे अच्छा प्रतिबंध एंजाइमों का चयन करें। यदि प्रजातियों की पहचान के लिए उपयुक्त कोई प्रतिबंध एंजाइम नहीं हैं, तो डीएनए अनुक्रमण द्वारा पुष्टि करें।
    5. 2% एगर उठे जेल पर लोडिंग डाई के साथ उत्पादों के 2 माइक्रोन लोड करें और इलेक्ट्रोफोरेसिस चलाएं।
      नोट: 1% या 1.5% एगर उठे जेल का उपयोग करते समय प्रजातियों की पहचान करना मुश्किल है।
    6. प्रजातियों की पहचान करने के लिए इलेक्ट्रोफोरेसिस पैटर्न की जांच करें(चित्रा 2)।
      नोट: आरएफएलपी पैटर्न प्रजातियां और जनसंख्या पर निर्भर हैं। त्सुकुबा आबादी में, I. asiatica 400-500 बीपी का एक प्रमुख बैंड है, जबकि मैं सेनेगल के पास लगभग 200 बीपी का एक प्रमुख बैंड और 100 बीपी से कम का एक अतिरिक्त बैंड (चित्र 2 में एक एरोहेड) है। ITS1 क्षेत्र जीनोम में कई प्रतियों में मौजूद है, और Ischnura प्रजातियों में, ITS1 क्षेत्र के भीतर माइक्रोसेटेलाइट बहुरूपता अक्सर एक ही व्यक्ति में मौजूद है, RFLPs के पैटर्न को प्रभावित ।
  3. आरएनएआई के लिए उपयोग होने तक प्रयोगशाला में एकत्र लार्वा को पीछे करें।
    1. प्रत्येक लार्वा को लगभग 3 एमएल पानी के साथ 12-अच्छी प्लेट के प्रत्येक कुएं में अलग से रखें।
      नोट: I. सेनेगलेन्सिस लार्वा को व्यक्तिगत रूप से रखा जाना चाहिए क्योंकि वे अक्सर एक दूसरे को नरभक्षी करते हैं, जबकि पी ज़ोनाटा लार्वा को एक समूह में रखा जा सकता है क्योंकि वे शायद ही कभी नरभक्षी होते हैं।
    2. हर दिन आर्टेमिया नमकीन झींगा के साथ फ़ीड I. सेनेगलेन्सिस लार्वा और पी ज़ोनाटा लार्वा रक्तवर्म और/या ट्यूबिफेक्स कीड़े के साथ सप्ताह में कम से कम दो बार जब तक वे आरएनएआई के लिए उपयुक्त विकासात्मक चरण में नहीं बढ़ते।
      नोट: वयस्क उद्भव की सफलता दर को बढ़ाने के लिए लगातार भोजन महत्वपूर्ण है।
    3. मल या बचे हुए गंदे होते ही पानी बदल लें।
      नोट: वयस्क उद्भव की सफलता दर को बढ़ाने के लिए लगातार पानी में परिवर्तन भी महत्वपूर्ण है।
    4. आरएनएआई के लिए उचित विकासात्मक चरण का न्याय करें।
      नोट: आई सेनेगलके अंतिम इंस्टार लार्वा को पांच विकासात्मक चरणों में वर्गीकृत किया जा सकता है14,20। पहला चरण (चरण ए, पंखों का विस्तार शुरू होने से पहले) या अंतिम इंस्टार लार्वा का दूसरा चरण (चरण बी) आरएनएआई प्रयोगों के लिए उपयुक्त है, जब वयस्क उद्भव के बाद आरएनएआई के स्पष्ट फेनोटाइप पर विचार करते समय (चर्चा देखें)। पी ज़ोनाटामें, विंग विस्तार से पहले अंतिम इंस्टार लार्वा (आई सेनेगल केचरण ए के अनुरूप) का उपयोग इस अध्ययन में किया गया था।

2. आरएनएआई के लिए डीएसआरएनए/सिरना समाधान और इंजेक्शन सुइयों की तैयारी।

नोट: आरएनएआई के समाधान के रूप में या तो छोटे हस्तक्षेप आरएनए (सिराना) (चरण 2.1) या डबल-फंसे आरएनए (dsRNA) (चरण 2.2) का चयन करें।

  1. सिरना समाधान की तैयारी
    1. पहले लेपिडोप्टरन कीड़े 22 में रिपोर्ट किए गए दिशा-निर्देशों का पालन करते हुए सिडायरेक्ट प्रोग्राम संस्करण2.0(http://sidirect2.rnai.jp/)21का उपयोग करके एसआईआरएनए डिजाइन करें।
    2. व्यावसायिक रूप से संश्लेषित सिरना प्राप्त करें।
      नोट: इस अध्ययन में इस्तेमाल किए गए I. सेनेगलके MCO2 जीन को लक्षित करने वाले सिरना के दृश्य इस प्रकार थे: 5'-जीसीए क्यूयू यूसीसी गुयू एयू एएयू-3' सेंस स्ट्रैंड और 5 '-UAU UGA UAA CGG AAA GUUC-3' के लिए एंटीसेंस स्ट्रैंड के लिए । एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में, सिरना के दृश्यों को लक्षित बढ़ाया हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (EGFP)जीन इस प्रकार थे: 5'-जीसीए UCA AGG UGA एक्यू यूसी-3 ' भावना कतरा के लिए और 5 '-UUG AAG UUC एसीसी UUG AUG CCG-3 ' एंटीसेंस स्ट्रैंड11के लिए ।
    3. इंजेक्शन बफर के साथ 100 माइक्रोन के लिए सिरना पतला [100 mM CH3कुक, 2 mM Mg (CH3सीओओ)2,30 m M HEPES-KOH, पीएच 7.4]22.
    4. उपयोग होने तक -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  2. डीएसआरएनए समाधान की तैयारी।
    1. प्राइमर 3 प्रोग्राम वर्जन 4.1.0 (http://bioinfo.ut.ee/primer3/)23 का उपयोग करके डीएसआरएनए के लिए 300-400 बीपी क्षेत्र का चयन करें और प्राइमर सेट डिजाइन करें।
    2. व्यावसायिक रूप से संश्लेषित प्राइमर सेट प्राप्त करें।
      नोट: DsRNA संश्लेषण के लिए टेम्पलेट्स का उत्पादन करने के लिए, इस अध्ययन में इस्तेमाल किए गए प्राइमर सेट इस प्रकार थे: (5'-जीसीसी टीजीटी कैग सीटीटीटी टीजीटी सीटीटी सीसी-3' फॉरवर्ड प्राइमर और 5'-जीजीटी जीटीसी टीजीजीजी एसीए अधिनियम एटी-3' रिवर्स प्राइमर के लिए) I. सेनेगल्स के MCO2 जीन के लिए(IsMCO2,accession No) । एलसी589180) और (5'-सीसीजी सीएसी एजीसी टीसीए सीटीए टीटीसी एए-3' फॉरवर्ड प्राइमर के लिए और 5 '- जीजीए जीजीए टीटीसी सीटीटी कैट सीजीए सीए-3'रिवर्स प्राइमर के लिए) पी ज़ोनाटा (पीजेएमसीओ2,परिग्रहण संख्या) के MCO2 जीन के लिए। LC589179) । एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में, क्लोनिंग वेक्टर पर β-लैक्टामेज (बीएलए)जीन को लक्षित करने वाले डीएसआरएनए के लिए प्राइमर सेट (5'-सीटीए टीजीटी जीजीसी जीजीजी जीटीए टीटीए टी-3' फॉरवर्ड प्राइमर और 5'-कैग एजीजी टीसीसी टीजीसी टीएसी टी-3 रिवर्स प्राइमर के लिए) थे ।
    3. व्यावसायिक रूप से उपलब्ध आरएनए निष्कर्षण किट का उपयोग करके ओडोनाटा लार्वा से आरएनए निकालें और निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार रिवर्स ट्रांसक्रिप्टेज का उपयोग करके सीडीएनए संश्लेषण करें।
      नोट: आरएनए अनुक्रमण विश्लेषण के लिए तैयार सीडीएनए लाइब्रेरी का भी उपयोग किया जा सकता है।
    4. संश्लेषित सीडीएनए और डिज़ाइन किए गए प्राइमर सेट का उपयोग करके लक्षित दृश्यों को बढ़ाना और निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार वाणिज्यिक लीगास का उपयोग करके क्लोनिंग वेक्टर में क्लोन करें।
    5. प्लाज्मिड को ई. कोलाई सक्षम कोशिकाओं में बदलें और रात भर इनक्यूबेशन के बाद एक ही कॉलोनी उठाएं।
    6. पीसीआर-वेक्टर पर प्राइमर का उपयोग करके डालने वाले क्षेत्र को बढ़ाना।
    7. सेंगर अनुक्रमण द्वारा क्लोन किए गए अनुक्रम की पुष्टि करें।
    8. पीसीआर-टी 7 पॉलीमरेज प्रमोटर अनुक्रम24, 25युक्त वेक्टर प्राइमर का उपयोग करके डालने को बढ़ाना ।
      नोट: इस अध्ययन में, निम्नलिखित प्राइमर का उपयोग किया गया था: T7-F (5'-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA GAC TAG TCA TAT GGA T-3') और T7-R (5'-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA GAC CCG GGG ATC CGA T-3') 25।
    9. निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार पीसीआर शुद्धि किट का उपयोग करके पीसीआर उत्पाद को शुद्ध करें, डीएनए को 50 माइक्रोन आसुत पानी के साथ फैलाएं, और एक अपकेंद्रित्र वाष्पीकरण का उपयोग करके लगभग 10 माइक्रोन के लिए eluted डीएनए समाधान को केंद्रित करें।
    10. निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन द्वारा डीएसआरएनए को संश्लेषित करें। कुल 1000 एनजी टेम्पलेट डीएनए और एल्यूट संश्लेषित डीएसआरएनए का उपयोग 100 माइक्रोन बफर के साथ करें।
    11. स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके डीएसआरएनए की एकाग्रता को मापें और 1.5% एगर उठे जेल पर इलेक्ट्रोफोरेसिस द्वारा डीएसआरएनए की गुणवत्ता की पुष्टि करें।
      नोट: जब dsRNA संश्लेषण सफल है एक बैंड देखा जा सकता है ।
    12. एल्यूशन बफर के साथ 1000 एनजी/μL को पतला करें और उपयोग तक -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  3. इंजेक्शन सुइयों की तैयारी
    1. एक ग्लास सुई खींचने वाला का उपयोग करके एक ग्लास केशिका खींचो।
    2. खींचे गए केशिका की नोक को दो तरफा चिपकने वाले टेप पर रखें और केशिका की नोक को संदंश के साथ तोड़ दें।
    3. एक इंजेक्टर के लिए केशिका सेट करें।
      नोट: यदि आप नाइट्रिल दस्ताने पहनते हैं तो केशिका को संभालना आसान है।
    4. तैयार केशिका के लिए लोड सिरना/dsRNA समाधान ।
      नोट: बार-बार केशिका का उपयोग न करें क्योंकि इंजेक्शन केशिका की नोक गंदगी से भरी हो सकती है क्योंकि खेत में एकत्र लार्वा कीचड़ में रहते थे।

3. सिरना/dsRNA इंजेक्शन

नोट: प्रक्रिया कमाने के लिए थोड़ा अलग है (चरण 3.1) और ड्रैगनफ्लियों (चरण 3.2)।

  1. एक Zygopteran (damselfly) लार्वा (उदाहरण के लिए, मैं सेनेगल)के लिए इंजेक्शन ।
    1. 50-70 सेकंड(चित्रा 3ए-सी)के लिए कुचल बर्फ पर गीले कागज से ढके लार्वा को एनेस्थेटाइज करें।
      नोट: बर्फ-ठंड संज्ञाहरण की अवधि लार्वा की स्थिति पर निर्भर करती है; यदि लार्वा बर्फ-ठंडे संज्ञाहरण के 70 सेकंड के बाद स्थानांतरित करना शुरू कर देता है, तो अतिरिक्त 70 सेकंड की बर्फ-ठंड संज्ञाहरण लागू होती है। लार्वा के लिए जो शायद ही कभी आगे बढ़ता है (उदाहरण के लिए, पी ज़ोनटा),यह प्रक्रिया आवश्यक नहीं है।
    2. प्रोथोरैक्स के दोनों किनारों पर दो पिन संलग्न करें और लार्वा को एक निश्चित स्टैंड (उदाहरण के लिए, स्टायरोफोम का एकटुकड़ा) (चित्र 3 डी)में ठीक करें।
      नोट: इंजेक्शन की जगह के आधार पर पिन की स्थिति और संख्या को समायोजित करें।
    3. पेट में आरएनएआई के लिए 7 वें और 8 वें पेट खंड के बीच या प्रोथोरैक्स और सिंथोरेक्स (फ्यूज्ड मेसोथोरेक्स और मेटाथोरेक्स) के बीच हाथों और संदंश का उपयोग करके छाती में आरएनएआई के लिए अंतर-खंडित झिल्ली को फैलाएं।
    4. अंतर-खंडीय झिल्ली को हाथ से फैलाए रखें।
    5. तैयार केशिका की नोक को विस्तारित अंतर-खंडीय झिल्ली(चित्रा 3 डी, 3F)में डालें।
    6. सिरना/dsRNA समाधान के 1 μL इंजेक्ट ।
  2. एक एनिसोप्टरन (ड्रैगनफ्लाई) लार्वा (जैसे, पी ज़ोनटा)को इंजेक्शन।
    1. एक कागज तौलिया के साथ लार्वा सतह से पानी पोंछ।
    2. यदि आवश्यक हो, तो प्रोथोरैक्स के दोनों किनारों पर दो पिन संलग्न करें और लार्वा को एक निश्चित स्टैंड (जैसे, स्टायरोफोम का एकटुकड़ा) (चित्रा 3H)में ठीक करें।
      नोट: इंजेक्शन की जगह के आधार पर पिन की स्थिति और संख्या को समायोजित करें। पी ज़ोनाटाके मामले में, इस चरण में पिन के साथ लार्वा को ठीक करना आवश्यक नहीं है।
    3. हाथ से 4 और 5 पेट खंड के बीच अंतर-खंडीय झिल्ली को फैलाएं।
    4. 4 और 5 पेट खंड के बीच अंतर-खंडीय झिल्ली में एक ठीक सुई के साथ एक छोटा सा छेद बनाएं।
      नोट: यह प्रक्रिया कई एनिसोप्टरन (ड्रैगनफ्लाई) प्रजातियों के लिए आवश्यक है क्योंकि अंतर-खंडीय झिल्ली सीधे ग्लास केशिका डालने के लिए बहुत कठिन है।
    5. तैयार छेद(चित्रा 3I)में तैयार केशिका की नोक डालें।
      नोट: जैसा कि चित्रा 3Hमें दिखाया गया है, लार्वा के पृष्ठीय पक्ष का हिस्सा वयस्क के वेंट्रल पक्ष से मेल खाता है, इसलिए चित्र 3H-Jमें दिखाए जाने पर फेनोटाइप वेंट्रेली दिखाई देता है।
    6. सिरना/dsRNA समाधान के 1 μL इंजेक्ट ।

4. वीवो इलेक्ट्रोपाउशन में

  1. यदि आवश्यक हो, तो लार्वा को एक निश्चित स्टैंड में ठीक करने के लिए अधिक पिन जोड़ें (उदाहरण के लिए, स्टायरोफोम का एक टुकड़ा)।
  2. सिरना/dsRNA समाधान के इंजेक्शन के बाद, संदंश का उपयोग कर लार्वा सतह पर अल्ट्रासाउंड जेल की दो बूंदों को लागू करें ।
  3. अल्ट्रासाउंड जेल पर इलेक्ट्रोड रखें, साइड पर सकारात्मक इलेक्ट्रोड के साथ सिरना/dsRNA समाधान और विपरीत दिशा में एक नकारात्मक इलेक्ट्रोड(चित्रा 3E, 3G, 3J)के साथ इंजेक्शन ।
    नोट: इलेक्ट्रोपॉर्मेशन के जलने वाले प्रभाव से बचने के लिए लार्वा के एपिडर्मिस को सीधे न छुएं।
  4. इलेक्ट्रोपोरेटर का उपयोग करके 10 गुना इलेक्ट्रोपोरेशन दालें (280 एमएस/एस प्रत्येक) उत्पन्न करें।
    नोट: प्रजातियों, चरणों और ऊतकों के आधार पर इलेक्ट्रोपाउशन के वोल्टेज को समायोजित करें। इस अध्ययन में, 25 वी को आई सेनेगलसेन्सिस और 45 वी से पी ज़ोनटाके लिए आवेदन किया गया था।
  5. एक कागज तौलिया के साथ सतह पर शेष जेल को मिटा दें।
  6. इलाज लार्वा वसूली के लिए लगभग एक दिन के लिए एक गीले कागज तौलिया पर आराम रखें और उन्हें अगले दिन एक पालन मामले में स्थानांतरित करें।

5. साइट-विशिष्ट फेनोटाइपिक विश्लेषण

  1. मैं एक पेट्री डिश (व्यास में 5 सेमी) में व्यक्तिगत रूप से सेनेगल रखें जिसमें लगभग 10 एमएल पानी और कागज के तौलिया का एक टुकड़ा होता है, और पी ज़ोनाटा को एक प्लास्टिक पिंजरे में डिस्पोजेबल गैर-बुना हुआ जाल (eclosion पिंजरे14)के साथ रखें।
  2. I. सेनेगल केलिए, लार्वा खाने से रोकने के बाद, उन्हें एक डिस्पोजेबल गैर-बुना जाल के साथ प्लास्टिक पिंजरे में व्यक्तिगत रूप से स्थानांतरित करें।
    नोट: एक ही पिंजरे में दो या अधिक लार्वा न डालें। अन्यथा, वे वयस्क होने के तुरंत बाद एक दूसरे को नरभक्षी कर देंगे।
  3. वयस्क के उद्भव के बाद, उस क्षेत्र के चारों ओर फेनोटाइप का निरीक्षण और फोटोग्राफ करें जहां सकारात्मक इलेक्ट्रोड को इलेक्ट्रोपाउरेशन के लिए रखा गया था।
    नोट: फेनोटाइप केवल पैच में दिखाई देता है। फेनोटाइप अक्सर अधूरे पिगमेंटेशन के कारण उभरने के तुरंत बाद पहचानना मुश्किल होता है।
  4. आरएनएआई (जैसे, मात्रात्मक आरटी-पीसीआर) की दक्षता की जांच करने के लिए, यदि फेनोटाइप दिखाई दे रहा है, तो क्षेत्र को विच्छेदन करें और फेनोटाइप के बिना क्षेत्र के साथ तुलना करें।
    नोट: आरएनएआई फेनोटाइप का स्तर, अर्थात् क्यूटिकल डिकोलोराइजेशन का आकार और स्थान, अक्सर व्यक्तियों के बीच काफी भिन्नता प्रदर्शित करता है (चित्र 4देखें)।
  5. भविष्य के विश्लेषण के लिए 100% EtOH में उभरा वयस्कों रखें।
    नोट: ओडोनाटा प्रजातियों के शरीर का रंग मृत्यु के बाद जल्दी से फीका पड़ जाता है, इसलिए मरने से पहले उन्हें इथेनॉल में स्टोर करना महत्वपूर्ण है। इथेनॉल कभी-कभी कीड़ों को बदरंग कर देता है, ऐसे मामलों में कि कीड़े मरने से पहले जमे रहते हैं।

Representative Results

हमने इलेक्ट्रोपॉरेशन-मध्यस्थता आरएनएआई के लिए उपरोक्त प्रोटोकॉल लागू किया, जिसमें एमसीओ 2 जीन और निगेटिव कंट्रोल जीन (सिरना के लिएईजीएफपी और डीएसआरएनए के लिए बला) (i) आई सेनेगलेंसिस (चित्रा 4)के पेट में (आई) आई सेनेगलसेन्सिस (चित्रा 5)के छाती में और (तृतीय) पी ज़ोनटा (चित्रा 6)के पेट में लक्षित किया गया है। आरएनएआई प्रयोगों के परिणाम तालिका 1में संक्षेप में प्रस्तुत किए गए हैं। क्योंकि नकारात्मक रूप से चार्ज किए गए सिरना/डीएसआरएनए को केवल सकारात्मक आवेशित कोशिकाओं में शामिल किया जाता है, इसलिए उस क्षेत्र के चारों ओर आरएनएआई फेनोटाइप देखे गए जहां इलेक्ट्रोपॉनेशन के लिए सकारात्मक इलेक्ट्रोड रखा गया था ।

दोनों में मैं। सेनेगल और पी ज़ोनटा,मेलेनिन पिगमेंटेशन (यानी, काले, भूरे और लाल भूरे रंग) का अवरोध उस क्षेत्र के चारों ओर पैच में दिखाई दिया जहां सकारात्मक इलेक्ट्रोड रखा गया था (चित्रा 4, चित्रा 5और चित्रा 6में सफेद एरोहेड और बिंदीदार लाइनें) जब MCO2 आरएनएआई इलेक्ट्रोपॉनेशन(टेबल 1)के संयोजन में किया गया था, जैसा कि पहले एन में रिपोर्ट किया गया था। इसके विपरीत, जब नियंत्रण जीन(ईजीएफपी सिरना या बला डीएसआरएनए)(चित्र 4,चित्रा 5, और चित्र 6,तालिका 1)इंजेक्शन दिया गया था तो इलेक्ट्रोपॉनेशन साइट के आसपास कोई फेनोटाइपिक प्रभाव नहीं देखा गया था। इसके अलावा, इलेक्ट्रोपॉनेशन के बिना MCO2 जीन इंजेक्शन वयस्क पिगमेंटेशन(चित्रा 4, तालिका 1)पर कोई प्रभाव नहीं पड़ा, यह दर्शाता है कि Odonata में आरएनएआई के लिए इलेक्ट्रोपॉरेशन आवश्यक है । यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि नीले, हरे और पीले रंग के रंग MCO2 जीन के आरएनएआई से प्रभावित नहीं होते हैं जो क्यूटिकल में मेलेनिन संश्लेषण में शामिल होते हैं, जो इस तथ्य को प्रतिबिंबित करते हैं कि इन शरीर के रंगों को एपिडरमल कोशिकाओं में मौजूद पिगमेंट कणिकाओं के लिए जिम्मेदार ठहराया जाता है जो पारदर्शी क्यूटिकल26के माध्यम से दिखाई देते हैं। जैसा कि चित्रा 4में दिखाया गया है, सिरना उपचार और dsRNA उपचार के अधीन व्यक्तियों के बीच कोई उल्लेखनीय फेनोटाइपिक मतभेदों को पहचाना गया था, जबकि आरएनएआई फेनोटाइप के आकार और स्थान में काफी भिन्नता एक ही आरएनएआई उपचार के अधीन विभिन्न व्यक्तियों के बीच देखी गई थी (पूर्व. चित्रा 4में IsMCO2 dsRNA के दो उदाहरणों की तुलना करें)।

आरएनएआई उपचार के लिए सबसे उपयुक्त विकासात्मक चरण का निर्धारण करने के लिए, हमने आरएनएआई उपचार के फेनोटाइपिक परिणामों की तुलना अंतिम लार्वा इनस्टार ऑफ आई सेनेगलेंसिस (चित्रा 7 ए)में पांच रूपात्मक चरणों (चरण ए-ई) पर की। MCO2 RNAi के कारण मेलेनिन पिगमेंटेशन का अवरोध सभी उभरे हुए वयस्कों में देखा गया था जब चरणों ए और बी(चित्रा 7C)पर इंजेक्शन दिया गया था। जब सी और डी चरणों में इंजेक्शन दिया जाता है, तो मेलेनिन पिगमेंटेशन का दमन निश्चित रूप से कुछ उभरे वयस्कों में देखा गया था, लेकिन अन्य वयस्कों ने घावों(चित्रा 7 बी)के कारण असामान्य रंग-रूप का प्रदर्शन किया।

Figure 1
चित्रा 1:ओडोनाटा में इलेक्ट्रोपॉरेशन-मध्यस्थता आरएनएआई विधियां। A. एक प्रतिनिधि के रूप में इस्चनुरा सेनेगल (कोनागिरोनिडी) एक प्रतिनिधि के रूप में। B. एक प्रतिनिधि ड्रैगनफ्लाई प्रजातियों के रूप में छद्मथेमिस ज़ोनटा (लिबेलुलिडी)। सी. प्रोटोकॉल की समग्र योजना। नीले और नारंगी बक्से क्रमशः I. सेनेगल और पी ज़ोनाटाके लिए प्रोटोकॉल का संकेत देते हैं। बैंगनी बक्से दोनों प्रजातियों पर लागू आम प्रोटोकॉल का संकेत देते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें । 

Figure 2
चित्रा 2:प्रतिबंध खंड लंबाई बहुरूपता (आरएफएलपी) के एक प्रतिनिधि परिणाम Ischnura प्रजातियों के लिए आधारित प्रजातियों की पहचान । एरोहेड I. सेनेगलसेन्सिस-विशिष्टबैंड को इंगित करता है। 1, 2, 4: I. asiatica,3: मैं सेनेगल,एम: १००-बेस जोड़ी सीढ़ी मार्कर । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3:ओडोनाटा में इलेक्ट्रोपॉरेशन-मध्यस्थता आरएनएआई विधि। ए-सी। मैं सेनेगलके बर्फ ठंड संज्ञाहरण । एरोहेड एक लार्वा का संकेत देते हैं। A. गीले कागज के साथ कुचल बर्फ पर एक लार्वा लाना। B. बर्फ पर लार्वा का बढ़ाया दृश्य। सी. बर्फ पर गीले कागज से ढका लार्वा। डी-जी। मैं सेनेगलके लिए आरएनएआई विधि । डी. छाती में इंजेक्शन। ई. छाती पर विद्युत पूर्णता। एफ. पेट में इंजेक्शन। जी. पेट पर इलेक्ट्रोपाउशन। एच-जे। पी ज़ोनाटाके लिए आरएनएआई विधि । एच. पेट पर एक छोटा सा छेद बनाना। मैं। पेट में इंजेक्शन। जम्मू. पेट पर इलेक्ट्रोपाउशन। तीर एक छेद या इंजेक्शन बनाने की बात इंगित करता है। +, -: सकारात्मक/नकारात्मक पक्ष इलेक्ट्रोड । संख्या पेट के खंड को इंगित करती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्र 4: आई सेनेगलकेपेट पर आरएनएआई फेनोटाइप के पृष्ठीय दृश्य। सफेद तीर सिर दबा उदासी के क्षेत्रों का संकेत देते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्र 5: आई सेनेगलकेछाती पर आरएनएआई फेनोटाइप के पार्श्व और पृष्ठीय दृश्य । सफेद एरोहेड और बिंदीदार रेखाएं दबे हुए पिगमेंटेशन के क्षेत्रों को इंगित करती हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 6
चित्र 6: पी ज़ोनटाके पेट में आरएनएआई फेनोटाइप के वेंट्रल दृश्य। सफेद तीर और बिंदीदार रेखाएं दबी हुई मेलनाइजेशन के क्षेत्रों का संकेत देती हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 7
चित्रा 7:स्टेज पर निर्भर IsMCO2 RNAI प्रभाव I.senegalensis के अंतिम लार्वा इनस्टार के दौरान । A. पांच रूपात्मक चरणों (चरण ए-ई) पर यौगिक आंखों में रूपात्मक परिवर्तन और इस अध्ययन में वयस्क उद्भव के लिए दिनों की संख्या। कोष्ठक में संख्या पिछली रिपोर्ट14से हैं । B. घावों के कारण असामान्य पिगमेंटेशन। एरोहेड इलेक्ट्रोपॉरेशन साइट को इंगित करता है। सी. आई सेनेगलमेंवयस्क पिगमेंटेशन पर पांच रूपात्मक चरणों में आरएनएआई का प्रभाव । बार पर संख्या व्यक्तियों की संख्या इंगित करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें । 

प्रजातियां I.सेनेगलेंसिस पी.ज़ोनाटा
इंजेक्शन क्षेत्र पेट छाती पेट
सिरना/dsRNA सिरना डीएसआरएनए डीएसआरएनए डीएसआरएनए
लक्ष्य जीन इस्मको2 ईजीएफपी इस्मको2 इस्मको2 बला इस्मको2 बला PzMCO2 PzMCO2 बला
इलेक्ट्रोपाउनेशन + + + - + + + + - +
इंजेक्शन लार्वा 22 25 30 6 53 12 20 17 5 9
उभरे वयस्क 7 6 13 4 40 11 14 11 2 5
कम वर्णक क्षेत्रों वाले वयस्क (अनुपात) 7
(100%)		 0
(0%)		 13
(100%)		 0
(0%)		 0
(0%)		 10
(91%)		 0
(0%)		 11
(100%)		 0
(0%)		 0
(0%)

तालिका 1. आई सेनेगलेंसिस और पी ज़ोनटामें वयस्क पिगमेंटेशन पर आरएनएआई काप्रभाव। चरण ए में परिणाम I. सेनेगल मेंदिखाए जाते हैं । इस्मको2: मल्टीकॉपर ऑक्सीडेस 2 जीन ऑफ आई सेनेगलेसिस, ईजीएफपी: उन्नत हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन जीन, बला:पीजीईएम-टी ईजी वेक्टर, पीजेडएमसीओ2से बीटा लैक्टामेज जीन: मल्टीकोपर ऑक्सीडेस 2 जीन पी ज़ोनटा। नियंत्रण जीन के लिए परिणाम प्रयोगों की कुल संख्या का प्रतिनिधित्व लेखकों की तारीख को आयोजित किया है ।

Discussion

आरएनएआई उपचार की घातकता

हमने पाया कि आरएनएआई उपचार की घातकता ओडोनाटा लार्वा के पालन इतिहास और स्थिति पर दृढ़ता से निर्भर करती है। क्षेत्र में संग्रह के तुरंत बाद लार्वा आम तौर पर स्वस्थ होते हैं और इलेक्ट्रोपाउरेशन-मध्यस्थता आरएनएआई उपचार के बाद कम मृत्यु दर प्रदर्शित करते हैं। इसके विपरीत, प्रयोगशाला में लंबे समय तक पाला गया लार्वा (उदाहरण के लिए, एक महीने) वयस्क उद्भव की कम सफलता दर ों को पीड़ित करता है। I. सेनेगलमें, खेत में एकत्र लार्वा के बजाय, अंडों से प्रयोगशाला में पाले गए लार्वा का उपयोग14किया जा सकता है, लेकिन प्रयोगशाला-पाला लार्वा का उपयोग करके आरएनएआई की सफलता दर काफी कम हो जाती है (क्षेत्र-एकत्र लार्वा का उपयोग करने वालों की तुलना में कई व्यक्ति कायापलट के दौरान मर गए)। इसके अलावा, वयस्क उद्भव की सफलता दरों को बढ़ाने और आरएनएआई उपचार की घातकता को कम करने के लिए लगातार लार्वा खिलाने और स्वच्छ पानी पालन महत्वपूर्ण हैं।

आरएनएआई उपचार की दक्षता

जैसा कि ऊपर वर्णित है, आरएनएआई फेनोटाइप के स्तर, अर्थात् क्यूटिकल डिकोलोराइजेशन के आकार और स्थान, अक्सर एक ही आरएनएआई उपचार (जैसे, चित्रा 4)के अधीन व्यक्तियों के बीच काफी भिन्नता प्रदर्शित करते हैं, लेकिन फेनोटा प्रजाति के बीच फेनोटापिक पेनेट्रान्स का स्तर उल्लेखनीय रूप से अलग लगता है। मनाया गया फेनोटाइपिक क्षेत्र 1. सेनेगल (आंकड़े 4-5)में पी ज़ोनटा (चित्र 6)और एन पिगमैया9की तुलना में अधिक प्रमुख थे। यह अंतर लार्वा की सतह पर क्यूटिकल की मोटाई के कारण हो सकता है, यह देखते हुए कि आई सेनेगलनेसिस का क्यूटिकल पी ज़ोनटा और एन पिग्मेयाके क्यूटिकल से पतला है)। जहां तक हमने जांच की, सिरना और डीएसआरएनए(चित्रा 4, तालिका 1)के प्रभावों के बीच कोई स्पष्ट अंतर नहीं पहचाना गया था।

आरएनएआई के लिए उपयुक्त विकासात्मक चरण

यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि आरएनएआई को कुशलतापूर्वक प्रदर्शन करने के लिए उचित लार्वा मंचन महत्वपूर्ण है। वयस्क पिगमेंटेशन का अवरोध चरण डी (वयस्क उद्भव से लगभग 3 दिन पहले) से पहले MCO2 RNAi द्वारा किया गया था, जो एन पिगमैया9पर पिछली रिपोर्ट के अनुरूप है। RNAi फेनोटाइप जब चरणों में इंजेक्शन सी और डी चरणों ए और बी, जो संकेत मिलता है कि सी और डी बहुत देर हो सकती है जीन अभिव्यक्ति को दबाने के लिए इलाज की तुलना में कम विशिष्ट थे मनाया । आरएनएआई उपचार के लिए उपयुक्त समय जीन अभिव्यक्ति के समय पर निर्भर करता है, और MCO2 जीन वयस्क उद्भव9के दौरान क्षणिक रूप से उच्च अभिव्यक्ति प्रदर्शित करता है, जैसा कि अन्य कीड़ोंमें 17,18। बदबूदार पलोटिया स्टैलीमें, MCO2 जीन का आरएनएआई नॉकडाउन इंजेक्शन27के बाद 4 दिन से मनाया गया, जो वर्तमान परिणामों के अनुरूप है।

I. सेनेगल्सिस पर हमारे पिछले अध्ययन से पता चला है कि, चरण बी के बाद, वयस्क उद्भव के दिनों में अंतिम इंस्टार लार्वा के बहुमत के बीच अपेक्षाकृत छोटे बदलाव प्रदर्शित होते हैं, यह सुझाव देते हुए कि चरण बी वयस्क उद्भव की ओर प्रक्रिया की शुरुआत के अनुरूप हो सकता है, जिसके बाद कायापलट के लिए विकासात्मक प्रक्रियाएं पूर्वनिर्धारित और समन्वित तरीके से आगे बढ़ती हैं14। घावों के कारण होने वाली रूपात्मक असामान्यताएं अक्सर देखी जाती थीं जब लार्वा को सी और डी(चित्रा 7 बी, 7सी) चरणों में आरएनएआई-उपचारित किया जाताथा। यह इन चरणों के दौरान कायापलट की एक नाटकीय प्रगति के साथ जुड़े होने की संभावना है, सुझाव है कि आरएनएआई उपचार सी और पर चरण से बचा जाना चाहिए । संक्षेप में, हम अनुशंसा करते हैं कि चरण ए या बी (या लार्वा पंखों के काफी विस्तार से पहले चरण में) अंतिम इंस्टार लार्वा का उपयोग आरएनएआई प्रयोगों के लिए किया जाना चाहिए।

इलेक्ट्रोपाउशन-मध्यस्थता आरएनएआई विधि की उपयोगिता और श्रेष्ठता

पारंपरिक आरएनएआई एक सरल और शक्तिशाली प्रयोगात्मक विधि है, लेकिन तितलियों10,एफिड्स28 और ड्रैगनफ्लियों जैसे कुछ कीट वंशकम आरएनएआई दक्षता प्रदर्शित करते हैं, जिसके लिए जीन फ़ंक्शन विश्लेषण की स्थापना एक बड़ी चुनौती है। इस अध्ययन में, हमने पाया कि इलेक्ट्रोपॉर्मेशन-मध्यस्थता आरएनएआई लगभग 100% दक्षता के साथ ड्रैगनफ्लियों में स्थानीय जीन दमन को प्रेरित कर सकता है, कम से कम एपिडर्मिस में, यदि उचित विकासात्मक चरणों(तालिका 1)पर इलाज किया जाता है। हाल ही में, CRISPR/Cas9 आधारित जीन नॉकआउट सफलतापूर्वक कीड़ों की एक किस्म के लिए लागू किया गया है, गैर मॉडल जीवों के लिए एक शक्तिशाली आणविक आनुवंशिक उपकरण प्रदान29। यहां, तथापि, हम बताते है कि CRISPR/Cas9 निश्चित रूप से महान है, लेकिन इलेक्ट्रोपॉरेशन-मध्यस्थता RNAi विधि कुछ मामलों में CRISPR/Cas9 से बेहतर हो सकता है ।

सबसे पहले, इलेक्ट्रोपॉन्स्ट्रेशन-मध्यस्थता आरएनएआई विधि में, शरीर क्षेत्र जहां आरएनएआई फेनोटाइप दिखाई देते हैं, को इलेक्ट्रोपॉरेशन पर सकारात्मक इलेक्ट्रोड की स्थिति द्वारा प्रयोगात्मक रूप से आसानी से नियंत्रित किया जा सकता है। इसके अलावा, चूंकि जिस क्षेत्र में जीन अभिव्यक्ति को दबाया जाता है, वह उस क्षेत्र के आसपास सीमित है जहां सकारात्मक इलेक्ट्रोड रखा गया था, आरएनएआई फेनोटाइप की तुलना एक ही व्यक्ति में नियंत्रण फेनोटाइप के साथ आसानी से की जा सकती है। दूसरे, CRISPR/Cas9 विधि की तुलना में जिसमें इंजेक्शन अंडे को नॉकआउट फेनोटाइप का निरीक्षण करने के लिए वयस्कता के लिए पाला जाना पड़ता है, इलेक्ट्रोपॉरेशन-मध्यस्थता आरएनएआई बेहतर है कि जीन नॉकडाउन फेनोटाइप आमतौर पर बहुत कम समय में देखा जा सकता है । उदाहरण के लिए, आई सेनेगल के लिए तीन से चार महीने और पी ज़ोनाटा के लिए अंडे से वयस्कों के लिए एक से दो वर्ष का समय लगता है14,30। हालांकि, वयस्क एपिडर्मिस के भीतर आरएनएआई फेनोटाइप का निरीक्षण करने के लिए, डीस्आरएनए इंजेक्शन से स्टेज बी में अंतिम इंस्टार लार्वा में एक महीने से भी कम समय लगता है, जो आई सेनेगलेंसिस और पी ज़ोनटा (चित्रा 7)दोनों के लिए वयस्क उद्भव के लिए है। तीसरा, इलेक्ट्रोपॉरेशन-मध्यस्थता आरएनएआई विधि में बड़े लार्वा में डीएसआरएनए इंजेक्शन पर जोर देता है, जो CRISPR/Cas9 विधि के लिए आवश्यक छोटे अंडों में माइक्रोइंजेक्शन की तुलना में आसान है । इसके अलावा, इलेक्ट्रोपॉरेशन-मध्यस्थता आरएनएआई कीट प्रजातियों पर लागू होता है जिनके नए रखे अंडे एकत्र करना मुश्किल होता है। उदाहरण के लिए, पी ज़ोनाटा की महिलाएं उड़ान के दौरान पानी की सतह पर तैरते पौधों पर अंडे डालती हैं, और इस प्रकार क्षेत्र और प्रयोगशाला दोनों में अपने अंडे एकत्र करना मुश्किल होता है। इसलिए, हम उम्मीद करते हैं कि यह प्रोटोकॉल आम तौर पर गैर-मॉडल जीवों पर लागू हो सकता है जिसमें पारंपरिक आरएनएआई विधि कुशलता से काम नहीं करती है।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम तकनीकी सलाह और समर्थन के लिए मिनोरू मोरियामा को धन्यवाद देते हैं, बिन हिरोटा और रयुतारो सुजुकी ओडोनाटा लार्वा इकट्ठा करने के लिए, और पांडुलिपि पर सहायक टिप्पणियों के लिए मीसा शिन्या। इस काम को जेएसपीएस काकेनही ग्रांट नंबर JP18J21561 से गो और JP18H02491, JP18H04893, JP19H03287 और JP20H04936 से आरएफ को समर्थन मिला ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
12-well plate Violamo VTC-P12 For rearing larvae before injection
Brine shrimp eggs JAPAN PET DESIGN 4975677012396
Calibrated micropipette (1-5 µL) Drummond 2-000-001-90
Deposit pestle 1.5 mL Thermo Fisher Scientific K749520-0090
Digital high defenition microscope camera Leica Microsystems MC170HD
Disposable non-woven mesh HAKUGEN EARTH DSC-105A
DNA Ligation Kit Ver.2.1 Takara Bio 6022
DraI Takara Bio 1037A
Electrode (1mmφ) NEPAGENE CUY650P1
Electroporator CellProduce Cure-gene
Forceps KOWA Forceps Industry K-10 No1
Glass needle puller NARISHIGE PN-3
Hand mixer AS ONE 1-229-02
Hand net HOGA IS33-3B
HEPES FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation 346-01373 For injection buffer
Insect pin capitate No. 3 Shiga Konchu Fukyusha N230 For fixing larvae
KCl FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation 163-03545 For PBS
KH2PO4 FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation 169-04245 For PBS
KOAc FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation 160-03175 For injection buffer
KOH FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation 168-21815 For injection buffer
Laboratory Jack (150x150) AS ONE 1-4642-11 For adjusting the position of the manipulator
LOGIQLEAN Gel for Ultrasound Hard type GE Healthcare 2369385
Manipulator Muromachi Kikai Co., Ltd. SJ-1 For adjusting the position of the injector and the capillary
MEGAscript RNAi kit Thermo Fisher Scientific AM1626
Mg(OAc)2 FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation 130-00095 For injection buffer
Na2HPO4 FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation 197-02865 For PBS
NaCl FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation 191-01665 For PBS
Petri dish (5 cm diameter) Iwaki 1010-060 For rearing injected larvae
Pneumatic Injector NARISHIGE IM-12
pT7Blue T-Vector Novagen 69820
QIAquick PCR Purification Kit QIAGEN 28106
RNAiso Plus FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation 9109
RNeasy Mini Kit QIAGEN 74106
Shiga micro insect pin with stainless headless Shiga Konchu Fukyusha N251 For making a small hole
Stereoscopic microscope Leica Microsystems S8APO
SuperScript IV Reverse Transcriptase Thermo Fisher Scientific 18090010
TaKaRa Ex Taq Takara Bio RR001B For PCR-amplification from plasmid
Tks Gflex DNA Polymerase Takara Bio R060B For PCR-amplification from caudal gill

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विकासात्मक जीव विज्ञान अंक 168 आरएनए हस्तक्षेप आरएनएआई वीवो इलेक्ट्रोप्यूशन में, जीन नॉकडाउन ड्रैगनफ्लाई डैमसेल्फली ओडोनाटा इस्चनुरा सेनेगल,स्यूडोथेइस ज़ोनटा
ओडोनाटा में इलेक्ट्रोपॉनेशन-मध्यस्थता आरएनए हस्तक्षेप विधि
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Okude, G., Fukatsu, T., Futahashi,… More

Okude, G., Fukatsu, T., Futahashi, R. Electroporation-mediated RNA Interference Method in Odonata. J. Vis. Exp. (168), e61952, doi:10.3791/61952 (2021).

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