Summary
ويصف المقال بروتوكول سريع لgonadectomize وعينة الدم من الأسماك تيليوست الصغيرة، وذلك باستخدام ميداكااليابانية (Oryzias latipes)كنموذج، للتحقيق في دور المنشطات الجنس في فسيولوجيا الحيوان.
Abstract
المنشطات الجنسية, التي تنتجها الغدد التناسلية, تلعب دورا أساسيا في الدماغ والأنسجة النخامية اللدونة وفي السيطرة العصبية الصماء من التكاثر في جميع الفقاريات من خلال توفير التغذية المرتدة للدماغ والغدة النخامية. تمتلك أسماك تيليوست درجة أعلى من اللدونة النسيجية والاختلاف في استراتيجيات الإنجاب مقارنة بالثدييات ويبدو أنها نماذج مفيدة للتحقيق في دور المنشطات الجنسية والآليات التي تعمل بها. إزالة المصدر الرئيسي لإنتاج الستيرويد الجنس باستخدام استئصال الغدد المنوية جنبا إلى جنب مع أخذ عينات الدم لقياس مستويات الستيرويد وقد راسخة وممكنة إلى حد ما في الأسماك أكبر وتقنية قوية للتحقيق في دور وآثار المنشطات الجنس. ومع ذلك، تثير هذه التقنيات تحديات عند تنفيذها في نماذج تيليوست صغيرة الحجم. هنا، نقوم بوصف الإجراءات خطوة بخطوة لاستئصال الغدد في كل من الذكور والإناث في ميداكا اليابانية تليها أخذ عينات الدم. وتبين أن هذه البروتوكولات ممكنة للغاية في ميداكا التي يشير إليها ارتفاع معدل البقاء على قيد الحياة، والسلامة لمدى الحياة والنمط الظاهري للأسماك، والاستنساخ من حيث إزالة الستيرويد الجنسي. استخدام هذه الإجراءات جنبا إلى جنب مع مزايا أخرى لاستخدام هذا النموذج تيليوست الصغيرة سوف تحسن كثيرا من فهم آليات التغذية المرتدة في السيطرة العصبية الصماء من التكاثر واللدونة الأنسجة التي توفرها المنشطات الجنس في الفقاريات.
Introduction
في الفقاريات، المنشطات الجنسية، والتي تنتج أساسا من قبل الغدد التناسلية، تلعب أدوارا هامة في تنظيم محور الدماغ- الغدة النخامية-غدد (BPG) من خلال آليات التغذية المرتدة المختلفة1،2،3،4،5. وبالإضافة إلى ذلك، المنشطات الجنس تؤثر على انتشار ونشاط الخلايا العصبية في الدماغ6،7،8 وخلايا الغدد الصماء ، بما في ذلك gonadotropes ، في الغدة النخامية9،10، وبالتالي تخدم أدوارا حاسمة في الدماغ واللدونة النخامية. على الرغم من المعرفة الجيدة نسبيا في الثدييات، وآلية تنظيم محور BPG بوساطة المنشطات الجنس أبعد ما يكون عن أن يفهم في الأنواع غير الثديية، مما يؤدي إلى فهم ضعيف للمبادئ التطورية المحفوظة11. لا يزال هناك عدد محدود من الدراسات التي توثق دور المنشطات الجنسية على اللدونة الدماغ والغدة النخامية, مما يزيد من الحاجة إلى مزيد من التحقيقات في دور وآثار المنشطات الجنسية على الأنواع الفقارية المتنوعة.
من بين الفقاريات، أصبحت teleosts الحيوانات نموذج قوية في معالجة العديد من الأسئلة البيولوجية والفسيولوجية، بما في ذلك استجابة الإجهاد12،13،نمو14،15،علم وظائف الأعضاء الغذائية16،17 والتكاثر2. Teleosts, التي يتم تمثيل معظمها المنشطات الجنس من قبل استراديول (E2) في الإناث و 11 كيتوتستوستيرون (11-KT) في الذكور18,19, منذ فترة طويلة نماذج تجريبية موثوق بها للتحقيق في المبدأ العام للتكاثر عبر الأنواع. Teleosts تظهر تفرد في اتصالها تحت المهاد والغدة النخامية20،21 وخلايا gonadotropeمتميزة 22، والتي هي في بعض الأحيان مريحة لتوضيح الآليات التنظيمية. وعلاوة على ذلك، ونظرا لقدرتها على كل من التجارب المختبرية والميدانية، فإن الخلايا التليوستية توفر مزايا كثيرة مقارنة بالكائنات الحية الأخرى. فهي غير مكلفة نسبيا لشراء وصيانة23،24. على وجه الخصوص، نماذج تيليوست صغيرة مثل حمار وحشي(دانيو ريو)وmedakaاليابانية (Oryzias latipes)،هي الأنواع ذات البراز عالية جدا ودورة حياة قصيرة نسبيا تمكين التحليل السريع لوظيفة الجينات وآليات المرض23،وبالتالي توفير مزايا أكبر في معالجة عدد كبير من الأسئلة البيولوجية والفسيولوجية، والنظر في العديد من البروتوكولات المتطورة جيدا والأدوات الوراثية المتاحة لهذه الأنواع25.
في العديد من الدراسات، تم استخدام إزالة الغدد التناسلية (استئصال الغدد التناسلية) جنبا إلى جنب مع تقنيات أخذ عينات الدم كوسيلة للتحقيق في العديد من الأسئلة الفسيولوجية، بما في ذلك تأثيره في فسيولوجيا الإنجاب الفقارية في الثدييات26و27و28والطيور29 والبرمائيات30. على الرغم من أن تأثير استئصال الغدد التناسلية على فسيولوجيا الإنجاب يمكن أن يحاكي بدلا من ذلك من قبل الخصوم الستيرويد الجنس, مثل تاموكسيفين وكلوميفين, تأثير الأدوية ويبدو أن تكون غير متناسقة بسبب آثار ثنائية الوسائط31,32. التعرض المزمن لخصم الستيرويد الجنس قد يؤدي إلى توسيع المبيض33,34, والتي قد تعطيل مراقبة آثاره لأغراض طويلة الأجل بسبب النمط الظاهري غير صحية. وبالإضافة إلى ذلك, فمن المستحيل إجراء تجربة الانتعاش بعد العلاج خصم الستيرويد الجنس, لتبرير تأثير محدد من المنشطات الجنس معينة. جنبا إلى جنب مع تلك النقاط المذكورة أعلاه, المقايضات الأخرى من استخدام خصم الستيرويد الجنس وقد استعرضت على نطاق واسع31,32. لذلك, استئصال الغدد المنوية لا يزال يظهر اليوم كتقنية قوية للتحقيق في دور المنشطات الجنس.
في حين أن تقنيات استئصال الغدد الدموية وأخذ عينات الدم سهلة نسبيا في الأنواع الأكبر ، مثل باس البحر الأوروبي (Dicentrarchus labrax)35، بلوهيد wrasse (Thalassoma bifasciatum)36، الكلب (Scyliorhinus canicula)37 وسمك السلور (Heteropneustes fossilis و Clarias bathracus)38،39، يثيرون التحديات عند تطبيقها في الأسماك الصغيرة كما ميداكا. على سبيل المثال، استخدام نظام توصيل التخدير السمك (FADS)40 هو أقل جدوى ويبدو أن تكون عرضة للتلف البدني المفرط للأسماك الصغيرة. بالإضافة إلى ذلك، فإن إجراء استئصال الغدد التي تستخدم عادة لأكبر الأسماك40 ليست مناسبة للأسماك الصغيرة التي تتطلب دقة عالية لتجنب الضرر المفرط. وأخيرا، فإن أخذ عينات الدم يشكل تحديا بسبب محدودية الوصول إلى الأوعية الدموية وكمية الدم الصغيرة في تلك الحيوانات. لذلك ، فإن بروتوكولا واضحا يوضح كل خطوة من خطوات استئصال الغدد الدموية وأخذ عينات الدم في تيليوست صغير أمر مهم.
يوضح هذا البروتوكول الإجراءات التدريجية لاستئصال الغدد الدموية متبوعة بأخذ عينات الدم في ميداكا اليابانية، وهي سمكة صغيرة من أسماك المياه العذبة موطنها شرق آسيا. ميداكا اليابانية لديها الجينوم تسلسل، العديد من الأدوات الجزيئية والجينية المتاحة25،ونظام تحديد الجنس الوراثية التي تسمح للتحقيق في الاختلافات الجنسية قبل الخصائص الجنسية الثانوية أو النواد متطورة41. ومن المثير للاهتمام، تمتلك ميداكا اليابانية النجنات تنصهر خلافا لكثير من الأنواع الأخرى teleost42. هذه التقنيتين مجتمعة يستغرق سوى 8 دقائق في المجموع، وسوف تكمل قائمة بروتوكولات الفيديو الموجودة بالفعل لهذا النوع التي شملت وضع العلامات على الأوعية الدموية43,التصحيح المشبك على أقسام الغدة النخامية44 والخلايا العصبية في الدماغ45, وثقافة الخلايا الأولية46. هذه التقنيات سوف تسمح للمجتمع البحثي للتحقيق وفهم أفضل لأدوار المنشطات الجنس في آليات التغذية المرتدة، فضلا عن اللدونة الدماغ والغدة النخامية في المستقبل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وقد أجريت جميع التجارب والتعامل مع الحيوانات وفقا للتوصيات المتعلقة بالرعاية التجريبية للحيوانات في الجامعة النرويجية لعلوم الحياة. وقد وافقت الهيئة النرويجية لسلامة الأغذية على التجارب التي استخدمت استئصال الغدد الغذائية (FOTS ID 24305).
ملاحظة: أجريت التجارب باستخدام البالغين الذكور والإناث (6-7 أشهر من العمر، الوزن ca. 0.35 غرام، طول كاليفورنيا 2.7 سم) ميداكا اليابانية. تم تحديد الجنس من خلال التمييز بين الخصائص الجنسية الثانوية ، مثل حجم وشكل الزعنفة الظهرية الشرجية ، كما هو موضح في42،47.
1. إعداد الآلات والحلول
- إعداد محلول مخزون مخدر (0.6٪ Tricaine).
- تمييع 0.6 غرام من Tricaine (MS-222) في 100 مل من 10x الفوسفات العازلة المالحة (PBS).
- توزيع 1 مل من محلول الأسهم Tricaine في عدة أنابيب بلاستيكية 1.5 مل وتخزينها في -20 درجة مئوية حتى الاستخدام.
- إعداد مياه الانتعاش (0.9٪ محلول NaCl) عن طريق إضافة 18 غرام من NaCl إلى 2 لتر من مياه حوض السمك. تخزين الحل في درجة حرارة الغرفة حتى الاستخدام.
- إعداد أدوات شق عن طريق كسر حلاقة قطريا للحصول على نقطة حادة (الشكل 1A).
- إعداد محلول مضاد للتخثر في الدم (0.05 U/μL من الهيبارين الصوديوم) عن طريق تخفيف 25 ميكرولتر من الهيبارين الصوديوم إلى 500 ميكرولتر من 1x PBS. تخزين الحل المضادة للتخثر في 4 درجة مئوية حتى الاستخدام.
- إعداد اثنين من الإبر الزجاجية من الشعرية الزجاج 90 ملم طويلة عن طريق سحب الشعيرات الدموية الزجاجية مع سحب إبرة (الشكل 1B) وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
ملاحظة: القطر الخارجي للابرة الزجاجية هو 1 مم، بينما القطر الداخلي هو 0.6 مم. - إعداد غطاء أنبوب بلاستيكي 1.5 مل عن طريق قطع الغطاء وجعل ثقب الذي يناسب مع قطر الإبرة الخارجي(الشكل 1C). لجعل الحفرة، والحرارة نهاية واحدة من الشعرية الزجاج 9 ملم وطعن الشعرية الزجاجية ساخنة من خلال الغطاء. بدلا من ذلك، استخدم إبرة للطعن من خلال الغطاء حتى يتناسب قطر الثقب مع الشعيرات الدموية الزجاجية عيار 9 ملم.
2. إجراء استئصال الغدد
- إعداد 0.02٪ من محلول مخدر عن طريق تمييع أنبوب واحد من مخزون Tricaine (0.6٪) في 30 مل من مياه حوض السمك.
- إعداد أدوات تشريح بما في ذلك واحد فائقة الغرامة واثنين من ملقط غرامة (واحد مع طرف واسع نسبيا)، مقص صغير، خيط النايلون وشفرة الحلاقة كما هو موضح في الخطوة 1.3.
- تخدير الأسماك عن طريق وضعها في محلول مخدر 0.02٪ لمدة 30-60 ثانية.
ملاحظة: مدة التخدير يعتمد على حجم ووزن السمك ويجب أن تتكيف. لضمان تخدير الأسماك بالكامل ، يمكن قرص جسم السمك بلطف باستخدام ملقط. إذا لم تتفاعل الأسماك، يمكن بدء استئصال الغدد. - إخراج الأسماك من محلول مخدر ووضع الأسماك أفقيا على جانبها، خارج الماء تحت المجهر تشريح.
- استئصال المبيض (OVX) لدى الإناث
- إزالة البيض oviposited (البيض شنقا خارج جسم الأنثى) إن وجدت وكشط المقاييس في منطقة شق (الشكل 2A).
- إجراء شق بلطف حول 2-2.5 مم طويلة بين الأضلاع، بين الحوض والزعانف الشرجية (الشكل 2A)، وذلك باستخدام شفرة الحلاقة. ثم، قرصة بلطف بطن السمكة في حين إخراج المبيضين شيئا فشيئا باستخدام ملقط غرامة مع طرف واسع.
- قطع نهاية المبيضين باستخدام ملقط ناعم ووضع المبيضين جانبا (الشكل 2B).
ملاحظة: الحرص على عدم كسر كيس المبيض إذا كان ذلك ممكنا. إذا كان كيس المبيض مكسورا، قم بإزالة أي آثار للغناد قدر الإمكان دون ترك أي بيضات غير مبيضة.
- استئصال السحلية عند الذكور
- إجراء شق بلطف بين الأضلاع فوق فتحة العلج (الشكل 2A)، وفتح شق ببطء باستخدام ملقط ناعم.
- الاستيلاء بلطف الخصيات باستخدام ملقط غرامة وتأخذ ببطء من الخصية. بعد ذلك، وقطع نهاية الخصيتين لإزالة الخصيتين تماما (الشكل 2B). بالنسبة لاستئصال السحلية الذكوري ، تشبه جميع الاستعدادات في الإناث حتى الجزء الشق. عند الاستيلاء على الخصيتين، وأحيانا يتم الحصول على الدهون تشبه الخصيتين. ومع ذلك، بعد استعادة الدهون، فمن الممكن في محاولة للعثور على الخصية مرة أخرى(الشكل 2B).
ملاحظة: بالنسبة للذكور والإناث على حد سواء، من المهم تقليل حجم الشق في البطن لمنع الضرر المفرط الذي يمكن أن يؤدي إلى الوفاة. في بعض الأحيان قد تظهر الأمعاء أيضا من خلال الشق جنبا إلى جنب مع النواد، لذلك تأكد من إعادتها بشكل صحيح داخل الشق قبل الإغلاق. المعرفة المسبقة على موقع المبيضين والخصيات في البطن ميداكا أمر ضروري.
- خياطة شق بالمثل في الذكور والإناث (الشكل 3).
- ضع الخيط النايلون بجانب منطقة شق وطعن الجلد من الجانب الأيمن من شق من خلال تجويف الجسم الداخلي باستخدام ملقط فائقة الدقة لاتخاذ الموضوع في مع ملقط غرامة (الشكل 3;1-2).
- طعن الجلد من الجانب الأيسر من الشق من خلال تجويف الجسم الخارجي لإخراج الخيط ( الشكل 3؛ 3-4).
- إغلاق فتحة شق وجعل عقدة اثنين وقطع الخيط المفرط (الشكل 3; 4-6).
ملاحظة: يجب أن تكون الغرزة ضيقة بشكل كاف، ويجب أن يكون الخيط المتبقي على السمك طويلا بما يكفي لمنع تخفيف الغرز. يستغرق الإجراء بأكمله من التخدير حتى الخياطة عادة ما يصل إلى 6 دقائق. وقد يؤدي طول الوقت إلى الوفاة. - وضع السمك في مياه الانتعاش وتركها لمدة 24 ساعة على الأقل قبل نقلها إلى نظام الحوض.
ملاحظة: عادة ما تظهر الأسماك Gonadectomized السلوك الطبيعي بعد 1-2 ساعة في مياه الانتعاش. ولذلك، اعتمادا على الغرض من التجربة، يمكن للمرء أن عينة الأسماك بعد هذا الفاصل الزمني.
3. إجراء أخذ عينات الدم
- إعداد الأدوات: إبرة زجاجية، وشعيرات سيليكون، وأنبوب بلاستيكي مع ثقب، وأنبوب بلاستيكي فارغ سعة 1.5 مل، وطارد مركزي صغير وشريط.
- تخدير الأسماك باستخدام محلول مخدر 0.02٪ كما هو موضح في الخطوة 2.1 ووضع السمك تحت مجهر تشريح في وضع عمودي(الشكل 4A). ضع السمك على سطح مشرق لتخفيف التصور الوريد ثقب caudal.
- تثبيت درج الدم عن طريق إرفاق إبرة زجاجية إلى الشعرية السيليكون (الشكل 4B). كسر غيض من الإبرة مع ملقط تلميح واسعة ومعطف داخل الإبرة مع حل مضاد للتخثر عن طريق الشفط وتهب.
ملاحظة: ينصح باستخدام مصاصة وشعيرات سيليكون بطول 50 سم على الأقل لتدابير السلامة لتجنب أي اتصال مباشر بالدم عند الشفط. بالإضافة إلى ذلك، تأكد من أن فتحة طرف الإبرة كبيرة بما يكفي للسماح بسحب الدم. - توجيه الإبرة نحو منطقة peduncle من الأسماك، وتهدف إلى الوريد peduncle caudal (الشكل 5A) ورسم الدم باستخدام الفم حتى يتم تعبئة ما لا يقل عن ربع الحجم الإجمالي للابرة (الشكل 5B).
ملاحظة: من المهم التوقف عن الشفط قبل إزالة الإبرة من جسم السمك. - الإفراج عن الإبرة ووضع قطعة من الشريط على مقربة من الجانب الحاد من الإبرة. ضع الغطاء مع ثقب على أنبوب جمع ووضع الإبرة داخل الأنبوب من خلال ثقب مع طرف إبرة على الخارج(الشكل 5C).
- وضع السمك في مياه الانتعاش وتركها لمدة 24 ساعة على الأقل قبل نقلها إلى نظام الحوض.
ملاحظة: لإجراء أخذ عينات دم ثانية من نفس السمكة، عينة الدم بعد أسبوع واحد من أخذ عينات الدم الأولى. - فلاش تدور أسفل الدم التي تم جمعها لمدة 1-2 ثانية مع 1000 × ز في درجة حرارة الغرفة لجمع الدم في الأنبوب.
- انتقل مباشرة إلى تطبيقات المصب أو تخزين الدم في -20 درجة مئوية حتى الاستخدام.
ملاحظة: الرجوع إلى الدراسة السابقة لاستخراج الستيرويد الجنس من الدم كله48.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يصف هذا البروتوكول كل خطوة لإجراء استئصال الغدد الدموية وأخذ عينات الدم في تيليوست نموذج صغير الحجم، ميداكا اليابانية. معدل بقاء الأسماك بعد استئصال المبيضين (OVX) في الإناث هو 100٪ (10 من أصل 10 أسماك) في حين نجا 94٪ (17 من أصل 18 سمكة) من الذكور بعد استئصال السحلية. وفي الوقت نفسه، وبعد إجراء عملية أخذ عينات الدم، نجت جميع الأسماك (38 سمكة).
تظهر الإناث التي تعمل بالشمس oviposition (الشكل 6A) وتم تخصيب جميع البويضات وسمح لنمو الجنين(الشكل 6B). كما تمكن الذكور الذين يعملون بالشام من تسميد البويضات بعد أسبوع إلى أسبوعين فقط. كما أظهرت اثنتان من كل ست إناث مغرضات جزئيا تربين مع ذكور مغرضات جزئيا oviposition مع 100٪ من البويضات المخصبة بعد شهرين. وعلى النقيض من ذلك، لم يلاحظ أي تراكب في الإناث أو الإخصاب من قبل الذكور في الأسماك المغرضة بالكامل، حتى بعد 4 أشهر.
عند تنفيذها بشكل صحيح، يتغير شكل جسم السمكة قليلا (الشكل 7A)، ولا ينبغي أن تبقى أي قطعة من الغدد الغدد الفونادية بعد إجراء استئصال الغدد(الشكل 7B). وفي الوقت نفسه، 4 أسابيع بعد استئصال الغدد التناسلية، شق وخياطة اختفت تماما(الشكل 8)،وبعد 4 أشهر، جميع الأسماك التناسلية لا تزال تظهر النمط الظاهري صحية، ولم يتم العثور على الأنسجة gonadal.
E2 تركيزات الدم في الإناث (الجدول 1), قياس مع ELISA اتباع تعليمات الشركة المصنعة, كشفت أن مستوى E2 في الأسماك OVX أقل بكثير مما كانت عليه في الأسماك التي تعمل بالشمس 24 ساعة بعد الجراحة (ص < 0.00001). بعد 4 أشهر، ومستوى E2 في الأسماك OVX هو أيضا أقل بكثير مما كانت عليه في الأسماك التي تعمل بالشمس(ص < 0.00001) ويظهر أي فرق كبير مقارنة مع ذلك في 24 ساعة بعد OVX الأسماك (ص > 0.05). وأخيرا، تظهر جزئيا أسماك OVX، حيث تمت إزالة 1/3 إلى 1/2 فقط من الندب، مستويات E2 أقل بكثير من الأسماك التي تعمل بالشمس(p = 0.0437) ومستويات E2 أعلى بكثير من أسماك OVX بالكامل(p < 0.00001)(الشكل 9A).
وبالمثل في الذكور (الجدول 1)، تركيز 11-KT في الأسماك orchidectomized أقل بكثير مما كانت عليه في الأسماك التي تعمل بالشمس بعد 24 ساعة من الجراحة (ص < 0.00001). مستوى 11-KT في الأسماك orchidectomized بعد 4 أشهر هو أيضا أقل بكثير مما كانت عليه في الأسماك التي تديرها صورية(ص < 0.00001) ويظهر أي فرق مقارنة مع 24 ساعة بعد استئصال السحلية الأسماك (ص > 0.05). وأخيرا، تظهر الأسماك المستئصالة جزئيا من السحلية مستويات أقل بكثير من 11-KT من الأسماك التي تعمل بالشمس(p = 0.0428) ومستويات أعلى بكثير من 11-KT من الأسماك المستئصالة بالكامل(p < 0.00001) (الشكل 9B).
الشكل 1. إعداد الأجهزة. (أ) شفرة الحلاقة لاستئصال الغدد المنوية،(ب)إبرة زجاجية لاستخراج الدم، و (ج) أنبوب بلاستيكي جنبا إلى جنب مع غطاء مع ثقب لجمع الدم. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. موقع منطقة الشق. أ)رسم منطقة الشق الواقعة بين الأضلاع ، بين زعانف الحوض والزعنفة الشرجية في الإناث (اللوحة اليسرى) والذكور (اللوحة اليمنى) ؛ ب) إزالة النناد في الإناث (اللوحة اليسرى) والذكور (لوحة الحق)، والدوائر البيضاء التي تبين الجزء المشترك، السهم الأبيض تظهر الخصية والسهم الأسود تظهر الدهون. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3. إجراء خياطة. 1) يتم إجراء ثقب على الجانب الأيمن من الشق باستخدام ملقط فائقة الدقة. 2) يتم تمرير الخيط النايلون من خلال الجلد باستخدام ثقب المحرز في 1. 3) يتم إجراء ثقب في الجانب الأيسر من الشق. 4) يتم تمرير الخيط النايلون من خلال ثقب المحرز في 3. 5) يتم عقدة اليد مرتين لإغلاق الشق. 6) يتم قطع الخيط الزائد. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4. وضع السمك أثناء أخذ عينات الدم (A)، وتركيب إبرة زجاجية مع الشعرية السيليكون (B). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5. منطقة شفط أخذ عينات الدم (A) والدم المسحوب (B) وخطوات جمع الدم (C). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6. تظهر الأسماك التي تعمل بالشمس بويضات مصوبة بسهم أبيض (A) وبويضات مخصبة (B). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 7. الشكلي (A) والتشريحية (B) مظهر الأسماك سليمة وgonadectomized. تظهر الأسهم البيضاء (اللوحات العلوية) علامة الجراحة على الأسماك المغرمة. الأسهم السوداء (لوحات القاع) تظهر النواد في الأسماك سليمة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 8. علامات الجراحة في الأسماك الذكور والإناث بعد 4 أسابيع. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 9. مستويات الدم من E2 في الإناث (A) و 11-KT في الذكور (B) ميداكا اليابانية, 24 ساعات بعد عملية صورية (السيطرة), جزئيا استئصال الغدد أو استئصال الغدد, و 4 أشهر بعد استئصال الغدد المجرى (OVX, استئصال المبيضين في الإناث; كاس، استئصال السحلية في الذكور). وأجريت التحليلات الإحصائية باستخدام طريقة واحدة ANOVA تليها اختبار توكي بوست مخصص. تظهر الحروف المختلفة (a-c) اختلافات كبيرة(p-value< 0.05). يتم توفير البيانات في الرسم البياني على أنها متوسط + SD، n = 5. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| E2 مستويات (الإناث) | 11-KT مستويات (الذكور) | |
| الشام التي تديرها | 4.15 ± 0.5 (ن = 5) | 10.38 ± 1.32 (ن = 5) |
| جزء من الغوناديكتوم | 3.37 ± 0.6 (ن = 5) | 8.37 ± 1.92 (ن = 5) |
| 24h بعد استئصال الغدد | 0.36 ± 0.2 (ن = 5) | 0.4 ± 0.2 (ن = 5) |
| 4 أشهر بعد استئصال الغدد | 0.54 ± 0.28 (ن = 5) | 0.74 ± 0.22 (ن = 5) |
الجدول 1 - الجداول E2 و 11-KT مستويات (نانوغرام / مل) في الإناث والذكور من الأسماك التي تعمل بالشمس وgonadectomized وgonadectomized جزئيا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
كما ورد في الأدبيات السابقة, وقد استخدمت منذ فترة طويلة استئصال الغدد المنوية وأخذ عينات الدم في الأنواع النموذجية الأخرى للتحقيق في المسائل المتعلقة بدور المنشطات الجنس في تنظيم محور BPG. ومع ذلك ، يبدو أن هذه التقنيات قابلة فقط للحيوانات الأكبر. وبالنظر إلى صغر حجم نموذج تيليوست الشائع الاستخدام، ميداكا اليابانية، ونحن نقدم بروتوكول مفصل لاستئصال الغدد الدموية وأخذ عينات الدم التي هي ممكنة لهذا النوع.
حقيقة أن معدل بقاء الأسماك المغرد وصلت إلى ما يقرب من 100٪ يشير إلى أن إجراء استئصال الغدد الرياضية ممكن تطبيقه على ميداكا. وبالمثل، فإن إجراء أخذ عينات الدم لا يؤثر على بقاء الأسماك كما هو مبين في معدل البقاء على قيد الحياة 100٪ بعد خضوعه لهذا الإجراء. بالإضافة إلى ذلك ، تظهر الإناث التي تعمل بالشمس التي تربى مع الذكور الذين يعملون بالشمس oviposition و 100 ٪ من البويضات المخصبة ، مما يشير إلى أن إجراء الشق والغرز لا يؤثر على تكاثر الأسماك. وبعبارة أخرى، كانت صحية بما فيه الكفاية لتفرخ. وعلاوة على ذلك، تظهر الأسماك المغرضة جزئيا تركيزات مماثلة من المنشطات الجنسية للأسماك التي تعمل بالشمس، ولوحظ في تلك الأسماك المغرضة جزئيا oviposition في بعض الإناث، فضلا عن تخصيب البويضات من قبل الذكور. تشير هذه النتائج إلى أنه يجب إجراء استئصال الغدد الدموية بدقة عالية، مما يعني أنه يجب إزالة المبيضين أو الخصيتين تماما.
كما هو مبين في الشكل 8، شق وعلامة خياطة على الأسماك اختفت تماما 4 أسابيع بعد استئصال الغدد ، والأسماك لا تزال على قيد الحياة وتبدو صحية 4 أشهر بعد الجراحة. وتشير هذه إلى أن إجراء العملية آمن للأسماك لأغراض طويلة الأجل ولا يؤثر على العمر الافتراضي للأسماك. بالإضافة إلى ذلك ، بعد 4 أشهر ، لم يلاحظ أي ونود. ويؤكد ذلك انخفاض مستويات E2 و 11-KT التي لا تزال مماثلة لتلك الموجودة في الأسماك المغرد بعد 24 ساعة.
مستويات E2 و 11-KT في الأسماك المغرمة هي أقل بكثير من الأسماك التي تعمل بالشمس، بالفعل بعد 24 ساعة بعد استئصال الغدد، وتظل أقل في الأسماك عينات 4 أشهر بعد استئصال الغدد. وقد لوحظ انخفاض كبير في مستويات الستيرويد الجنس في الأسماك gonadectomized مقارنة مع السيطرة في الدراسات السابقة في dogfish37, سمك السلور39 وميداكا48. هذه الأدلة متسقة تشير إلى أن إجراء استئصال الغدد المنوية الموصوفة في البروتوكول هو تقنية موثوق بها لمسح المنشطات الجنس المتداولة.
وبما أن هذا الإجراء لا يعتمد على الفاد كما هو موضح في40، يجب إجراء استئصال الغدد في أسرع وقت ممكن لمنع الوفيات أثناء الجراحة. في الواقع ، فإن استخدام FADS يمكن من الحفاظ على إيقاع التشغيل لأن هذه الأداة تسمح بحالة مخدر مستمرة للأسماك على الرغم من تعرضها للهواء. ومع ذلك، ونظرا لانخفاض جدواه في تيليوست صغيرة كما ميداكا، لا يمكن تنفيذ استخدام FADS مع هذا الحجم من الأسماك. بالإضافة إلى ذلك، وعلى عكس بروتوكول استئصال الغدد المائية السابق في الأسماك الأكبر حجما الذي يمكن الشق الواسع من الوصول إلى الغدد الغددغددية، فإن البروتوكول الموصوف في هذه المخطوطة لا يسمح بشق واسع لتجنب الأضرار المفرطة التي لحقت بالأسماك الصغيرة. لذلك ، يجب على المرء أن يكون حذرا جدا عند محاولة الوصول إلى الندب باستخدام ملقط لمنع الضرر في الأنسجة الأخرى داخل تجويف جسم السمك.
يعتمد البروتوكول على إجراء سريع ونظيف. وبالتالي ينصح بشدة التدريب حتى تصل إلى نسبة نجاح عالية، وأشار إلى ارتفاع معدل بقاء الأسماك بعد استئصال الغدد، فضلا عن إزالة كاملة من الغدد الغدد (انظر الفرق من المظهر المورفولوجي والتشريحي للأسماك قبل وبعد استئصال الغدد المنوية الناجحة في الشكل 7). في الواقع ، يمكن أن تؤثر العديد من العوامل على معدل نجاح الإجراء ، بما في ذلك فترة التخدير ، واتساع الشق ، ودقة وترتيب الخياطة والتعامل مع الأسماك أثناء الإجراء. نقطة أخرى مهمة هي أنه ينبغي للمرء أن يعد الأسماك الصحية من خلال الحفاظ على الأسماك على النحو الأمثل قبل تنفيذ البروتوكول.
وفيما يتعلق بإجراء أخذ عينات الدم، حاولت الدراسات السابقة أخذ عينات من الدم من ميداكا48 وسمك الحمار الوحشي49،50،51، ولكن الإجراء لا يسمح بأخذ عينات الدم المتكررة في نفس السمكة حيث يتم أخذ الدم بعد القتل الرحيم للأسماك. وقد ثبت أخذ عينات الدم المتكررة باستخدام حمار وحشي في دراسة أخرى52, لكننا تقرير هذا النوع من البروتوكول للمرة الأولى في ميداكا.
يتم تقييم تركيزات الستيرويد الجنس عادة باستخدام اختبار مناعي مرتبط بالإنزيم (ELISA) عدة, وكانت هناك العديد من مجموعات ELISA المتاحة تجاريا لأنواع مختلفة من المنشطات الجنسية. نظرا لانخفاض كمية الدم التي يتم جمعها أثناء أخذ عينات الدم ، فإن المقايسات المصبية مخصصة للدم كله. وقد أظهرت الدراسات السابقة أن هناك فرقا في مستوى قياس مستويات الستيرويد المتداولة المستخرجة من الدم كله والبلازما53,54. ولذلك, الفرق في مستويات الستيرويد الجنس من الدم كله والبلازما يحتاج إلى التحقق من صحة قبل إجراء تجربة حقيقية باستخدام البروتوكول.
وكما هو موثق في دراسات سابقة مع نماذج حيوانية مختلفة، فإن البروتوكول الموصوف هنا سيسمح بالتحقيق في المسائل المتعلقة بفيزيولوجيا الإنجاب باستخدام تيليوست صغير الحجم كنموذج. في الواقع، وقد ساهمت هذه التقنيات بالفعل للإجابة على الأسئلة المتعلقة بتنظيم محور BPG وآليات التغذية المرتدة لها، مثل مشاركة kiss1 (kisspeptin نوع الجينات 1) التعبير عن الخلايا العصبية في حلقات التغذية المرتدة الإيجابية55،تنظيم الاستروجين بوساطة kiss1 التعبير عن الخلايا العصبية في النواة البطينية tuberis (NVT)، و kiss2 (kisspeptin نوع الجينات 2) التعبير عن الخلايا العصبية في منطقة ما قبل البصريات (POA)56، 57, المشاركة المحتملة لمستقبلات الإستروجين β1 (Esr2a) في مستوى التعبير fsh أسفل التنظيم في الإناث اليابانية ميداكا58 فضلا عن لمحة عن إيقاع circadian من E2 في الأسماك الإناث48. وعلاوة على ذلك, منذ الدراسات السابقة أظهرت أن المنشطات الجنس تؤثر أيضا على انتشار الخلايا gonadotrope في الغدة النخامية من teleosts59,60, ومن المثير للاهتمام للتحقيق في آثار إزالة الستيرويد الجنس بعد استئصال الغدد النخامية على اللدونة النخامية.
تقنية أخذ عينات الدم لا يمكن استخدامها فقط لتحليل الستيرويد الجنس, ولكن أيضا لتحليل محتوى الدم الأخرى, بما في ذلك مستويات السكر في الدم. في الواقع، يمكن تطبيق البروتوكول أيضا لقياسات السكر في الدم كما هو موضح في حمار وحشي52 و medaka61. لذلك، يمكن توسيع هذه التقنية لمعالجة المسائل البحثية في مجالات أخرى من علم وظائف الأعضاء.
وأخيرا، فإن البروتوكولات الموصوفة هنا مخصصة ومحسنة لل ميداكا اليابانية البالغة، وقد تختلف النتائج الناجمة عن اختلاف حجم الأسماك والمواد المستخدمة أثناء الإجراءات. وعلاوة على ذلك، بما أن المبيضين/الخصيتين الأيسر والأييم من ميداكا تنصهران، مما قد يوفر ميزة هامة لاستئصال الغدد، فقد يحتاج هذا البروتوكول إلى عدة تعديلات قبل استخدامه في أنواع أخرى حيث لا يكون الأمر كذلك كما هو الحال في سمك الحمار الوحشي. وبالتالي، ينبغي أن تؤخذ في الاعتبار التحسين وفقا لاختيار المعدات المختبرية وحجم الأسماك قبل اختبار هذه البروتوكولات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.
Acknowledgments
يشكر المؤلفان السيدة لورد كاريون جي تان على مساعدتها في تربية الأسماك. تم تمويل هذا العمل من قبل NMBU، والمنح في المعونة من الجمعية اليابانية لتعزيز العلوم (JSPS) (منحة رقم 18H04881 و 18K19323)، ومنحة لمشاريع أبحاث العلوم الأساسية من مؤسسة سوميتومو إلى S.K.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass capilary | GD1 | Glass Capillary with Filament GD-1; Narishige | |
| Heparin sodium salt | H4784-1G | Sigma-aldrich | |
| Needle puller | P97 | Flaming/Brown Micropipette puller Model P-97; Sutter Instrument | |
| Nylon thread | N45VL | Polyamide suture, 0.2 metric; Crownjun | |
| Plastic tube | T9661 | Eppendorf Safe-lock microcentifuge tube 1.5 ml, Sigma-aldrich | |
| Razor blade | - | Astra Superior Platinum Double Edge Razor Blades Green, salonwholesale.com | |
| Silicone capillary | a16090800ux0403 | Uxcell Silicone Tube 1 mm ID x 2 mm OD, amazon.com | |
| Tricaine | WXBC9102V | Aldrich chemistry |
References
- Weltzien, F. -A., Andersson, E., Andersen, Ø, Shalchian-Tabrizi, K., Norberg, B. The brain-pituitary-gonad axis in male teleosts, with special emphasis on flatfish (Pleuronectiformes). Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Molecular & Integrative Physiology. 137 (3), 447-477 (2004).
- Yaron, Z., Levavi-Sivan, B. Encyclopedia of Fish Physiology. Farrell, A. P. 2, Academic Press. 1500-1508 (2011).
- Goldman, B. D. The circadian timing system and reproduction in mammals. Steroids. 64 (9), 679-685 (1999).
- Taranger, G. L., et al.
- Messinis, I. E. Ovarian feedback, mechanism of action and possible clinical implications. Human Reproduction Update. 12 (5), 557-571 (2006).
- Diotel, N., et al. The brain of teleost fish, a source, and a target of sexual steroids. Frontiers in Neuroscience. 5, 137 (2011).
- Diotel, N., et al. Steroid Transport, Local Synthesis, and Signaling within the Brain: Roles in Neurogenesis, Neuroprotection, and Sexual Behaviors. Frontiers in Neuroscience. 12, 84 (2018).
- Larson, T. A. Sex Steroids, Adult Neurogenesis, and Inflammation in CNS Homeostasis, Degeneration, and Repair. Frontiers in Endocrinology. 9, 205 (2018).
- Fontaine, R., et al. Gonadotrope plasticity at cellular, population and structural levels: A comparison between fishes and mammals. General and Comparative Endocrinology. 287, 113344 (2020).
- Fontaine, R., Royan, M. R., von Krogh, K., Weltzien, F. -A., Baker, D. M. Direct and indirect effects of sex steroids on gonadotrope cell plasticity in the teleost fish pituitary. Frontiers in Endocrinology. , (2020).
- Kanda, S. Evolution of the regulatory mechanisms for the hypothalamic-pituitary-gonadal axis in vertebrates-hypothesis from a comparative view. General and Comparative Endocrinology. 284, 113075 (2019).
- Schreck, C. B. Stress and fish reproduction: The roles of allostasis and hormesis. General and Comparative Endocrinology. 165 (3), 549-556 (2010).
- Wendelaar Bonga, S. E.
- Mommsen, T. P.
- Won, E., Borski, R. Endocrine Regulation of Compensatory Growth in Fish. Front. Endocrinol. 4, 74 (2013).
- MacKenzie, D. S., VanPutte, C. M., Leiner, K. A. Nutrient regulation of endocrine function in fish. Aquaculture. 161 (1), 3-25 (1998).
- Rønnestad, I., Thorsen, A., Finn, R. N. Fish larval nutrition: a review of recent advances in the roles of amino acids. Aquaculture. 177 (1), 201-216 (1999).
- Borg, B.
- Rege, J., et al. Circulating 11-oxygenated androgens across species. The Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology. 190, 242-249 (2019).
- Blázquez, M., Bosma, P. T., Fraser, E. J., Van Look, K. J. W., Trudeau, V. L. Fish as models for the neuroendocrine regulation of reproduction and growth. Comparative Biochemistry and Physiology Part C: Pharmacology, Toxicology and Endocrinology. 119 (3), 345-364 (1998).
- Zambrano, D.
- Weltzien, F. -A., Hildahl, J., Hodne, K., Okubo, K., Haug, T. M. Embryonic development of gonadotrope cells and gonadotropic hormones - Lessons from model fish. Molecular and Cellular Endocrinology. 385 (1), 18-27 (2014).
- Harris, M. P., Henke, K., Hawkins, M. B., Witten, P. E. Fish is Fish: the use of experimental model species to reveal causes of skeletal diversity in evolution and disease. Journal of applied ichthyology. 30 (4), 616-629 (2014).
- Powers, D.
- Naruse, K. Medaka: A Model for Organogenesis, Human Disease, and Evolution. Naruse, K., Tanaka, M., Takeda, H. , Springer. Japan. 19-37 (2011).
- Green, P. G., et al. Sex Steroid Regulation of the Inflammatory Response: Sympathoadrenal Dependence in the Female Rat. The Journal of Neuroscience. 19 (10), 4082-4089 (1999).
- Pakarinen, P., Huhtaniemi, I. Gonadal and sex steroid feedback regulation of gonadotrophin mRNA levels and secretion in neonatal male and female rats. Journal of Molecular Endocrinology. 3 (2), 139 (1989).
- Purves-Tyson, T. D., et al. Testosterone regulation of sex steroid-related mRNAs and dopamine-related mRNAs in adolescent male rat substantia nigra. BMC Neuroscience. 13 (1), 95 (2012).
- Adkins-Regan, E., Ascenzi, M. Sexual differentiation of behavior in the zebra finch: Effect of early gonadectomy or androgen treatment. Hormones and Behavior. 24 (1), 114-127 (1990).
- McCreery, B. R., Licht, P. Effects of gonadectomy and sex steroids on pituitary gonadotrophin release and response to gonadotrophin-releasing hormone (GnRH) agonist in the bullfrog, Rana catesbeiana. General and Comparative Endocrinology. 54 (2), 283-296 (1984).
- Clark, J. H., Markaverich, B. M. The agonistic-antagonistic properties of clomiphene: a review. Pharmacology & Therapeutics. 15 (3), 467-519 (1981).
- Mourits, M. J. E., et al. Tamoxifen treatment and gynecologic side effects: a review. Obstetrics & Gynecology. 97 (5), 855-866 (2001).
- Wallach, E., Huppert, L. C. Induction of Ovulation with Clomiphene Citrate. Fertility and Sterility. 31 (1), 1-8 (1979).
- Moradi, B., Kazemi, M. A., Rahamni, M., Gity, M. Ovarian hyperstimulation syndrome followed by ovarian torsion in premenopausal patient using adjuvant tamoxifen treatment for breast cancer. Asian Pacific Journal of Reproduction. 5 (5), 442-444 (2016).
- Alvarado, M. V., et al. Actions of sex steroids on kisspeptin expression and other reproduction-related genes in the brain of the teleost fish European sea bass. The Journal of Experimental Biology. 219 (21), 3353-3365 (2016).
- Godwin, J., Crews, D., Warner, R. R. Behavioural sex change in the absence of gonads in a coral reef fish. Proceedings of the Royal Society of London. Series B: Biological Sciences. 263 (1377), 1683-1688 (1996).
- Jenkins, N., Dodd, J. M. Effects of ovariectomy of the dogfish Scyliorhinus canicula L. on circulating levels of androgen and oestradiol and on pituitary gonadotrophin content. Journal of Fish Biology. 21 (3), 297-303 (1982).
- Manickam, P., Joy, K. P. Changes in hypothalamic catecholamine levels in relation to season, ovariectomy and 17β-estradiol replacement in the catfish, Clarias batrachus (L.). General and Comparative Endocrinology. 80 (2), 167-174 (1990).
- Senthilkumaran, B., Joy, K. P. Effects of ovariectomy and oestradiol replacement on hypothalamic serotonergic and monoamine oxidase activity in the catfish, Heteropneustes fossilis: a study correlating plasma oestradiol and gonadotrophin levels. Journal of Endocrinology. 142 (2), 193-203 (1994).
- Sladky, K. K., Clarke, E. O. Fish Surgery: Presurgical Preparation and Common Surgical Procedures. Veterinary Clinics of North America: Exotic Animal Practice. 19 (1), 55-76 (2016).
- Hori, H. Medaka: A Model for Organogenesis, Human Disease, and Evolution. Naruse, K., Tanaka, M., Takeda, H. , Springer. Japan. 1-16 (2011).
- Murata, K., Kinoshita, M., Naruse, K., Tanaka, M., Kamei, Y. Medaka: Biology, Management, and Experimental Protocols. Murata, K., et al. 2, John Wiley & Sons. 49-95 (2019).
- Fontaine, R., Weltzien, F. -A. Labeling of Blood Vessels in the Teleost Brain and Pituitary Using Cardiac Perfusion with a DiI-fixative. Journal of Visualized Experiments. (148), e59768 (2019).
- Fontaine, R., Hodne, K., Weltzien, F. -A. Healthy Brain-pituitary Slices for Electrophysiological Investigations of Pituitary Cells in Teleost Fish. Journal of Visualized Experiments. (138), e57790 (2018).
- Zhao, Y., Wayne, N. L. Recording Electrical Activity from Identified Neurons in the Intact Brain of Transgenic Fish. Journal of Visualized Experiments. (74), e50312 (2013).
- Ager-Wick, E., et al. Preparation of a High-quality Primary Cell Culture from Fish Pituitaries. Journal of Visualized Experiments. (138), e58159 (2018).
- Wittbrodt, J., Shima, A., Schartl, M. Medaka - model organism from the far east. Nature Reviews Genetics. 3 (1), 53-64 (2002).
- Kayo, D., Oka, Y., Kanda, S. Examination of methods for manipulating serum 17β-Estradiol (E2) levels by analysis of blood E2 concentration in medaka (Oryzias latipes). General and Comparative Endocrinology. 285, 113272 (2020).
- Eames, S. C., Philipson, L. H., Prince, V. E., Kinkel, M. D. Blood sugar measurement in zebrafish reveals dynamics of glucose homeostasis. Zebrafish. 7 (2), 205-213 (2010).
- Velasco-Santamaría, Y. M., Korsgaard, B., Madsen, S. S., Bjerregaard, P. Bezafibrate, a lipid-lowering pharmaceutical, as a potential endocrine disruptor in male zebrafish (Danio rerio). Aquatic Toxicology. 105 (1-2), 107-118 (2011).
- Jagadeeswaran, P., Sheehan, J. P., Craig, F. E., Troyer, D. Identification and characterization of zebrafish thrombocytes. British Journal of Haematology. 107 (4), 731-738 (1999).
- Zang, L., Shimada, Y., Nishimura, Y., Tanaka, T., Nishimura, N. Repeated Blood Collection for Blood Tests in Adult Zebrafish. Journal of Visualized Experiments. (102), e53272 (2015).
- Taves, M. D., et al. Steroid concentrations in plasma, whole blood and brain: effects of saline perfusion to remove blood contamination from brain. PloS one. 5 (12), 15727 (2010).
- Holtkamp, H. C., Verhoef, N. J., Leijnse, B. The difference between the glucose concentrations in plasma and whole blood. Clinica Chimica Acta. 59 (1), 41-49 (1975).
- Kanda, S., et al. Identification of KiSS-1 Product Kisspeptin and Steroid-Sensitive Sexually Dimorphic Kisspeptin Neurons in Medaka (Oryzias latipes). Endocrinology. 149 (5), 2467-2476 (2008).
- Kanda, S., Karigo, T., Oka, Y. Steroid Sensitive kiss2 Neurones in the Goldfish: Evolutionary Insights into the Duplicate Kisspeptin Gene-Expressing Neurones. Journal of Neuroendocrinology. 24 (6), 897-906 (2012).
- Mitani, Y., Kanda, S., Akazome, Y., Zempo, B., Oka, Y. Hypothalamic Kiss1 but Not Kiss2 Neurons Are Involved in Estrogen Feedback in Medaka (Oryzias latipes). Endocrinology. 151 (4), 1751-1759 (2010).
- Kayo, D., Zempo, B., Tomihara, S., Oka, Y., Kanda, S. Gene knockout analysis reveals essentiality of estrogen receptor β1 (Esr2a) for female reproduction in medaka. Scientific Reports. 9 (1), 8868 (2019).
- Fontaine, R., Ager-Wick, E., Hodne, K., Weltzien, F. -A. Plasticity in medaka gonadotropes via cell proliferation and phenotypic conversion. Journal of Endocrinology. 245 (1), 21 (2020).
- Fontaine, R., Ager-Wick, E., Hodne, K., Weltzien, F. -A. Plasticity of Lh cells caused by cell proliferation and recruitment of existing cells. Journal of Endocrinology. 240 (2), 361 (2019).
- Hasebe, M., Kanda, S., Oka, Y. Female-Specific Glucose Sensitivity of GnRH1 Neurons Leads to Sexually Dimorphic Inhibition of Reproduction in Medaka. Endocrinology. 157 (11), 4318-4329 (2016).
