Summary
Vi tillhandahåller ett detaljerat protokoll för elektroporation-medierad RNA-interferens hos insekter av ordningen Odonata (trollsländor och damselflies) med hjälp av den blåstjärtade damselfly (Ischnura senegalensis: Coenagironidae: Zygoptera) och pied skimmer trollslända (Pseudothemis zonata: Libellulidae: Anisoptera).
Abstract
Trollsländor och damselflies (ordning Odonata) representerar en av de mest förfädernas insekter med metamorfos, där de ändrar sin livsmiljö, morfologi och beteende drastiskt från vattenlevande larver till landlevande / antenn vuxna utan pupal skede. Odonata vuxna har en väl utvecklad färgseende och visar en anmärkningsvärd mångfald i kroppens färger och mönster över kön, stadier och arter. Medan många ekologiska och beteendemässiga studier på Odonata har genomförts, molekylär genetiska studier har varit knappa främst på grund av svårigheten att tillämpa genfunktionalanalys till Odonata. Till exempel är RNA-interferens (RNAi) mindre effektivt i Odonata, som rapporterats i Lepidoptera. För att övervinna detta problem, vi framgångsrikt etablerat en RNAi metod i kombination med in vivo elektroporation. Här ger vi ett detaljerat protokoll inklusive en video av den elektroporationsmedierade RNAi-metoden enligt följande: beredning av larver, artidentifiering, beredning av dsRNA/siRNA-lösning och injektionsnålar, iskall anestesi av larver, dsRNA/siRNA-insprutning, in vivo elektroporation och individuell uppfödning tills vuxen uppkomst. Den elektroporationsmedierade RNAi-metoden är tillämplig på både damselflies (underordning Zygoptera) och trollsländor (underordning Anisoptera). I detta protokoll presenterar vi metoderna för den blåstjärtade damselfly Ischnura senegalensis (Coenagrionidae) som ett exempel på damselfly arter och pied skimmer trollslända Pseudothemis zonata (Libellulidae) som ett annat exempel på trollslända arter. Som representativa exempel visar vi resultaten av RNAi inriktning melanin syntesen genen multicopper oxidas 2. Denna RNAi metod kommer att underlätta förståelsen av olika genfunktioner som deltar i metamorfos, morfogenes, färgmönster bildning, och andra biologiska funktioner i Odonata. Dessutom kan detta protokoll vara allmänt tillämpligt på icke-modellorganismer i vilka RNAi är mindre effektivt vid undertryckning av genen på grund av ineffektiviteten och den låga peneetriansen.
Introduction
Trollsländor och damselflies (ordningen Odonata) är bland de mest förfädernas grupper av insekter som uppvisar "metamorfos"1,2. Genom metamorfos, de ändrar sin livsmiljö, morfologi, och beteende drastiskt från vattenlevande larver till markbundna / antenn vuxna3. Odonata vuxna har en väl utvecklad färgseende och representerar en anmärkningsvärd mångfald i kroppens färger och mönster över kön, stadier, och art3,4,5. Medan många ekologiska och beteendemässiga studier på Odonata har genomförts6,7, molekylär genetiska studier har hindrats främst av svårigheten att tillämpa genfunktionalanalys till Odonata.
Den konventionella RNA-interferensen (RNAi) metod, som dubblett-stranded RNA (dsRNA) injiceras i för att dämpa fungera av genen avintresserar 8, vänt ut för att vara ineffektiv i Odonatakryp 9, som anmält i Lepidopterankryp 10. Å andra sidan har tidigare rapporter föreslagit att electroporation-medierad RNAi är effektiv i Lepidopteran arter, särskilt i epidermal vävnader11,12,13. Vi fann nyligen att den elektroporation-medierad RNAi fungerar effektivt i den lilla trollslända Nannophya pygmaea (Libellulidae: Anisoptera)9, men N. pygmaea är en relativt sällsynt art och därför inte lämplig för molekylära genetiska studier.
De flesta Odonata arter klassificeras i endera av de två underordningar, Zygoptera (damselflies) eller Anisoptera (sanna trollsländor)3. Här fokuserade vi på den blåstjärtade damselfly Ischnura senegalensis (Coenagrionidae; Bild 1A) som en representativ Zygopteran art och pied skimmer trollslända Pseudothemis zonata (Libellulidae; Bild 1B) som en representativ Anisopteran art. De två arterna är bland de vanligaste Odonata-arterna i naturliga och urbana dammar i Japan, inklusive de i Tsukuba City, och vi kan samla många larver av de två arterna i fältet. Nyligen etablerade vi ett laboratorium uppfödningssystem för enskilda larver av I. senegalensis, som möjliggjorde kontinuerlig övervakning av utveckling och morfogenes av Odonata larverna i detalj14.
I denna rapport, vi ger en förfinad metod och en video protokoll för den elektroporation-medierad RNAi i I. senegalensis och P. zonata. I Japan, I. senegalensis och Ischnura asiatica, som är genetiskt nära, ofta finns sympatrically15, och de är svåra att skilja ilarver 16. Vi beskriver också hur två Ischnura arter kan särskiljas genom begränsning fragment längd polymorfism (RFLP).
För att utvärdera effektiviteten av den elektroporation-medierad RNAi, väljer vi multicopper oxidas 2 gen (MCO2; även känd som laccase2) som en representativ målgen, på grund av den synliga fenotyp av blekare nagelband färg vid knockdown av genen uttrycket9. MCO2 är känt för att vara väsentlig för mörkning av epidermis i en mängd olika insektsarter17,18.
Protocol
OBS: Protokollens övergripande schema visas i figur 1.
1. Beredning av larver av trollsländor eller damselflies.
- Samla larver i fält med hjälp av ett handnät.
OBS: I. senegalensis larver ofta klamrar sig fast på vatten växter som flyter på vattenytan, medan P. zonata larver ofta stanna bland lövskräp längst ner. I Tsukuba City, den slutliga instar larver av I. senegalensis finns främst från mars till juni, och de av P. zonata från maj till juni. I. senegalensis larver kan födas upp från ägg ilaboratoriet 14, men larverna som samlas i fältet har den klart högre andelen framgångsrika vuxna uppkomst. - Artidentifiering genom begränsningsfragmentlängd polymorfism (RFLP) av PCR-amplifierade produkter.
OBS: Detta steg är endast nödvändigt om arten är svår att identifiera från utseendet på larverna, som i I. senegalensis.- Håll en av de caudal gälarna av en larva med hjälp av tuts. Sedan faller larven av sin caudal gill själv (orsakar autotomi).
OBS: Larver av Zygopteran damselflies har vanligtvis tre caudal gälar (Figur 1A). När de attackeras av ett rovdjur, kan de ta av sig sina egna caudal gälar för att fly. Om caudal gälen inte är tillgänglig, dissekeras en del av benet. - Sätt en caudal gäl i 100 μL PBS-lösning [0,8% NaCl, 0,02% KCl, 0,115% Na2HPO4, och 0,02% KH2PO4 (w / v)] och homogenisera med en hand mixer med hjälp av en insättning mortelstöt.
- Snurra ner blandningen vid 5 000 x g i 10 sekunder, och ämne 0,5 μL av supernatanten till PCR-amplifiering med hjälp av DNA-polymeras och primers för att förstärka den inre transkriberade distansen 1 (ITS1) region i kärn-DNA.
OBS: Utför PCR enligt tillverkarens protokoll. Kombinationen av ITS-F0 (5'- GGA AAG ATG GCC AAA CTT GA -3') och 5.8S-AS1 (5'- GCC GGC CCT CAG CCA G -3') primers kan förstärka ITS1 region i nästan alla Odonataarter 19. - Inkubera blandningen av 1 μL PCR-amplifierad produkt, 0,3 μL 10x M Buffert, 0,1 μL av DraI-restriktionsenzym och 1,6 μL vatten vid 37 °C i 1 h.
OBS: Välj de bästa restriktionsenzymerna, beroende på kombinationen av arter. Om det inte finns några restriktionsenzymer som är lämpliga för artidentifiering, bekräfta genom DNA-sekvensering. - Ladda 2 μL av produkterna med lastningsfärg på 2% agarosgel och körelektrofores.
OBS: Det är svårt att identifiera arter när man använder 1% eller 1,5% agarosgel. - Kontrollera elektroforesmönstret för att identifiera arten (Figur 2).
OBS: RFLP-mönster är art- och populationsberoende. I Tsukuba befolkning, I. asiatica har ett stort band på 400-500 bp, medan I. senegalensis har ett stort band på cirka 200 bp och ett ytterligare band på mindre än 100 bp (en pilspets i Figur 2). ITS1-regionen finns i flera exemplar i arvsmassan, och i Ischnura-arter förekommer ofta microsatellitepolymorfism inom ITS1-regionen i samma individ, vilket påverkar mönstret för RFLPs.
- Håll en av de caudal gälarna av en larva med hjälp av tuts. Sedan faller larven av sin caudal gill själv (orsakar autotomi).
- Bakre de insamlade larverna i laboratoriet tills användning för RNAi.
- Placera varje larva separat i varje brunn av en 12-brunnsplatta med cirka 3 mL vatten.
OBS: I. senegalensis larver måste hållas individuellt eftersom de ofta kannibalisera varandra, medan P. zonata larver kan hållas i en grupp eftersom de sällan kannibalisera. - Foder I. senegalensis larver med Artemia saltlake räkor varje dag och P. zonata larver med blodmaskar och / eller Tubifex maskar minst två gånger i veckan tills de växer till den lämpliga utvecklingsstadiet för RNAi.
OBS: Frekvent matning är avgörande för att öka andelen framgångsrika vuxna uppkomst. - Byt vatten så fort det blir smutsigt med avföring eller rester.
OBS: Frekvent vattenbyte är också viktigt att öka andelen framgångsrika vuxna uppkomst. - Bedöm lämpligt utvecklingsstadium för RNAi.
NOTERA: Finalen instar larvae av I. senegalensis kan klassificeras in i fem utvecklings- arrangerar14,20. Det första steget (steg A, innan vingarna börjar expandera) eller den andra etappen (steg B) av den slutliga instar larver är lämplig för RNAi experiment, när man överväger den tydliga fenotyp av RNAi efter vuxen uppkomst (se Diskussion). I P. zonata, användes den slutliga instar larver före vingexpansion (motsvarande steg A av I. senegalensis) i denna studie.
- Placera varje larva separat i varje brunn av en 12-brunnsplatta med cirka 3 mL vatten.
2. Beredning av dsRNA/siRNA-lösning och injektionsnålar för RNAi.
OBS: Välj antingen små störande RNA (siRNA) (steg 2.1) eller dubbelsträngat RNA (dsRNA) (steg 2.2) som lösning för RNAi.
- Beredning av siRNA-lösningen
- Design siRNA med hjälp av siDirect program version 2.0 (http://sidirect2.rnai.jp/)21,följer de riktlinjer som tidigare rapporterats i Lepidopteraninsekter 22.
- Erhåll kommersiellt syntetiserade siRNA.
OBS: Sekvenserna av siRNA inriktning MCO2 gen av I. senegalensis används i denna studie var följande: 5'- GCA CUU UCC GUU AUC AAU AUA -3' för sense strand och 5'- UAU UGA UAA CGG AAA GUG CUC -3' för antisense strand. Som en negativ kontroll var sekvenserna av siRNA inriktning förstärkt grönt fluorescerande protein (EGFP) genen som följer: 5'- GCA UCA AGG UGA ACU UCA -3' för sense strand och 5'- UUG AAG UUC ACC UUG AUG CCG -3' för antisense strand11. - Späd siRNA till 100 μM med injektionsbuffert [100 mM CH3COOK, 2 mM Mg(CH3COO)2, 30 mM HEPES-KOH, pH 7,4]22.
- Förvaras vid -80 °C tills användning.
- Beredning av dsRNA-lösning.
- Välj en 300-400 bp region för dsRNA med hjälp av Primer3 program version 4.1.0 (http://bioinfo.ut.ee/primer3/)23 och utforma primer set.
- Erhålla kommersiellt syntetiserade primeruppsättningar.
OBS: För att producera mallar för dsRNA-syntes, primer uppsättningar som används i denna studie var följande: (5'- GCC TGT CAGT CTT TGT CTT CC -3' för framåt primer och 5'- GGT GTC TGG CGG ACA ACT AT -3' för omvänd primer) för MCO2 gener av I. senegalensis (IsMCO2, anslutning nr. LC589180) och (5'- CCG CAC AGC TCA CTA TTC AA -3' för framåt primer och 5'- GGA GGA TTC CTTC CAT CGA CA -3' för omvänd primer) för MCO2 gener av P. zonata (PzMCO2, anslutning nr. LC589179). Som en negativ kontroll var primern som fastställts för dsRNA inriktning β-laktamas (bla) gen på kloning vektor (5'- CTA TGT GGCG GTA TTA T -3' för framåt primer och 5'- CAG AAG TGG TCC TGC AAC -3' för omvänd primer). - Extrahera RNA från Odonata larver med hjälp av ett kommersiellt tillgängligt RNA-extraktionskit och utför cDNA-syntes med hjälp av omvänd transkriptas enligt tillverkarens protokoll.
OBS: cDNA bibliotek förberett för RNA sekvensering analys kan också användas. - Förstärka målsekvenserna med hjälp av syntetiserade cDNA och den utformade primeruppsättningen och klona in dem i kloningsvektorn med hjälp av en kommersiell ligase enligt tillverkarens protokoll.
- Omvandla plasmiden till E. coli kompetenta celler och plocka upp en enda koloni efter natten inkubation.
- PCR-förstärka insatsen regionen med hjälp av primers på vektorn.
- Bekräfta den klonade sekvensen genom Sanger-sekvensering.
- PCR-förstärka insatsen med hjälp av vektorprimer som innehåller T7 polymeras promotornsekvens 24, 25.
OBS: I denna studie användes följande primers: T7-F (5' - TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA GAC TAG TCA TAT GGA T - 3') och T7-R (5'- TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA GAC CCG GGG ATC CGA T - 3') 25. - Rena PCR-produkten med hjälp av PCR-reningssatsen enligt tillverkarens protokoll, elera DNA:t med 50 μL destillerat vatten, och koncentrera den eluterade DNA-lösningen till ca 10 μL med hjälp av en centrifugalindunstningsapparat.
- Syntetisera dsRNA genom in vitro-transkription enligt tillverkarens protokoll. Använd totalt 1000 ng mall DNA och elute syntetiserade dsRNA med 100 μL elueringsbuffert.
- Mät koncentrationen av dsRNA med hjälp av en spektrofotometer och bekräfta kvaliteten på dsRNA genom elektrofores på en 1,5% agarosgel.
OBS: Ett enda band kan ses när DSRNA-syntesen är framgångsrik. - Späd dsRNA till 1000 ng/μL med elueringsbuffert och förvara vid -20 °C tills användning.
- Beredning av injektionsnålar
- Dra en glas kapillär genom att använda en glas nål puller.
- Placera spetsen på den dragna kapillären på en dubbelsidig tejp och bryt kapillärens spets med tåten.
- Ställ kapillären till en injektor.
OBS: Det är lättare att hantera kapillären om du bär nitrilhandskar. - Ladda siRNA/dsRNA-lösning till den förberedda kapillären.
OBS: Använd inte kapillären upprepade gånger eftersom spetsen på den injicerade kapillären kan bli igensatt med smuts eftersom larverna som samlats i fältet bodde i leran.
3. siRNA/dsRNA-injektion
OBS: Förfarandet är något annorlunda för damselflies (steg 3.1) och trollsländor (steg 3.2).
- Injektion till en Zygopteran (damselfly) larva (e.g., I. senegalensis).
- Söva en larv täckt med ett vått papper på krossad is i 50-70 sekunder (Bild 3A-C).
OBS: Varaktighet av iskall anestesi beror på larvens tillstånd; om larven börjar röra sig efter 70 sekunder av iskall anestesi appliceras ytterligare 70 sekunder av iskall anestesi. För larver som sällan rör sig (t.ex., P. zonata)är detta förfarande inte väsentligt. - Fäst två stift på båda sidor av prothoraxen och fixera larven på ett fast stativ (t.ex. en bit frigolit) (Bild 3D).
OBS: Justera position och antal tappar, beroende på injektionsstället. - Sträck det intersegmentella membranet mellan 7: e och 8: e buksegmentet för RNAi i buken eller mellan prothorax och synthorax (smält mesothorax och metathorax) för RNAi i bröstkorgen med hjälp av händer och tänjningar.
- Håll det intersegmentella membranet sträckt för hand.
- För in spetsen på den förberedda kapillären i det sträckta intersegmentella membranet (Figur 3D, 3F).
- Injicera 1 μL siRNA/dsRNA-lösning.
- Söva en larv täckt med ett vått papper på krossad is i 50-70 sekunder (Bild 3A-C).
- Injektion till en Anisopteran (trollslända) larv (t.ex., P. zonata).
- Torka bort vattnet från larvytan med en pappershandduk.
- Om det behövs, fäst två stift på båda sidor av prothoraxen och fixera larven på ett fast stativ (t.ex. en bit frigolit) (Bild 3H).
OBS: Justera position och antal tappar, beroende på injektionsstället. När det gäller P. zonataär det inte väsentligt att fixera larverna med stift vid detta steg. - Sträck det inter-segmental membranet mellan 4: e och 5: e buken segmentet för hand.
- Gör ett litet hål med en fin nål i inter-segmental membranet mellan 4: e och 5: e buksegmentet.
OBS: Detta förfarande är nödvändigt för många Anisopteran (trollslända) arter eftersom inter-segmental membranet är för svårt att sätta in ett glas kapillär direkt. - För in spetsen på den förberedda kapillären i det förberedda hålet (Bild 3I).
OBS: Som visas i figur 3H, motsvarar en del av larvernas ryggsida den ventrala sidan av den vuxna, så fenotypen verkar ventrally när den behandlas enligt figur 3H-J. - Injicera 1 μL siRNA/dsRNA-lösning.
4. in vivo elektroporation
- Om det behövs, tillsätt fler stift för att fixera larven på ett fast stativ (t.ex. en bit frigolit).
- Efter injektionen av siRNA/dsRNA-lösningen, applicera två droppar av ultraljudsgel på larvytan med hjälp av kraftpenser.
- Placera elektroder på ultraljudsgelen, med den positiva elektroden på sidan injicerad med siRNA/dsRNA-lösningen och en negativ elektrod på motsatt sida (Figur 3E, 3G, 3J).
OBS: Rör inte direkt överhuden på larven för att undvika den brännande effekten av elektroporation. - Generera 10-gångers elektroporationspulser (280 ms/s vardera) med hjälp av en elektroporator.
OBS: Justera elektroporationens spänning, beroende på art, stadier och vävnader. I denna studie, 25 V tillämpades på I. senegalensis och 45 V till P. zonata. - Torka bort den återstående gelen på ytan med en pappershandduk.
- Håll de behandlade larverna vilande på en våt pappershandduk i ungefär en dag för återhämtning och överför dem till ett uppfödningsfodral följande dag.
5. Platsspecifik fenotypisk analys
- Håll I. senegalensis individuellt i en Petriskål (5 cm i diameter) som innehåller cirka 10 mL vatten och en bit pappershandduk, och hålla P. zonata i en plastbur med en engångs non-woven mesh (eclosion bur14).
- För I. senegalensis, efter larverna sluta äta, flytta dem individuellt i en plast bur med en disponibel non-woven mesh.
OBS: Lägg inte två eller flera larver i samma bur. Annars kommer de kannibalisera varandra omedelbart efter att de blivit vuxna. - Efter uppkomsten av den vuxna, observera och fotografera fenotyp runt regionen där den positiva elektroden placerades för elektroporation.
OBS: Fenotypen visas endast i plåster. Fenotyper är ofta svårt att känna igen omedelbart efter uppkomsten på grund av ofullständiga pigmentering. - För att undersöka effektiviteten hos RNAi (t.ex. kvantitativa RT-PCR), om fenotyp är synlig, dissekera regionen och jämföra den med regionen utan fenotyp.
OBS: Nivåerna av RNAi fenotyp, nämligen storlek och placering av nagelbanden avfärgning, uppvisar ofta betydande variation mellan individer (se figur 4). - Håll de uppvriga vuxna i 100% EtOH för framtida analyser.
OBS: Kroppsfärg av Odonata arter snabbt bleknar efter döden, så det är viktigt att lagra dem i etanol innan de dör. Etanol missfärgar ibland insekterna, i sådana fall att insekterna är frysta innan de dör.
Representative Results
Vi tillämpade ovanstående protokoll på elektroporation-medierad RNAi inriktning MCO2 gen och negativa styrgener (EGFP för siRNA och bla för dsRNA) (i) i buken av I. senegalensis (Figur 4), (ii) i bröstkorgen i I. senegalensis (Figur 5), och (iii) i buken av P. zonata (Figur 6). Resultaten av RNAi-experimenten sammanfattas i tabell 1. Eftersom negativt laddade siRNA/dsRNA införlivas endast i positivt laddade celler, observerades RNAi-fenotyper runt regionen där den positiva elektroden placerades för elektroporation.
I båda I. senegalensis och P. zonata, hämning av melaninpigmentering (dvs. svart, brun och rödbrun) dök upp i fläckar runt regionen där den positiva elektroden placerades (vita pilspetsar och prickade linjer i figur 4, figur 5, och figur 6) när MCO2 RNAi utfördes i kombination med elektroporation (Tabell 1), som tidigare rapporterats i N. pygmaea9. Däremot observerades inga fenotypiska effekter runt elektroporationsstället när kontrollgenen injicerades (EGFP siRNA eller bla dsRNA) (Figur 4, Figur 5, och Figur 6, Tabell 1). Dessutom hade injicering av MCO2-genen utan elektroporation ingen effekt på vuxenpigmentering (Figur 4, Tabell 1), vilket indikerar att elektroporation är väsentligt för RNAi i Odonata. Det bör noteras att den blå, gröna och gula färgsättningar inte påverkas av RNAi av MCO2 gen som är involverad i melanin syntes i nagelbanden, som rimligen återspeglar det faktum att dessa kroppsfärger tillskrivs pigmentgranulat som finns i de epidermala cellerna som är synliga genom den genomskinliga nagelband26. Som framgår av figur 4, inga anmärkningsvärda fenotypiska skillnader erkändes mellan de individer som utsätts för siRNA behandling och dsRNA behandling, medan betydande variation i storlek och placering av RNAi fenotyp observerades bland olika individer utsätts för samma RNAi behandling (ex. jämföra två exempel på IsMCO2 dsRNA i figur 4).
För att bestämma utvecklingsstadiet som är mest lämpligt för RNAi-behandlingen jämförde vi de fenotypiska följderna av RNAi-behandlingen i fem morfologiska stadier (steg A-E) i den slutliga larven instar av I. senegalensis (Figur 7A). Hämning av melaninpigmentering orsakad av MCO2 RNAi observerades hos alla uppträdda vuxna när de injicerades i stadierna A och B (Figur 7C). När injiceras i stadierna C och D, var undertryckande av melanin pigmentering säkert observerades hos vissa framkommit vuxna, men andra vuxna uppvisade onormal färgning orsakad av sår (Figur 7B).
Figur 1: Elektroporationsmedierade RNAi-metoder i Odonata. A. Ischnura senegalensis (Coenagirionidae) som en representativ damselfly art. B. Pseudothemis zonata (Libellulidae) som en representativ trollslända arter. C. Protokollens övergripande schema. Blå och orange lådor anger protokollen för I. senegalensis och P. zonata, respektive. De lila rutorna anger de gemensamma protokoll som tillämpas på båda arterna. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 2: Ett representativt resultat av restriktionsfragmentets längdpolymorfism (RFLP)-baserad artidentifiering för Ischnura-arter. Pilspets anger I. senegalensis-specifika bandet. 1, 2, 4: I. asiatica, 3: I. senegalensis, M: 100-base par stege markör. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Bild 3: Elektroporationsmedierad RNAi-metod i Odonata. A-C. Iskall anestesi av I. senegalensis. Pilspetsar indikerar en larv. A. Att sätta en larv på krossad is med ett vått papper. B. Förstorad vy av en larv på is. C. En larv täckt med ett vått papper på is. D-G. RNAi metod för I. senegalensis. D. Injektion i bröstkorgen. E. Elektroporation på bröstkorgen. F. Injektion i buken. G. Elektroporation på buken. H-J. RNAi metod för P. zonata. H. Att göra ett litet hål på buken. - I. Injektion i buken. J. Elektroporation på buken. Pilar anger poängen med att göra ett hål eller en injektion. +, -: Positiva/negativa sidoelektroder. Siffror anger buksegmentet. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 4: Dorsala synpunkter på RNAi fenotyper på buken av I. senegalensis. Vita pilspetsar anger regionerna av undertryckta melanization. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Bild 5: Laterala och ryggvyer av RNAi fenotyper på bröstkorgen av I. senegalensis. Vita pilspetsar och prickade linjer anger regionerna för undertryckta pigmentering. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Bild 6: Ventrala vyer av RNAi fenotyper i buken av P. zonata. Vita pilspetsar och streckade linjer anger regionerna för undertryckt melanisering. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 7: Stage beroende IsMCO2 RNAi effekter under den slutliga larven instar av I.senegalensis. A. Morfologiska förändringar i de sammansatta ögonen i fem morfologiska stadier (steg A-E) och antalet dagar till vuxen uppkomst i denna studie. Tal inom parentes är från tidigare rapport14. B. Onormal pigmentering på grund av sår. Pilspets indikerar elektroporationsstället. C. Effekten av RNAi vid fem morfologiska stadier på vuxna pigmentering i I. senegalensis. Numret i stapeln anger antalet individer. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
| Arter | I.senegalensis | P.zonata | |||||||||
| Injicerad region | Buken | Bröstkorgen | Buken | ||||||||
| siRNA/dsRNA | siRNA | dsRNA | dsRNA | dsRNA | |||||||
| Målgen | IsMCO2 | EGFP | IsMCO2 | IsMCO2 | bla | IsMCO2 | bla | PzMCO2 | PzMCO2 | bla | |
| Elektroporation | + | + | + | - | + | + | + | + | - | + | |
| Injicerade larver | 22 | 25 | 30 | 6 | 53 | 12 | 20 | 17 | 5 | 9 | |
| Uppvred vuxna | 7 | 6 | 13 | 4 | 40 | 11 | 14 | 11 | 2 | 5 | |
| Vuxna med mindre pigmenterade regioner (förhållande) | 7 (100%) |
0 (0%) |
13 (100%) |
0 (0%) |
0 (0%) |
10 (91%) |
0 (0%) |
11 (100%) |
0 (0%) |
0 (0%) |
|
Tabell 1. Effekten av RNAi på vuxenpigmentering i I. senegalensis och P. zonata. Resultat i steg A visas i I. senegalensis. IsMCO2: multicopper oxidas 2 gen av I. senegalensis, EGFP: Förstärkt grön fluorescerande proteingen, bla: beta lactamase gen från pGEM-T Easy Vector, PzMCO2: multicopper oxidas 2 gen av P. zonata. Resultaten för kontrollgenerna representerar det totala antalet experiment som författarna hittills har utfört.
Discussion
RNAi-behandlingens dödlighet
Vi fann att RNAi-behandlingens dödlighet beror starkt på Odonata-larvernas uppfödningshistorik och tillstånd. Larverna strax efter insamling på fältet är i allmänhet friska och uppvisar låg dödlighet efter den elektroporation-medierade RNAi behandling. Däremot tenderar de larver som föds upp i laboratoriet under en lång tid (t.ex. en månad) att lida låg framgång av vuxna uppkomst. I I. senegalensis, i stället för larverna som samlas i fält, kan larverna som föds upp i laboratoriet från ägg användas14, men framgångsfrekvensen för RNAi som använder de laboratorieuppfödda larverna tenderar att vara betydligt lägre (många individer dog under metamorfos) än de som använder de fältsamlade larverna. Dessutom är frekvent larvmatning och ren vattenuppfödning viktiga för att öka andelen framgångsrika vuxnas uppkomst och minska dödligheten hos RNAi-behandlingen.
Effektiviteten av RNAi behandling
Som beskrivits ovan uppvisade nivåerna av RNAi fenotyp, nämligen storlek och placering av nagelbanden avfärgning, ofta betydande variation mellan individer som utsätts för samma RNAi behandling (t.ex. Figur 4), men nivåerna av den fenotypiska peneetance verkar vara anmärkningsvärt olika mellan Odonata arter. De observerade fenotypiska regionerna var större och mer framträdande i I. senegalensis (Figurerna 4-5) än i P. zonata (Figur 6) och N. pygmaea9. Denna skillnad kan bero på tjockleken på nagelbanden på larvytan, med tanke på att nagelbanden av I. senegalensis är tunnare än nagelbanden hos P. zonata och N. pygmaea). Såvitt vi undersökte erkändes ingen tydlig skillnad mellan effekterna av siRNA och dsRNA (Figur 4, tabell 1).
Lämpligt utvecklingsstadium för RNAi
Det bör noteras att korrekt larviscensättning är viktigt för att utföra RNAi effektivt. Hämning av vuxna pigmentering orsakades av MCO2 RNAi före stadium D (cirka 3 dagar före vuxen uppkomst), vilket är förenligt med den tidigare rapporten om N. pygmaea9. De RNAi-fenotyper som observerades när de injicerades i stadierna C och D var mindre iögonfallande än de som behandlades i etapperna A och B, vilket tyder på att stadierna C och D kan vara för sent för att tillräckligt dämpa genuttrycket. Lämplig timing för RNAi behandling beror på tidpunkten för genuttryck, och MCO2 gen uppvisar övergående högt uttryck under vuxna uppkomst9, som i andra insekter17,18. I stinkbug Plautia stali, RNAi knockdown av MCO2 genen observerades från dag 4 och framåt efter injektion27, vilket är förenligt med de nuvarande resultaten.
Vår tidigare studie om I. senegalensis visade att, efter etappen B, dagar till vuxen uppkomst uppvisar relativt liten variation bland majoriteten av slutliga instar larver, vilket tyder på att scenen B kan motsvara uppkomsten av processen mot vuxna uppkomst, varefter utvecklingsmässiga processer för metamorfos fortsätta i ett prefixed och samordnat sätt14. Morfologiska avvikelser orsakade av sår observerades ofta när larverna RNAi-behandlade vid stadierna C och D (Figur 7B, 7C). Detta är sannolikt att associeras med en dramatisk progression av metamorfos under dessa stadier, vilket tyder på att RNAi behandling bör undvikas från scenen C och på. Sammanfattningsvis rekommenderar vi att slutliga instar larver i stadium A eller B (eller på det stadium innan larvvingarna expanderar betydligt) bör användas för RNAi experiment.
Användbarhet och överlägsenhet av elektroporationsmedierad RNAi-metod
Den konventionella RNAi är en enkel och kraftfull experimentell metod, men vissa insekts härstamningar som fjärilar10, bladlöss28 och trollsländor9 uppvisar låg RNAi effektivitet, för vilka etablering av genfunktionsanalys är en stor utmaning. I denna studie fann vi att elektroporation-medierad RNAi kan inducera lokala gensupprbildning i trollsländor med nästan 100% effektivitet, åtminstone i epidermis, om de behandlas i lämpliga utvecklingsstadier (Tabell 1). Nyligen har CRISPR/Cas9-baserade gen knockouts framgångsrikt tillämpats på en mängd olika insekter, vilket ger ett kraftfullt molekylärgenetisk verktyg för icke-modellorganismer29. Här påpekar vi dock att CRISPR/Cas9 förvisso är bra men den elektroporationsmedierade RNAi-metoden kan vara överlägsen CRISPR/Cas9 i vissa avseenden.
För det första, i den elektroporationsmedierade RNAi-metoden kan kroppsregionen där RNAi-fenotyper uppträder enkelt kontrolleras experimentellt av den positiva elektrodens position vid elektroporation. Dessutom, eftersom regionen där genuttrycket undertrycks är begränsad runt den region där den positiva elektroden placerades, kan RNAi fenotyperna enkelt jämföras med kontroll fenotyperna sida vid sida i samma individ. För det andra, jämfört med CRISPR/Cas9-metoden där injicerade ägg måste födas upp till vuxen ålder för att observera knockout-fenotyperna, är den elektroporationsmedierade RNAi överlägsen på så sätt att genen knockdown-fenotyper vanligtvis kan observeras på mycket kortare tid. Till exempel tar det tre till fyra månader för I. senegalensis och ett till två år för P. zonata från ägg till vuxna14,30. För att observera RNAi fenotyper inom vuxenepdermis tar det dock mindre än en månad från dsRNA-injicering i slutinstarlar i stadium B till vuxenuppkomst för både I. senegalensis och P. zonata (Figur 7). För det tredje innebär den elektroporationsmedierade RNAi-metoden dsRNA-injektion i stora larver, vilket är lättare än mikroinjektion i små ägg som krävs för CRISPR/Cas9-metoden. Dessutom är den elektroporationsmedierade RNAi tillämplig på insektsarter vars nylagda ägg är svåra att samla in. Till exempel lägger honor av P. zonata ägg på flytande växter på vattenytan under flygning, och därmed är det svårt att samla sina ägg både på fältet och i labbet. Därav förväntar vi oss att detta protokoll kan vara allmänt tillämpligt på icke-modellorganismer där den konventionella RNAi-metoden inte fungerar effektivt.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar Minoru Moriyama för teknisk rådgivning och stöder, Bin Hirota och Ryutaro Suzuki för att samla Odonata larver, och Misa Shinya för hjälpkommentarer på manuskriptet. Detta arbete stöddes av JSPS KAKENHI Grant Numbers JP18J21561 till GO och JP18H02491, JP18H04893, JP19H03287, och JP20H04936 till RF.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12-well plate | Violamo | VTC-P12 | For rearing larvae before injection |
| Brine shrimp eggs | JAPAN PET DESIGN | 4975677012396 | |
| Calibrated micropipette (1-5 µL) | Drummond | 2-000-001-90 | |
| Deposit pestle 1.5 mL | Thermo Fisher Scientific | K749520-0090 | |
| Digital high defenition microscope camera | Leica Microsystems | MC170HD | |
| Disposable non-woven mesh | HAKUGEN EARTH | DSC-105A | |
| DNA Ligation Kit Ver.2.1 | Takara Bio | 6022 | |
| DraI | Takara Bio | 1037A | |
| Electrode (1mmφ) | NEPAGENE | CUY650P1 | |
| Electroporator | CellProduce | Cure-gene | |
| Forceps | KOWA Forceps Industry | K-10 No1 | |
| Glass needle puller | NARISHIGE | PN-3 | |
| Hand mixer | AS ONE | 1-229-02 | |
| Hand net | HOGA | IS33-3B | |
| HEPES | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 346-01373 | For injection buffer |
| Insect pin capitate No. 3 | Shiga Konchu Fukyusha | N230 | For fixing larvae |
| KCl | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 163-03545 | For PBS |
| KH2PO4 | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 169-04245 | For PBS |
| KOAc | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 160-03175 | For injection buffer |
| KOH | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 168-21815 | For injection buffer |
| Laboratory Jack (150x150) | AS ONE | 1-4642-11 | For adjusting the position of the manipulator |
| LOGIQLEAN Gel for Ultrasound Hard type | GE Healthcare | 2369385 | |
| Manipulator | Muromachi Kikai Co., Ltd. | SJ-1 | For adjusting the position of the injector and the capillary |
| MEGAscript RNAi kit | Thermo Fisher Scientific | AM1626 | |
| Mg(OAc)2 | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 130-00095 | For injection buffer |
| Na2HPO4 | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 197-02865 | For PBS |
| NaCl | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 191-01665 | For PBS |
| Petri dish (5 cm diameter) | Iwaki | 1010-060 | For rearing injected larvae |
| Pneumatic Injector | NARISHIGE | IM-12 | |
| pT7Blue T-Vector | Novagen | 69820 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | QIAGEN | 28106 | |
| RNAiso Plus | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 9109 | |
| RNeasy Mini Kit | QIAGEN | 74106 | |
| Shiga micro insect pin with stainless headless | Shiga Konchu Fukyusha | N251 | For making a small hole |
| Stereoscopic microscope | Leica Microsystems | S8APO | |
| SuperScript IV Reverse Transcriptase | Thermo Fisher Scientific | 18090010 | |
| TaKaRa Ex Taq | Takara Bio | RR001B | For PCR-amplification from plasmid |
| Tks Gflex DNA Polymerase | Takara Bio | R060B | For PCR-amplification from caudal gill |
References
- Misof, B., et al. Phylogenomics resolves the timing and pattern of insect evolution. Science. 346 (6210), 763-767 (2014).
- Wipfler, B., et al. Evolutionary history of Polyneoptera and its implications for our understanding of early winged insects. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (8), 3024-3029 (2019).
- Corbet, P. S. Dragonflies Behavior and Ecology of Odonata. , Cornell University Press. Ithaca, NY. (1999).
- Futahashi, R. Color vision and color formation in dragonflies. Current Opinion in Insect Science. 17, 32-39 (2016).
- Futahashi, R. Diversity of UV reflection patterns in Odonata. Frontiers in Ecology and Evolution. 8 (201), (2020).
- Córdoba-Aguilar, A. Dragonflies and damselflies. Model organisms for ecological and evolutionary research. , Oxford University Press. Oxford. (2008).
- Bybee, S., et al. Odonata (dragonflies and damselflies) as a bridge between ecology and evolutionary genomics. Frontiers in Zoology. 13 (46), (2016).
- Linz, D. M., Clark-Hachtel, C. M., Borràs-Castelles, F., Tomoyasu, Y. Larval RNA interference the red flour beetle, Tribolium castaneum. Journal of Visualized Experiments. 92, 52059 (2014).
- Okude, G., et al. Electroporation-mediated RNA interference reveals a role of multicopper oxidase 2 gene in dragonfly’s cuticular pigmentation. Applied Entomology and Zoology. 53 (3), 379-387 (2017).
- Terenius, O., et al. RNA interference in Lepidoptera: An overview of successful and unsuccessful studies and implications for experimental design. Journal of Insect Physiology. 57, 231-245 (2011).
- Ando, T., Fujiwara, H. Electroporation-mediated somatic transgenesis for rapid functional analysis in insects. Development. 140, 454-458 (2013).
- Nishikawa, H., et al. A genetic mechanism for female-limited Batesian mimicry in Papilio butterfly. Nature Genetics. 47 (4), 405-409 (2015).
- Osanai-Futahashi, M., et al. Positional cloning of a Bombyx pink-eyed white egg locus reveals the major role of cardinal in ommochrome synthesis. Heredity. 116 (2), 135-145 (2016).
- Okude, G., Futahashi, R., Tanahashi, M., Fukatsu, T. Laboratory rearing system for Ischnura senegalensis (Insecta: Odonata) enables detailed description of dragonfly’s larval development and morphogenesis. Zoological Science. 34 (5), 386-397 (2017).
- Ozono, A., Kawashima, I., Futahashi, R. Dragonflies of Japan (3rd edition). , Bunichi-Sogo Syuppan, Co Ltd. Tokyo. (2017).
- Ozono, A., Kawashima, I., Futahashi, R. The Handbook of Japanese Aquatic Insects. Volume 3: Dragonfly larvae. , Bunichi-Sogo Syuppan, Co Ltd. Tokyo. (2019).
- Arakane, Y., Noh, M. Y., Asano, T., Kramer, K. J. Tyrosine metabolism for insect cuticle pigmentation and sclerotization. Extracellular Composite Matrices in Arthropods. , Springer. 165-220 (2016).
- Asano, T., et al. Mini-review an insect-specific system for terrestrialization: Laccase-mediated cuticle formation. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 108, 61-70 (2019).
- Futahashi, R., Okude, G., Sugimura, M., Ugai, S.
- Okude, G., Fukatsu, T., Futahashi, R. Interspecific crossing between blue-tailed damselflies Ischnura elegans and I. senegalensis in the laboratory. Entomological Science. 23 (2), 165-172 (2020).
- Naito, Y., Yoshimura, J., Morishita, S., Ui-Tei, K. siDirect 2.0: updated software for designing functional siRNA with reduced seed-dependent off-target effect. BMC Bioinformatics. 10, 392 (2009).
- Yamaguchi, J., Mizoguchi, T., Fujiwara, H. siRNAs induce efficient RNAi response in Bombyx mori embryos. PLoS ONE. 6 (9), e25469 (2011).
- Untergasser, A., et al.
- Futahashi, R. Whole-mount in situ hybridization of sectioned tissues of species hybrids to detect cis-regulatory changes in gene expression pattern. Methods in Molecular Biology. 772, 319-328 (2011).
- Matsuura, Y., Kikuchi, Y., Miura, T., Fukatsu, T. Ultrabithorax is essential for bacteriocyte development. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (30), 9376-9381 (2015).
- Henze, M. J., Lind, O., Wilts, B. D., Kelber, A. Pterin-pigmented nanospheres create the colours of the polymorphiic damselfly Ischnura elegans. Journal of The Royal Society Interface. 16, 20180785 (2019).
- Nishide, Y., et al. Diversity and function of multicopper oxidase genes in the stinkbug Plautia stali. Scientific Reports. 10 (1), 3464 (2020).
- Christiaens, O., Swevers, L., Smagghe, G. DsRNA degradation in the pea aphid (Acyrthosiphon pisum) associated with lack of response in RNAi feeding and injection assay. Peptides. 53, 307-314 (2014).
- Sun, D., Guo, Z., Liu, Y., Zhang, Y. Progress and prospects of CRISPR/Cas systems in insects and other arthropods. Frontiers in Physiology. 8, 608 (2017).
- Miyakawa, K. A study of the life-history of Pseudothemis zonata (Burm.) (Odonata, Libellulidae) II. Immature stage. Kontyû. 37 (4), 409-422 (1969).
