Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

הליכי גונדקטומיה ודגימה בדם במודל טלוסט קטן מדאקה(Oryzias latipes)

Published: December 11, 2020 doi: 10.3791/62006
Automatic Translation
1, 2, 3, 4, 4, 1, 1
1Physiology Unit, Faculty of Veterinary Medicine, Norwegian University of Life Sciences, 2Laboratory of Physiology, Atmosphere and Ocean Research Institute, The University of Tokyo, 3Department of Biological Sciences, Graduate School of Science, The University of Tokyo, 4Centre of Reproduction, Development and Aging (CRDA), Faculty of Health Sciences, University of Macau

Summary

המאמר מתאר פרוטוקול מהיר כדי gonadectomize ולדגום דם מדג הטלוסט הקטן, באמצעות medaka יפני(Oryzias latipes) כמודל, כדי לחקור את התפקיד של סטרואידים מיניים בפיזיולוגיה של בעלי חיים.

Abstract

סטרואידים סקס, המיוצר על ידי האשכים, לשחק תפקיד חיוני במוח ורקמות יותרת המוח פלסטיות, בשליטה neuroendocrine של רבייה בכל בעלי החוליות על ידי מתן משוב למוח ובלוטות יותרת המוח. דגי טלוסט מחזיקים ברמה גבוהה יותר של פלסטיות רקמות וריאציה באסטרטגיות הרבייה בהשוואה ליונקים ונראה שהם מודלים שימושיים לחקור את תפקידם של סטרואידים מיניים ואת המנגנונים שבאמצעותם הם פועלים. הסרת המקור העיקרי של ייצור סטרואידים מיני באמצעות gonadectomy יחד עם דגימת דם כדי למדוד את רמות הסטרואידים כבר מבוסס היטב למדי אפשרי דגים גדולים יותר, היא טכניקה רבת עוצמה לחקור את התפקיד וההשפעות של סטרואידים מיניים. עם זאת, טכניקות אלה מעלות אתגרים כאשר מיושמות במודלים טלוסט בגודל קטן. כאן, אנו מתארים את ההליכים שלב אחר שלב של כריתת גונדקטומיה הן אצל זכרים והן אצל נקבה יפנית מדאקה ואחריו דגימת דם. פרוטוקולים אלה מוצגים להיות אפשרי מאוד medaka המצוין על ידי שיעור הישרדות גבוה, בטיחות על תוחלת החיים ואת פנוטיפ של הדג, רבייה במונחים של אישור סטרואידים מין. השימוש בהליכים אלה בשילוב עם היתרונות האחרים של שימוש במודל טלוסט קטן זה ישפר מאוד את ההבנה של מנגנוני משוב בשליטה הנוירואנדוקרינית של רבייה ופלסטיות רקמות המסופקים על ידי סטרואידים מיניים בחולייתנים.

Introduction

בחולייתנים, סטרואידים מיניים, אשר מיוצרים בעיקר על ידי gonads, לשחק תפקידים חשובים ברגולציה של המוח-יותרת המוח-Gonadal (BPG) ציר באמצעות מנגנוני משוב שונים1,2,3,4,5. בנוסף, סטרואידים מיניים משפיעים על התפשטות ופעילות של נוירונים במוח6,7,8 ותאים אנדוקריניים, כולל גונדוטרופים, בבלוטת יותרת המוח9,10, ובכך משרתים תפקידים מכריעים בפלסטיות המוח ובלוטות יותרת המוח. למרות ידע טוב יחסית ביונקים, המנגנון של ויסות ציר BPG בתיווך סטרואידים מיניים רחוק מלהיות מובן במינים שאינם יונקים, מה שמוביל להבנה לקויה של עקרונות שמורים אבולוציוניים11. יש עדיין מספר מוגבל של מחקרים המתעדים את התפקיד של סטרואידים מיניים על המוח ופלסטיות יותרת המוח, ובכך להעלות את הצורך בחקירות נוספות של התפקיד וההשפעות של סטרואידים מיניים על מינים בעלי חוליות מגוונים.

בקרב בעלי חוליות, teleosts הפכו חיות מודל חזקות בטיפול בשאלות ביולוגיות ופיזיולוגיות רבות, כולל תגובת מתח12,13, צמיחה14,15, פיזיולוגיה תזונתית16,17 ורבייה2. Teleosts, שבו סטרואידים מיני מיוצגים בעיקר על ידי אסטרדיול (E2) אצל נקבות ו 11-ketotestosterone (11-KT) אצל זכרים18,19, כבר זמן רב מודלים ניסיוניים אמינים לחקור את העיקרון הכללי של רבייה על פני מינים. Teleosts להראות ייחודיות שלהם חיבור ההיפותלמוס-יותרת המוח20,21 ותאי גונדוטרופים נפרדים22, אשר לפעמים נוחים להבהרת מנגנונים רגולטוריים. יתר על כן, בשל נוחותם הן לניסויי מעבדה והן לניסויים בשטח, טלוסטים מציעים יתרונות רבים בהשוואה לאורגניזמים אחרים. הם זולים יחסית לרכוש ולתחזק23,24. בפרט, מודלים טלוסט קטנים כגון דגיזברה (דניו rerio) ואת medaka היפני (Oryzias latipes),הם מינים עם פוריות גבוהה מאוד ומחזור חיים קצר יחסית המאפשר ניתוח מהיר של תפקוד גנים ומנגנוני מחלות23,ובכך מספק יתרונות גדולים עוד יותר בטיפול בשפע של שאלות ביולוגיות ופיזיולוגיות, בהתחשב בפרוטוקולים המפותחים הרבים וארגז הכלים הגנטי הזמין למינים אלה25.

במחקרים רבים, הסרת gonads (gonadectomy) יחד עם טכניקות דגימת דם שימשו כשיטה לחקור שאלות פיזיולוגיות רבות, כולל השפעתה על פיזיולוגיה של פוריות חוליות ביונקים26,27,28, ציפורים29 ודו חיים30. למרות ההשפעה gonadectomy על פיזיולוגיה הרבייה יכול להיות לחילופין החיות על ידי אנטגוניסטים סטרואידים מין, כגון טמוקסיפן ו clomiphene, ההשפעה של התרופות נראה לא עקבי עקב השפעות bimodal31,32. חשיפה כרונית אנטגוניסט סטרואידים מין עלול להוביל להגדלת השחלות33,34, אשר עשוי להשבית תצפית של השפעותיו למטרות לטווח ארוך עקב פנוטיפ לא בריא. בנוסף, אי אפשר לבצע ניסוי התאוששות לאחר טיפול אנטגוניסט סטרואידים סקס, כדי להצדיק את ההשפעה הספציפית של סטרואידים מיניים מסוימים. יחד עם אלה נקודות הנ"ל, פשרות אחרות של שימוש אנטגוניסט סטרואידים סקס נבדקו בהרחבה31,32. לכן, gonadectomy עדיין מופיע היום כדכניקה רבת עוצמה לחקור את התפקיד של סטרואידים מיניים.

בעוד שטכניקות גונדכרטומיה ודגימה בדם קלות יחסית לביצוע במינים גדולים יותר, כגון בס ים אירופאי(Dicentrarchus labrax)35, ראסה ראש כחול(תלאסומה ביפסיאטום)36,דגי כלבים(Scyliorhinus)37 ושמנונים(Heteropneustes מאובנים וקלאריאס רחקוס)38,39,הם מעלים אתגרים כאשר מוחלים בדגים קטנים כמו medaka. לדוגמה, השימוש במערכת משלוח הרדמה דגים (FADS)40 הוא פחות ריאלי ונראה נוטה נזק פיזי מוגזם עבור דגים קטנים. בנוסף, הליך כריתת גונדקטומיה המשמש בדרך כלל לדגים גדולים יותר40 אינו מתאים לדגים קטנים הדורש דיוק גבוה כדי למנוע נזק מוגזם. לבסוף, דגימת דם היא מאתגרת בשל הגישה המוגבלת לכלי הדם וכמות הדם הקטנה בבעלי חיים אלה. לכן, פרוטוקול ברור המדגים כל שלב של כריתת גונדקטומיה ודגימה דם בטלוסט קטן הוא בעל חשיבות.

פרוטוקול זה מדגים את ההליכים שלב אחר שלב של כריתת גונדקטומיה ואחריו דגימת דם ב Medaka היפנית, דג מים מתוקים קטן שמקורו במזרח אסיה. Medaka היפני יש גנום רצף, כמה כלים מולקולריים וגנטיים זמינים25, ומערכת קביעת מין גנטי המאפשר לחקור הבדלים מיניים לפני מאפיינים מיניים משניים או gonads מפותחים היטב41. מעניין לציין שמדקה היפנית מחזיקה בגונדים מותכים בניגוד למינים טלוסטים רבים אחרים42. שתי טכניקות אלה יחד לקחת רק 8 דקות בסך הכל וישלים את הרשימה של פרוטוקולי וידאו כבר קיים עבור מין זה שכלל תיוג של כלי הדם43, מהדק תיקון על סעיפים יותרת המוח44 נוירונים במוח45, ותרבות תאיםראשונית 46. טכניקות אלה יאפשרו לקהילת המחקר לחקור ולהבין טוב יותר את התפקידים של סטרואידים מיניים במנגנוני משוב, כמו גם פלסטיות המוח ובלוטות יותרת המוח בעתיד.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל הניסויים והטיפול בבעלי חיים נערכו בהתאם להמלצות על רווחת בעלי החיים הניסיונית באוניברסיטה הנורבגית למדעי החיים. ניסויים באמצעות כריתת גונדקטומיה אושרו על ידי הרשות הנורבגית לבטיחות מזון (FOTS ID 24305).

הערה: הניסויים בוצעו באמצעות זכר ונקבה בוגרים (6-7 חודשים, משקל כ 0.35 גרם, אורך כ 2.7 ס"מ) Medaka יפני. המין נקבע על ידי הבחנה המאפיינים המיניים המשניים, כגון גודל וצורה של סנפיר גב ואנאלי, כמתוארב 42,47.

1. הכנת מכשירים ופתרונות

  1. הכן פתרון מלאי הרדמה (0.6% טריקיין).
    1. לדלל 0.6 גרם של Tricaine (MS-222) ב 100 מ"ל של 10x פוספט חוצץ מלוח (PBS).
    2. להפיץ 1 מ"ל של פתרון מלאי Tricaine לתוך כמה צינורות פלסטיק 1.5 מ"ל ולאחסן ב -20 °C (70 °F) עד לשימוש.
  2. הכן מי התאוששות (0.9% פתרון NaCl) על ידי הוספת 18 גרם של NaCl לתוך 2 ליטר של מים באקווריום. יש לאחסן את הפתרון בטמפרטורת החדר עד לשימוש.
  3. הכן את כלי החתך על ידי שבירת סכין גילוח באלכסון כדי לקבל נקודה חדה(איור 1A).
  4. הכן פתרון נוגד קרישה בדם (0.05 U/μL של נתרן הפרין) על ידי דילול 25 μL של נתרן הפרין לתוך 500 μL של 1x PBS. יש לאחסן את הפתרון נוגד קרישה ב-4 מעלות צלזיוס עד לשימוש.
  5. הכן שתי מחטי זכוכית מזכוכית באורך 90 מ"מ על ידי משיכת נימי זכוכית עם מושך מחטים (איור 1B) בהתאם להוראות היצרן.
    הערה: הקוטר החיצוני של מחט הזכוכית הוא 1 מ"מ, בעוד הקוטר הפנימי הוא 0.6 מ"מ.
  6. הכן מכסה צינור פלסטיק בגודל 1.5 מ"ל על ידי חיתוך המכסה ובצע חור שמתאים לקוטר החיצוני של המחט(איור 1C). כדי להפוך את החור, לחמם קצה אחד של נימי זכוכית 9 מ"מ ולדקור את נימי הזכוכית מחומם דרך המכסה. לחלופין, להשתמש במחט כדי לדקור דרך המכסה עד קוטר החור מתאים עם נימי זכוכית 9 מ"מ.

2. הליך כריתת גונדקטומיה

  1. הכן 0.02% של פתרון הרדמה על ידי דילול צינור אחד של מניות Tricaine (0.6%) ב 30 מ"ל של מים אקווריום.
  2. הכן כלי ניתוח כולל מלקחיים דקים במיוחד ושני מלקחיים עדינים (אחד עם קצה רחב יחסית), מספריים קטנים, חוט ניילון ותער כמתואר בשלב 1.3.
  3. מרדים את הדג על ידי הכנסתו לתמיסת הרדמה של 0.02% למשך 30-60 שניות.
    הערה: משך ההרדמה תלוי בגודל ובמשקל של הדג ויש להתאים אותו. כדי להבטיח כי הדג הוא מרדים לחלוטין, גוף הדג ניתן לצבוט בעדינות באמצעות מלקחיים. אם הדג לא מגיב, ניתן להתחיל את כריתת הגונדקטומיה.
  4. מוציאים את הדגים מהתמיסה ההרדמה ומניחים את הדג אופקית על צידו, מחוץ למים תחת מיקרוסקופ הרדמה.
  5. כריתת אובלות (OVX) אצל נקבות
    1. יש להסיר ביצים (ביצים התלויות מחוץ לגוף הנקבה) אם בכלל ולגרד את המאזניים באזור החתכים(איור 2A).
    2. יש לבצע בעדינות חתך באורך של כ-2-2.5 מ"מ בין הצלעות, בין הסנפירים האגן לאנאלי(איור 2A),באמצעות סכין הגילוח. לאחר מכן, לצבוט בעדינות את הבטן דגים תוך לקיחת השחלות לאט לאט באמצעות מלקחיים עדינים עם קצה רחב.
    3. חותכים את קצה השחלות באמצעות מלקחיים עדינים ומניחים את השחלות בצד(איור 2B).
      הערה: יש להקפיד לא לשבור את שק השחלות במידת האפשר. אם שק השחלות שבור, הסר כל עקבות gonad לחלוטין ככל האפשר מבלי להשאיר אפילו כל ביצים שאינן ביוץ.
  6. כריתת סחלב אצל זכרים
    1. יש לבצע בעדינות חתוך בין הצלעות שמעל פי הטבעת (איור 2A), ולפתוח את החתירה באיטיות באמצעות מלקחיים עדינים.
    2. תפסו בעדינות את האשכים באמצעות המלקחיים העדינים ואיטיות הוציאו את האשכים. לאחר מכן, חתכו את קצה האשכים כדי להסיר לחלוטין את האשכים (איור 2B). לכריתת סחלבים זכרים, כל ההכנות דומות לנקבות עד לחלק ההחתכה. כאשר תופסים את האשכים, לפעמים השומן הדומה האשכים מתקבל. עם זאת, לאחר שחזור השומן, ניתן לנסות למצוא את האשכים שוב (איור 2B).
      הערה: הן עבור זכרים והן עבור נקבות, חשוב למזער את גודל ההסתה בבטן כדי למנוע נזק מוגזם שיכול להוביל לתמותה. לפעמים המעיים עשויים להופיע גם דרך ההסתעפות יחד עם הגונדים, כדי לוודא שהם מוחזרים כראוי בתוך ההסתעפות לפני הסגירה. ידע מוקדם על השחלות ומיקום האשכים בבטן מדאקה הוא חיוני.
  7. לתבל את החתירה באופן דומה אצל זכרים ונקבות(איור 3).
    1. מניחים את חוט הניילון ליד אזור ההשתכה ודוקרים את העור מצד ימין של ההשתכה דרך חלל הגוף הפנימי באמצעות מלקחיים עדינים במיוחד כדי לקחת את החוט במלקחיים עדינים (איור 3;1-2).
    2. דקרו את העור מצד שמאל של ההסתעפות דרך חלל הגוף החיצוני כדי להוציא את החוט (איור 3;3-4).
    3. סגור את פתח החתך ובצע שני קשרים וחתוך את החוט המוגזם (איור 3;4-6).
      הערה: התפר חייב להיות הדוק כראוי, ואת החוט הנותר על הדג חייב להיות ארוך מספיק כדי למנוע התרופפות של התפר. כל ההליך מהרדמה עד תפירה בדרך כלל לוקח עד 6 דקות. זמן רב יותר עלול להוביל לתמותה.
    4. שים את הדגים במי ההתאוששות ולהשאיר אותם לפחות 24 שעות לפני העברתם למערכת האקווריום.
      הערה: דג Gonadectomized בדרך כלל להראות התנהגות נורמלית לאחר 1-2 שעות במי ההתאוששות. לכן, בהתאם למטרת הניסוי, ניתן לדגום את הדגים לאחר מרווח זמן זה.

3. הליך דגימת דם

  1. הכן את הכלים: מחט זכוכית, נימי סיליקון, צינור פלסטיק עם חור, צינור פלסטיק ריק 1.5 מ"ל, מיני צנטריפוגה וסרט הדבקה.
  2. יש להעשיר את הדגים באמצעות פתרון הרדמה של 0.02% כמתואר בשלב 2.1 ולהניח את הדגים מתחת למיקרוסקופ ניתוח במיקום אנכי (איור 4A). מניחים את הדג על משטח בהיר כדי להקל על ההדמיה של וריד הדקירה.
  3. התקן את מגירת הדם על ידי חיבור מחט זכוכית לנופלרי הסיליקון(איור 4B). לשבור את קצה המחט עם מלקחיים קצה רחב וציפוי החלק הפנימי של המחט עם פתרון נוגד קרישה על ידי שאיבה ופיצוץ.
    הערה: השימוש של פראייר נימי סיליקון עם אורך של לפחות 50 ס"מ מומלץ לאמצעי בטיחות כדי למנוע כל מגע ישיר של הדם בעת שאיבה. בנוסף, ודא כי פתיחת קצה המחט הוא גדול מספיק כדי לאפשר ציור הדם.
  4. כוון את המחט לכיוון אזור הדו-פדנקל של הדג, כוון לווריד הדו-פדונקל(איור 5A)ומשוך את הדם באמצעות הפה עד שלפחות רבע מהנפח הכולל של המחט יתמלא (איור 5B).
    הערה: חשוב להפסיק לניקה לפני הסרת המחט מגוף הדג.
  5. שחרר את המחט ולשים חתיכת קלטת בסמיכות של הצד החד של המחט. הניחו את המכסה עם חור בצינור איסוף והכניסו את המחט לתוך הצינור דרך החור עם קצה המחט מבחוץ(איור 5C).
  6. שים את הדגים במי ההתאוששות ולהשאיר אותם לפחות 24 שעות לפני העברתם למערכת האקווריום.
    הערה: כדי לבצע דגימת דם שנייה מאותו דג, לדגום את הדם שבוע לאחר דגימת הדם הראשונה.
  7. פלאש לסובב את הדם שנאסף במשך 1-2 שניות עם 1,000 x גרם בטמפרטורת החדר כדי לאסוף את הדם בצינור.
  8. המשך ישירות ליישומים במורד הזרם או לאחסן את הדם ב -20 °C (70 °F) עד לשימוש.
    הערה: עיין במחקר הקודם עבור מיצוי סטרואידים סקס מכל הדם48.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

פרוטוקול זה מתאר כל צעד לביצוע כריתת גונדקטומיה ודגימה בדם בטלוסט מודל בגודל קטן, medaka היפני. שיעור ההישרדות של הדגים לאחר כריתת השחלות (OVX) אצל הנקבות הוא 100% (10 מתוך 10 דגים) ואילו 94% (17 מתוך 18 דגים) של הזכרים שרדו לאחר כריתת סחלב. בינתיים, לאחר שבוצע הליך דגימת הדם, שרדו כל הדגים (38 הדגים).

נקבות המופעלות על ידי שיים מראות אויביפוזיציה(איור 6A)וכל הביציות הופרו והתאפשרו להתפתחות עוברית(איור 6B). זכרים המופעלים בשאפת שמים הצליחו גם להפרות ביצים לאחר שבוע-שבועיים בלבד. שתיים מתוך שש נקבות חלקיות שגדלו עם זכרים חלקית עברו כריתה הראו גם הם אוביפוזיציה עם 100% מהביצים המופרות לאחר חודשיים. לעומת זאת, לא נצפתה נטייה אצל נקבות או הפריה על ידי זכרים בדגים בגונדקטומיה מלאה, גם לאחר 4 חודשים.

כאשר מתבצע נכון, צורת הגוף של הדג משתנה מעט (איור 7A),ושום חתיכת גונד לא צריכה להישאר לאחר הליך כריתת הגונדקטומיה(איור 7B). בינתיים, 4 שבועות לאחר כריתת הגונדקטומיה, החתירה והתפיר נעלמו לחלוטין(איור 8),ואחרי 4 חודשים, כל הדגים הגונדקטומיים עדיין הראו פנוטיפ בריא, ולא נמצאה רקמת גונדל.

ריכוזי הדם E2 אצל נקבות (טבלה 1),שנמדדו עם ELISA בעקבות הוראות היצרן, גילו כי רמת E2 בדגי OVX נמוכה משמעותית מאשר בדגים המופעלים בשאפתן 24 שעות לאחר הניתוח (p < 0.00001). לאחר 4 חודשים, רמת E2 בדגי OVX נמוכה משמעותית מאשר בדגים המופעלים בשאיפה(p < 0.00001) ולא מראה הבדל משמעותי בהשוואה לזה ב 24 שעות לאחר OVX דגים(p > 0.05). לבסוף, בחלקו דגים OVX, שבו רק 1/3 עד 1/2 של gonad הוסר, להראות רמות E2 נמוכות משמעותית מאשר דגים המופעלים בשאפתן(p = 0.0437) ורמות E2 גבוהות משמעותית מאשר דגי OVX מלאים(p < 0.00001)(איור 9A).

באופן דומה אצל גברים (טבלה 1),ריכוז 11-KT בדגים סחלבים נמוך משמעותית מאשר בדגים המופעלים בשאיפה 24 שעות לאחר הניתוח (p < 0.00001). הרמה של 11-KT בדגים סחלב לאחר 4 חודשים היא גם נמוכה משמעותית מאשר דגים המופעלים בשאפתן(p < 0.00001) ולא מראה הבדל לעומת דגים לאחר סחלב 24 שעות(עמ ' > 0.05). לבסוף, דגים בחלקם סחלבים מראים רמות נמוכות משמעותית של 11-KT מאשר דגים המופעלים בשאפתן(p = 0.0428) ורמות גבוהות משמעותית של 11-KT מאשר דגים סחלבים לחלוטין(p < 0.00001)(איור 9B).

Figure 1
איור 1. הכנת מכשיר. (א)סכין גילוח לכריתת גונדקטומיה, (B)מחט זכוכית להפקת דם, ו (C) צינור פלסטיק יחד עם מכסה עם חור לאיסוף דם. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2. מיקום אזור ההחתצה. A) ציור של אזור ההחתכה הממוקם בין הצלעות, בין סנפירי האגן והאנאלי אצל הנקבות (פאנל שמאלי) וזכרים (פאנל ימני); B) הסרת לד אצל נקבות (פאנל שמאלי) וזכרים (פאנל ימני), עיגולים לבנים המציגים את החלק המשותף, חץ לבן המציג את האשכים ואת החץ השחור מראה את השומן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3. הליך התפר. 1) חור נעשה בצד ימין של ההסתה באמצעות מלקחיים עדינים במיוחד. 2) חוט הניילון מועבר דרך העור באמצעות החור שנעשה ב 1. .3 נעשה חור בצד שמאל של ההסתה. 4) חוט הניילון מועבר דרך החור שנעשה ב 3. 5) קשר מוגזם נעשה פעמיים כדי לסגור את ההסתבכות. 6) חוט עודף נחתך. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4. מיקום דגים במהלך דגימת דם (A), התקנת מחט זכוכית עם נימי סיליקון (B). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5. אזור היניקה של דגימת דם (A), דם מוגרר (B) ושלבי איסוף דם (C). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 6
איור 6. דגים המופעלים על ידי שאם מראים שפע של ביצים הצביעו על ידי חץ לבן (A) וביצים מופרות (B). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 7
איור 7. מראה מורפולוגי (A) ואנטומית (B) של דגים שלמים ועברו כריתת רחם. חצים לבנים (לוחות עליונים) מראים את סימן הניתוח על דג גונקטו. חצים שחורים (לוחות תחתון) מראים קבצים ודגים שלמים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 8
איור 8. סימני ניתוח בדגים זכרים ונקביים לאחר 4 שבועות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 9
איור 9. רמות הדם של E2 בנקבה (A) ו 11-KT בזכר (B) מדאקה יפנית, 24 שעות לאחר ניתוח מזויף (שליטה), חלקית גונד כריתת או כריתת גונדקטומיה, ו 4 חודשים לאחר כריתת גונדקטומיה (OVX, כריתת השחלות אצל הנקבות; קאס, כריתת סחלבים אצל זכרים). הניתוחים הסטטיסטיים בוצעו באמצעות ANOVA דרך אחת ואחריו מבחן טוקי פוסט הוק. אותיות שונות (a-c) מציגות הבדלים משמעותיים (p-value < 0.05). הנתונים בגרף מסופקים כממוצע + SD, n = 5. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

רמות E2 (נקבות) רמות 11-KT (זכרים)
המופעל על ידי שיים 4.15 ± 0.5 (n = 5) 10.38 ± 1.32 (n = 5)
חלקית-gonadectomized 3.37 ± 0.6 (n = 5) 8.37 ± 1.92 (n = 5)
24h לאחר כריתת גונדקטומיה 0.36 ± 0.2 (n = 5) 0.4 ± 0.2 (n = 5)
4 חודשים לאחר כריתת גונדקטומיה 0.54 ± 0.28 (n = 5) 0.74 ± 0.22 (n = 5)

טבלה 1. E2 ו 11-KT רמות (ng / mL) אצל נקבות וזכרים של שדים המופעלים במזוף ו gonadectomized וחלקו gonadectomized דגים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

כפי שדווח בספרות קודמת, gonadectomy ודגימה דם שימשו זמן רב במינים מודל אחרים כדי לחקור שאלות הקשורות לתפקיד של סטרואידים מיניים ברגולציה של ציר BPG. עם זאת, טכניקות אלה נראה מקובל רק עבור בעלי חיים גדולים יותר. בהתחשב בגודל הקטן של מודל הטלוסט הנפוץ, medaka יפנית, אנו מספקים פרוטוקול מפורט עבור gonadectomy ודגימה דם כי הוא אפשרי עבור מין זה.

העובדה ששיעור ההישרדות של דגי גונדקטומיים הגיע כמעט ל -100% מצביעה על כך שניתן ליישם את הליך כריתת הגונדקטומיה על מדאקה. באופן דומה, הליך דגימת הדם אינו משפיע על שרידות הדג כפי שמוצג על ידי שיעור ההישרדות של 100% לאחר שעבר הליך זה. בנוסף, נקבות המופעלות בזיוף שגדלו יחד עם זכרים המופעלים בשאפתן מראות אופוזיציה וביציות מופרות ב -100%, מה שמצביע על כך שהליך החתירה והתפר אינם משפיעים על רביית הדגים. במילים אחרות, הם היו בריאים מספיק כדי להשריץ. יתר על כן, דגים חלקית gonadectomized להראות ריכוזים דומים של סטרואידים מיני לדגים המופעלים בזיוף, ו oviposition אצל כמה נקבות, כמו גם הפריה של ביצים על ידי זכרים נצפו אלה דגים גונדקטומיים חלקית. תוצאות אלה מציעות כי ההליך של gonadectomy צריך להתבצע בדיוק גבוה, כלומר השחלות או האשכים צריך להיות מוסר לחלוטין.

כפי שניתן לראות באיור 8, סימן החתירה והתפירה על הדגים נעלם לחלוטין 4 שבועות לאחר כריתת הגונדקטומיה, והדגים עדיין חיים ונראים בריאים 4 חודשים לאחר הניתוח. אלה מצביעים על כך שהליך הפעולה בטוח לדגים למטרה ארוכת טווח ואינו משפיע על תוחלת החיים של הדגים. בנוסף, לאחר 4 חודשים, לא נצפו נדות. זה מאושר על ידי רמות נמוכות של E2 ו 11-KT כי הם עדיין דומים לאלה שנמצאו דגים gonadectomized לאחר 24 שעות.

רמות E2 ו-11-KT בדגים בגונדקטומיה נמוכות משמעותית מדגים המופעלים בשאפתן, כבר לאחר 24 שעות לאחר כריתת הגונדקט ונשארות נמוכות יותר בדגים שנדגמו 4 חודשים לאחר כריתת הגונדקטומיה. רמות סטרואידים המין נמוכות משמעותית דגים gonadectomized לעומת שליטה נצפו במחקרים קודמים דג37, שפמנון39 ו medaka48. עדויות עקביות אלה מצביעות על כך הליך כריתת הגונדקטומיה המתואר בפרוטוקול היא טכניקה אמינה כדי לנקות סטרואידים סקס במחזור.

מאז הליך זה אינו מסתמך על FADS כפי שהוכח ב40, gonadectomy צריך להתבצע מהר ככל האפשר כדי למנוע תמותה במהלך הניתוח. ואכן, השימוש ב- FADS מאפשר לשמור על קצב הפעולה שכן כלי זה מאפשר מצב הרדמה מתמשך לדגים למרות שהוא נחשף לאוויר. עם זאת, בשל ההיתכנות הנמוכה יותר שלה בטלוסט הקטן כמו medaka, השימוש FADS לא יכול להתבצע עם גודל כזה של דגים. בנוסף, בניגוד לפרוטוקול הגונדקטומיה הקודם בדגים גדולים יותר המאפשר זעזוע רחב להגיע לגונד, הפרוטוקול המתואר בכתב יד זה אינו מאפשר חדירה רחבה כדי למנוע נזק מוגזם לדגים הקטנים. לכן, יש להיזהר מאוד כאשר מנסים לגשת gonad באמצעות מלקחיים כדי למנוע נזק ברקמות אחרות בתוך חלל גוף הדג.

הפרוטוקול מסתמך על הליך מהיר ונקי. לכן מומלץ מאוד לאמן עד להגעה לשיעור הצלחה גבוה, המצוין על ידי שיעור הישרדות גבוה של הדגים לאחר כריתת הגונדקטומיה, כמו גם הסרה מלאה של הגונדים (ראו את ההבדל במראה המורפולוגי והאנטומי של הדג לפני ואחרי כריתת גונדקטומיה מוצלחת באיור 7). למעשה, גורמים רבים יכולים להשפיע על שיעור ההצלחה של ההליך, כולל תקופת ההרדמה, הרחבה של החתירה, הדיוק והסידרות של התפר וטיפול בדגים במהלך ההליך. נקודה חשובה נוספת היא כי יש להכין דגים בריאים על ידי שמירה על הדג בצורה אופטימלית לפני ביצוע הפרוטוקול.

לגבי הליך דגימת הדם, המחקרים הקודמים ניסו לדגום את הדם מדאקה48 ודג זברה49,50,51, אבל ההליך אינו מאפשר דגימת דם חוזרת באותו דגים מאז הדם נלקח לאחר המתת חסד את הדג. דגימת דם חוזרת הודגמה באמצעות דגי זברה במחקר אחר52, אבל אנחנו מדווחים על סוג זה של פרוטוקול בפעם הראשונה medaka.

ההערכה של ריכוזי סטרואידים מיני מתבצעת בדרך כלל באמצעות ערכת חיסון הקשורה אנזים (ELISA), והיו ערכות ELISA רבות זמין מסחרית עבור סוגים שונים של סטרואידים מין. בשל כמות הדם הנמוכה שנאספה במהלך דגימת הדם, בדיקות במורד הזרם מיועדות לכל הדם. מחקרים קודמים הראו כי יש הבדל ברמה הנמדדת של רמות סטרואידים במחזור שחולצו מדם שלם ופלזמה53,54. לכן, ההבדל ברמות סטרואידים המין מדם שלם ופלזמה צריך להיות מאומת לפני ביצוע הניסוי האמיתי באמצעות הפרוטוקול.

כפי שתועד במחקרים קודמים עם מודלים שונים של בעלי חיים, הפרוטוקול המתואר כאן יאפשר לחקור שאלות הקשורות לפיזיולוגיה של הרבייה באמצעות טלוסט בגודל קטן כמודל. למעשה, טכניקות אלה כבר תרמו לענות על שאלות הנוגעות לרגולציה של ציר BPG ומנגנוני המשוב שלו, כגון מעורבות של kiss1 (סוג גן kisspeptin 1) המבטאים נוירונים בלולאות משוב חיוביות55, רגולציה בתיווך אסטרוגן של kiss1 המבטאת נוירונים בגרעין גנאליס tuberis (NVT), ו kiss2 (kisspeptin סוג 2) מבטא נוירונים באזור טרוםoptic (POA)56, 57, המעורבות האפשרית של קולטן אסטרוגן β1 (Esr2a) ברמת ביטוי fsh מווסת למטה בנקבה יפנית medaka58, כמו גם את הפרופיל של השעון הביולוגי של E2 בדגיםנקבה 48. יתר על כן, מאז מחקרים קודמים הראו כי סטרואידים מיניים משפיעים גם על התפשטות של תאי גונדוטרופים בבלוטת יותרת המוח של teleosts59,60, זה מסקרן לחקור את ההשפעות של שחרור סטרואידים מיני לאחר כריתת בלוטת יותרת המוח על פלסטיות יותרת המוח.

טכניקת דגימת הדם לא רק יכול לשמש לניתוח סטרואידים סקס, אלא גם לניתוח תוכן דם אחר, כולל רמות הגלוקוז בדם. ואכן, הפרוטוקול יכול להיות מיושם גם למדידות גלוקוז בדם כפי שהוכח דג זברה52 ו medaka61. לכן, ניתן להרחיב טכניקה זו כדי לטפל בשאלות מחקר בתחומים אחרים של פיזיולוגיה.

לבסוף, הפרוטוקולים המתוארים כאן מיועדים ומותאמות עבור medaka יפנית למבוגרים, ואת התוצאות בשל גודל שונה של דגים וחומרים המשמשים במהלך ההליכים עשוי להשתנות. יתר על כן, כמו medaka שמאל וימין שחלות / האשכים מותכים, אשר עשוי לספק יתרון חשוב עבור gonadectomy, פרוטוקול זה עשוי להזדקק מספר התאמות לפני השימוש במינים אחרים שבו זה לא המקרה כגון דגי זברה. לכן, יש לקחת בחשבון אופטימיזציה על פי בחירת ציוד מעבדה וגודל דגים לפני בדיקת פרוטוקולים אלה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

המחברים מודים לגברת לורדס קאריון ג'י טאן על עזרתה בבעלות הדגים. עבודה זו מומנה על ידי NMBU, מענקים בסיוע מהחברה היפנית לקידום המדע (JSPS) (מענק מספר 18H04881 ו- 18K19323), ומענק לפרויקטים בסיסיים לחקר המדע מקרן סומיטומו ל- S.K.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Glass capilary GD1 Glass Capillary with Filament GD-1; Narishige
Heparin sodium salt H4784-1G Sigma-aldrich
Needle puller P97 Flaming/Brown Micropipette puller Model P-97; Sutter Instrument
Nylon thread N45VL Polyamide suture, 0.2 metric; Crownjun
Plastic tube T9661 Eppendorf Safe-lock microcentifuge tube 1.5 ml, Sigma-aldrich
Razor blade - Astra Superior Platinum Double Edge Razor Blades Green, salonwholesale.com
Silicone capillary a16090800ux0403 Uxcell Silicone Tube 1 mm ID x 2 mm OD, amazon.com 
Tricaine WXBC9102V Aldrich chemistry

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Weltzien, F. -A., Andersson, E., Andersen, Ø, Shalchian-Tabrizi, K., Norberg, B. The brain-pituitary-gonad axis in male teleosts, with special emphasis on flatfish (Pleuronectiformes). Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Molecular & Integrative Physiology. 137 (3), 447-477 (2004).
  2. Yaron, Z., Levavi-Sivan, B. Encyclopedia of Fish Physiology. Farrell, A. P. 2, Academic Press. 1500-1508 (2011).
  3. Goldman, B. D. The circadian timing system and reproduction in mammals. Steroids. 64 (9), 679-685 (1999).
  4. Taranger, G. L., et al. Control of puberty in farmed fish. General and Comparative Endocrinology. 165 (3), 483-515 (2010).
  5. Messinis, I. E. Ovarian feedback, mechanism of action and possible clinical implications. Human Reproduction Update. 12 (5), 557-571 (2006).
  6. Diotel, N., et al. The brain of teleost fish, a source, and a target of sexual steroids. Frontiers in Neuroscience. 5, 137 (2011).
  7. Diotel, N., et al. Steroid Transport, Local Synthesis, and Signaling within the Brain: Roles in Neurogenesis, Neuroprotection, and Sexual Behaviors. Frontiers in Neuroscience. 12, 84 (2018).
  8. Larson, T. A. Sex Steroids, Adult Neurogenesis, and Inflammation in CNS Homeostasis, Degeneration, and Repair. Frontiers in Endocrinology. 9, 205 (2018).
  9. Fontaine, R., et al. Gonadotrope plasticity at cellular, population and structural levels: A comparison between fishes and mammals. General and Comparative Endocrinology. 287, 113344 (2020).
  10. Fontaine, R., Royan, M. R., von Krogh, K., Weltzien, F. -A., Baker, D. M. Direct and indirect effects of sex steroids on gonadotrope cell plasticity in the teleost fish pituitary. Frontiers in Endocrinology. , (2020).
  11. Kanda, S. Evolution of the regulatory mechanisms for the hypothalamic-pituitary-gonadal axis in vertebrates-hypothesis from a comparative view. General and Comparative Endocrinology. 284, 113075 (2019).
  12. Schreck, C. B. Stress and fish reproduction: The roles of allostasis and hormesis. General and Comparative Endocrinology. 165 (3), 549-556 (2010).
  13. Wendelaar Bonga, S. E. The stress response in fish. Physiological Reviews. 77 (3), 591-625 (1997).
  14. Mommsen, T. P. Paradigms of growth in fish. Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Biochemistry and Molecular Biology. 129 (2), 207-219 (2001).
  15. Won, E., Borski, R. Endocrine Regulation of Compensatory Growth in Fish. Front. Endocrinol. 4, 74 (2013).
  16. MacKenzie, D. S., VanPutte, C. M., Leiner, K. A. Nutrient regulation of endocrine function in fish. Aquaculture. 161 (1), 3-25 (1998).
  17. Rønnestad, I., Thorsen, A., Finn, R. N. Fish larval nutrition: a review of recent advances in the roles of amino acids. Aquaculture. 177 (1), 201-216 (1999).
  18. Borg, B. Androgens in teleost fishes. Comparative Biochemistry and Physiology Part C: Pharmacology, Toxicology and Endocrinology. 109 (3), 219-245 (1994).
  19. Rege, J., et al. Circulating 11-oxygenated androgens across species. The Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology. 190, 242-249 (2019).
  20. Blázquez, M., Bosma, P. T., Fraser, E. J., Van Look, K. J. W., Trudeau, V. L. Fish as models for the neuroendocrine regulation of reproduction and growth. Comparative Biochemistry and Physiology Part C: Pharmacology, Toxicology and Endocrinology. 119 (3), 345-364 (1998).
  21. Zambrano, D. Innervation of the teleost pituitary. General and Comparative Endocrinology. 3, 22-31 (1972).
  22. Weltzien, F. -A., Hildahl, J., Hodne, K., Okubo, K., Haug, T. M. Embryonic development of gonadotrope cells and gonadotropic hormones - Lessons from model fish. Molecular and Cellular Endocrinology. 385 (1), 18-27 (2014).
  23. Harris, M. P., Henke, K., Hawkins, M. B., Witten, P. E. Fish is Fish: the use of experimental model species to reveal causes of skeletal diversity in evolution and disease. Journal of applied ichthyology. 30 (4), 616-629 (2014).
  24. Powers, D. Fish as model systems. Science. 246 (4928), 352-358 (1989).
  25. Naruse, K. Medaka: A Model for Organogenesis, Human Disease, and Evolution. Naruse, K., Tanaka, M., Takeda, H. , Springer. Japan. 19-37 (2011).
  26. Green, P. G., et al. Sex Steroid Regulation of the Inflammatory Response: Sympathoadrenal Dependence in the Female Rat. The Journal of Neuroscience. 19 (10), 4082-4089 (1999).
  27. Pakarinen, P., Huhtaniemi, I. Gonadal and sex steroid feedback regulation of gonadotrophin mRNA levels and secretion in neonatal male and female rats. Journal of Molecular Endocrinology. 3 (2), 139 (1989).
  28. Purves-Tyson, T. D., et al. Testosterone regulation of sex steroid-related mRNAs and dopamine-related mRNAs in adolescent male rat substantia nigra. BMC Neuroscience. 13 (1), 95 (2012).
  29. Adkins-Regan, E., Ascenzi, M. Sexual differentiation of behavior in the zebra finch: Effect of early gonadectomy or androgen treatment. Hormones and Behavior. 24 (1), 114-127 (1990).
  30. McCreery, B. R., Licht, P. Effects of gonadectomy and sex steroids on pituitary gonadotrophin release and response to gonadotrophin-releasing hormone (GnRH) agonist in the bullfrog, Rana catesbeiana. General and Comparative Endocrinology. 54 (2), 283-296 (1984).
  31. Clark, J. H., Markaverich, B. M. The agonistic-antagonistic properties of clomiphene: a review. Pharmacology & Therapeutics. 15 (3), 467-519 (1981).
  32. Mourits, M. J. E., et al. Tamoxifen treatment and gynecologic side effects: a review. Obstetrics & Gynecology. 97 (5), 855-866 (2001).
  33. Wallach, E., Huppert, L. C. Induction of Ovulation with Clomiphene Citrate. Fertility and Sterility. 31 (1), 1-8 (1979).
  34. Moradi, B., Kazemi, M. A., Rahamni, M., Gity, M. Ovarian hyperstimulation syndrome followed by ovarian torsion in premenopausal patient using adjuvant tamoxifen treatment for breast cancer. Asian Pacific Journal of Reproduction. 5 (5), 442-444 (2016).
  35. Alvarado, M. V., et al. Actions of sex steroids on kisspeptin expression and other reproduction-related genes in the brain of the teleost fish European sea bass. The Journal of Experimental Biology. 219 (21), 3353-3365 (2016).
  36. Godwin, J., Crews, D., Warner, R. R. Behavioural sex change in the absence of gonads in a coral reef fish. Proceedings of the Royal Society of London. Series B: Biological Sciences. 263 (1377), 1683-1688 (1996).
  37. Jenkins, N., Dodd, J. M. Effects of ovariectomy of the dogfish Scyliorhinus canicula L. on circulating levels of androgen and oestradiol and on pituitary gonadotrophin content. Journal of Fish Biology. 21 (3), 297-303 (1982).
  38. Manickam, P., Joy, K. P. Changes in hypothalamic catecholamine levels in relation to season, ovariectomy and 17β-estradiol replacement in the catfish, Clarias batrachus (L.). General and Comparative Endocrinology. 80 (2), 167-174 (1990).
  39. Senthilkumaran, B., Joy, K. P. Effects of ovariectomy and oestradiol replacement on hypothalamic serotonergic and monoamine oxidase activity in the catfish, Heteropneustes fossilis: a study correlating plasma oestradiol and gonadotrophin levels. Journal of Endocrinology. 142 (2), 193-203 (1994).
  40. Sladky, K. K., Clarke, E. O. Fish Surgery: Presurgical Preparation and Common Surgical Procedures. Veterinary Clinics of North America: Exotic Animal Practice. 19 (1), 55-76 (2016).
  41. Hori, H. Medaka: A Model for Organogenesis, Human Disease, and Evolution. Naruse, K., Tanaka, M., Takeda, H. , Springer. Japan. 1-16 (2011).
  42. Murata, K., Kinoshita, M., Naruse, K., Tanaka, M., Kamei, Y. Medaka: Biology, Management, and Experimental Protocols. Murata, K., et al. 2, John Wiley & Sons. 49-95 (2019).
  43. Fontaine, R., Weltzien, F. -A. Labeling of Blood Vessels in the Teleost Brain and Pituitary Using Cardiac Perfusion with a DiI-fixative. Journal of Visualized Experiments. (148), e59768 (2019).
  44. Fontaine, R., Hodne, K., Weltzien, F. -A. Healthy Brain-pituitary Slices for Electrophysiological Investigations of Pituitary Cells in Teleost Fish. Journal of Visualized Experiments. (138), e57790 (2018).
  45. Zhao, Y., Wayne, N. L. Recording Electrical Activity from Identified Neurons in the Intact Brain of Transgenic Fish. Journal of Visualized Experiments. (74), e50312 (2013).
  46. Ager-Wick, E., et al. Preparation of a High-quality Primary Cell Culture from Fish Pituitaries. Journal of Visualized Experiments. (138), e58159 (2018).
  47. Wittbrodt, J., Shima, A., Schartl, M. Medaka - model organism from the far east. Nature Reviews Genetics. 3 (1), 53-64 (2002).
  48. Kayo, D., Oka, Y., Kanda, S. Examination of methods for manipulating serum 17β-Estradiol (E2) levels by analysis of blood E2 concentration in medaka (Oryzias latipes). General and Comparative Endocrinology. 285, 113272 (2020).
  49. Eames, S. C., Philipson, L. H., Prince, V. E., Kinkel, M. D. Blood sugar measurement in zebrafish reveals dynamics of glucose homeostasis. Zebrafish. 7 (2), 205-213 (2010).
  50. Velasco-Santamaría, Y. M., Korsgaard, B., Madsen, S. S., Bjerregaard, P. Bezafibrate, a lipid-lowering pharmaceutical, as a potential endocrine disruptor in male zebrafish (Danio rerio). Aquatic Toxicology. 105 (1-2), 107-118 (2011).
  51. Jagadeeswaran, P., Sheehan, J. P., Craig, F. E., Troyer, D. Identification and characterization of zebrafish thrombocytes. British Journal of Haematology. 107 (4), 731-738 (1999).
  52. Zang, L., Shimada, Y., Nishimura, Y., Tanaka, T., Nishimura, N. Repeated Blood Collection for Blood Tests in Adult Zebrafish. Journal of Visualized Experiments. (102), e53272 (2015).
  53. Taves, M. D., et al. Steroid concentrations in plasma, whole blood and brain: effects of saline perfusion to remove blood contamination from brain. PloS one. 5 (12), 15727 (2010).
  54. Holtkamp, H. C., Verhoef, N. J., Leijnse, B. The difference between the glucose concentrations in plasma and whole blood. Clinica Chimica Acta. 59 (1), 41-49 (1975).
  55. Kanda, S., et al. Identification of KiSS-1 Product Kisspeptin and Steroid-Sensitive Sexually Dimorphic Kisspeptin Neurons in Medaka (Oryzias latipes). Endocrinology. 149 (5), 2467-2476 (2008).
  56. Kanda, S., Karigo, T., Oka, Y. Steroid Sensitive kiss2 Neurones in the Goldfish: Evolutionary Insights into the Duplicate Kisspeptin Gene-Expressing Neurones. Journal of Neuroendocrinology. 24 (6), 897-906 (2012).
  57. Mitani, Y., Kanda, S., Akazome, Y., Zempo, B., Oka, Y. Hypothalamic Kiss1 but Not Kiss2 Neurons Are Involved in Estrogen Feedback in Medaka (Oryzias latipes). Endocrinology. 151 (4), 1751-1759 (2010).
  58. Kayo, D., Zempo, B., Tomihara, S., Oka, Y., Kanda, S. Gene knockout analysis reveals essentiality of estrogen receptor β1 (Esr2a) for female reproduction in medaka. Scientific Reports. 9 (1), 8868 (2019).
  59. Fontaine, R., Ager-Wick, E., Hodne, K., Weltzien, F. -A. Plasticity in medaka gonadotropes via cell proliferation and phenotypic conversion. Journal of Endocrinology. 245 (1), 21 (2020).
  60. Fontaine, R., Ager-Wick, E., Hodne, K., Weltzien, F. -A. Plasticity of Lh cells caused by cell proliferation and recruitment of existing cells. Journal of Endocrinology. 240 (2), 361 (2019).
  61. Hasebe, M., Kanda, S., Oka, Y. Female-Specific Glucose Sensitivity of GnRH1 Neurons Leads to Sexually Dimorphic Inhibition of Reproduction in Medaka. Endocrinology. 157 (11), 4318-4329 (2016).

Tags

ביולוגיה גיליון 166 גונדקטומיה כריתת השחלות כריתת סחלב סירוס מדאקה דם סטרואידים דגים רבייה פלסטיות אסטרדיול 11-קטוסטוסטרון
הליכי גונדקטומיה ודגימה בדם במודל טלוסט קטן מדאקה<em>(Oryzias latipes</em>)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Royan, M. R., Kanda, S., Kayo, D.,… More

Royan, M. R., Kanda, S., Kayo, D., Song, W., Ge, W., Weltzien, F. A., Fontaine, R. Gonadectomy and Blood Sampling Procedures in the Small Size Teleost Model Japanese Medaka (Oryzias latipes). J. Vis. Exp. (166), e62006, doi:10.3791/62006 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter