Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Elektroporasjonsmediert RNA interferensmetode i Odonata

Published: February 6, 2021 doi: 10.3791/61952
Automatic Translation
1,2, 1,2,3, 2
1Department of Biological Sciences, Graduate School of Science, The University of Tokyo, 2Bioproduction Research Institute, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST), 3Graduate School of Life and Environmental Sciences, University of Tsukuba

Summary

Vi gir en detaljert protokoll for elektroporasjon-mediert RNA interferens i insekter av ordenen Odonata (øyenstikkere og damselflies) ved hjelp av blå-tailed damselfly (Ischnura senegalensis: Coenagironidae: Zygoptera) og pied skimmer dragonfly (Pseudothemis zonata: Libellulidae: Anisoptera).

Abstract

Dragonflies og damselflies (orden Odonata) representerer et av de mest forfedrenes insekter med metamorfose, der de endrer sitt habitat, morfologi og oppførsel drastisk fra akvatiske larver til terrestriske / antenne voksne uten pupal stadium. Odonata voksne har et velutviklet fargesyn og viser et bemerkelsesverdig mangfold i kroppsfarger og mønstre på tvers av kjønn, stadier og arter. Mens mange økologiske og atferdsstudier på Odonata har blitt utført, molekylære genetiske studier har vært knappe hovedsakelig på grunn av vanskeligheten med å bruke genfunksjonell analyse til Odonata. For eksempel er RNA-interferens (RNAi) mindre effektiv i Odonata, som rapportert i Lepidoptera. For å overvinne dette problemet etablerte vi en RNAi-metode kombinert med in vivo elektroporasjon. Her gir vi en detaljert protokoll, inkludert en video av elektroporasjonsmediert RNAi-metoden som følger: fremstilling av larver, artsidentifikasjon, fremstilling av dsRNA/ siRNA-løsning og injeksjonsnåler, iskald anestesi av larver, dsRNA / siRNA-injeksjon, in vivo elektroporasjon og individuell oppdrett til voksen fremvekst. Den elektroporasjonsmedierte RNAi-metoden gjelder for både damselflies (underbestilling Zygoptera) og øyenstikkere (underordnede Anisoptera). I denne protokollen presenterer vi metodene for den blå-tailed damselfly Ischnura senegalensis (Coenagrionidae) som et eksempel på damselfly arter og pied skimmer dragonfly Pseudothemis zonata (Libellulidae) som et annet eksempel på dragonfly arter. Som representative eksempler viser vi resultatene av RNAi rettet mot melaninsyntesegen multicopper oxidase 2. Denne RNAi-metoden vil lette forståelsen av ulike genfunksjoner involvert i metamorfose, morfogenese, fargemønsterdannelse og andre biologiske egenskaper ved Odonata. Videre kan denne protokollen være generelt aktuelt for ikke-modellorganismer der RNAi er mindre effektiv i genundertrykkelse på grunn av ineffektivitet og lav penetrance.

Introduction

Dragonflies og damselflies (rekkefølgen Odonata) er blant de mest forfedres grupper av insekter som viser "metamorfose"1,2. Ved metamorfose endrer de sitt habitat, morfologi og oppførsel drastisk fra akvatiske larver til terrestriske / antenne voksne3. Odonata voksne har et velutviklet fargesyn og representerer et bemerkelsesverdig mangfold i kroppsfarger og mønstre på tvers av kjønn, stadier ogarter 3,4,5. Mens mange økologiske og atferdsstudier på Odonata har blittutført 6,7, molekylære genetiske studier har blitt hindret hovedsakelig av vanskeligheten med å bruke genfunksjonell analyse til Odonata.

Den konvensjonelle RNA interferens (RNAi) metoden, der dobbelttrådet RNA (dsRNA) injiseres for å undertrykke funksjonen til genet av interesse8, viste seg å være ineffektiv i Odonata insekter9, som rapportert i Lepidopteran insekter10. På den annen side har tidligere rapporter antydet at elektroporasjonsmediert RNAi er effektiv i lepidopteriske arter, spesielt i epidermal vev11,12,13. Vi fant nylig at elektroporasjon-mediert RNAi fungerer effektivt i den lille dragonfly Nannophya pygmaea (Libellulidae: Anisoptera)9, men N. pygmaea er en relativt sjelden art og derfor ikke egnet for molekylære genetiske studier.

De fleste Odonata arter er klassifisert i en av de to underbestillinger, Zygoptera (damselflies) eller Anisoptera (sanne øyenstikkere)3. Her fokuserte vi på den blå-tailed damselfly Ischnura senegalensis (Coenagrionidae; Figur 1A) som en representant Zygopteran arter og pied skimmer dragonfly Pseudothemis zonata (Libellulidae; Figur 1B) som en representativ anisopteran art. De to artene er blant de vanligste Odonata-artene i naturlige og urbane dammer i Japan, inkludert de i Tsukuba By, og vi kan samle mange larver av de to artene i feltet. Nylig etablerte vi et laboratorieoppdragssystem for individuelle larver av I. senegalensis, som gjorde det mulig kontinuerlig overvåking av utvikling og morfogenese av Odonata larver i detalj14.

I denne rapporten gir vi en raffinert metode og en videoprotokoll for elektroporasjonsmedierte RNAi i I. senegalensis og P. zonata. I Japan finnes I. senegalensis og Ischnura asiatica, som er genetisk nær, ofte sympatrisk15, og de er vanskelige å skille mellomi larver 16. Vi beskriver også hvordan to Ischnura arter kan skilles ved begrensning fragment lengde polymorfisme (RFLP).

For å evaluere effektiviteten av elektroporasjonsmedierte RNAi, velger vi multicopper oxidase 2 genet (MCO2; også kjent som laccase2) som et representativt målgen, på grunn av den synlige fenotypen av blekere cuticle farge ved knockdown av genuttrykket9. MCO2 er kjent for å være avgjørende for mørkere epidermis i en rekke insektarter17,18.

Protocol

MERK: Den generelle ordningen for protokollene vises i figur 1.

1. Forberedelse av larver av øyenstikkere eller damselflies.

  1. Samle larver i feltet ved hjelp av et håndnett.
    MERK: I. senegalensis larver klamrer seg ofte på vannplanter som flyter på vannoverflaten, mens P. zonata larver ofte holder seg blant bladkull nederst. I Tsukuba City finnes de siste instar larver av I. senegalensis hovedsakelig fra mars til juni, og de av P. zonata fra mai til juni. I. senegalensis larver kan oppdras fra egg ilaboratoriet 14, men larver samlet i feltet har den klart høyere suksessraten for voksen fremvekst.
  2. Arter identifikasjon av begrensning fragment lengde polymorfisme (RFLP) av PCR-forsterkede produkter.
    MERK: Dette trinnet er bare nødvendig hvis arten er vanskelig å identifisere fra larvers utseende, som i I. senegalensis.
    1. Hold en av caudal gjellene i en larve ved hjelp av tang. Deretter faller larven av sin caudal gjelle selv (forårsaker autotomi).
      MERK: Larver av Zygopteran damselflies har vanligvis tre kaudalgjeller (figur 1A). Når de blir angrepet av et rovdyr, kan de ta av seg sine egne kaudalgjeller for å unnslippe. Hvis halegellet ikke er tilgjengelig, blir en del av benet dissekert.
    2. Sett en caudal gjelle i 100 μL PBS-oppløsning [0,8% NaCl, 0,02% KCl, 0,115% Na2HPO4og 0,02% KH2PO4 (w / v)] og homogeniser med en håndmikser ved hjelp av en innskuddsskadeskade.
    3. Spinn ned blandingen på 5000 x g i 10 sekunder, og subjek 0,5 μL av det overnaturlige til PCR-forsterkning ved hjelp av DNA-polymerase og primere for å forsterke den interne transkriberte avstandss avstandss avstandss avstand 1 (ITS1) regionen av kjernefysisk DNA.
      MERK: Utfør PCR i henhold til produsentens protokoll. Kombinasjonen av ITS-F0 (5'- GGA AAG ATG GCC AAA CTT GA -3') og 5.8S-AS1 (5'- GCC GGC CCT CAG CCA G -3') primere kan forsterke ITS1-regionen i nesten alle Odonata arter19.
    4. Inkuber blandingen av 1 μL PCR-forsterket produkt, 0,3 μL μL 10x M buffer, 0,1 μL DraI-begrensningsenzym og 1,6 μL vann ved 37 °C i 1 time.
      MERK: Velg de beste begrensningsenzymene, avhengig av kombinasjonen av arter. Hvis det ikke er noen restriksjonsenzymer egnet for artsidentifikasjon, må du bekrefte ved DNA-sekvensering.
    5. Legg 2 μL av produktene med lasting fargestoff på 2% agarose gel og kjøre elektroforese.
      MERK: Det er vanskelig å identifisere arter når du bruker 1% eller 1,5% agarose gel.
    6. Kontroller elektroforesemønsteret for å identifisere arten (figur 2).
      MERK: RFLP-mønstre er arts- og populasjonsavhengige. I Tsukuba befolkningen, I. asiatica har et stort band på 400-500 bp, mens I. senegalensis har et stort band på ca 200 bp og et ekstra band på mindre enn 100 bp (et pilspiss i figur 2). ITS1-regionen finnes i flere kopier i genomet, og i Ischnura-arter er mikrosatellittpolymorfisme i ITS1-regionen ofte tilstede i samme individ, noe som påvirker mønsteret av RFLPs.
  3. Bak de innsamlede larver i laboratoriet til bruk for RNAi.
    1. Legg hver larve separat i hver brønn av en 12-brønnsplate med ca. 3 ml vann.
      MERK: I. senegalensis larver må holdes individuelt fordi de ofte kannibalisere hverandre, mens P. zonata larver kan holdes i en gruppe fordi de sjelden kannibalisere.
    2. Feed I. senegalensis larver med Artemia saltlake reker hver dag og P. zonata larver med blodormer og / eller Tubifex ormer minst to ganger i uken før de vokser til egnet utviklingsstadium for RNAi.
      MERK: Hyppig fôring er avgjørende for å øke suksessraten for voksen fremvekst.
    3. Bytt vannet så snart det blir skittent med avføring eller rester.
      MERK: Hyppig vannendring er også viktig for å øke suksessraten for voksen fremvekst.
    4. Døm riktig utviklingsstadium for RNAi.
      MERK: Den endelige instar larver av I. senegalensis kan klassifiseres i fem utviklingsstadier14,20. Den første fasen (trinn A, før vingene begynner å ekspandere) eller den andre fasen (trinn B) av de endelige instar larver er egnet for RNAi eksperimenter, når man vurderer den klare fenotypen RNAi etter voksen fremvekst (se Diskusjon). I P. zonatable den endelige instar larver før vingeutvidelse (tilsvarende stadium A av I. senegalensis) brukt i denne studien.

2. Tilberedning av dsRNA/siRNA oppløsning og injeksjonsnåler til RNAi.

MERK: Velg enten små forstyrrende RNA (siRNA) (trinn 2.1) eller dobbelttrådet RNA (dsRNA) (trinn 2.2) som løsning for RNAi.

  1. Utarbeidelse av siRNA-løsningen
    1. Design siRNA ved hjelp av siDirect programversjon 2.0 (http://sidirect2.rnai.jp/)21, etter retningslinjene som tidligere er rapportert i Lepidopteran insekter22.
    2. Få kommersielt syntetisert siRNA.
      MERK: Sekvensene av siRNA rettet mot MCO2 genet av I. senegalensis som brukes i denne studien var som følger: 5'- GCA CUU UCC GUU AUC AAU AUA -3 ' for sense strand og 5'- UAU UGA UAA CGG AAA GUG CUC -3 ' for antisense strand. Som en negativ kontroll var sekvensene av siRNA rettet mot forbedret grønt fluorescerende protein (EGFP)genet som følger: 5'- GCA UCA AGG UGA ACU UCA AGA -3' for sense strand og 5'- UUG AAG UUC ACC UUG AUG CCG -3' for antisense strand11.
    3. Fortynn siRNA til 100 μM med injeksjonsbuffer [100 mM CH3COOK, 2 mM Mg(CH3COO)2,30 mM HEPES-KOH, pH 7,4]22.
    4. Oppbevares ved -80 °C til bruk.
  2. Utarbeidelse av dsRNA-løsning.
    1. Velg en 300-400 bp-region for dsRNA ved hjelp av primer3 programversjon 4.1.0 (http://bioinfo.ut.ee/primer3/)23 og design primer settene.
    2. Få kommersielt syntetiserte primersett.
      MERK: For å produsere maler for dsRNA-syntese, var primersettene som ble brukt i denne studien som følger: (5'- GCC TGT CAG CTT TGT CTT CC -3' for fremover primer og 5'- GGT GTC TGG CGG ACA ACT AT -3 ' for omvendt primer) for MCO2 gener av I. senegalensis (IsMCO2, tiltredelse nr. LC589180) og (5'- CCG CAC AGC TCA CTA TTC AA -3' for fremover primer og 5'- GGA GGA TTC CTT CAT CGA CA -3 ' for omvendt primer) for MCO2 gener av P. zonata (PzMCO2, tiltredelse nr. LC589179). Som en negativ kontroll var primeren satt for dsRNA rettet mot β-laktamase (bla) genet på kloning vektoren (5'- CTA TGT GGC GCG GTA TTA T -3 ' for fremover primer og 5 '- CAG AAG TGG TCC TGC AAC T -3 ' for omvendt primer).
    3. Trekk ut RNA fra Odonata larver ved hjelp av et kommersielt tilgjengelig RNA-ekstraksjonssett og utfør cDNA-syntese ved hjelp av omvendt transkripsjon i henhold til produsentens protokoll.
      MERK: cDNA-biblioteket som er klargjort for RNA-sekvenseringsanalyse, kan også brukes.
    4. Forsterk målsekvensene ved hjelp av den syntetiserte cDNA og det utformede primersettet og klone dem inn i kloningsvektoren ved hjelp av en kommersiell ligase i henhold til produsentens protokoll.
    5. Forvandle plasmid til E. coli kompetente celler og plukke opp en enkelt koloni etter natten inkubasjon.
    6. PCR-forsterke innsettingsområdet ved hjelp av primere på vektoren.
    7. Bekreft den klonede sekvensen av Sanger sekvensering.
    8. PCR-forsterke innsatsen ved hjelp av vektor primere som inneholder T7 polymerase promotor sekvens24, 25.
      MERK: I denne studien ble følgende primere brukt: T7-F (5' - TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA GAC TAG TCA TAT GGA T - 3') og T7-R (5'- TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA GAC CCG GGG ATC CGA T - 3') 25.
    9. Rens PCR-produktet ved hjelp av PCR-rensesettet i henhold til produsentens protokoll, elute DNA med 50 μL destillert vann, og konsentrat den eluted DNA-løsningen til ca. 10 μL ved hjelp av en sentrifugalfordamper.
    10. Syntetisere dsRNA ved in vitro transkripsjon i henhold til produsentens protokoll. Bruk totalt 1000 ng mal DNA og elute syntetisert dsRNA med 100 μL elution buffer.
    11. Mål konsentrasjonen av dsRNA ved hjelp av et spektrofotometer og bekreft kvaliteten på dsRNA ved elektroforese på en 1,5% agarose gel.
      MERK: Et enkelt bånd kan ses når dsRNA-syntesen er vellykket.
    12. Fortynn dsRNA til 1000 ng/μL med elutionbuffer og oppbevar ved -20 °C til bruk.
  3. Tilberedning av injeksjonsnåler
    1. Trekk en glasskapillær ved hjelp av en glassnåltrekker.
    2. Plasser spissen av det trukket kapillær på et dobbeltsidig tape og bryte spissen av kapillæren med tang.
    3. Sett kapillæren på en injektor.
      MERK: Det er lettere å håndtere kapillæren hvis du bruker nitrilhansker.
    4. Last siRNA/dsRNA-oppløsningen til det tilberedte kapillæret.
      MERK: Ikke bruk kapillæren gjentatte ganger siden spissen av det injiserte kapillæret kan bli tilstoppet med smuss fordi larvene som samles i feltet bodde i gjørma.

3. siRNA/dsRNA injeksjon

MERK: Prosedyren er litt annerledes for damselflies (trinn 3.1) og øyenstikkere (trinn 3.2).

  1. Injeksjon til en Zygopteran (damselfly) larve (f.eks. I. senegalensis).
    1. Bedøve en larve dekket med et vått papir på knust is i 50-70 sekunder (Figur 3A-C).
      MERK: Varigheten av iskaldbedøvelse avhenger av larvens tilstand; hvis larven begynner å bevege seg etter 70 sekunder med iskald anestesi, påføres ytterligere 70 sekunder med iskald anestesi. For larver som sjelden beveger seg (f.eks. P. zonata),er denne prosedyren ikke viktig.
    2. Fest to pinner på begge sider av prothoraxen og fest larven til et fast stativ (f.eks. et stykke Styrofoam) (figur 3D).
      MERK: Juster posisjonen og antall pinner, avhengig av injeksjonsstedet.
    3. Strekk den intersegmentale membranen mellom 7th og 8th abdominal segmentet for RNAi i magen eller mellom prothorax og synthorax (smeltet mesothorax og metathorax) for RNAi i thorax ved hjelp av hender og tang.
    4. Hold intersegmental membran strukket for hånd.
    5. Sett spissen av den tilberedte kapillæren inn i den strukket intersegmentalmembranen (figur 3D, 3F).
    6. Injiser 1 μL siRNA/dsRNA oppløsning.
  2. Injeksjon til en anisopteran (dragonfly) larve (f.eks. P. zonata).
    1. Tørk av vannet av larveoverflaten med et papirhåndkle.
    2. Fest om nødvendig to pinner på begge sider av prothoraxen og fest larven til et fast stativ (f.eks. et stykke Styrofoam) (figur 3H).
      MERK: Juster posisjonen og antall pinner, avhengig av injeksjonsstedet. I tilfelle av P. zonataer det ikke viktig å fikse larver med pinner på dette trinnet.
    3. Strekk den intersegmentale membranen mellom fjerde og femte abdominalsegment for hånd.
    4. Lag et lite hull med en fin nål i den intersegmentale membranen mellom det fjerde og femte magesegmentet.
      MERK: Denne prosedyren er nødvendig for mange anisopteran (dragonfly) arter fordi intersegmental membran er for vanskelig å sette inn et glass kapillær direkte.
    5. Sett spissen av det tilberedte kapillæret inn i det tilberedte hullet (figur 3I).
      MERK: Som vist i figur 3H,tilsvarer en del av den dorsale siden av larvene ventral siden av den voksne, slik at fenotypen vises ventrikt når den behandles som vist i figur 3H-J.
    6. Injiser 1 μL siRNA/dsRNA oppløsning.

4. in vivo elektroporasjon

  1. Legg om nødvendig til flere pinner for å feste larven til et fast stativ (f.eks. et stykke Styrofoam).
  2. Etter injeksjon av siRNA/dsRNA-oppløsningen, påfør to dråper ultralydgel på larveoverflaten ved hjelp av tang.
  3. Plasser elektroder på ultralydgelen, med den positive elektroden på siden injisert med siRNA/ dsRNA-løsningen og en negativ elektrode på motsatt side (figur 3E, 3G, 3J).
    MERK: Ikke berør larvens epidermis direkte for å unngå den brennende effekten av elektroporasjon.
  4. Generer 10 ganger elektroporasjonspulser (280 ms/s hver) ved hjelp av en elektroporator.
    MERK: Juster spenningen til elektroporasjon, avhengig av arten, stadiene og vevet. I denne studien ble 25 V brukt på I. senegalensis og 45 V til P. zonata.
  5. Tørk av den gjenværende gelen på overflaten med et papirhåndkle.
  6. Hold de behandlede larver hviler på et vått papirhåndkle i omtrent en dag for gjenoppretting og overfør dem til et opparbeidingsetui neste dag.

5. Stedsspesifikk fenotypisk analyse

  1. Hold I. senegalensis individuelt i en petriskål (5 cm i diameter) som inneholder ca. 10 ml vann og et stykke papirhåndkle, og hold P. zonata i et plastbur med engangs ikke-vevd nett (eclosion bur14).
  2. For I. senegalensis, etter larvene slutter å spise, flytt dem individuelt inn i et plastbur med et engangs ikke-vevd nett.
    MERK: Ikke legg to eller flere larver i samme bur. Ellers vil de kannibalisere hverandre umiddelbart etter at de blir voksne.
  3. Etter fremveksten av den voksne, observere og fotografere fenotypen rundt regionen der den positive elektroden ble plassert for elektroporasjon.
    MERK: Fenotypen vises bare i patcher. Fenotyper er ofte vanskelig å gjenkjenne umiddelbart etter fremveksten på grunn av ufullstendig pigmentering.
  4. For å undersøke effektiviteten til RNAi (f.eks. kvantitativ RT-PCR), hvis fenotypen er synlig, dissekere regionen og sammenligne den med regionen uten fenotypen.
    MERK: Nivåene av RNAi fenotype, nemlig størrelse og plassering av skjellaget decolorization, viser ofte betydelig variasjon mellom individer (se figur 4).
  5. Hold de fremvoksende voksne i 100% EtOH for fremtidige analyser.
    MERK: Kroppsfargen til Odonata-artene forsvinner raskt etter døden, så det er viktig å lagre dem i etanol før de dør. Etanol misfarger noen ganger insekter, i slike tilfeller at insekter er frosset før de dør.

Representative Results

Vi brukte protokollen ovenfor på elektroporasjonsmedierte RNAi rettet mot MCO2 gen- og negativ kontrollgener (EGFP for siRNA og bla for dsRNA) (i) i magen til I. senegalensis (figur 4), (ii) i thoraxen til I. senegalensis (figur 5) og (iii) i magen til P. zonata (figur 6). Resultatene av RNAi-eksperimentene er oppsummert i tabell 1. Fordi negativt ladet siRNA/dsRNA bare er innlemmet i positivt ladede celler, ble RNAi fenotyper observert rundt i regionen der den positive elektroden ble plassert for elektroporasjon.

I begge jeg. senegalensis og P. zonata, hemming av melanin pigmentering (det vil si svart, brun og rødbrun) dukket opp i flekker rundt regionen der den positive elektroden ble plassert (hvite pilspisser og stiplede linjer i figur 4, figur 5og figur 6) da MCO2 RNAi ble utført i kombinasjon med elektroporasjon (tabell 1), som tidligere rapportert i N. pygmaea9. Derimot ble det ikke observert fenotypiske effekter rundt elektroporasjonsstedet da kontrollgenet ble injisert (EGFP siRNA eller bla dsRNA) (figur 4, figur 5og figur 6, tabell 1). I tillegg hadde injeksjon av MCO2-genet uten elektroporasjon ingen effekt på voksenpigmentering (figur 4, tabell 1), noe som indikerer at elektroporasjon er avgjørende for RNAi i Odonata. Det bør bemerkes at de blå, grønne og gule fargene ikke påvirkes av RNAi av MCO2 genet som er involvert i melanin syntese i skjellaget, som plausibly gjenspeiler det faktum at disse kroppsfargene tilskrives pigmentgranulat tilstede i epidermal celler som er synlige gjennom gjennomsiktig cuticle26. Som vist i figur 4ble det ikke observert bemerkelsesverdige fenotypiske forskjeller mellom personene som ble utsatt for behandling med siRNA og dsRNA, mens det ble observert betydelig variasjon i størrelse og plassering av RNAi fenotypen blant ulike personer som ble utsatt for samme RNAi-behandling (f.eks. sammenligne to eksempler på IsMCO2 dsRNA i figur 4).

For å bestemme utviklingsstadiet som var mest egnet for RNAi-behandlingen, sammenlignet vi de fenotypiske konsekvensene av RNAi-behandlingen på fem morfologiske stadier (stadium A-E) i den endelige larval instar av I. senegalensis (figur 7A). Hemming av melaninpigmentering forårsaket av MCO2 RNAi ble observert hos alle voksne da de injiserte i trinn A og B (figur 7C). Når injisert i stadiene C og D, undertrykkelse av melanin pigmentering ble sikkert observert hos noen dukket voksne, men andre voksne viste unormal farge forårsaket av sår (Figur 7B).

Figure 1
Figur 1: Elektroporasjonsmedierte RNAi-metoder i Odonata. A. Ischnura senegalensis (Coenagirionidae) som en representativ damselfly arter. B. Pseudothemis zonata (Libellulidae) som en representativ dragonfly arter. C. Den generelle ordningen med protokollene. Blå og oransje bokser indikerer protokollene for henholdsvis I. senegalensis og P. zonata. De lilla boksene indikerer de vanlige protokollene som brukes på begge artene. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren. 

Figure 2
Figur 2: Et representativt resultat av begrensning fragment lengde polymorfisme (RFLP)-baserte arter identifikasjon for Ischnura arter. Arrowhead indikerer I. senegalensis-spesifiktband. 1, 2, 4: I. asiatica, 3: I. senegalensis, M: 100-base par stige markør. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Elektroporasjonsmediert RNAi-metode i Odonata. A-C. Iskald anestesi av I. senegalensis. Pilspisser indikerer en larve. A. Sette en larve på knust is med et vått papir. B. Forstørret utsikt over en larve på is. C. En larve dekket med et vått papir på is. D-G. RNAi metode for I. senegalensis. D. Injeksjon i thoraxen. E. Elektroporasjon på thoraxen. F. Injeksjon i magen. G. Elektroporasjon på magen. H-J. RNAi metode for P. zonata. H. Å lage et lite hull på magen. Jeg er en av de beste i Injeksjon i magen. J. Elektroporasjon på magen. Piler indikerer poenget med å lage et hull eller injeksjon. +, -: Positive/negative sideelektroder. Tall indikerer buksegmentet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Dorsal utsikt over RNAi fenotyper på magen av I. senegalensis. Hvite pilspisser indikerer regionene for undertrykt melanisering. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Lateral og dorsal utsikt over RNAi fenotyper på thorax av I. senegalensis. Hvite pilspisser og stiplede linjer indikerer regionene med undertrykt pigmentering. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 6
Figur 6: Ventral utsikt over RNAi fenotyper i magen av P. zonata. Hvite pilspisser og stiplede linjer indikerer regionene for undertrykt melanisering. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 7
Figur 7: Sceneavhengig IsMCO2 RNAi effekter under den endelige larval instar av I.senegalensis. A. Morfologiske endringer i de sammensatte øynene på fem morfologiske stadier (stadium A-E) og antall dager til voksen fremvekst i denne studien. Tall i parentes er fra forrige rapport14. B. Unormal pigmentering på grunn av sår. Pilspiss indikerer elektroporasjonsstedet. C. Effekten av RNAi på fem morfologiske stadier på voksen pigmentering i I. senegalensis. Nummeret på linjen angir antall personer. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren. 

Arter I.senegalensis P.zonata
Injisert region Magen Thorax Magen
siRNA/dsRNA siRNA DsRNA DsRNA DsRNA
Målgen IsMCO2 EGFP IsMCO2 IsMCO2 bla i IsMCO2 bla i PzMCO2 Leilighet PzMCO2 Leilighet bla i
Elektroporasjon + + + - + + + + - +
Injisert larver 22 25 30 6 53 12 20 17 5 9
Voksne dukket opp 7 6 13 4 40 11 14 11 2 5
Voksne med mindre pigmenterte regioner (forhold) 7
(100%)		 0
(0%)		 13
(100%)		 0
(0%)		 0
(0%)		 10
(91%)		 0
(0%)		 11
(100%)		 0
(0%)		 0
(0%)

Tabell 1. Effekten av RNAi på voksen pigmentering i I. senegalensis og P. zonata. Resultater på trinn A vises i I. senegalensis. IsMCO2: multicopper oxidase 2 genet av I. senegalensis, EGFP: Forbedret grønt fluorescerende protein gen, bla: beta lactamase genet fra pGEM-T Easy Vector, PzMCO2: multicopper oksidase 2 genet av P. zonata. Resultatene for kontrollgenene representerer det totale antallet eksperimenter forfatterne har gjennomført til dags dato.

Discussion

Dødelighet av RNAi behandling

Vi fant at dødeligheten av RNAi-behandlingen avhenger sterkt av oppdrettshistorien og tilstanden til Odonata larver. Larvene kort tid etter innsamling i feltet er generelt sunne og viser lav dødelighet etter elektroporasjonsmediert RNAi-behandling. Derimot har larvene oppdratt i laboratoriet i lang tid (f.eks. en måned) en tendens til å lide lave suksessrater for voksen fremvekst. I I. senegalensis, i stedet for larver samlet i feltet, kan larvene oppdratt i laboratoriet fra egg brukes14, men suksessratene til RNAi ved hjelp av laboratorie-oppdrettede larver har en tendens til å være betydelig lavere (mange individer døde under metamorfose) enn de som bruker de feltsamlede larver. I tillegg er hyppig larvefôring og ren vannoppdring viktig for å øke suksessratene for voksen fremvekst og redusere dødeligheten av RNAi-behandlingen.

Effektiviteten av RNAi behandling

Som beskrevet ovenfor, nivåene av RNAi fenotype, nemlig størrelse og plassering av cuticle decolorization, viste ofte betydelig variasjon mellom individer utsatt for samme RNAi behandling (f.eks Figur 4),men nivåene av fenotypisk penetrering synes å være bemerkelsesverdig forskjellig mellom Odonata arter. De observerte fenotypiske regionene var større og mer fremtredende i I. senegalensis (Figur 4-5) enn i P. zonata (figur 6) og N. pygmaea9. Denne forskjellen kan skyldes tykkelsen på skjellaget på larvaloverflaten, med tanke på at skjellaget av I. senegalensis er tynnere enn skjellaget av P. zonata og N. pygmaea). Så vidt vi undersøkte, ble det ikke gjenkjent noen klar forskjell mellom effekten av siRNA og dsRNA (figur 4, tabell 1).

Passende utviklingsstadium for RNAi

Det bør bemerkes at riktig larval iscenesettelse er viktig for å utføre RNAi effektivt. Hemming av voksenpigmentering var forårsaket av MCO2 RNAi før trinn D (ca. 3 dager før voksen fremvekst), noe som er i samsvar med den forrige rapporten om N. pygmaea9. RNAi fenotypene observert når de injiseres i trinn C og D var mindre iøynefallende enn de som ble behandlet i stadiene A og B, noe som indikerer at stadier C og D kan være for sent til å tilstrekkelig undertrykke genuttrykket. Riktig tidspunkt for RNAi-behandling avhenger av tidspunktet for genuttrykk, og MCO2-genet viser forbigående høyt uttrykk under voksen fremvekst9, som i andreinsekter 17,18. I stinkbug Plautia stalible RNAi knockdown av MCO2 genet observert fra dag 4 og utover etter injeksjon27, noe som er i samsvar med dagens resultater.

Vår tidligere studie på I. senegalensis viste at etter stadium B viser dager til voksen fremvekst relativt liten variasjon blant flertallet av endelige instar larver, noe som tyder på at stadium B kan tilsvare utbruddet av prosessen mot voksen fremvekst, hvoretter utviklingsprosessene for metamorfose fortsetter på en prefiks og koordinertmåte 14. Morfologiske abnormiteter forårsaket av sår ble ofte observert når larvene ble RNAi-behandlet i stadiene C og D (figur 7B, 7C). Dette vil sannsynligvis være forbundet med en dramatisk progresjon av metamorfose i disse stadiene, noe som tyder på at RNAi behandling bør unngås fra stadium C og videre. Oppsummert anbefaler vi at endelige instar larver på scenen A eller B (eller på scenen før larvevingene utvides betydelig) skal brukes til RNAi-eksperimenter.

Nytten og overlegenheten til elektroporasjonsmediert RNAi-metode

Den konvensjonelle RNAi er en enkel og kraftig eksperimentell metode, men noen insektslektninger somsommerfugler 10,bladlus28 og øyenstikkere9 viser lav RNAi effektivitet, som etablering av genfunksjonsanalyse er en stor utfordring. I denne studien fant vi at elektroporasjonsmediert RNAi kan indusere lokal genundertrykkelse i øyenstikkere med nesten 100% effektivitet, i hvert fall i epidermis, hvis behandlet på passende utviklingsstadier (tabell 1). Nylig har CRISPR / Cas9-baserte gen knockouts blitt brukt på en rekke insekter, noe som gir et kraftig molekylært genetisk verktøy for ikke-modellorganismer29. Her påpeker vi imidlertid at CRISPR/Cas9 er absolutt flott, men elektroporasjonsmediert RNAi-metoden kan være bedre enn CRISPR/Cas9 i noen henseender.

For det første, i elektroporasjonsmediert RNAi-metoden, kan kroppsområdet der RNAi fenotyper vises lett kontrolleres eksperimentelt ved posisjonen til den positive elektroden ved elektroporasjon. I tillegg, siden regionen der genuttrykket undertrykkes er begrenset rundt regionen der den positive elektroden ble plassert, kan RNAi fenotypene enkelt sammenlignes med kontrollfenotypene side om side i samme individ. For det andre, sammenlignet med CRISPR/Cas9-metoden der injiserte egg må oppdras til voksen alder for å observere knockout fenotypene, er elektroporasjonsmediert RNAi overlegen ved at genet knockdown fenotyper vanligvis kan observeres på mye kortere tid. For eksempel tar det tre til fire måneder for I. senegalensis og ett til to år for P. zonata fra egg tilvoksne 14,30. Men for å observere RNAi fenotyper innenfor den voksne epidermis, tar det mindre enn en måned fra dsRNA injeksjon til endelig instar larver på stadium B til voksen fremvekst for både I. senegalensis og P. zonata (Figur 7). For det tredje innebærer den elektroporasjonsmedierte RNAi-metoden dsRNA-injeksjon i store larver, noe som er lettere enn mikroinjeksjon i små egg som kreves for CRISPR/ Cas9-metoden. I tillegg gjelder den elektroporasjonsmedierte RNAi for insektarter hvis nylagte egg er vanskelige å samle. For eksempel legger kvinner av P. zonata egg på flytende planter på vannoverflaten under flyturen, og dermed er det vanskelig å samle eggene sine både i feltet og i laboratoriet. Derfor forventer vi at denne protokollen generelt kan gjelde for ikke-modellorganismer der den konvensjonelle RNAi-metoden ikke fungerer effektivt.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Vi takker Minoru Moriyama for tekniske råd og støtter, Bin Hirota og Ryutaro Suzuki for å samle Odonata larver, og Misa Shinya for nyttige kommentarer på manuskriptet. Dette arbeidet ble støttet av JSPS KAKENHI Grant Numbers JP18J21561 til GO og JP18H02491, JP18H04893, JP19H03287 og JP20H04936 til RF.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
12-well plate Violamo VTC-P12 For rearing larvae before injection
Brine shrimp eggs JAPAN PET DESIGN 4975677012396
Calibrated micropipette (1-5 µL) Drummond 2-000-001-90
Deposit pestle 1.5 mL Thermo Fisher Scientific K749520-0090
Digital high defenition microscope camera Leica Microsystems MC170HD
Disposable non-woven mesh HAKUGEN EARTH DSC-105A
DNA Ligation Kit Ver.2.1 Takara Bio 6022
DraI Takara Bio 1037A
Electrode (1mmφ) NEPAGENE CUY650P1
Electroporator CellProduce Cure-gene
Forceps KOWA Forceps Industry K-10 No1
Glass needle puller NARISHIGE PN-3
Hand mixer AS ONE 1-229-02
Hand net HOGA IS33-3B
HEPES FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation 346-01373 For injection buffer
Insect pin capitate No. 3 Shiga Konchu Fukyusha N230 For fixing larvae
KCl FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation 163-03545 For PBS
KH2PO4 FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation 169-04245 For PBS
KOAc FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation 160-03175 For injection buffer
KOH FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation 168-21815 For injection buffer
Laboratory Jack (150x150) AS ONE 1-4642-11 For adjusting the position of the manipulator
LOGIQLEAN Gel for Ultrasound Hard type GE Healthcare 2369385
Manipulator Muromachi Kikai Co., Ltd. SJ-1 For adjusting the position of the injector and the capillary
MEGAscript RNAi kit Thermo Fisher Scientific AM1626
Mg(OAc)2 FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation 130-00095 For injection buffer
Na2HPO4 FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation 197-02865 For PBS
NaCl FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation 191-01665 For PBS
Petri dish (5 cm diameter) Iwaki 1010-060 For rearing injected larvae
Pneumatic Injector NARISHIGE IM-12
pT7Blue T-Vector Novagen 69820
QIAquick PCR Purification Kit QIAGEN 28106
RNAiso Plus FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation 9109
RNeasy Mini Kit QIAGEN 74106
Shiga micro insect pin with stainless headless Shiga Konchu Fukyusha N251 For making a small hole
Stereoscopic microscope Leica Microsystems S8APO
SuperScript IV Reverse Transcriptase Thermo Fisher Scientific 18090010
TaKaRa Ex Taq Takara Bio RR001B For PCR-amplification from plasmid
Tks Gflex DNA Polymerase Takara Bio R060B For PCR-amplification from caudal gill

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Misof, B., et al. Phylogenomics resolves the timing and pattern of insect evolution. Science. 346 (6210), 763-767 (2014).
  2. Wipfler, B., et al. Evolutionary history of Polyneoptera and its implications for our understanding of early winged insects. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (8), 3024-3029 (2019).
  3. Corbet, P. S. Dragonflies Behavior and Ecology of Odonata. , Cornell University Press. Ithaca, NY. (1999).
  4. Futahashi, R. Color vision and color formation in dragonflies. Current Opinion in Insect Science. 17, 32-39 (2016).
  5. Futahashi, R. Diversity of UV reflection patterns in Odonata. Frontiers in Ecology and Evolution. 8 (201), (2020).
  6. Córdoba-Aguilar, A. Dragonflies and damselflies. Model organisms for ecological and evolutionary research. , Oxford University Press. Oxford. (2008).
  7. Bybee, S., et al. Odonata (dragonflies and damselflies) as a bridge between ecology and evolutionary genomics. Frontiers in Zoology. 13 (46), (2016).
  8. Linz, D. M., Clark-Hachtel, C. M., Borràs-Castelles, F., Tomoyasu, Y. Larval RNA interference the red flour beetle, Tribolium castaneum. Journal of Visualized Experiments. 92, 52059 (2014).
  9. Okude, G., et al. Electroporation-mediated RNA interference reveals a role of multicopper oxidase 2 gene in dragonfly’s cuticular pigmentation. Applied Entomology and Zoology. 53 (3), 379-387 (2017).
  10. Terenius, O., et al. RNA interference in Lepidoptera: An overview of successful and unsuccessful studies and implications for experimental design. Journal of Insect Physiology. 57, 231-245 (2011).
  11. Ando, T., Fujiwara, H. Electroporation-mediated somatic transgenesis for rapid functional analysis in insects. Development. 140, 454-458 (2013).
  12. Nishikawa, H., et al. A genetic mechanism for female-limited Batesian mimicry in Papilio butterfly. Nature Genetics. 47 (4), 405-409 (2015).
  13. Osanai-Futahashi, M., et al. Positional cloning of a Bombyx pink-eyed white egg locus reveals the major role of cardinal in ommochrome synthesis. Heredity. 116 (2), 135-145 (2016).
  14. Okude, G., Futahashi, R., Tanahashi, M., Fukatsu, T. Laboratory rearing system for Ischnura senegalensis (Insecta: Odonata) enables detailed description of dragonfly’s larval development and morphogenesis. Zoological Science. 34 (5), 386-397 (2017).
  15. Ozono, A., Kawashima, I., Futahashi, R. Dragonflies of Japan (3rd edition). , Bunichi-Sogo Syuppan, Co Ltd. Tokyo. (2017).
  16. Ozono, A., Kawashima, I., Futahashi, R. The Handbook of Japanese Aquatic Insects. Volume 3: Dragonfly larvae. , Bunichi-Sogo Syuppan, Co Ltd. Tokyo. (2019).
  17. Arakane, Y., Noh, M. Y., Asano, T., Kramer, K. J. Tyrosine metabolism for insect cuticle pigmentation and sclerotization. Extracellular Composite Matrices in Arthropods. , Springer. 165-220 (2016).
  18. Asano, T., et al. Mini-review an insect-specific system for terrestrialization: Laccase-mediated cuticle formation. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 108, 61-70 (2019).
  19. Futahashi, R., Okude, G., Sugimura, M., Ugai, S. Interspecific hybrids in Japanese Odonata. Tombo. 60, 1-49 (2018).
  20. Okude, G., Fukatsu, T., Futahashi, R. Interspecific crossing between blue-tailed damselflies Ischnura elegans and I. senegalensis in the laboratory. Entomological Science. 23 (2), 165-172 (2020).
  21. Naito, Y., Yoshimura, J., Morishita, S., Ui-Tei, K. siDirect 2.0: updated software for designing functional siRNA with reduced seed-dependent off-target effect. BMC Bioinformatics. 10, 392 (2009).
  22. Yamaguchi, J., Mizoguchi, T., Fujiwara, H. siRNAs induce efficient RNAi response in Bombyx mori embryos. PLoS ONE. 6 (9), e25469 (2011).
  23. Untergasser, A., et al. Primer3--new capabilities and interfaces. Nucleic Acids Research. 40 (15), e115 (2012).
  24. Futahashi, R. Whole-mount in situ hybridization of sectioned tissues of species hybrids to detect cis-regulatory changes in gene expression pattern. Methods in Molecular Biology. 772, 319-328 (2011).
  25. Matsuura, Y., Kikuchi, Y., Miura, T., Fukatsu, T. Ultrabithorax is essential for bacteriocyte development. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (30), 9376-9381 (2015).
  26. Henze, M. J., Lind, O., Wilts, B. D., Kelber, A. Pterin-pigmented nanospheres create the colours of the polymorphiic damselfly Ischnura elegans. Journal of The Royal Society Interface. 16, 20180785 (2019).
  27. Nishide, Y., et al. Diversity and function of multicopper oxidase genes in the stinkbug Plautia stali. Scientific Reports. 10 (1), 3464 (2020).
  28. Christiaens, O., Swevers, L., Smagghe, G. DsRNA degradation in the pea aphid (Acyrthosiphon pisum) associated with lack of response in RNAi feeding and injection assay. Peptides. 53, 307-314 (2014).
  29. Sun, D., Guo, Z., Liu, Y., Zhang, Y. Progress and prospects of CRISPR/Cas systems in insects and other arthropods. Frontiers in Physiology. 8, 608 (2017).
  30. Miyakawa, K. A study of the life-history of Pseudothemis zonata (Burm.) (Odonata, Libellulidae) II. Immature stage. Kontyû. 37 (4), 409-422 (1969).

Tags

Utviklingsbiologi Utgave 168 RNA interferens RNAi in vivo elektroporasjon Gene knockdown Dragonfly Damselfly Odonata Ischnura senegalensis,Pseudothemis zonata
Elektroporasjonsmediert RNA interferensmetode i Odonata
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Okude, G., Fukatsu, T., Futahashi,… More

Okude, G., Fukatsu, T., Futahashi, R. Electroporation-mediated RNA Interference Method in Odonata. J. Vis. Exp. (168), e61952, doi:10.3791/61952 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter