Summary
本文描述了一个快速协议去纳切除术和采样血液从小远程鱼，使用日本美达卡（Oryzias拉蒂普斯）作为模型，以调查性类固醇在动物生理中的作用。
Abstract
性类固醇，由腺体产生，在大脑和垂体组织可塑性和神经内分泌控制所有脊椎动物通过提供大脑和垂体的反馈发挥关键作用。与哺乳动物相比，Teleost鱼在组织可塑性和生殖策略变化方面具有较高的水平，似乎是研究性类固醇的作用及其作用机制的有用模型。去除性类固醇生产的主要来源使用腺切除术与血液采样测量类固醇水平已经建立和相当可行的大鱼， 是一个强大的技术来调查性类固醇的作用和影响.但是，当在小型远程模型中实施时，这些技术会带来挑战。在这里，我们描述了日本母体的妇腺切除术的分步程序，然后是血液采样。这些协议被证明是非常可行的美达卡表明高存活率， 安全的寿命和表型的鱼， 并在性别类固醇清除方面可重复性.使用这些程序结合使用这种小远程模型的其他优势将大大提高对脊椎动物中性类固醇提供的生殖神经内分泌控制和组织可塑性的反馈机制的理解。
Introduction
在脊椎动物中，性类固醇，主要是由性腺动物产生的，通过各种反馈机制1，2，3，4，5在大脑-脑-脑-淋巴（BPG）轴的调节中起着重要的作用。此外，性类固醇影响大脑6，7，8和内分泌细胞，包括脑垂体9，10神经元的增殖和活动，从而在大脑和垂体可塑性的关键作用。 尽管在哺乳动物方面知识相对较好，但由性类固醇调停的BPG轴调节机制在非哺乳动物物种中还远远不为人所知，导致对进化保护原则的理解不充分。仍然有数量有限的研究记录性类固醇在大脑和垂体可塑性的作用， 从而提出了进一步研究性类固醇对各种脊椎动物物种的作用和影响的需要.
在脊椎动物中，远程运动已成为解决许多生物和生理问题的有力示范动物，包括应激反应12、13、生长14、15、营养生理16、17和繁殖2。Teleosts， 其中性别类固醇主要代表雌二 （E2） 和 11- 酮睾酮 （11-KT） 在男性18，19，长期以来一直是可靠的实验模型， 以调查跨物种繁殖的一般原理.Teleosts在下丘脑脑垂体连接20、21和独特的角细胞22中表现出独特性，这有时便于解释调节机制。此外，由于远程实验既适应实验室实验又进行实地实验，因此与其他生物体相比，远程运动具有许多优势。他们相对便宜购买和维持23，24。特别是小型远程模型，如斑马鱼（Danio rerio）和日本美达卡（Oryzias latipes），是具有非常高的活性，生命周期相对较短的物种，能够快速分析基因功能和疾病机制23，从而提供了更大的优势，解决大量的生物和生理问题，考虑到许多发达的协议和遗传工具包可用于这些物种25。
在许多研究中，去除淋巴（淋巴切除术）以及血液采样技术已被用作研究许多生理问题的方法，包括它对26、27、28、鸟类29和两栖动物30种哺乳动物的脊椎动物生殖生理学的影响。虽然腺切除术对生殖生理的影响可以替代模仿性类固醇拮抗剂，如塔莫西芬和氯米芬，药物的作用似乎是不一致的，由于双模效应31，32。长期接触性类固醇拮抗剂可能导致卵巢扩大33，34，这可能会禁用观察其影响的长期目的， 由于不健康的表型.此外， 不可能进行性类固醇拮抗剂治疗后的恢复实验， 以保证某些性类固醇的具体效果.与上述点， 性类固醇对抗剂使用的其他权衡已广泛审查31，32.因此， 结核切除术今天仍然作为一个强大的技术来研究性类固醇的作用.
虽然去角切除术和血液采样技术在更大的物种中相对容易执行， 如欧洲海贝（迪森特拉丘斯拉布拉克斯）35，蓝头瓦塞（塔拉索马双发）36，狗鱼（西利奥尔希努斯犬）37和猫鱼（异种化石和克拉里亚斯浴场）38，39，他们提出了挑战时，应用在小鱼作为梅达卡。例如，使用鱼麻醉输送系统（FADS）40不太可行，而且似乎容易对小鱼造成过度的身体伤害。此外，通常用于大鱼40的腺切除术不适合需要高精度以避免过度伤害的小鱼。最后，由于获得血管的机会有限，而且这些动物的血液量很小，血液采样具有挑战性。因此，在小手术中展示造血术和血液采样的每一步的明确协议非常重要。
该协议演示了腺切除术的分步程序，随后在日本产自东亚的小淡水鱼——日本美中进行血液取样。日本的美田有一个测序的基因组，几个分子和遗传工具可用25，和一个基因性别测定系统，允许调查性差异之前，二次性特征或性腺发育良好41。有趣的是，日本美达卡拥有融合的果子虫，这与许多其他的远程物种42相反。这两种技术加起来总共只需要8分钟，将完成该物种已经存在的视频协议列表，其中包括血管标签43，垂体部分44 和脑神经元45的补丁夹，和原细胞培养46。这些技术将使研究社区调查和更好地了解性类固醇在反馈机制中的作用，以及大脑和垂体可塑性在未来。
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Protocol
所有实验和动物处理都是根据挪威生命科学大学关于实验动物福利的建议进行的。挪威食品安全局（FOTS ID 24305）批准了使用淋病切除术的实验。
注：实验采用成年男性和女性（6-7个月大，体重约0.35克，长度约2.7厘米）日本美的进行。性别是通过区分次要性特征，如背鳍和肛鳍的大小和形状，如42，47描述确定。
1. 仪器和解决方案准备
- 准备麻醉库存溶液（0.6% 三卡因）。
- 稀释 0.6 克三甲酸酯 （MS-222） 在 100 mL 的 10 倍磷酸盐缓冲盐水 （PBS）.
- 将 1 mL 的 Tricaine 库存溶液分发到多个 1.5 mL 塑料管中，并储存在 -20 °C 下，直至使用。
- 将 18 克 NaCl 加入 2 升水族馆水中，准备回收水（0.9% NaCl 溶液）。将溶液存放在室温下，直到使用。
- 通过对角线打破剃须刀来准备切口工具，以获得一个锐点（图1A）。
- 通过将 25 μL 肝素钠稀释到 1x PBS 的 500 μL 中，准备血液抗凝血溶液（0.05 U/μL 肝素钠）。将抗凝血液存储在 4 °C 下，直到使用。
- 根据制造商的指示，用拔针器（图1B）拉玻璃毛细圈，从90毫米长的玻璃毛细圈中准备两根玻璃针。
注：玻璃针的外径为1毫米，内径为0.6毫米。 - 通过切割盖子来准备一个1.5mL塑料管盖，并制作一个与针外径相符的孔（图1C）。要打孔，加热 9 毫米玻璃毛细孔的一端，并通过盖子刺穿加热的玻璃毛细圈。或者，使用针刺穿盖子，直到孔的直径与 9 毫米玻璃毛细孔相符。
2. 妇科切除术
- 在30mL的水族馆水中稀释一管三甲酸酯（0.6%），准备0.02%的麻醉液。
- 准备解剖工具，包括一个超细和两个细钳（一个有相对宽的尖端），小剪刀，尼龙线和剃须刀，如第1.3步所述。
- 将鱼放入 0.02% 麻醉液中 30-60 秒，使鱼麻醉。
注：麻醉的持续时间取决于鱼的大小和重量，必须加以调整。为了确保鱼完全麻醉，鱼体可以用钳子轻轻捏捏。如果鱼没有反应，就可以开始做腺切除术。 - 从麻醉液中取出鱼，将鱼水平放在其一侧，在解剖显微镜下出水。
- 女性卵巢切除术 （OVX）
- 取出卵卵（挂在女性身体外的卵子），如果有的话，刮切口区域的鳞片（图2A）。
- 使用剃须刀刀片，在肋骨之间、骨盆和鼻鳍之间轻轻切口约2-2.5毫米长（图2A）。然后，轻轻捏鱼腹部，同时用宽尖的细钳一点一点地取出卵巢。
- 使用细钳切开卵巢末端，将卵巢放在一边（图2B）。
注意：如果可能，请注意不要折断卵巢囊。如果卵巢囊破裂，尽可能完全去除任何腺体痕迹，而不留下任何未排卵的卵子。
- 男性兰花切除术
- 轻轻地在肛门上方的肋骨之间切开（图2A），然后用细钳慢慢打开切口。
- 用细钳轻轻抓住睾试，慢慢取出睾试。之后，切开睾片的末端，以完全去除睾测试（图2B）。对于男性兰花切除术，所有制剂都类似于女性，直到切口部分。抓睾考试时，有时会获得类似于睾子的脂肪。然而，在恢复脂肪后，可以尝试再次找到睾试（图2B）。
注：对于男性和女性来说，重要的是尽量减少腹部的切口大小，以防止可能导致死亡的过度损伤。有时肠道也可能通过切口和淋头出现，因此请确保在关闭前将它们正确返回切口内。先前对卵巢和睾睾门在梅达卡腹部的位置的了解是必不可少的。
- 缝合切口同样在男性和女性（图3）。
- 将尼龙线放在切口区旁边，用超细钳子将切口右侧的皮肤刺入内侧腔内，用细钳将线带入（图3：1-2）。
- 通过外体腔从切口左侧刺出皮肤以取出线（图3：3-4）。
- 关闭切口开口，打两个结，切开过多的线（图3：4-6）。
注：缝合线必须足够紧，鱼的剩余线必须足够长，以防止缝合线松动。从麻醉到缝注的整个过程通常需要长达6分钟。更长的时间可能导致死亡。 - 将鱼放入回收水中，并放置至少24小时，然后再将其转移到水族馆系统。
注：果纳切除鱼类通常在回收水中1-2小时后表现出正常行为。因此，根据实验目的，一个人可以在这个时间间隔后对鱼进行采样。
3. 血液采样程序
- 准备工具：玻璃针、硅胶毛细管、带孔的塑料管、空的1.5毫升塑料管、迷你中心和胶带。
- 使用第 2.1 步中描述的 0.02% 麻醉液对鱼进行麻醉，并将鱼置于垂直位置的解剖显微镜下（图 4A）。将鱼放在明亮的表面上，以方便眼花孔穿刺静脉的可视化。
- 将玻璃针连接到硅胶毛细血管上（图4B），安装抽屉。用宽尖钳子打破针尖，通过吸气和吹动将针头内部涂上抗凝固液。
注意：建议使用吸盘和长度至少为 50 厘米的硅胶毛细血管，以采取安全措施，避免吸吸时直接接触血液。此外，确保针尖的开口足够大，以便抽取血液。 - 将针头引向鱼的斑点区域，瞄准静脉（图5A），用嘴抽血，直到至少四分之一的针头总体积被填充（图5B）。
注意：在从鱼体中取出针头之前，必须停止吸气。 - 松开针头，在针尖侧附近放一块胶带。将盖子与一个孔放在收集管上，将针头放在管内，通过孔，针尖放在外侧（图5C）。
- 将鱼放入回收水中，并放置至少24小时，然后再将其转移到水族馆系统。
注：要从同一条鱼进行第二次血液取样，请在第一次血液采样一周后对血液进行取样。 - 闪光旋转收集的血液1-2秒，在室温下1000克收集管内的血液。
- 直接进入下游应用或将血液储存在 -20 °C 下，直到使用。
注： 参考以前的研究性类固醇提取从整个血液48.
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Representative Results
该协议描述了在小尺寸模型远程手术（日本医疗）中执行腺切除术和血液采样的每一步。雌性卵巢切除术（OVX）后鱼类的存活率为100%（10条鱼类中的10条），而94%（18条鱼类中的17条）的雄性在兰花切除术后存活下来。同时，在进行血液采样手术后，所有（38条鱼）都幸存了下来。
沙姆操作的雌性显示卵子（图6A），所有卵子都受精，并允许胚胎发育（图6B）。沙姆经营的雄性也能够受精卵后，只有1-2周。六分之二的半子宫切除术女性在2个月后也表现出100%受精卵的卵巢。相比之下，即使在4个月后，在完全去性化的鱼类中也没有观察到雌性卵子或雄性受精。
如果执行正确，鱼的体型略有变化（图7A），在腺切除术（图7B）后，不应留下任何一块果子酱。同时，4周后的切除术，切口和缝合完全消失（图8），4个月后，所有腺切除鱼仍然表现出健康表型，并没有发现淋瑙组织。
女性E2血液浓度（表1）根据制造商的指示用ELISA测量，显示OVX鱼的E2水平明显低于手术后24小时（p <0.00001）。4个月后，OVX鱼的E2水平也明显低于假操作鱼（p <0.00001），与OVX鱼后24小时（p >0.05）相比没有显著差异。最后，部分OVX鱼，其中只有1/3至1/2的淋巴被移除，显示明显低于假操作鱼（p = 0.0437）和显著高于全OVX鱼（p <0.00001）的E2水平（图9A）。
同样，在雄性（表1）中，兰花切除鱼的11KT浓度明显低于手术后24小时的假手术鱼（p <0.00001）。4个月后兰花切除鱼的11KT水平也明显低于假经营鱼（p <0.00001），与兰花切除后24小时（p >0.05）相比没有差别。最后，部分兰花切除鱼的11KT水平明显低于假经营鱼（p = 0.0428），11KT水平明显高于全兰花切除鱼（p <0.00001）（图9B）。
图1。仪器准备。 （A） 用于淋巴切除术的剃刀刀片，用于抽血的玻璃针，以及（C） 塑料管以及带孔的盖子进行采血。 请单击此处查看此图的较大版本。
图2。切口区域的位置。A） 绘制位于肋骨之间的切口区域，女性（左面板）和男性（右面板）的骨盆和鼻鳍之间的切口区域图纸： B） 女性（左面板）和男性（右面板）的腺切除，白圆显示关节部分，白色箭头显示睾片，黑色箭头显示脂肪。 请单击此处查看此图的较大版本。
图3。缝合程序。 1） 切口右侧使用超细钳子打孔。2） 尼龙线通过皮肤使用孔在1。3） 切口左侧有一个孔。4） 尼龙线通过 3 制成的孔。5） 两次结结以关闭切口。6） 多余的线被切割。 请单击此处查看此图的较大版本。
图4。采血时的鱼的位置（A），安装玻璃针与硅胶毛细血管（B）。请单击此处查看此图的较大版本。
图5。抽血区（A）、抽血（B）和采血步骤（C）。请单击此处查看此图的较大版本。
图6。沙姆经营的鱼显示由白箭头 （A） 和受精卵 （B） 指向的卵子的卵子。请单击此处查看此图的较大版本。
图7。形态学 （A） 和解剖 （B） 外观完好无损和果原切除术的鱼。白箭（顶板）显示手术标记在去角切除鱼。 黑色箭头（底板）显示在完整的鱼的妖精。 请单击此处查看此图的较大版本。
图8。4周后在雄鱼和雌鱼的手术标记。请单击此处查看此图的较大版本。
图9。女性（A）和男性（B）日本美中11KT的E2血水平，假手术（控制）后24小时，部分性腺切除术或淋巴切除术，以及4个月后的淋巴切除术（OVX，女性的卵巢切除术）：卡斯，兰花切除术在男性）。 统计分析是使用单向 ANOVA 进行的，然后是图基 后特克 测试。不同的字母（a-c）显示显著差异（p值<0.05）。图中的数据按平均值 = SD、n = 5 提供。 请单击此处查看此图的较大版本。
| E2 级别（女性） | 11KT 级别（男性） | |
| 沙姆操作 | 4.15 ± 0.5 （n = 5） | 10.38 ± 1.32 （n = 5） |
| 部分去结肠切除术 | 3.37 ± 0.6 （n = 5） | 8.37 ± 1.92 （n = 5） |
| 24h 后腺切除术 | 0.36 ± 0.2 （n = 5） | 0.4 ± 0.2 （n = 5） |
| 子宫切除术后4个月 | 0.54 ± 0.28 （n = 5） | 0.74 ± 0.22 （n = 5） |
表1。E2 和 11-KT 水平 （ng/mL） 在女性和男性的假操作和去纳切除术和部分去纳切除切除的鱼。
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Discussion
如以往文献所报道，在其他模型物种中，长期以来一直使用造血术和血液采样来调查与性别类固醇在BPG轴调节中的作用有关的问题。然而，这些技术似乎只适合更大的动物。考虑到常用的远程模型（日本美田）体积小，我们为该物种的去结肠切除术和血液采样提供了详细的协议。
果子切除术鱼类的成活率达到近100%，表明在麦田上应用果子切除术是可行的。同样，血液采样过程不会影响鱼类的生存能力，如接受此手术后100%的存活率所示。此外，与假操作的雄性一起饲养的假操作雌性卵子和100%受精卵，表明切口和缝合程序不影响鱼类的繁殖。换句话说，它们足够健康，可以产卵。此外，部分去性切除鱼类显示性类固醇的浓度与假操作的鱼相当，在部分去功能化鱼类中观察到一些雌性药物的卵巢化以及雄性受精的卵子。这些结果表明，妇腺切除术的手术应高精度进行，这意味着卵巢或睾肠应完全切除。
如图 8所示，在做结核术后4周，鱼的切口和缝合痕迹完全消失，手术后4个月，鱼还活着，看起来健康。这些表明，操作程序对鱼类长期是安全的，不会影响鱼的寿命。此外，4个月后，没有观察到性腺。这一点通过E2和11-KT的低水平得到证实，这些水平在24小时后仍然与在腺切除鱼类中发现的水平相似。
果纳切除术鱼类的E2和11KT水平明显低于假操作的鱼，在子宫切除术后24小时已经降低，在吞食后4个月取样的鱼类中仍然较低。与控制相比，在戈纳切除鱼类的性别类固醇水平明显降低，在之前的研究中观察到狗鱼37，猫鱼39 和美达卡48。这些一致的证据表明，在协议中描述的腺切除术是一个可靠的技术，以清除循环性类固醇.
由于这种手术不依赖于FADS在40证明，妇科切除术应尽快进行，以防止在手术过程中死亡。事实上，使用FADS能够保持操作的节奏，因为这个工具允许连续麻醉条件的鱼，尽管暴露在空气中。然而，由于它在小远程医疗的可行性较低，使用FADS不能用这种大小的鱼进行。此外，与之前的大鱼的淋除术方案不同，大鱼的切口能够到达果子酱，本手稿中描述的协议不允许宽切口避免对小鱼的过度伤害。因此，在试图使用钳子进入淋瑙以防止鱼体腔内其他组织受损时，应非常小心。
该协议依赖于快速和干净的程序。因此，在达到高成功率之前，强烈建议进行训练，这表现在果纳切除术后鱼类的高存活率以及果子酱的完全去除（见 图7中成功吞食前后鱼类形态和解剖外观的差异）。事实上，许多因素会影响手术的成功率，包括麻醉期、切口的宽度、缝合线的准确性和整洁性以及手术过程中的鱼类处理。另一个重要的一点是，一个人应该准备健康的鱼，通过保持鱼的最佳之前执行协议。
关于血液采样程序，先前的研究曾试图从美达卡48和斑马鱼49，50，51的血液中取样，但该程序不允许在同一条鱼中重复采血，因为血液是在对鱼实施安乐死后采集的。在另一项研究52中，使用斑马鱼进行了反复的血液采样，但我们在美达卡首次报告了这种类型的协议。
性类固醇浓度的评估通常使用酶链接免疫吸附剂检测 （ELISA） 套件进行， 并有许多 ELISA 套件商业可用于不同类型的性类固醇.由于采血时采集的血液量较低，下游检测用于整个血液。先前的研究表明，从全血和血浆53，54中提取的循环类固醇水平的测量水平存在差异。因此，在使用协议进行真正的实验之前，需要验证整个血液和血浆的性别类固醇水平差异。
正如以前对不同动物模型的研究所记录的那样，这里描述的协议将允许使用小尺寸的远程模型来研究与生殖生理学有关的问题。事实上， 这些技术已经有助于回答有关BPG轴及其反馈机制的调节问题，例如吻1（吻肽基因类型1）在正反馈回路55中表达神经元的参与，在细胞核文胎管（NVT）中表达神经元的雌激素介导调节，以及吻2（吻肽基因2型）表达前光区神经元（POA）56， 57，雌激素受体β1（Esr2a）可能参与日本雌鱼58的下调节fsh表达水平，以及雌鱼48中E2的昼夜节律的轮廓。此外，由于以前的研究表明，性类固醇也影响角膜细胞在脑垂体59，60的增殖， 这是耐人寻味的，调查性类固醇清除后，去角质切除术对垂体可塑性的影响.
血液采样技术不仅可用于性类固醇分析，还可用于其他血液含量分析，包括血糖水平。事实上，该协议也可以适用于血糖测量，如斑马鱼52 和美达卡61。因此，这项技术可以扩展，以解决其他生理学领域的研究问题。
最后，这里描述的协议是针对成年日本美田的，结果可能因程序过程中使用的鱼和材料的不同大小而有所不同。此外，由于美达卡左右卵巢/睾鱼融合在一起，这可能为淋除术提供重要优势，因此，在用于斑马鱼等其他物种之前，可能需要进行一些适应。因此，在测试这些协议之前，应考虑根据实验室设备和鱼的大小进行优化。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
作者感谢卢尔德·卡伦·谭女士在养鱼方面给予的帮助。这项工作由NMBU、日本科学促进会（JSPS）的助学金（赠款编号18H04881和18K19323）资助，并资助住友基金会至S.K.的基础科学研究项目。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass capilary | GD1 | Glass Capillary with Filament GD-1; Narishige | |
| Heparin sodium salt | H4784-1G | Sigma-aldrich | |
| Needle puller | P97 | Flaming/Brown Micropipette puller Model P-97; Sutter Instrument | |
| Nylon thread | N45VL | Polyamide suture, 0.2 metric; Crownjun | |
| Plastic tube | T9661 | Eppendorf Safe-lock microcentifuge tube 1.5 ml, Sigma-aldrich | |
| Razor blade | - | Astra Superior Platinum Double Edge Razor Blades Green, salonwholesale.com | |
| Silicone capillary | a16090800ux0403 | Uxcell Silicone Tube 1 mm ID x 2 mm OD, amazon.com | |
| Tricaine | WXBC9102V | Aldrich chemistry |
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