Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Gonadectomie et procédures de prélèvement sanguin dans le modèle de téléostéen de petite taille Medaka japonais (Oryzias latipes)

Published: December 11, 2020 doi: 10.3791/62006
Automatic Translation
1, 2, 3, 4, 4, 1, 1
1Physiology Unit, Faculty of Veterinary Medicine, Norwegian University of Life Sciences, 2Laboratory of Physiology, Atmosphere and Ocean Research Institute, The University of Tokyo, 3Department of Biological Sciences, Graduate School of Science, The University of Tokyo, 4Centre of Reproduction, Development and Aging (CRDA), Faculty of Health Sciences, University of Macau

Summary

L’article décrit un protocole rapide pour gondécatomiser et prélassez le sang du petit poisson téléostéen, en utilisant le medaka japonais(Oryzias latipes)comme modèle, pour étudier le rôle des stéroïdes sexuels dans la physiologie animale.

Abstract

Les stéroïdes sexuels, produits par les gonfles, jouent un rôle essentiel dans la plasticité du cerveau et des tissus hypophysaires et dans le contrôle neuroendocrinien de la reproduction chez tous les vertébrés en fournissant une rétroaction au cerveau et à l’hypophyse. Les poissons téléostéens possèdent un degré plus élevé de plasticité tissulaire et de variation dans les stratégies de reproduction que les mammifères et semblent être des modèles utiles pour étudier le rôle des stéroïdes sexuels et les mécanismes par lesquels ils agissent. L’élimination de la principale source de production de stéroïdes sexuels à l’aide de la gonadectomie avec un prélèvement sanguin pour mesurer les niveaux de stéroïdes a été bien établie et assez réalisable chez les gros poissons et est une technique puissante pour étudier le rôle et les effets des stéroïdes sexuels. Cependant, ces techniques soulèvent des défis lorsqu’elles sont mises en œuvre dans des modèles de téléostéen de petite taille. Ici, nous décrivons les procédures étape par étape de la gonadectomie chez les hommes et les femmes medaka japonais suivies d’un prélèvement sanguin. Ces protocoles se sont révélés hautement réalisables dans le medaka, ce qui indique un taux de survie élevé, la sécurité pour la durée de vie et le phénotype du poisson, et la reproductibilité en termes de clairance des stéroïdes sexuels. L’utilisation de ces procédures combinée aux autres avantages de l’utilisation de ce petit modèle de téléostéen améliorera considérablement la compréhension des mécanismes de rétroaction dans le contrôle neuroendocrinien de la reproduction et de la plasticité tissulaire fournis par les stéroïdes sexuels chez les vertébrés.

Introduction

Chez les vertébrés, les stéroïdes sexuels, qui sont principalement produits par les gonds, jouent un rôle important dans la régulation de l’axe cerveau-hypophyse-gonadique (BPG) à travers divers mécanismes de rétroaction1,2,3,4,5. En outre, les stéroïdes sexuels affectent la prolifération et l’activité des neurones dans le cerveau6,7,8 et les cellules endocriniennes, y compris les gonadotrophes, dans l’hypophyse9,10, et jouent ainsi un rôle crucial dans la plasticité cérébrale et hypophysaire. Malgré des connaissances relativement bonnes chez les mammifères, le mécanisme de régulation de l’axe BPG médié par les stéroïdes sexuels est loin d’être compris chez les espèces non mammifères, ce qui conduit à une mauvaise compréhension des principes évolutifs conservés11. Il existe encore un nombre limité d’études documentant le rôle des stéroïdes sexuels sur la plasticité cérébrale et hypophysaire, ce qui soulève la nécessité d’études plus approfondies sur le rôle et les effets des stéroïdes sexuels sur diverses espèces de vertébrés.

Chez les vertébrés, les téléostéens sont devenus de puissants animaux modèles en abordant de nombreuses questions biologiques et physiologiques, notamment la réponse au stress12,13,la croissance14,15,la physiologie nutritionnelle16,17 et la reproduction2. Les téléostéens, dans lesquels les stéroïdes sexuels sont principalement représentés par l’œstradiol (E2) chez les femelles et la 11-cétotestostérone (11-KT) chez les mâles18,19, sont depuis longtemps des modèles expérimentaux fiables pour étudier le principe général de la reproduction entre les espèces. Les téléostéens montrent un caractère unique dans leur connexion hypothalamo-hypophysaire20,21 et leurs cellules gonadotrophes distinctes22,qui sont parfois pratiques pour l’élucidation des mécanismes de régulation. De plus, en raison de leur aptitude aux expériences en laboratoire et sur le terrain, les téléostéens offrent de nombreux avantages par rapport à d’autres organismes. Ils sont relativement peu coûteux à l’achat et àl’entretien23,24. En particulier, les petits modèles de téléostéens tels que le poisson-zèbre (Danio rerio) et le medaka japonais (Oryzias latipes), sont des espèces à très forte fécondité et à cycle de vie relativement court permettant une analyse rapide de la fonction des gènes et des mécanismes pathologiques23, offrant ainsi des avantages encore plus grands pour répondre à une pléthore de questions biologiques et physiologiques, compte tenu des nombreux protocoles bien développés et de la boîte à outils génétique disponible pour ces espèces25.

Dans de nombreuses études, l’élimination des gonacées (gonadectomie) ainsi que les techniques de prélèvement sanguin ont été utilisées comme méthode pour étudier de nombreuses questions physiologiques, y compris son impact sur la physiologie de la reproduction des vertébrés chez les mammifères26,27,28,les oiseaux29 et les amphibiens30. Bien que l’effet de la gondectomie sur la physiologie de la reproduction puisse être imité alternativement par les antagonistes des stéroïdes sexuels, tels que le tamoxifène et le clomifène, l’effet des médicaments semble être incohérent en raison des effets bimodinaux31,32. L’exposition chronique à un antagoniste des stéroïdes sexuels peut entraîner une hypertrophie ovarienne33,34, ce qui peut désactiver l’observation de ses effets à long terme en raison d’un phénotype malsain. En outre, il est impossible d’effectuer une expérience de récupération après un traitement antagoniste des stéroïdes sexuels, pour justifier l’effet spécifique de certains stéroïdes sexuels. En plus de ces points susmentionnés, d’autres compromis de l’utilisation d’antagonistes de stéroïdes sexuels ont été largement examinés31,32. Par conséquent, la gonadectomie apparaît encore aujourd’hui comme une technique puissante pour étudier le rôle des stéroïdes sexuels.

Alors que les techniques de gonadectomie et de prélèvement sanguin sont relativement faciles à réaliser chez les espèces plus grandes, telles que le bar européen (Dicentrarchus labrax)35, le labre à tête bleue (Thalassoma bifasciatum)36, l’aiguillat commun (Scyliorhinus canicula)37 et le poisson-chat (Heteropneustes fossilis et Clarias bathracus)38,39, ils soulèvent des défis lorsqu’ils sont appliqués dans de petits poissons comme medaka. Par exemple, l’utilisation du système d’administration d’anesthésie pour poissons (FADS)40 est moins réalisable et semble sujette à des dommages physiques excessifs pour les petits poissons. En outre, une procédure de gonadectomie couramment utilisée pour les gros poissons40 ne convient pas aux petits poissons qui nécessitent une grande précision pour éviter des dommages excessifs. Enfin, le prélèvement sanguin est difficile en raison de l’accès limité aux vaisseaux sanguins et de la petite quantité de sang chez ces animaux. Par conséquent, un protocole clair démontrant chaque étape de la gonadectomie et du prélèvement sanguin dans un petit téléostéen est important.

Ce protocole démontre les procédures étape par étape de la gonadectomie suivie d’un prélèvement sanguin dans le medaka japonais, un petit poisson d’eau douce originaire d’Asie de l’Est. Les medaka japonais ont un génome séquencé, plusieurs outils moléculaires et génétiques disponibles25,et un système de détermination génétique du sexe permettant d’enquêter sur les différences sexuelles avant que les caractéristiques sexuelles secondaires ou les gonas ne soient bien développées41. Fait intéressant, les medaka japonais possèdent des gonnes fusionnées contrairement à de nombreuses autres espèces de téléostéens42. Ces deux techniques combinées ne prennent que 8 minutes au total et compléteront la liste des protocoles vidéo déjà existants pour cette espèce qui comprenait le labeling des vaisseaux sanguins43,le patch-clamp sur les sections hypophysaires44 et les neurones cérébraux45,et la culture cellulaire primaire46. Ces techniques permettront à la communauté de recherche d’étudier et de mieux comprendre les rôles des stéroïdes sexuels dans les mécanismes de rétroaction ainsi que la plasticité cérébrale et hypophysaire à l’avenir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Toutes les expérimentations et manipulations d’animaux ont été menées conformément aux recommandations sur le bien-être des animaux d’expérimentation à l’Université norvégienne des sciences de la vie. Les expériences utilisant la gonadectomie ont été approuvées par l’Autorité norvégienne de sécurité des aliments (FOTS ID 24305).

NOTE: Les expériences ont été réalisées en utilisant des hommes et des femmes adultes (âgés de 6 à 7 mois, poids d’environ 0,35 g, longueur d’environ 2,7 cm) medaka japonais. Le sexe a été déterminé en distinguant les caractéristiques sexuelles secondaires, telles que la taille et la forme de la nageoire dorsale et anale, comme décrit dans42,47.

1. Préparation des instruments et des solutions

  1. Préparer une solution d’anesthésique (Tricaine à 0,6 %).
    1. Diluer 0,6 g de tricaïne (MS-222) dans 100 mL de solution saline tampon phosphate (PBS).
    2. Répartir 1 mL de la solution d’origine Tricaine dans plusieurs tubes en plastique de 1,5 mL et conserver à -20 °C jusqu’à utilisation.
  2. Préparer l’eau de récupération (solution de NaCl à 0,9 %) en ajoutant 18 g de NaCl dans 2 L d’eau d’aquarium. Conserver la solution à température ambiante jusqu’à utilisation.
  3. Préparez les outils d’incision en cassant un rasoir en diagonale pour obtenir un point pointu (Figure 1A).
  4. Préparer une solution anticoagulante sanguine (0,05 U/μL d’héparine de sodium) en diluant 25 μL d’héparine de sodium en 500 μL de 1x PBS. Conserver la solution anticoagulante à 4 °C jusqu’à utilisation.
  5. Préparer deux aiguilles en verre à partir d’un capillaire en verre de 90 mm de long en tirant un capillaire en verre à l’éventreur (Figure 1B) en suivant les instructions du fabricant.
    REMARQUE: Le diamètre extérieur de l’aiguille en verre est de 1 mm, tandis que le diamètre intérieur est de 0,6 mm.
  6. Préparez un couvercle de tube en plastique de 1,5 mL en coupant le couvercle et faites un trou qui s’adapte au diamètre extérieur de l’aiguille (Figure 1C). Pour faire le trou, chauffez une extrémité du capillaire en verre de 9 mm et poignardez le capillaire en verre chauffé à travers le couvercle. Alternativement, utilisez une aiguille pour poignarder à travers le couvercle jusqu’à ce que le diamètre du trou s’adapte au capillaire en verre de 9 mm.

2. Procédure de gonadectomie

  1. Préparer 0,02% de solution anesthésique en diluant un tube de bouillon de Tricaine (0,6%) dans 30 mL d’eau d’aquarium.
  2. Préparez des outils de dissection comprenant une pince ultra-fine et deux pinces fines (une avec une pointe relativement large), de petits ciseaux, du fil de nylon et un rasoir comme décrit à l’étape 1.3.
  3. Anesthésiez le poisson en le mettant dans la solution anesthésique à 0,02% pendant 30 à 60 secondes.
    REMARQUE: La durée de l’anesthésie dépend de la taille et du poids du poisson et doit être adaptée. Pour s’assurer que le poisson est complètement anesthéséché, le corps du poisson peut être pincé doucement à l’aide d’une pince. Si le poisson ne réagit pas, la gonadectomie peut être commencée.
  4. Sortez le poisson de la solution anesthésique et placez-le horizontalement sur le côté, hors de l’eau sous un microscope à dissection.
  5. Ovariectomie (OVX) chez les femmes
    1. Retirez les œufs ovposités (œufs suspendus à l’extérieur du corps de la femelle) le cas échéant et grattez les écailles dans la zone d’incision (Figure 2A).
    2. Faites doucement une incision d’environ 2 à 2,5 mm de long entre les côtes, entre les nageoires pelvienne et anale (Figure 2A), à l’aide de la lame de rasoir. Ensuite, pincez doucement l’abdomen du poisson tout en sortant les ovaires petit à petit à l’aide d’une pince fine à pointe large.
    3. Coupez l’extrémité des ovaires à l’aide de pinces fines et placez les ovaires de côté (Figure 2B).
      REMARQUE: Veillez à ne pas casser le sac ovarien si possible. Si le sac ovarien est brisé, enlevez toute trace de gonace aussi complètement que possible sans laisser d’ovules non ovulés.
  6. Orchidectomie chez les hommes
    1. Faites doucement une incision entre les côtes au-dessus de l’anus (Figure 2A) et ouvrez l’incision lentement à l’aide d’une pince fine.
    2. Attrapez doucement les testicules à l’aide de la pince fine et retirez lentement les testicules. Ensuite, coupez l’extrémité des testicules pour enlever complètement les testicules (Figure 2B). Pour l’orchidectomie masculine, toutes les préparations sont similaires à chez les femelles jusqu’à la partie incision. Lors de la prise des testicules, on obtient parfois la graisse ressemblant aux testicules. Cependant, après avoir restauré la graisse, il est possible d’essayer de retrouver les testicules (Figure 2B).
      REMARQUE: Pour les hommes et les femmes, il est important de minimiser la taille de l’incision dans l’abdomen pour éviter des dommages excessifs pouvant entraîner la mortalité. Parfois, les intestins peuvent également apparaître à travers l’incision avec les gonailles, alors assurez-vous qu’ils sont correctement renvoyés à l’intérieur de l’incision avant la fermeture. Une connaissance préalable de l’emplacement des ovaires et des testicules dans l’abdomen medaka est essentielle.
  7. Suturez l’incision de la même manière chez les hommes et les femmes (Figure 3).
    1. Placez le fil de nylon à côté de la zone d’incision et poignardez la peau du côté droit de l’incision à travers la cavité interne du corps à l’aide d’une pince ultra-fine pour prendre le fil avec une pince fine (Figure 3; 1-2).
    2. Poignardez la peau du côté gauche de l’incision à travers la cavité externe du corps pour retirer le fil ( Figure 3; 3-4).
    3. Fermez l’ouverture de l’incision et faites deux nœuds et coupez le fil excessif (Figure 3; 4-6).
      REMARQUE: La suture doit être suffisamment serrée et le fil restant sur le poisson doit être assez long pour empêcher le desserrage de la suture. L’ensemble de la procédure, de l’anesthésie à la suture, prend généralement jusqu’à 6 minutes. Un temps plus long peut conduire à la mortalité.
    4. Mettez les poissons dans l’eau de récupération et laissez-les pendant au moins 24 heures avant de les transférer dans le système d’aquarium.
      REMARQUE: Les poissons gonadétomisés présentent généralement un comportement normal après 1-2 heures dans l’eau de récupération. Par conséquent, selon le but de l’expérience, on peut échantillonner le poisson après cet intervalle de temps.

3. Procédure de prélèvement sanguin

  1. Préparez les outils : une aiguille en verre, un capillaire en silicone, un tube en plastique avec un trou, un tube en plastique vide de 1,5 mL, une minicentrifugeuse et du ruban adhésif.
  2. Anesthésier le poisson à l’aide d’une solution anesthésique à 0,02 % décrite à l’étape 2.1 et placer le poisson sous un microscope à dissection en position verticale (Figure 4A). Placez le poisson sur une surface brillante pour faciliter la visualisation de la veine de ponction caudale.
  3. Installez le tiroir à sang en attachant une aiguille en verre au capillaire en silicone(Figure 4B). Casser la pointe de l’aiguille avec une pince à pointe large et recouvrir l’intérieur de l’aiguille d’une solution anticoagulante par aspiration et soufflage.
    REMARQUE: L’utilisation d’une ventouse et d’un capillaire en silicone d’au moins 50 cm de longueur est recommandée pour les mesures de sécurité afin d’éviter tout contact direct avec le sang lors de l’aspiration. De plus, assurez-vous que l’ouverture de la pointe de l’aiguille est suffisamment grande pour permettre de tirer le sang.
  4. Dirigez l’aiguille vers la zone du pédoncule du poisson, visez la veine du pédoncule caudal (Figure 5A) et prélevez le sang par la bouche jusqu’à ce qu’au moins un quart du volume total de l’aiguille soit rempli (Figure 5B).
    REMARQUE: Il est important d’arrêter d’aspirer avant de retirer l’aiguille du corps du poisson.
  5. Relâchez l’aiguille et placez un morceau de ruban adhésif à proximité du côté pointu de l’aiguille. Placez le couvercle avec un trou sur un tube de collecte et placez l’aiguille à l’intérieur du tube à travers le trou avec la pointe de l’aiguille à l’extérieur (Figure 5C).
  6. Mettez les poissons dans l’eau de récupération et laissez-les pendant au moins 24 heures avant de les transférer dans le système d’aquarium.
    REMARQUE: Pour effectuer un deuxième prélèvement sanguin sur le même poisson, échantillonnez le sang une semaine après le premier prélèvement sanguin.
  7. Flash faire tourner le sang recueilli pendant 1-2 secondes avec 1 000 x g à température ambiante pour recueillir le sang dans le tube.
  8. Passez directement aux applications en aval ou stockez le sang à -20 °C jusqu’à l’utilisation.
    REMARQUE: Se référer à l’étude précédente pour l’extraction de stéroïdes sexuels à partir du sangtotal 48.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Ce protocole décrit chaque étape pour effectuer une gonadectomie et un prélèvement sanguin dans un téléostéen modèle de petite taille, le medaka japonais. Le taux de survie du poisson après ovariectomie (OVX) chez les femelles est de 100% (10 poissons sur 10) tandis que 94% (17 sur 18 poissons) des mâles ont survécu après une orchidectomie. Pendant ce temps, après la procédure de prélèvement sanguin, tous les poissons (38 poissons) ont survécu.

Les femelles opérées par simulacre présentent une ponte (Figure 6A) et tous les œufs ont été fécondés et ont permis le développement embryonnaire (Figure 6B). Les mâles opérés par Sham ont également été en mesure de féconder des œufs après seulement 1-2 semaines. Deux des six femelles partiellement gondétomisées élevées avec des mâles partiellement gonadétomisés ont également montré une ponte avec 100% des œufs fécondés après 2 mois. En revanche, aucune ponte chez les femelles ou fécondation par les mâles n’a été observée chez les poissons entièrement gondétomisés, même après 4 mois.

Lorsqu’elle est effectuée correctement, la forme corporelle du poisson change légèrement (Figure 7A), et aucun morceau de gonne ne doit rester après la procédure de gonadectomie (Figure 7B). Pendant ce temps, 4 semaines après la gonadectomie, l’incision et la suture ont complètement disparu(Figure 8),et après 4 mois, tous les poissons gonadétomisés présentaient toujours un phénotype sain et aucun tissu gonadique n’a été trouvé.

Les concentrations sanguines d’E2 chez les femelles (Tableau 1), mesurées avec ELISA conformément aux instructions du fabricant, ont révélé que le taux d’E2 chez les poissons OVX est significativement plus faible que chez les poissons opérés par simulacre 24 heures après la chirurgie (p < 0,00001). Après 4 mois, le niveau d’E2 dans les poissons OVX est également significativement inférieur à celui des poissons simulés(p < 0,00001) et ne montre aucune différence significative par rapport à celui des poissons OVX 24 heures après OVX(p > 0,05). Enfin, les poissons OVX en partie, où seulement 1/3 à 1/2 de la gonade a été enlevée, présentent des niveaux d’E2 significativement inférieurs à ceux des poissons simulés (p = 0,0437) et des niveaux E2 significativement plus élevés que les poissons entièrement OVX (p < 0,00001) (Figure 9A).

De même, chez les mâles (Tableau 1), la concentration de 11-KT chez les poissons orchidectomisés est significativement plus faible que chez les poissons opérés par simulacre 24 heures après la chirurgie (p < 0,00001). Le niveau de 11-KT chez les poissons orchidectomisés après 4 mois est également significativement plus faible que chez les poissons opérés par simulacre(p < 0,00001) et ne montre aucune différence par rapport aux poissons post-orchidectomisés 24 heures(p > 0,05). Enfin, les poissons partiellement orchidectomisés présentent des niveaux significativement plus faibles de 11 KT que les poissons simulés (p = 0,0428) et des niveaux significativement plus élevés de 11 KT que les poissons entièrement orchidectomisés (p < 0,00001) (Figure 9B).

Figure 1
Graphique 1. Préparation des instruments. ( A )Lamede rasoir pour la gonadectomie, (B) aiguille en verre pour l’extraction du sang, et (C) un tube en plastique avec un couvercle avec un trou pour la collecte de sang. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Graphique 2. Emplacement de la zone d’incision. A) Dessin de la zone d’incision située entre les côtes, entre les nageoires pelvienne et anale chez les femelles (panneau de gauche) et les mâles (panneau de droite); B)enlèvement des gonaux chez les femelles (panneau de gauche) et les mâles (panneau de droite), cercles blancs montrant la partie articulaire, flèche blanche montrant le testicule et flèche noire montrant la graisse. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Graphique 3. La procédure de suture. 1) Un trou est fait sur le côté droit de l’incision à l’aide de pinces ultra-fines. 2) Le fil de nylon est passé à travers la peau en utilisant le trou fait en 1. 3) Un trou est fait dans le côté gauche de l’incision. 4) Le fil de nylon est passé à travers le trou fait en 3. 5) Un nœud à la main est fait deux fois pour fermer l’incision. 6) L’excès de fil est coupé. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Graphique 4. Position du poisson lors du prélèvement sanguin (A), installation d’une aiguille en verre avec le capillaire en silicone (B). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Graphique 5. La zone d’aspiration des étapes de prélèvement sanguin (A), de sang prélevé (B) et de prélèvement sanguin (C). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 6
Graphique 6. Les poissons opérés par simulacre montrent la ponte des œufs pointés par une flèche blanche (A) et des œufs fécondés (B). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 7
Graphique 7. Aspect morphologique (A) et anatomique (B) des poissons intacts et gondécatomisés. Des flèches blanches (panneaux supérieurs) montrent la marque chirurgicale sur les poissons gondétomisés. Des flèches noires (panneaux du bas) montrent des gonas dans des poissons intacts. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 8
Graphique 8. Marques chirurgicales chez les poissons mâles et femelles après 4 semaines. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 9
Graphique 9. Taux sanguins d’E2 chez les femmes (A) et de 11-KT chez les hommes (B) japonais medaka, 24 heures après une opération simulée (contrôle), en partie gonadectomie ou gonadectomie, et 4 mois après une gonadectomie (OVX, ovariectomie chez les femmes; Cas, orchidectomie chez les hommes). Les analyses statistiques ont été effectuées à l’aide d’une ANOVA unidirectionnelle suivie d’un test Tukey Post Hoc. Différentes lettres (a-c) montrent des différences significatives(p-valeur < 0,05). Les données du graphique sont fournies sous forme moyenne + ET, n = 5. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Niveaux E2 (Femmes) Niveaux de 11 KT (hommes)
Opéré par Sham 4,15 ± 0,5 (n = 5) 10,38 ± 1,32 (n = 5)
Partiellement gondétomisé 3,37 ± 0,6 (n = 5) 8,37 ± 1,92 (n = 5)
24h après la gonadectomie 0,36 ± 0,2 (n = 5) 0,4 ± 0,2 (n = 5)
4 mois après la gonadectomie 0,54 ± 0,28 (n = 5) 0,74 ± 0,22 (n = 5)

Tableau 1. Niveaux d’E2 et de 11 KT (ng/mL) chez les femelles et les mâles de poissons opérés par simulacre et gonadétomisés et partiellement gonadétomisés.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Comme indiqué dans la littérature précédente, la gonadectomie et le prélèvement sanguin ont longtemps été utilisés chez d’autres espèces modèles pour étudier les questions liées au rôle des stéroïdes sexuels dans la régulation de l’axe BPG. Cependant, ces techniques ne semblent se prêter qu’aux animaux plus gros. Compte tenu de la petite taille du modèle de téléostéoscé couramment utilisé, le medaka japonais, nous fournissons un protocole détaillé pour la gonadectomie et le prélèvement sanguin qui est réalisable pour cette espèce.

Le fait que le taux de survie des poissons gonadétomisés ait atteint près de 100% indique que la procédure de gonadectomie est réalisable sur medaka. De même, la procédure de prélèvement sanguin n’affecte pas la capacité de survie du poisson, comme le montre le taux de survie de 100% après avoir subi cette procédure. En outre, les femelles opérées par simulacre élevées avec des mâles opérés par simulacre présentent une ponte et des œufs fécondés à 100%, ce qui indique que la procédure d’incision et de suture n’affecte pas la reproduction du poisson. En d’autres termes, ils étaient en assez bonne santé pour frayer. En outre, les poissons partiellement gondétomisés présentent des concentrations comparables de stéroïdes sexuels aux poissons opérés par simulacre, et une ponte chez certaines femelles ainsi que la fécondation des œufs par les mâles ont été observées chez ces poissons partiellement gondétomisés. Ces résultats suggèrent que la procédure de gonadectomie doit être effectuée avec une grande précision, ce qui signifie que les ovaires ou les testicules doivent être complètement enlevés.

Comme le montre la figure 8,la marque d’incision et de suture sur le poisson a complètement disparu 4 semaines après la gonadectomie, et les poissons sont toujours en vie et ont l’air en bonne santé 4 mois après la chirurgie. Ceux-ci indiquent que la procédure d’opération est sans danger pour le poisson à long terme et n’affecte pas la durée de vie du poisson. De plus, après 4 mois, aucune gonad n’a été observée. Ceci est confirmé par les faibles niveaux d’E2 et de 11-KT qui sont toujours similaires à ceux trouvés dans les poissons gonadétomisés après 24 heures.

Les niveaux d’E2 et de 11-KT chez les poissons gonadétomisés sont significativement plus faibles que chez les poissons opérés par simulacre, déjà après 24 heures après la gonadecctomie et restent plus faibles chez les poissons échantillonnés 4 mois après la gonadectomie. Les niveaux de stéroïdes sexuels significativement plus faibles chez les poissons gonadétomisés par rapport au contrôle ont été observés dans des études antérieures chez l’aiguillat commun37,le poisson-chat39 et le medaka48. Ces preuves cohérentes suggèrent que la procédure de gonadectomie décrite dans le protocole est une technique fiable pour éliminer les stéroïdes sexuels circulants.

Étant donné que cette procédure ne repose pas sur FADS comme démontré dans40, la gonadectomie doit être effectuée le plus rapidement possible pour prévenir la mortalité pendant la chirurgie. En effet, l’utilisation de FADS permet de maintenir le rythme de fonctionnement puisque cet outil permet une condition anesthésique continue aux poissons malgré leur exposition à l’air. Néanmoins, en raison de sa plus faible faisabilité dans le petit téléostéen comme medaka, l’utilisation de FADS ne peut pas être effectuée avec cette taille de poisson. De plus, contrairement au protocole précédent de gonadectomie chez les gros poissons qui permet une incision large pour atteindre la gonale, le protocole décrit dans ce manuscrit ne permet pas une incision large pour éviter des dommages excessifs aux petits poissons. Par conséquent, il faut être très prudent lorsque vous essayez d’accéder à la gonaille à l’aide de pinces pour éviter les dommages dans d’autres tissus à l’intérieur de la cavité corporelle du poisson.

Le protocole repose sur une procédure rapide et propre. L’entraînement est donc fortement recommandé jusqu’à atteindre un taux de réussite élevé, indiqué par un taux de survie élevé du poisson après une gondectomie ainsi que l’ablation complète des gonodées (voir la différence d’aspect morphologique et anatomique du poisson avant et après une gonadectomie réussie dans la figure 7). En fait, de nombreux facteurs peuvent affecter le taux de réussite de la procédure, y compris la période d’anesthésie, la largeur de l’incision, la précision et la propreté de la suture et la manipulation du poisson pendant la procédure. Un autre point important est qu’il faut préparer des poissons en bonne santé en les entretenant de manière optimale avant d’exécuter le protocole.

En ce qui concerne la procédure de prélèvement sanguin, les études précédentes ont tenté d’échantillonner le sang de medaka48 et de poisson zèbre49,50,51, mais la procédure ne permet pas de prélèvement sanguin répété dans le même poisson puisque le sang est prélevé après l’euthanasie du poisson. Des prélèvements sanguins répétés ont été démontrés à l’aide de poissons-zèbres dans une autre étude52, mais nous rapportons ce type de protocole pour la première fois dans medaka.

L’évaluation des concentrations de stéroïdes sexuels est généralement effectuée à l’aide d’un kit de dosage immuno-enzymatique (ELISA), et il existe de nombreux kits ELISA disponibles dans le commerce pour différents types de stéroïdes sexuels. En raison de la faible quantité de sang prélevée lors du prélèvement sanguin, les tests en aval sont destinés au sang total. Des études antérieures ont montré qu’il existe une différence dans le niveau mesuré de stéroïdes circulants extraits du sang total et du plasma53,54. Par conséquent, la différence dans les niveaux de stéroïdes sexuels du sang total et du plasma doit être validée avant d’effectuer l’expérience réelle en utilisant le protocole.

Comme documenté dans des études antérieures avec différents modèles animaux, le protocole décrit ici permettra d’étudier les questions liées à la physiologie de la reproduction en utilisant un téléostéen de petite taille comme modèle. En fait, ces techniques ont déjà contribué à répondre à des questions concernant la régulation de l’axe BPG et ses mécanismes de rétroaction, tels que l’implication de kiss1 (gène kisspeptine de type 1) exprimant des neurones dans des boucles de rétroaction positives55,la régulation médiée par les œstrogènes de kiss1 exprimant des neurones dans le noyau ventralis tuberis (NVT), et kiss2 (gène de la kisspeptine de type 2) exprimant des neurones dans la zone préoptique (POA)56, 57, l’implication possible du récepteur β1 des œstrogènes (Esr2a) dans la régulation à la baisse du niveau d’expression de fsh chez la femelle japonaise medaka58 ainsi que le profil du rythme circadien de E2 chez les poissons femelles48. En outre, puisque des études antérieures ont démontré que les stéroïdes sexuels affectent également la prolifération des cellules gonadotropes dans l’hypophyse des téléostéens59,60, il est intrigant d’étudier les effets de la clairance des stéroïdes sexuels après une gonadectomie sur la plasticité hypophysaire.

La technique de prélèvement sanguin peut non seulement être utilisée pour l’analyse des stéroïdes sexuels, mais également pour d’autres analyses de la teneur en sang, y compris les niveaux de glucose dans le sang. En effet, le protocole peut également être appliqué pour les mesures de glycémie comme démontré chez le poisson zèbre52 et le medaka61. Par conséquent, cette technique peut être élargie pour répondre à des questions de recherche dans d’autres domaines de la physiologie.

Enfin, les protocoles décrits ici sont destinés et optimisés pour le medaka japonais adulte, et les résultats dus à la taille différente des poissons et des matériaux utilisés au cours des procédures peuvent varier. De plus, comme les ovaires / testicules gauche et droit medaka sont fusionnés, ce qui pourrait fournir un avantage important pour la gonadectomie, ce protocole pourrait nécessiter plusieurs adaptations avant d’être utilisé chez d’autres espèces où ce n’est pas le cas comme chez le poisson-zèbre. Ainsi, une optimisation en fonction du choix de l’équipement de laboratoire et de la taille des poissons doit être prise en compte avant de tester ces protocoles.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Les auteurs remercient Mme Lourdes Carreon G Tan pour son aide dans l’élevage du poisson. Ce travail a été financé par NMBU, Grants-in-Aid de la Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) (numéro de subvention 18H04881 et 18K19323), et une subvention pour des projets de recherche scientifique fondamentale de la Fondation Sumitomo à S.K.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Glass capilary GD1 Glass Capillary with Filament GD-1; Narishige
Heparin sodium salt H4784-1G Sigma-aldrich
Needle puller P97 Flaming/Brown Micropipette puller Model P-97; Sutter Instrument
Nylon thread N45VL Polyamide suture, 0.2 metric; Crownjun
Plastic tube T9661 Eppendorf Safe-lock microcentifuge tube 1.5 ml, Sigma-aldrich
Razor blade - Astra Superior Platinum Double Edge Razor Blades Green, salonwholesale.com
Silicone capillary a16090800ux0403 Uxcell Silicone Tube 1 mm ID x 2 mm OD, amazon.com 
Tricaine WXBC9102V Aldrich chemistry

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Weltzien, F. -A., Andersson, E., Andersen, Ø, Shalchian-Tabrizi, K., Norberg, B. The brain-pituitary-gonad axis in male teleosts, with special emphasis on flatfish (Pleuronectiformes). Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Molecular & Integrative Physiology. 137 (3), 447-477 (2004).
  2. Yaron, Z., Levavi-Sivan, B. Encyclopedia of Fish Physiology. Farrell, A. P. 2, Academic Press. 1500-1508 (2011).
  3. Goldman, B. D. The circadian timing system and reproduction in mammals. Steroids. 64 (9), 679-685 (1999).
  4. Taranger, G. L., et al. Control of puberty in farmed fish. General and Comparative Endocrinology. 165 (3), 483-515 (2010).
  5. Messinis, I. E. Ovarian feedback, mechanism of action and possible clinical implications. Human Reproduction Update. 12 (5), 557-571 (2006).
  6. Diotel, N., et al. The brain of teleost fish, a source, and a target of sexual steroids. Frontiers in Neuroscience. 5, 137 (2011).
  7. Diotel, N., et al. Steroid Transport, Local Synthesis, and Signaling within the Brain: Roles in Neurogenesis, Neuroprotection, and Sexual Behaviors. Frontiers in Neuroscience. 12, 84 (2018).
  8. Larson, T. A. Sex Steroids, Adult Neurogenesis, and Inflammation in CNS Homeostasis, Degeneration, and Repair. Frontiers in Endocrinology. 9, 205 (2018).
  9. Fontaine, R., et al. Gonadotrope plasticity at cellular, population and structural levels: A comparison between fishes and mammals. General and Comparative Endocrinology. 287, 113344 (2020).
  10. Fontaine, R., Royan, M. R., von Krogh, K., Weltzien, F. -A., Baker, D. M. Direct and indirect effects of sex steroids on gonadotrope cell plasticity in the teleost fish pituitary. Frontiers in Endocrinology. , (2020).
  11. Kanda, S. Evolution of the regulatory mechanisms for the hypothalamic-pituitary-gonadal axis in vertebrates-hypothesis from a comparative view. General and Comparative Endocrinology. 284, 113075 (2019).
  12. Schreck, C. B. Stress and fish reproduction: The roles of allostasis and hormesis. General and Comparative Endocrinology. 165 (3), 549-556 (2010).
  13. Wendelaar Bonga, S. E. The stress response in fish. Physiological Reviews. 77 (3), 591-625 (1997).
  14. Mommsen, T. P. Paradigms of growth in fish. Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Biochemistry and Molecular Biology. 129 (2), 207-219 (2001).
  15. Won, E., Borski, R. Endocrine Regulation of Compensatory Growth in Fish. Front. Endocrinol. 4, 74 (2013).
  16. MacKenzie, D. S., VanPutte, C. M., Leiner, K. A. Nutrient regulation of endocrine function in fish. Aquaculture. 161 (1), 3-25 (1998).
  17. Rønnestad, I., Thorsen, A., Finn, R. N. Fish larval nutrition: a review of recent advances in the roles of amino acids. Aquaculture. 177 (1), 201-216 (1999).
  18. Borg, B. Androgens in teleost fishes. Comparative Biochemistry and Physiology Part C: Pharmacology, Toxicology and Endocrinology. 109 (3), 219-245 (1994).
  19. Rege, J., et al. Circulating 11-oxygenated androgens across species. The Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology. 190, 242-249 (2019).
  20. Blázquez, M., Bosma, P. T., Fraser, E. J., Van Look, K. J. W., Trudeau, V. L. Fish as models for the neuroendocrine regulation of reproduction and growth. Comparative Biochemistry and Physiology Part C: Pharmacology, Toxicology and Endocrinology. 119 (3), 345-364 (1998).
  21. Zambrano, D. Innervation of the teleost pituitary. General and Comparative Endocrinology. 3, 22-31 (1972).
  22. Weltzien, F. -A., Hildahl, J., Hodne, K., Okubo, K., Haug, T. M. Embryonic development of gonadotrope cells and gonadotropic hormones - Lessons from model fish. Molecular and Cellular Endocrinology. 385 (1), 18-27 (2014).
  23. Harris, M. P., Henke, K., Hawkins, M. B., Witten, P. E. Fish is Fish: the use of experimental model species to reveal causes of skeletal diversity in evolution and disease. Journal of applied ichthyology. 30 (4), 616-629 (2014).
  24. Powers, D. Fish as model systems. Science. 246 (4928), 352-358 (1989).
  25. Naruse, K. Medaka: A Model for Organogenesis, Human Disease, and Evolution. Naruse, K., Tanaka, M., Takeda, H. , Springer. Japan. 19-37 (2011).
  26. Green, P. G., et al. Sex Steroid Regulation of the Inflammatory Response: Sympathoadrenal Dependence in the Female Rat. The Journal of Neuroscience. 19 (10), 4082-4089 (1999).
  27. Pakarinen, P., Huhtaniemi, I. Gonadal and sex steroid feedback regulation of gonadotrophin mRNA levels and secretion in neonatal male and female rats. Journal of Molecular Endocrinology. 3 (2), 139 (1989).
  28. Purves-Tyson, T. D., et al. Testosterone regulation of sex steroid-related mRNAs and dopamine-related mRNAs in adolescent male rat substantia nigra. BMC Neuroscience. 13 (1), 95 (2012).
  29. Adkins-Regan, E., Ascenzi, M. Sexual differentiation of behavior in the zebra finch: Effect of early gonadectomy or androgen treatment. Hormones and Behavior. 24 (1), 114-127 (1990).
  30. McCreery, B. R., Licht, P. Effects of gonadectomy and sex steroids on pituitary gonadotrophin release and response to gonadotrophin-releasing hormone (GnRH) agonist in the bullfrog, Rana catesbeiana. General and Comparative Endocrinology. 54 (2), 283-296 (1984).
  31. Clark, J. H., Markaverich, B. M. The agonistic-antagonistic properties of clomiphene: a review. Pharmacology & Therapeutics. 15 (3), 467-519 (1981).
  32. Mourits, M. J. E., et al. Tamoxifen treatment and gynecologic side effects: a review. Obstetrics & Gynecology. 97 (5), 855-866 (2001).
  33. Wallach, E., Huppert, L. C. Induction of Ovulation with Clomiphene Citrate. Fertility and Sterility. 31 (1), 1-8 (1979).
  34. Moradi, B., Kazemi, M. A., Rahamni, M., Gity, M. Ovarian hyperstimulation syndrome followed by ovarian torsion in premenopausal patient using adjuvant tamoxifen treatment for breast cancer. Asian Pacific Journal of Reproduction. 5 (5), 442-444 (2016).
  35. Alvarado, M. V., et al. Actions of sex steroids on kisspeptin expression and other reproduction-related genes in the brain of the teleost fish European sea bass. The Journal of Experimental Biology. 219 (21), 3353-3365 (2016).
  36. Godwin, J., Crews, D., Warner, R. R. Behavioural sex change in the absence of gonads in a coral reef fish. Proceedings of the Royal Society of London. Series B: Biological Sciences. 263 (1377), 1683-1688 (1996).
  37. Jenkins, N., Dodd, J. M. Effects of ovariectomy of the dogfish Scyliorhinus canicula L. on circulating levels of androgen and oestradiol and on pituitary gonadotrophin content. Journal of Fish Biology. 21 (3), 297-303 (1982).
  38. Manickam, P., Joy, K. P. Changes in hypothalamic catecholamine levels in relation to season, ovariectomy and 17β-estradiol replacement in the catfish, Clarias batrachus (L.). General and Comparative Endocrinology. 80 (2), 167-174 (1990).
  39. Senthilkumaran, B., Joy, K. P. Effects of ovariectomy and oestradiol replacement on hypothalamic serotonergic and monoamine oxidase activity in the catfish, Heteropneustes fossilis: a study correlating plasma oestradiol and gonadotrophin levels. Journal of Endocrinology. 142 (2), 193-203 (1994).
  40. Sladky, K. K., Clarke, E. O. Fish Surgery: Presurgical Preparation and Common Surgical Procedures. Veterinary Clinics of North America: Exotic Animal Practice. 19 (1), 55-76 (2016).
  41. Hori, H. Medaka: A Model for Organogenesis, Human Disease, and Evolution. Naruse, K., Tanaka, M., Takeda, H. , Springer. Japan. 1-16 (2011).
  42. Murata, K., Kinoshita, M., Naruse, K., Tanaka, M., Kamei, Y. Medaka: Biology, Management, and Experimental Protocols. Murata, K., et al. 2, John Wiley & Sons. 49-95 (2019).
  43. Fontaine, R., Weltzien, F. -A. Labeling of Blood Vessels in the Teleost Brain and Pituitary Using Cardiac Perfusion with a DiI-fixative. Journal of Visualized Experiments. (148), e59768 (2019).
  44. Fontaine, R., Hodne, K., Weltzien, F. -A. Healthy Brain-pituitary Slices for Electrophysiological Investigations of Pituitary Cells in Teleost Fish. Journal of Visualized Experiments. (138), e57790 (2018).
  45. Zhao, Y., Wayne, N. L. Recording Electrical Activity from Identified Neurons in the Intact Brain of Transgenic Fish. Journal of Visualized Experiments. (74), e50312 (2013).
  46. Ager-Wick, E., et al. Preparation of a High-quality Primary Cell Culture from Fish Pituitaries. Journal of Visualized Experiments. (138), e58159 (2018).
  47. Wittbrodt, J., Shima, A., Schartl, M. Medaka - model organism from the far east. Nature Reviews Genetics. 3 (1), 53-64 (2002).
  48. Kayo, D., Oka, Y., Kanda, S. Examination of methods for manipulating serum 17β-Estradiol (E2) levels by analysis of blood E2 concentration in medaka (Oryzias latipes). General and Comparative Endocrinology. 285, 113272 (2020).
  49. Eames, S. C., Philipson, L. H., Prince, V. E., Kinkel, M. D. Blood sugar measurement in zebrafish reveals dynamics of glucose homeostasis. Zebrafish. 7 (2), 205-213 (2010).
  50. Velasco-Santamaría, Y. M., Korsgaard, B., Madsen, S. S., Bjerregaard, P. Bezafibrate, a lipid-lowering pharmaceutical, as a potential endocrine disruptor in male zebrafish (Danio rerio). Aquatic Toxicology. 105 (1-2), 107-118 (2011).
  51. Jagadeeswaran, P., Sheehan, J. P., Craig, F. E., Troyer, D. Identification and characterization of zebrafish thrombocytes. British Journal of Haematology. 107 (4), 731-738 (1999).
  52. Zang, L., Shimada, Y., Nishimura, Y., Tanaka, T., Nishimura, N. Repeated Blood Collection for Blood Tests in Adult Zebrafish. Journal of Visualized Experiments. (102), e53272 (2015).
  53. Taves, M. D., et al. Steroid concentrations in plasma, whole blood and brain: effects of saline perfusion to remove blood contamination from brain. PloS one. 5 (12), 15727 (2010).
  54. Holtkamp, H. C., Verhoef, N. J., Leijnse, B. The difference between the glucose concentrations in plasma and whole blood. Clinica Chimica Acta. 59 (1), 41-49 (1975).
  55. Kanda, S., et al. Identification of KiSS-1 Product Kisspeptin and Steroid-Sensitive Sexually Dimorphic Kisspeptin Neurons in Medaka (Oryzias latipes). Endocrinology. 149 (5), 2467-2476 (2008).
  56. Kanda, S., Karigo, T., Oka, Y. Steroid Sensitive kiss2 Neurones in the Goldfish: Evolutionary Insights into the Duplicate Kisspeptin Gene-Expressing Neurones. Journal of Neuroendocrinology. 24 (6), 897-906 (2012).
  57. Mitani, Y., Kanda, S., Akazome, Y., Zempo, B., Oka, Y. Hypothalamic Kiss1 but Not Kiss2 Neurons Are Involved in Estrogen Feedback in Medaka (Oryzias latipes). Endocrinology. 151 (4), 1751-1759 (2010).
  58. Kayo, D., Zempo, B., Tomihara, S., Oka, Y., Kanda, S. Gene knockout analysis reveals essentiality of estrogen receptor β1 (Esr2a) for female reproduction in medaka. Scientific Reports. 9 (1), 8868 (2019).
  59. Fontaine, R., Ager-Wick, E., Hodne, K., Weltzien, F. -A. Plasticity in medaka gonadotropes via cell proliferation and phenotypic conversion. Journal of Endocrinology. 245 (1), 21 (2020).
  60. Fontaine, R., Ager-Wick, E., Hodne, K., Weltzien, F. -A. Plasticity of Lh cells caused by cell proliferation and recruitment of existing cells. Journal of Endocrinology. 240 (2), 361 (2019).
  61. Hasebe, M., Kanda, S., Oka, Y. Female-Specific Glucose Sensitivity of GnRH1 Neurons Leads to Sexually Dimorphic Inhibition of Reproduction in Medaka. Endocrinology. 157 (11), 4318-4329 (2016).

Tags

Biologie Numéro 166 Gonadectomie ovariectomie orchidectomie castration medaka sang stéroïdes poisson reproduction plasticité estradiol 11-kétotestostérone
Gonadectomie et procédures de prélèvement sanguin dans le modèle de téléostéen de petite taille Medaka japonais (<em>Oryzias latipes</em>)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Royan, M. R., Kanda, S., Kayo, D.,… More

Royan, M. R., Kanda, S., Kayo, D., Song, W., Ge, W., Weltzien, F. A., Fontaine, R. Gonadectomy and Blood Sampling Procedures in the Small Size Teleost Model Japanese Medaka (Oryzias latipes). J. Vis. Exp. (166), e62006, doi:10.3791/62006 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter