Summary
Het artikel beschrijft een snel protocol om bloed van de kleine teleostvis te gonadectomiseren en te bemonsteren, met behulp van Japanse medaka (Oryzias latipes) als model, om de rol van geslachtssteroïden in de dierfysiologie te onderzoeken.
Abstract
Geslachtssteroïden, geproduceerd door de geslachtsdelen, spelen een essentiële rol in de plasticiteit van hersenen en hypofyseweefsel en in de neuro-endocriene controle van de voortplanting bij alle gewervelde dieren door feedback te geven aan de hersenen en hypofyse. Teleostvissen bezitten een hogere mate van weefselplasticiteit en variatie in voortplantingsstrategieën in vergelijking met zoogdieren en lijken nuttige modellen te zijn om de rol van geslachtssteroïden en de mechanismen waarmee ze werken te onderzoeken. De verwijdering van de belangrijkste bron van de productie van geslachtssteroïden met behulp van gonadectomie samen met bloedafname om steroïde niveaus te meten, is goed ingeburgerd en redelijk haalbaar bij grotere vissen en is een krachtige techniek om de rol en effecten van geslachtssteroïden te onderzoeken. Deze technieken brengen echter uitdagingen met zich mee wanneer ze worden geïmplementeerd in kleine teleostmodellen. Hier beschrijven we de stapsgewijze procedures van gonadectomie bij zowel mannelijke als vrouwelijke Japanse medaka gevolgd door bloedafname. Deze protocollen blijken zeer haalbaar te zijn in medaka, aangegeven door een hoge overlevingskans, veiligheid voor de levensduur en het fenotype van de vis en reproduceerbaarheid in termen van klaring van geslachtssteroïden. Het gebruik van deze procedures in combinatie met de andere voordelen van het gebruik van dit kleine teleost-model zal het begrip van feedbackmechanismen in de neuro-endocriene controle van reproductie en weefselplasticiteit door geslachtssteroïden bij gewervelde dieren aanzienlijk verbeteren.
Introduction
Bij gewervelde dieren spelen geslachtssteroïden, die voornamelijk worden geproduceerd door de geslachtsnaden, een belangrijke rol bij de regulatie van de Brain-Pituitary-Gonadal (BPG) -as via verschillende feedbackmechanismen1,2,3,4,5. Bovendien beïnvloeden geslachtssteroïden de proliferatie en activiteit van neuronen in de hersenen6,7,8 en endocriene cellen, waaronder gonadotropen, in de hypofyse9,10, en dienen dus cruciale rollen in de hersenen en hypofyse plasticiteit. Ondanks relatief goede kennis bij zoogdieren, is het mechanisme van BPG-asregulatie gemedieerd door geslachtssteroïden verre van begrepen bij niet-zoogdiersoorten, wat leidt tot een slecht begrip van evolutionaire geconserveerde principes11. Er is nog steeds een beperkt aantal studies die de rol van geslachtssteroïden op de hersenen en hypofyseplasticiteit documenteren, waardoor de behoefte aan verder onderzoek naar de rol en effecten van geslachtssteroïden op verschillende gewervelde soorten toeneemt.
Onder gewervelde dieren zijn teleosten krachtige modeldieren geworden bij het aanpakken van tal van biologische en fysiologische vragen, waaronder stressrespons12,13,groei14,15,voedingsfysiologie16,17 en reproductie2. Teleosts, waarin geslachtssteroïden meestal worden vertegenwoordigd door estradiol (E2) bij vrouwen en 11-ketotestosteron (11-KT) bij mannen18,19, zijn al lang betrouwbare experimentele modellen voor het onderzoeken van het algemene principe van reproductie tussen soorten. Teleosts vertonen uniciteit in hun hypothalamus-hypofyseverbinding20,21 en verschillende gonadotroopcellen22, die soms handig zijn voor de opheldering van regulerende mechanismen. Bovendien bieden teleosts vanwege hun vatbaarheid voor zowel laboratorium- als veldexperimenten veel voordelen in vergelijking met andere organismen. Ze zijn relatief goedkoop in aanschaf en onderhoud23,24. Met name kleine teleostmodellen zoals zebravissen(Danio rerio)en de Japanse medaka(Oryzias latipes),zijn soorten met een zeer hoge vruchtbaarheid en een relatief korte levenscyclus die een snelle analyse van genfunctie en ziektemechanismen mogelijk maken23, waardoor nog grotere voordelen worden geboden bij het aanpakken van een overvloed aan biologische en fysiologische vragen, gezien de vele goed ontwikkelde protocollen en genetische toolkit die beschikbaar zijn voor deze soorten25.
In talrijke studies is de verwijdering van geslachtsdia (gonadectomie) samen met bloedafnametechnieken gebruikt als een methode voor het onderzoeken van vele fysiologische vragen, waaronder de impact ervan op de voortplantingsfysiologie van gewervelde dieren bij zoogdieren26,27,28,vogels29 en amfibieën30. Hoewel het gonadectomie-effect op de voortplantingsfysiologie alternatief kan worden nagebootst door geslachtssteroïdantagonisten, zoals tamoxifen en clomifeen, lijkt het effect van de geneesmiddelen inconsistent te zijn vanwege bimodale effecten31,32. Chronische blootstelling aan een geslachtssteroïdantagonist kan leiden tot ovariëlevergroting 33,34, die de observatie van de effecten ervan voor langetermijndoeleinden kan uitschakelen als gevolg van een ongezond fenotype. Bovendien is het onmogelijk om een herstelexperiment uit te voeren na behandeling met geslachtssteroïdantagonisten, om het specifieke effect van bepaalde geslachtssteroïden te rechtvaardigen. Samen met die bovengenoemde punten, andere trade-offs van geslacht steroïde antagonist gebruik zijn uitgebreid beoordeeld31,32. Daarom verschijnt gonadectomie vandaag de dag nog steeds als een krachtige techniek om de rol van geslachtssteroïden te onderzoeken.
Hoewel gonadectomie en bloedafnametechnieken relatief eenvoudig uit te voeren zijn bij grotere soorten, zoals Europese zeebaars (Dicentrarchus labrax)35, blauwkoplipvis (Thalassoma bifasciatum)36, hondshaai (Scyliorhinus canicula)37 en meerval (Heteropneustes fossilis en Clarias bathracus)38,39, roepen ze uitdagingen op wanneer ze worden toegepast in kleine vissen als medaka. Het gebruik van Fish Anesthesia Delivery System (FADS)40 is bijvoorbeeld minder haalbaar en lijkt gevoelig te zijn voor overmatige fysieke schade voor kleine vissen. Bovendien is een gonadectomieprocedure die vaak wordt gebruikt voor grotere vissen40 niet geschikt voor kleine vissen die een hoge precisie vereisen om overmatige schade te voorkomen. Ten slotte is bloedafname een uitdaging vanwege de beperkte toegang tot bloedvaten en de kleine hoeveelheid bloed bij die dieren. Daarom is een duidelijk protocol dat elke stap van gonadectomie en bloedafname in een kleine teleost demonstreert van belang.
Dit protocol demonstreert de stapsgewijze procedures van gonadectomie gevolgd door bloedafname in Japanse medaka, een kleine zoetwatervis afkomstig uit Oost-Azië. Japanse medaka hebben een gesequenced genoom, verschillende moleculaire en genetische hulpmiddelen beschikbaar25, en een genetisch geslachtsbepalingssysteem dat onderzoek naar seksuele verschillen mogelijk maakt voordat secundaire geslachtskenmerken of geslachtsvolgen goed ontwikkeld zijn41. Interessant is dat Japanse medaka gefuseerde gonaden bezitten in tegenstelling tot veel andere teleostsoorten42. Deze twee technieken gecombineerd duren in totaal slechts 8 minuten en zullen de lijst met videoprotocollen die al voor deze soort bestaan, compleet maken, waaronder etikettering van bloedvaten43,patch-clamp op hypofysesecties44 en hersenneuronen45en primaire celcultuur46. Deze technieken zullen de onderzoeksgemeenschap in staat stellen om de rollen van geslachtssteroïden in feedbackmechanismen en hersen- en hypofyseplasticiteit in de toekomst te onderzoeken en beter te begrijpen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle experimenten en dierbehandeling werden uitgevoerd in overeenstemming met de aanbevelingen over het experimentele dierenwelzijn aan de Noorse Universiteit voor Levenswetenschappen. Experimenten met gonadectomie werden goedgekeurd door de Noorse Autoriteit voor voedselveiligheid (FOTS ID 24305).
OPMERKING: De experimenten werden uitgevoerd met volwassen mannelijke en vrouwelijke (6-7 maanden oud, gewicht ca. 0,35 g, lengte ca. 2,7 cm) Japanse medaka. Het geslacht werd bepaald door onderscheid te maken tussen de secundaire geslachtskenmerken, zoals de grootte en vorm van de rug- en anale vin, zoals beschreven in42,47.
1. Voorbereiding van instrumenten en oplossingen
- Bereid een verdovingsoplossing (0,6% Tricaïne).
- Verdun 0,6 g Tricaïne (MS-222) in 100 ml 10x fosfaatbuffersaline (PBS).
- Verdeel 1 ml van de Tricaine-stamoplossing in verschillende plastic buisjes van 1,5 ml en bewaar bij -20 °C tot gebruik.
- Bereid herstelwater (0,9% NaCl-oplossing) voor door 18 g NaCl toe te voegen aan 2 L aquariumwater. Bewaar de oplossing bij kamertemperatuur tot gebruik.
- Bereid de incisiegereedschappen voor door een scheermes diagonaal te breken om een scherpe punt te krijgen (figuur 1A).
- Bereid bloedwerende antistollingsoplossing (0,05 E/μL natriumheparine) door 25 μL natriumheparine te verdunnen tot 500 μL 1x PBS. Bewaar de antistollingsoplossing bij 4 °C tot gebruik.
- Bereid twee glazen naalden van een 90 mm lang glazen capillair door met een naaldentrekker (figuur 1B) aan een glazen capillair te trekken volgens de instructies van de fabrikant.
OPMERKING: De buitendiameter van de glasnaald is 1 mm, terwijl de binnendiameter 0,6 mm is. - Bereid een plastic buisdeksel van 1,5 ml voor door het deksel te snijden en maak een gat dat past bij de buitendiameter van de naald(figuur 1C). Om het gat te maken, verwarmt u het ene uiteinde van het 9 mm glazen capillair en steekt u het verwarmde glazen capillair door het deksel. U kunt ook een naald gebruiken om door het deksel te steken totdat de diameter van het gat past bij het glazen capillair van 9 mm.
2. Gonadectomie procedure
- Bereid 0,02% van de anesthetische oplossing door één buis Tricaine-bouillon (0,6%) te verdunken in 30 ml aquariumwater.
- Bereid snijgereedschap voor, waaronder een ultrafijne en twee fijne tangen (een met relatief brede punt), een kleine schaar, nylondraad en scheermes zoals beschreven in stap 1.3.
- Verdoof de vis door hem gedurende 30-60 seconden in de 0,02% anesthetische oplossing te doen.
OPMERKING: De duur van de anesthesie hangt af van de grootte en het gewicht van de vis en moet worden aangepast. Om ervoor te zorgen dat de vis volledig wordt verdoofd, kan het vislichaam voorzichtig worden geknepen met een tang. Als de vis niet reageert, kan de gonadectomie worden gestart. - Haal de vis uit de verdovingsoplossing en plaats de vis horizontaal op zijn zij, buiten het water onder een dissectiemicroscoop.
- Ovariëctomie (OVX) bij vrouwen
- Verwijder eventuele eicellen (eieren die buiten het vrouwelijk lichaam hangen) en schraap de schubben in het incisiegebied(figuur 2A).
- Maak voorzichtig een incisie van ongeveer 2-2,5 mm lang tussen de ribben, tussen het bekken en de anale vinnen (figuur 2A), met behulp van het scheermesje. Knijp vervolgens zachtjes in de buik van de vis terwijl je de eierstokken beetje bij beetje verwijdert met behulp van een fijne tang met brede punt.
- Snijd het uiteinde van de eierstokken af met een fijne tang en leg de eierstokken opzij(figuur 2B).
OPMERKING: Zorg ervoor dat u de eierstokzak indien mogelijk niet breekt. Als de eierstokzak is gebroken, verwijder dan alle gonadesporen zo volledig mogelijk zonder zelfs niet-geovuleerde eieren achter te laten.
- Orchidectomie bij mannen
- Maak voorzichtig een incisie tussen de ribben boven de anus (figuur 2A) en open de incisie langzaam met een fijne tang.
- Pak de teelballen voorzichtig vast met de fijne tang en haal de teelballen er langzaam uit. Snijd daarna het uiteinde van de teelballen om de teelballen volledig te verwijderen(figuur 2B). Voor mannelijke orchidectomie zijn alle preparaten vergelijkbaar met bij vrouwen tot het incisiegedeelte. Bij het grijpen van de teelballen wordt soms het vet verkregen dat op de teelballen lijkt. Na het herstellen van het vet is het echter mogelijk om te proberen de teelballen opnieuw te vinden(figuur 2B).
OPMERKING: Voor zowel mannen als vrouwen is het belangrijk om de incisiegrootte in de buik te minimaliseren om overmatige schade te voorkomen die tot sterfte kan leiden. Soms kunnen de darmen ook verschijnen via de incisie samen met de gonaden, dus zorg ervoor dat ze goed worden teruggebracht in de incisie voordat ze worden gesloten. Voorkennis over de locatie van eierstokken en teelballen in de buik van Medaka is essentieel.
- Hecht de incisie op dezelfde manier bij mannen en vrouwen(figuur 3).
- Plaats de nylondraad naast het incisiegebied en steek de huid vanaf de rechterkant van de incisie door de binnenste lichaamsholte met behulp van een ultrafijne tang om de draad met een fijne tang in te nemen (Figuur 3; 1-2).
- Steek de huid vanaf de linkerkant van de incisie door de buitenste lichaamsholte om de draad eruit te halen ( Figuur 3; 3-4).
- Sluit de incisieopening en maak twee knopen en knip de overtollige draad door(figuur 3;4-6).
OPMERKING: De hechtdraad moet voldoende strak zijn en de resterende draad op de vis moet lang genoeg zijn om losraken van de hechtdraad te voorkomen. De hele procedure van anesthesie tot hechten duurt meestal tot 6 minuten. Langere tijd kan leiden tot sterfte. - Zet de vissen in het herstelwater en laat ze minstens 24 uur staan voordat je ze overbrengt naar het aquariumsysteem.
OPMERKING: Gonadectomized vissen vertonen meestal normaal gedrag na 1-2 uur in het herstelwater. Daarom kan men, afhankelijk van het doel van het experiment, de vis na dit tijdsinterval bemonsteren.
3. Bloedafnameprocedure
- Bereid de gereedschappen voor: een glazen naald, een siliconen capillair, een plastic buis met een gat, een lege plastic buis van 1,5 ml, een minicentrifuge en tape.
- Verdoof de vis met 0,02% anesthesieoplossing zoals beschreven in stap 2.1 en plaats de vis onder een dissectiemicroscoop in verticale positie (figuur 4A). Plaats de vis op een helder oppervlak om de visualisatie van de caudale punctieader te vergemakkelijken.
- Installeer de bloedlade door een glazen naald aan het siliconen capillair te bevestigen(figuur 4B). Breek de punt van de naald met een brede top en bedek de binnenkant van de naald met een antistollingsoplossing door te zuigen en te blazen.
OPMERKING: Het gebruik van een zuignap en een siliconen capillair met een lengte van ten minste 50 cm worden aanbevolen voor veiligheidsmaatregelen om direct contact van het bloed tijdens het zuigen te voorkomen. Zorg er bovendien voor dat de opening van de naaldpunt voldoende groot is om het bloed te kunnen trekken. - Richt de naald naar het steelgebied van de vis, richt op de caudale steelader (figuur 5A) en trek het bloed met behulp van de mond totdat ten minste een vierde van het totale volume van de naald is gevuld (figuur 5B).
OPMERKING: Het is belangrijk om te stoppen met zuigen voordat u de naald uit het lichaam van de vis verwijdert. - Laat de naald los en plaats een stuk tape op de nabijheid van de scherpe kant van de naald. Plaats het deksel met een gat op een opvangbuis en steek de naald in de buis door het gat met de naaldpunt aan de buitenkant (figuur 5C).
- Zet de vissen in het herstelwater en laat ze minstens 24 uur staan voordat je ze overbrengt naar het aquariumsysteem.
OPMERKING: Om een tweede bloedafname van dezelfde vis uit te voeren, bemonstert u het bloed een week na de eerste bloedafname. - Flash draai het verzamelde bloed gedurende 1-2 seconden met 1.000 x g bij kamertemperatuur om het bloed in de buis te verzamelen.
- Ga direct naar downstream-toepassingen of bewaar het bloed bij -20 °C tot gebruik.
OPMERKING: Raadpleeg de vorige studie voor geslachtssteroïdextractie uit het volbloed48.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dit protocol beschrijft elke stap voor het uitvoeren van gonadectomie en bloedafname in een klein formaat model teleost, de Japanse medaka. De overlevingskans van de vis na ovariëctomie (OVX) bij vrouwtjes is 100% (10 van de 10 vissen), terwijl 94% (17 van de 18 vissen) van de mannetjes overleefde na orchidectomie. Ondertussen, nadat de bloedafnameprocedure was uitgevoerd, overleefden alle (38 vissen) vissen.
Schijngeopereerde vrouwtjes vertonen ovipositie (figuur 6A) en alle eieren werden bevrucht en zorgden voor embryonale ontwikkeling (figuur 6B). Sham-geopereerde mannetjes waren ook in staat om eieren te bevruchten na slechts 1-2 weken. Twee van de zes gedeeltelijk gonadectomized vrouwtjes gefokt met gedeeltelijk gonadectomized mannetjes vertoonden ook ovipositie met 100% van de bevruchte eieren na 2 maanden. Daarentegen werd geen ovipositie bij vrouwtjes of bevruchting door mannetjes waargenomen bij volledig gonadectomized vissen, zelfs niet na 4 maanden.
Bij correcte uitvoer verandert de lichaamsvorm van de vis enigszins(figuur 7A)en mag er geen stuk gonade achterblijven na de gonadectomieprocedure(figuur 7B). Ondertussen, 4 weken na gonadectomie, verdwenen de incisie en hechting volledig (figuur 8), en na 4 maanden vertoonden alle gonadectomized vissen nog steeds een gezond fenotype en werd er geen gonadaal weefsel gevonden.
E2-bloedconcentraties bij vrouwen(tabel 1),gemeten met ELISA volgens de instructies van de fabrikant, toonden aan dat het E2-niveau in OVX-vissen significant lager is dan in sham-geopereerde vissen 24 uur na de operatie(p < 0,00001). Na 4 maanden is het E2-niveau in OVX-vissen ook aanzienlijk lager dan bij sham-operated fish(p < 0,00001) en vertoont geen significant verschil met dat in 24 uur na OVX-vissen(p > 0,05). Ten slotte vertonen gedeeltelijk OVX-vissen, waarbij slechts 1/3 tot 1/2 van de gonade werd verwijderd, significant lagere E2-niveaus dan schijnvissen (p = 0,0437) en significant hogere E2-niveaus dan volledig OVX-vissen (p < 0,00001) (figuur 9A).
Evenzo bij mannen(tabel 1)is de 11-KT-concentratie in orchidectomievissen significant lager dan bij schijnvissen 24 uur na de operatie(p < 0,00001). Het niveau van 11-KT in orchidectomie vissen na 4 maanden is ook significant lager dan bij sham-geopereerde vissen(p < 0,00001) en vertoont geen verschil in vergelijking met 24 uur post-orchidectomie vissen(p > 0,05). Ten slotte vertonen gedeeltelijk orchidectomievissen significant lagere niveaus van 11-KT dan schijnvissen(p = 0,0428) en significant hogere niveaus van 11-KT dan volledig orchideectomievissen(p < 0,00001) (Figuur 9B).
Figuur 1. Instrument voorbereiding. (A) Scheermesje voor gonadectomie, (B) glazen naald voor bloedextractie, en (C) een plastic buis samen met een deksel met een gat voor bloedafname. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Locatie van het incisiegebied. A) Tekening van het incisiegebied tussen de ribben, tussen het bekken en de anale vinnen bij vrouwen (linkerpaneel) en mannetjes (rechterpaneel); B) gonadeverwijdering bij vrouwtjes (linkerpaneel) en mannetjes (rechterpaneel), witte cirkels met het gewrichtsgedeelte, witte pijl met de testis en zwarte pijl met het vet. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. De procedure van hechting. 1) Aan de rechterkant van de incisie wordt een gat gemaakt met behulp van een ultrafijne tang. 2) De nylondraad wordt door de huid geleid met behulp van het gat gemaakt in 1. 3) Er wordt een gat gemaakt in de linkerkant van de incisie. 4) De nylondraad wordt door het gat in 3 geleid. 5) Een overhandse knoop wordt twee keer gemaakt om de incisie te sluiten. 6) Overtollige draad wordt gesneden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4. Vispositie tijdens bloedafname (A), de installatie van glazen naald met het siliconencapillair (B). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5. Het zuiggebied van bloedafname (A), getrokken bloed (B) en bloedafnamestappen (C). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6. Sham-geopereerde vissen tonen ovipositie van eieren gericht door witte pijl (A) en bevruchte eieren (B). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 7. Morfologisch (A) en anatomisch (B) uiterlijk van intacte en gonadectomized vissen. Witte pijlen (bovenste panelen) tonen het operatiemerk op gonadectomized vissen. Zwarte pijlen (onderste panelen) tonen gonaden in intacte vissen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 8. Operatiemarkeringen bij mannelijke en vrouwelijke vissen na 4 weken. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 9. Bloedspiegels van E2 bij vrouwen (A) en 11-KT bij mannelijke (B) Japanse medaka, 24 uur na schijnoperatie (controle), gedeeltelijk gonadectomie of gonadectomie en 4 maanden na gonadectomie (OVX, ovariëctomie bij vrouwen; Cas, orchidectomie bij mannen). De statistische analyses werden uitgevoerd met behulp van One Way ANOVA gevolgd door Tukey Post Hoc test. Verschillende letters (a-c) vertonen significante verschillen(p-waarde< 0,05). Gegevens in de grafiek worden weergegeven als gemiddelde + SD, n = 5. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| E2 niveaus (Vrouwen) | 11-KT niveaus (Mannen) | |
| Sham-bediend | 4,15 ± 0,5 (n = 5) | 10,38 ± 1,32 (n = 5) |
| Gedeeltelijk gonadectomized | 3,37 ± 0,6 (n = 5) | 8,37 ± 1,92 (n = 5) |
| 24-uurs post-gonadectomie | 0,36 ± 0,2 (n = 5) | 0,4 ± 0,2 (n = 5) |
| 4 maanden na gonadectomie | 0,54 ± 0,28 (n = 5) | 0,74 ± 0,22 (n = 5) |
Tabel 1. E2- en 11-KT-niveaus (ng / ml) bij vrouwtjes en mannetjes van sham-geopereerde en gonadectomized en gedeeltelijk gonadectomized vissen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Zoals gemeld in eerdere literatuur, zijn gonadectomie en bloedafname al lang gebruikt in andere modelsoorten om vragen te onderzoeken met betrekking tot de rol van geslachtssteroïden in de regulatie van de BPG-as. Deze technieken lijken echter alleen geschikt te zijn voor grotere dieren. Gezien de kleine omvang van het veelgebruikte teleostmodel, Japanse medaka, bieden we een gedetailleerd protocol voor gonadectomie en bloedafname dat haalbaar is voor deze soort.
Het feit dat de overlevingskans van gonadectomized vissen bijna 100% bereikte, geeft aan dat de gonadectomieprocedure haalbaar is om op medaka te worden toegepast. Evenzo heeft de procedure van bloedafname geen invloed op de overlevingskansen van de vis, zoals blijkt uit de 100% overlevingskans na het ondergaan van deze procedure. Bovendien vertonen schijngeopereerde vrouwtjes die samen met sham-geopereerde mannetjes worden grootgebracht ovipositie en 100% bevruchte eieren, wat aangeeft dat de incisie- en hechtingsprocedure de reproductie van de vis niet beïnvloeden. Met andere woorden, ze waren gezond genoeg om te paaien. Bovendien vertonen gedeeltelijk gonadectomized vissen vergelijkbare concentraties van geslachtssteroïden als sham-geopereerde vissen, en ovipositie bij sommige vrouwtjes en bevruchting van eieren door mannetjes werden waargenomen bij die gedeeltelijk gonadectomized vissen. Deze resultaten suggereren dat de procedure van gonadectomie met hoge precisie moet worden uitgevoerd, wat betekent dat de eierstokken of teelballen volledig moeten worden verwijderd.
Zoals te zien is in figuur 8,zijn de incisie en hechtingsmarkering op de vis 4 weken na gonadectomie volledig verdwenen en de vissen leven nog steeds en zien er 4 maanden na de operatie gezond uit. Deze geven aan dat de operatieprocedure veilig is voor de vis voor langetermijndoeleinden en geen invloed heeft op de levensduur van de vis. Bovendien werden er na 4 maanden geen gonaden waargenomen. Dit wordt bevestigd door de lage niveaus van E2 en 11-KT die na 24 uur nog steeds vergelijkbaar zijn met die in gonadectomized vissen.
De niveaus van E2 en 11-KT in gonadectomized vissen zijn aanzienlijk lager dan sham-geopereerde vissen, al na 24 uur na gonadectomie en blijven lager bij vissen die 4 maanden na gonadectomie zijn bemonsterd. De significant lagere geslachtssteroïdenspiegels in gonadectomized vis in vergelijking met controle zijn waargenomen in eerdere studies bij hondshaai37,meerval39 en medaka48. Deze consistente bewijzen suggereren dat de gonadectomieprocedure beschreven in het protocol een betrouwbare techniek is om circulerende geslachtssteroïden te wissen.
Aangezien deze procedure niet afhankelijk is van FADS zoals aangetoond in40, moet de gonadectomie zo snel mogelijk worden uitgevoerd om sterfte tijdens de operatie te voorkomen. Inderdaad, het gebruik van FADS maakt het mogelijk om het werkingsritme te behouden, omdat deze tool een continue verdovingsconditie voor de vis mogelijk maakt ondanks dat hij aan de lucht wordt blootgesteld. Niettemin, vanwege de lagere haalbaarheid in de kleine teleost als medaka, kan het gebruik van FADS niet worden uitgevoerd met die grootte van vissen. Bovendien, in tegenstelling tot het vorige gonadectomieprotocol bij grotere vissen dat brede incisie mogelijk maakt om de gonade te bereiken, staat het protocol dat in dit manuscript wordt beschreven geen brede incisie toe om overmatige schade aan de kleine vis te voorkomen. Daarom moet men heel voorzichtig zijn bij het proberen toegang te krijgen tot de gonade met behulp van een tang om schade in andere weefsels in de lichaamsholte van de vis te voorkomen.
Het protocol is gebaseerd op een snelle en schone procedure. Training wordt daarom ten zeerste aanbevolen tot het bereiken van een hoog slagingspercentage, aangegeven door een hoge overlevingskans van de vis na gonadectomie en de volledige verwijdering van de gonaden (zie het verschil in morfologische en anatomische verschijning van de vis voor en na succesvolle gonadectomie in figuur 7). In feite kunnen veel factoren het succespercentage van de procedure beïnvloeden, waaronder de anesthesieperiode, de breedte van de incisie, de nauwkeurigheid en netheid van de hechting en visbehandeling tijdens de procedure. Een ander belangrijk punt is dat men gezonde vissen moet bereiden door de vis optimaal te onderhouden voordat het protocol wordt uitgevoerd.
Met betrekking tot de bloedafnameprocedure hebben de eerdere studies geprobeerd het bloed van medaka48 en zebravis49,50, 51te bemonsteren, maar de procedure staat geen herhaalde bloedafname in dezelfde vis toe, omdat het bloed wordt afgenomen na het euthanaseren van de vis. Herhaalde bloedafname is aangetoond met behulp van zebravis in een andere studie52, maar we rapporteren dit type protocol voor het eerst in medaka.
De evaluatie van geslachtssteroïdconcentraties wordt vaak uitgevoerd met behulp van een enzymgebonden immunosorbent assay (ELISA) -kit en er zijn veel ELISA-kits in de handel verkrijgbaar voor verschillende soorten geslachtssteroïden. Vanwege de lage hoeveelheid bloed die tijdens de bloedafname wordt verzameld, zijn de stroomafwaartse testen bedoeld voor het volbloed. Eerdere studies hebben aangetoond dat er een verschil is in het gemeten niveau van circulerende steroïde niveaus geëxtraheerd uit volbloed en plasma53,54. Daarom moet het verschil in de geslachtssteroïdenspiegels van volbloed en plasma worden gevalideerd voordat het echte experiment met behulp van het protocol wordt uitgevoerd.
Zoals gedocumenteerd in eerdere studies met verschillende diermodellen, zal het hier beschreven protocol het mogelijk maken om vragen met betrekking tot reproductieve fysiologie te onderzoeken met behulp van een klein formaat teleost als model. In feite hebben deze technieken al bijgedragen aan het beantwoorden van vragen over de regulatie van de BPG-as en zijn feedbackmechanismen, zoals de betrokkenheid van kiss1 (kisspeptin-gen type 1) die neuronen tot expressie brengen in positieve feedbacklussen55, oestrogeen-gemedieerde regulatie van kiss1 tot expressie brengende neuronen in nucleus ventralis tuberis (NVT) en kiss2 (kisspeptin-gen type 2) die neuronen tot expressie brengen in preoptisch gebied (POA)56, 57, de mogelijke betrokkenheid van oestrogeenreceptor β1 (Esr2a) bij het downregulerende fsh-expressieniveau bij vrouwelijke Japanse medaka58 en het profiel van het circadiane ritme van E2 bij vrouwelijke vissen48. Bovendien, aangezien eerdere studies hebben aangetoond dat geslachtssteroïden ook de proliferatie van gonadotrope cellen in de hypofyse van teleosts59,60beïnvloeden, is het intrigerend om de effecten van geslachtssteroïdklaring na gonadectomie op hypofyseplasticiteit te onderzoeken.
De bloedafnametechniek kan niet alleen worden gebruikt voor geslachtssteroïdenanalyse, maar ook voor andere bloedgehalteanalyses, waaronder bloedglucosewaarden. Inderdaad, het protocol kan ook worden toegepast voor bloedglucosemetingen zoals aangetoond in zebravis52 en medaka61. Daarom kan deze techniek worden uitgebreid om onderzoeksvragen op andere gebieden van de fysiologie aan te pakken.
Ten slotte zijn de hier beschreven protocollen bedoeld en geoptimaliseerd voor volwassen Japanse medaka, en de resultaten als gevolg van verschillende grootte van vissen en materialen die tijdens de procedures worden gebruikt, kunnen variëren. Bovendien, omdat medaka linker en rechter eierstokken / teelballen zijn gefuseerd, wat een belangrijk voordeel kan bieden voor gonadectomie, kan dit protocol verschillende aanpassingen nodig hebben voordat het wordt gebruikt in andere soorten waar dit niet het geval is, zoals bij zebravissen. Er moet dus rekening worden gehouden met een optimalisatie op basis van de keuze van laboratoriumapparatuur en visgrootte voordat deze protocollen worden getest.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs danken mevrouw Lourdes Carreon G Tan voor haar hulp in de visteelt. Dit werk werd gefinancierd door NMBU, Grants-in-Aid van de Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) (Grant nummer 18H04881 en 18K19323), en subsidie voor Basic Science Research Projects van Sumitomo Foundation naar S.K.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass capilary | GD1 | Glass Capillary with Filament GD-1; Narishige | |
| Heparin sodium salt | H4784-1G | Sigma-aldrich | |
| Needle puller | P97 | Flaming/Brown Micropipette puller Model P-97; Sutter Instrument | |
| Nylon thread | N45VL | Polyamide suture, 0.2 metric; Crownjun | |
| Plastic tube | T9661 | Eppendorf Safe-lock microcentifuge tube 1.5 ml, Sigma-aldrich | |
| Razor blade | - | Astra Superior Platinum Double Edge Razor Blades Green, salonwholesale.com | |
| Silicone capillary | a16090800ux0403 | Uxcell Silicone Tube 1 mm ID x 2 mm OD, amazon.com | |
| Tricaine | WXBC9102V | Aldrich chemistry |
References
- Weltzien, F. -A., Andersson, E., Andersen, Ø, Shalchian-Tabrizi, K., Norberg, B. The brain-pituitary-gonad axis in male teleosts, with special emphasis on flatfish (Pleuronectiformes). Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Molecular & Integrative Physiology. 137 (3), 447-477 (2004).
- Yaron, Z., Levavi-Sivan, B. Encyclopedia of Fish Physiology. Farrell, A. P. 2, Academic Press. 1500-1508 (2011).
- Goldman, B. D. The circadian timing system and reproduction in mammals. Steroids. 64 (9), 679-685 (1999).
- Taranger, G. L., et al.
- Messinis, I. E. Ovarian feedback, mechanism of action and possible clinical implications. Human Reproduction Update. 12 (5), 557-571 (2006).
- Diotel, N., et al. The brain of teleost fish, a source, and a target of sexual steroids. Frontiers in Neuroscience. 5, 137 (2011).
- Diotel, N., et al. Steroid Transport, Local Synthesis, and Signaling within the Brain: Roles in Neurogenesis, Neuroprotection, and Sexual Behaviors. Frontiers in Neuroscience. 12, 84 (2018).
- Larson, T. A. Sex Steroids, Adult Neurogenesis, and Inflammation in CNS Homeostasis, Degeneration, and Repair. Frontiers in Endocrinology. 9, 205 (2018).
- Fontaine, R., et al. Gonadotrope plasticity at cellular, population and structural levels: A comparison between fishes and mammals. General and Comparative Endocrinology. 287, 113344 (2020).
- Fontaine, R., Royan, M. R., von Krogh, K., Weltzien, F. -A., Baker, D. M. Direct and indirect effects of sex steroids on gonadotrope cell plasticity in the teleost fish pituitary. Frontiers in Endocrinology. , (2020).
- Kanda, S. Evolution of the regulatory mechanisms for the hypothalamic-pituitary-gonadal axis in vertebrates-hypothesis from a comparative view. General and Comparative Endocrinology. 284, 113075 (2019).
- Schreck, C. B. Stress and fish reproduction: The roles of allostasis and hormesis. General and Comparative Endocrinology. 165 (3), 549-556 (2010).
- Wendelaar Bonga, S. E.
- Mommsen, T. P.
- Won, E., Borski, R. Endocrine Regulation of Compensatory Growth in Fish. Front. Endocrinol. 4, 74 (2013).
- MacKenzie, D. S., VanPutte, C. M., Leiner, K. A. Nutrient regulation of endocrine function in fish. Aquaculture. 161 (1), 3-25 (1998).
- Rønnestad, I., Thorsen, A., Finn, R. N. Fish larval nutrition: a review of recent advances in the roles of amino acids. Aquaculture. 177 (1), 201-216 (1999).
- Borg, B.
- Rege, J., et al. Circulating 11-oxygenated androgens across species. The Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology. 190, 242-249 (2019).
- Blázquez, M., Bosma, P. T., Fraser, E. J., Van Look, K. J. W., Trudeau, V. L. Fish as models for the neuroendocrine regulation of reproduction and growth. Comparative Biochemistry and Physiology Part C: Pharmacology, Toxicology and Endocrinology. 119 (3), 345-364 (1998).
- Zambrano, D.
- Weltzien, F. -A., Hildahl, J., Hodne, K., Okubo, K., Haug, T. M. Embryonic development of gonadotrope cells and gonadotropic hormones - Lessons from model fish. Molecular and Cellular Endocrinology. 385 (1), 18-27 (2014).
- Harris, M. P., Henke, K., Hawkins, M. B., Witten, P. E. Fish is Fish: the use of experimental model species to reveal causes of skeletal diversity in evolution and disease. Journal of applied ichthyology. 30 (4), 616-629 (2014).
- Powers, D.
- Naruse, K. Medaka: A Model for Organogenesis, Human Disease, and Evolution. Naruse, K., Tanaka, M., Takeda, H. , Springer. Japan. 19-37 (2011).
- Green, P. G., et al. Sex Steroid Regulation of the Inflammatory Response: Sympathoadrenal Dependence in the Female Rat. The Journal of Neuroscience. 19 (10), 4082-4089 (1999).
- Pakarinen, P., Huhtaniemi, I. Gonadal and sex steroid feedback regulation of gonadotrophin mRNA levels and secretion in neonatal male and female rats. Journal of Molecular Endocrinology. 3 (2), 139 (1989).
- Purves-Tyson, T. D., et al. Testosterone regulation of sex steroid-related mRNAs and dopamine-related mRNAs in adolescent male rat substantia nigra. BMC Neuroscience. 13 (1), 95 (2012).
- Adkins-Regan, E., Ascenzi, M. Sexual differentiation of behavior in the zebra finch: Effect of early gonadectomy or androgen treatment. Hormones and Behavior. 24 (1), 114-127 (1990).
- McCreery, B. R., Licht, P. Effects of gonadectomy and sex steroids on pituitary gonadotrophin release and response to gonadotrophin-releasing hormone (GnRH) agonist in the bullfrog, Rana catesbeiana. General and Comparative Endocrinology. 54 (2), 283-296 (1984).
- Clark, J. H., Markaverich, B. M. The agonistic-antagonistic properties of clomiphene: a review. Pharmacology & Therapeutics. 15 (3), 467-519 (1981).
- Mourits, M. J. E., et al. Tamoxifen treatment and gynecologic side effects: a review. Obstetrics & Gynecology. 97 (5), 855-866 (2001).
- Wallach, E., Huppert, L. C. Induction of Ovulation with Clomiphene Citrate. Fertility and Sterility. 31 (1), 1-8 (1979).
- Moradi, B., Kazemi, M. A., Rahamni, M., Gity, M. Ovarian hyperstimulation syndrome followed by ovarian torsion in premenopausal patient using adjuvant tamoxifen treatment for breast cancer. Asian Pacific Journal of Reproduction. 5 (5), 442-444 (2016).
- Alvarado, M. V., et al. Actions of sex steroids on kisspeptin expression and other reproduction-related genes in the brain of the teleost fish European sea bass. The Journal of Experimental Biology. 219 (21), 3353-3365 (2016).
- Godwin, J., Crews, D., Warner, R. R. Behavioural sex change in the absence of gonads in a coral reef fish. Proceedings of the Royal Society of London. Series B: Biological Sciences. 263 (1377), 1683-1688 (1996).
- Jenkins, N., Dodd, J. M. Effects of ovariectomy of the dogfish Scyliorhinus canicula L. on circulating levels of androgen and oestradiol and on pituitary gonadotrophin content. Journal of Fish Biology. 21 (3), 297-303 (1982).
- Manickam, P., Joy, K. P. Changes in hypothalamic catecholamine levels in relation to season, ovariectomy and 17β-estradiol replacement in the catfish, Clarias batrachus (L.). General and Comparative Endocrinology. 80 (2), 167-174 (1990).
- Senthilkumaran, B., Joy, K. P. Effects of ovariectomy and oestradiol replacement on hypothalamic serotonergic and monoamine oxidase activity in the catfish, Heteropneustes fossilis: a study correlating plasma oestradiol and gonadotrophin levels. Journal of Endocrinology. 142 (2), 193-203 (1994).
- Sladky, K. K., Clarke, E. O. Fish Surgery: Presurgical Preparation and Common Surgical Procedures. Veterinary Clinics of North America: Exotic Animal Practice. 19 (1), 55-76 (2016).
- Hori, H. Medaka: A Model for Organogenesis, Human Disease, and Evolution. Naruse, K., Tanaka, M., Takeda, H. , Springer. Japan. 1-16 (2011).
- Murata, K., Kinoshita, M., Naruse, K., Tanaka, M., Kamei, Y. Medaka: Biology, Management, and Experimental Protocols. Murata, K., et al. 2, John Wiley & Sons. 49-95 (2019).
- Fontaine, R., Weltzien, F. -A. Labeling of Blood Vessels in the Teleost Brain and Pituitary Using Cardiac Perfusion with a DiI-fixative. Journal of Visualized Experiments. (148), e59768 (2019).
- Fontaine, R., Hodne, K., Weltzien, F. -A. Healthy Brain-pituitary Slices for Electrophysiological Investigations of Pituitary Cells in Teleost Fish. Journal of Visualized Experiments. (138), e57790 (2018).
- Zhao, Y., Wayne, N. L. Recording Electrical Activity from Identified Neurons in the Intact Brain of Transgenic Fish. Journal of Visualized Experiments. (74), e50312 (2013).
- Ager-Wick, E., et al. Preparation of a High-quality Primary Cell Culture from Fish Pituitaries. Journal of Visualized Experiments. (138), e58159 (2018).
- Wittbrodt, J., Shima, A., Schartl, M. Medaka - model organism from the far east. Nature Reviews Genetics. 3 (1), 53-64 (2002).
- Kayo, D., Oka, Y., Kanda, S. Examination of methods for manipulating serum 17β-Estradiol (E2) levels by analysis of blood E2 concentration in medaka (Oryzias latipes). General and Comparative Endocrinology. 285, 113272 (2020).
- Eames, S. C., Philipson, L. H., Prince, V. E., Kinkel, M. D. Blood sugar measurement in zebrafish reveals dynamics of glucose homeostasis. Zebrafish. 7 (2), 205-213 (2010).
- Velasco-Santamaría, Y. M., Korsgaard, B., Madsen, S. S., Bjerregaard, P. Bezafibrate, a lipid-lowering pharmaceutical, as a potential endocrine disruptor in male zebrafish (Danio rerio). Aquatic Toxicology. 105 (1-2), 107-118 (2011).
- Jagadeeswaran, P., Sheehan, J. P., Craig, F. E., Troyer, D. Identification and characterization of zebrafish thrombocytes. British Journal of Haematology. 107 (4), 731-738 (1999).
- Zang, L., Shimada, Y., Nishimura, Y., Tanaka, T., Nishimura, N. Repeated Blood Collection for Blood Tests in Adult Zebrafish. Journal of Visualized Experiments. (102), e53272 (2015).
- Taves, M. D., et al. Steroid concentrations in plasma, whole blood and brain: effects of saline perfusion to remove blood contamination from brain. PloS one. 5 (12), 15727 (2010).
- Holtkamp, H. C., Verhoef, N. J., Leijnse, B. The difference between the glucose concentrations in plasma and whole blood. Clinica Chimica Acta. 59 (1), 41-49 (1975).
- Kanda, S., et al. Identification of KiSS-1 Product Kisspeptin and Steroid-Sensitive Sexually Dimorphic Kisspeptin Neurons in Medaka (Oryzias latipes). Endocrinology. 149 (5), 2467-2476 (2008).
- Kanda, S., Karigo, T., Oka, Y. Steroid Sensitive kiss2 Neurones in the Goldfish: Evolutionary Insights into the Duplicate Kisspeptin Gene-Expressing Neurones. Journal of Neuroendocrinology. 24 (6), 897-906 (2012).
- Mitani, Y., Kanda, S., Akazome, Y., Zempo, B., Oka, Y. Hypothalamic Kiss1 but Not Kiss2 Neurons Are Involved in Estrogen Feedback in Medaka (Oryzias latipes). Endocrinology. 151 (4), 1751-1759 (2010).
- Kayo, D., Zempo, B., Tomihara, S., Oka, Y., Kanda, S. Gene knockout analysis reveals essentiality of estrogen receptor β1 (Esr2a) for female reproduction in medaka. Scientific Reports. 9 (1), 8868 (2019).
- Fontaine, R., Ager-Wick, E., Hodne, K., Weltzien, F. -A. Plasticity in medaka gonadotropes via cell proliferation and phenotypic conversion. Journal of Endocrinology. 245 (1), 21 (2020).
- Fontaine, R., Ager-Wick, E., Hodne, K., Weltzien, F. -A. Plasticity of Lh cells caused by cell proliferation and recruitment of existing cells. Journal of Endocrinology. 240 (2), 361 (2019).
- Hasebe, M., Kanda, S., Oka, Y. Female-Specific Glucose Sensitivity of GnRH1 Neurons Leads to Sexually Dimorphic Inhibition of Reproduction in Medaka. Endocrinology. 157 (11), 4318-4329 (2016).
