Summary
Der Artikel beschreibt ein schnelles Protokoll zur Gonadekttomisierung und Blutentnahme aus dem kleinen Teleostfisch, wobei japanische Medaka(Oryzias latipes)als Modell verwendet wird, um die Rolle von Sexualsteroiden in der Tierphysiologie zu untersuchen.
Abstract
Sexualsteroide, die von den Gonaden produziert werden, spielen eine wesentliche Rolle bei der Plastizität von Gehirn und Hypophysengewebe und bei der neuroendokrinen Kontrolle der Fortpflanzung bei allen Wirbeltieren, indem sie dem Gehirn und der Hypophyse Rückmeldung geben. Teleostfische besitzen im Vergleich zu Säugetieren einen höheren Grad an Gewebeplastizität und Variation der Fortpflanzungsstrategien und scheinen nützliche Modelle zu sein, um die Rolle von Sexualsteroiden und die Mechanismen, mit denen sie wirken, zu untersuchen. Die Entfernung der Hauptquelle der Sexualsteroidproduktion durch Gonadektomie zusammen mit Blutentnahme zur Messung des Steroidspiegels ist bei größeren Fischen gut etabliert und ziemlich machbar und ist eine leistungsstarke Technik, um die Rolle und Auswirkungen von Sexualsteroiden zu untersuchen. Diese Techniken werfen jedoch Herausforderungen auf, wenn sie in kleinen Teleostmodellen implementiert werden. Hier beschreiben wir die schrittweisen Verfahren der Gonadektomie sowohl bei Männern als auch bei weiblichen japanischen Medakas, gefolgt von Blutentnahmen. Diese Protokolle haben sich in Medaka als sehr praktikabel erwiesen, was durch eine hohe Überlebensrate, Sicherheit für die Lebensdauer und den Phänotyp der Fische und Reproduzierbarkeit in Bezug auf die Clearance von Sexualsteroiden angezeigt wird. Die Verwendung dieser Verfahren in Kombination mit den anderen Vorteilen der Verwendung dieses kleinen Teleostmodells wird das Verständnis der Rückkopplungsmechanismen bei der neuroendokrinen Kontrolle der Fortpflanzung und der Gewebeplastizität von Sexualsteroiden bei Wirbeltieren erheblich verbessern.
Introduction
Bei Wirbeltieren spielen Sexualsteroide, die hauptsächlich von den Gonaden produziert werden, eine wichtige Rolle bei der Regulation der Gehirn-Hypophysen-Gonaden-Achse (BPG) durch verschiedene Rückkopplungsmechanismen1,2,3,4,5. Darüber hinaus beeinflussen Sexualsteroide die Proliferation und Aktivität von Neuronen im Gehirn6,7,8 und endokrinen Zellen, einschließlich Gonadotropen, in der Hypophyse9,10und spielen somit eine entscheidende Rolle bei der Plastizität von Gehirn und Hypophyse. Trotz relativ guter Kenntnisse bei Säugetieren ist der Mechanismus der BPG-Achsenregulation, der durch Sexualsteroide vermittelt wird, bei Nicht-Säugetierarten weit davon entfernt, verstanden zu werden, was zu einem schlechten Verständnis der evolutionär konservierten Prinzipien führt11. Es gibt immer noch eine begrenzte Anzahl von Studien, die die Rolle von Sexualsteroiden auf die Plastizität von Gehirn und Hypophyse dokumentieren, was die Notwendigkeit weiterer Untersuchungen der Rolle und der Auswirkungen von Sexualsteroiden auf verschiedene Wirbeltierarten erhöht.
Unter den Wirbeltieren sind Teleoste zu mächtigen Modelltieren geworden, die zahlreiche biologische und physiologische Fragen beantworten, einschließlich Stressreaktion12,13, Wachstum14,15, Ernährungsphysiologie16,17 und Fortpflanzung2. Teleosten, bei denen Sexualsteroide hauptsächlich durch Östradiol (E2) bei Weibchen und 11-Ketotestosteron (11-KT) bei Männchen18,19vertreten sind, sind seit langem zuverlässige experimentelle Modelle zur Untersuchung des allgemeinen Prinzips der Fortpflanzung über Arten hinweg. Teleoste zeigen Einzigartigkeit in ihrer Hypothalamus-Hypophysen-Verbindung20,21 und verschiedenen Gonadotropzellen22, die manchmal für die Aufklärung von Regulationsmechanismen geeignet sind. Darüber hinaus bieten Teleoste aufgrund ihrer Zugänglichkeit für Labor- und Feldexperimente viele Vorteile gegenüber anderen Organismen. Sie sind relativ kostengünstig in der Anschaffung und Wartung23,24. Insbesondere kleine Teleostmodelle wie Zebrafische (Danio rerio) und die japanische Medaka (Oryzias latipes) sind Arten mit sehr hoher Fruchtbarkeit und einem relativ kurzen Lebenszyklus, die eine schnelle Analyse der Genfunktion und Krankheitsmechanismen ermöglichen23, was angesichts der zahlreichen gut entwickelten Protokolle und des genetischen Toolkits, die für diese Arten verfügbar sind, noch größere Vorteile bei der Behandlung einer Vielzahl biologischer und physiologischer Fragen bietet25.
In zahlreichen Studien wurde die Entfernung von Gonaden (Gonadektomie) zusammen mit Blutentnahmetechniken als Methode zur Untersuchung vieler physiologischer Fragen verwendet, einschließlich ihrer Auswirkungen auf die Fortpflanzungsphysiologie von Wirbeltieren bei Säugetieren26,27,28,Vögeln 29 und Amphibien30. Obwohl die Gonadeektomie-Wirkung auf die Fortpflanzungsphysiologie alternativ von Sexualsteroidantagonisten wie Tamoxifen und Clomifen nachgeahmt werden kann, scheint die Wirkung der Medikamente aufgrund bimodaler Wirkungen inkonsistent zu sein31,32. Chronische Exposition gegenüber einem Sexualsteroidantagonisten kann zu einer Ovarialvergrößerung führen33,34, die die Beobachtung seiner Auswirkungen für langfristige Zwecke aufgrund eines ungesunden Phänotyps deaktivieren kann. Darüber hinaus ist es unmöglich, ein Erholungsexperiment nach der Behandlung mit Sexualsteroidantagonisten durchzuführen, um die spezifische Wirkung bestimmter Sexualsteroide zu gewährleisten. Zusammen mit diesen oben genannten Punkten wurden andere Kompromisse bei der Verwendung von Sexsteroid-Antagonisten ausführlich überprüft31,32. Daher erscheint die Gonadektomie auch heute noch als eine leistungsfähige Technik, um die Rolle von Sexualsteroiden zu untersuchen.
Während Gonadektomie- und Blutentnahmetechniken bei größeren Arten wie dem Europäischen Wolfsbarsch (Dicentrarchus labrax)35, Dem Blaukopflippfisch (Thalassoma bifasciatum)36, Dornhai (Scyliorhinus canicula)37 und Wels (Heteropneustes fossilis und Clarias bathracus)38,39) relativ einfach durchzuführen sind, stellen sie Herausforderungen dar, wenn sie bei kleinen Fischen als Medaka angewendet werden. Zum Beispiel ist die Verwendung von Fish Anesthesia Delivery System (FADS)40 weniger machbar und scheint anfällig für übermäßige körperliche Schäden für kleine Fische zu sein. Darüber hinaus ist ein Gonadektomieverfahren, das üblicherweise für größere Fische40 verwendet wird, nicht für kleine Fische geeignet, die eine hohe Präzision erfordern, um übermäßige Schäden zu vermeiden. Schließlich ist die Blutentnahme aufgrund des begrenzten Zugangs zu Blutgefäßen und der geringen Blutmenge bei diesen Tieren eine Herausforderung. Daher ist ein klares Protokoll, das jeden Schritt der Gonadeektomie und Blutentnahme in einem kleinen Teleost demonstriert, von Bedeutung.
Dieses Protokoll demonstriert die Schrittweisen Verfahren der Gonadektomie, gefolgt von Blutentnahmen in japanischen Medaka, einem kleinen Süßwasserfisch, der in Ostasien beheimatet ist. Japanische Medaka haben ein sequenziertes Genom, mehrere molekulare und genetische Werkzeuge zur Verfügung25und ein genetisches Geschlechtsbestimmungssystem, das die Untersuchung sexueller Unterschiede ermöglicht, bevor sekundäre Geschlechtsmerkmale oder Gonaden gut entwickelt sind41. Interessanterweise besitzen japanische Medaka verschmolzene Gonaden im Gegensatz zu vielen anderen Teleost-Arten42. Diese beiden Techniken zusammen dauern insgesamt nur 8 Minuten und vervollständigen die Liste der bereits für diese Spezies vorhandenen Videoprotokolle, darunter die Markierung von Blutgefäßen43,Patch-Clamp an Hypophysenabschnitten44 und Gehirnneuronen45und primäre Zellkultur46. Diese Techniken werden es der Forschungsgemeinschaft ermöglichen, die Rolle von Sexualsteroiden in Feedback-Mechanismen sowie die Plastizität von Gehirn und Hypophyse in Zukunft zu untersuchen und besser zu verstehen.
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Protocol
Alle Experimente und der Umgang mit Tieren wurden in Übereinstimmung mit den Empfehlungen zum experimentellen Tierschutz an der Norwegian University of Life Sciences durchgeführt. Experimente mit Gonadeektomie wurden von der norwegischen Behörde für Lebensmittelsicherheit genehmigt (FOTS ID 24305).
HINWEIS: Die Experimente wurden mit erwachsenen männlichen und weiblichen (6-7 Monate alt, Gewicht ca. 0,35 g, Länge ca. 2,7 cm) japanischen Medaka durchgeführt. Das Geschlecht wurde durch Unterscheidung der sekundären Geschlechtsmerkmale, wie größe und Form der Rücken- und Afterflosse, wie in42,47beschrieben bestimmt.
1. Vorbereitung von Instrumenten und Lösungen
- Bereiten Sie anästhetische Stammlösung (0,6% Tricain) vor.
- Verdünnen Sie 0,6 g Tricain (MS-222) in 100 ml 10x Phosphatpuffersalzlösung (PBS).
- 1 ml der Tricain-Stammlösung in mehrere 1,5 mL Kunststoffröhrchen verteilen und bis zum Gebrauch bei -20 °C lagern.
- Bereiten Sie Auflischerwasser (0,9% NaCl-Lösung) vor, indem Sie 18 g NaCl in 2 l Aquarienwasser geben. Lagern Sie die Lösung bis zum Gebrauch bei Raumtemperatur.
- Bereiten Sie die Schnittwerkzeuge vor, indem Sie einen Rasierer diagonal brechen, um einen scharfen Punkt zu erhalten (Abbildung 1A).
- Herstellung einer gerinnungshemmenden Blutlösung (0,05 U/μL Natrium heparin), indem 25 μL Natrium heparin in 500 μL 1x PBS verdünnt werden. Lagern Sie die gerinnungshemmende Lösung bis zum Gebrauch bei 4 °C.
- Bereiten Sie zwei Glasnadeln aus einer 90 mm langen Glaskapillare vor, indem Sie eine Glaskapillare mit einem Nadelzieher ziehen (Abbildung 1B) gemäß den Anweisungen des Herstellers.
HINWEIS: Der Außendurchmesser der Glasnadel beträgt 1 mm, während der Innendurchmesser 0,6 mm beträgt. - Bereiten Sie einen 1,5-ml-Kunststoffrohrdeckel vor, indem Sie den Deckel schneiden und ein Loch machen, das zum Außendurchmesser der Nadel passt (Abbildung 1C). Um das Loch zu machen, erhitzen Sie ein Ende der 9 mm Glaskapillar und stechen Sie die erhitzte Glaskapillar durch den Deckel. Alternativ stechen Sie mit einer Nadel durch den Deckel, bis der Durchmesser des Lochs mit der 9-mm-Glaskapillare zusammenpasst.
2. Gonadektomie
- Bereiten Sie 0,02% der Anästhesielösung vor, indem Sie eine Tube Tricain-Brühe (0,6%) in 30 ml Aquarienwasser verdünnen.
- Bereiten Sie Dissektionswerkzeuge vor, einschließlich einer ultrafeinen und zwei feinen Heppzette (eine mit relativ breiter Spitze), einer kleinen Schere, einem Nylonfaden und einem Rasierer, wie in Schritt 1.3 beschrieben.
- Betäuben Sie den Fisch, indem Sie ihn für 30-60 Sekunden in die 0,02% ige Anästhesielösung legen.
HINWEIS: Die Dauer der Anästhesie hängt von der Größe und dem Gewicht des Fisches ab und muss angepasst werden. Um sicherzustellen, dass der Fisch vollständig betäubt ist, kann der Fischkörper mit einer Zette sanft eingeklemmt werden. Reagiert der Fisch nicht, kann mit der Gonadektomie begonnen werden. - Nehmen Sie den Fisch aus der Anästhesielösung heraus und legen Sie den Fisch horizontal auf die Seite, außerhalb des Wassers unter einem Seziermikroskop.
- Ovariektomie (OVX) bei Frauen
- Entfernen Sie eiabgelagerte Eier (Eier, die außerhalb des weiblichen Körpers hängen), falls vorhanden, und kratzen Sie die Schuppen im Schnittbereich (Abbildung 2A).
- Machen Sie vorsichtig einen etwa 2-2,5 mm langen Schnitt zwischen den Rippen, zwischen den Becken- und Afterflossen (Abbildung 2A) mit der Rasierklinge. Dann kneifen Sie vorsichtig den Fischbauch, während Sie die Eierstöcke nach und nach mit einer feinen Zette mit breiter Spitze herausnehmen.
- Schneiden Sie das Ende der Eierstöcke mit einer feinen Zette ab und legen Sie die Eierstöcke beiseite (Abbildung 2B).
HINWEIS: Achten Sie darauf, den Eierstocksack möglichst nicht zu brechen. Wenn der Eierstocksack gebrochen ist, entfernen Sie alle Gonadenspuren so vollständig wie möglich, ohne auch nur nicht eisprungende Eier zu hinterlassen.
- Orchidektomie bei Männern
- Machen Sie vorsichtig einen Schnitt zwischen den Rippen über dem Anus (Abbildung 2A) und öffnen Sie den Schnitt langsam mit einer feinen Zette.
- Greifen Sie die Hoden vorsichtig mit der feinen Zinnen und nehmen Sie die Hoden langsam heraus. Schneiden Sie anschließend das Ende der Hoden ab, um die Hoden vollständig zu entfernen (Abbildung 2B). Bei der männlichen Orchidektomie sind alle Präparate bis zum Schnittteil ähnlich wie bei Denbinnen. Beim Greifen der Hoden wird manchmal das Fett erhalten, das den Hoden ähnelt. Nach der Wiederherstellung des Fettes ist es jedoch möglich, die Hoden wieder zu finden (Abbildung 2B).
HINWEIS: Sowohl für Männer als auch für Frauen ist es wichtig, die Schnittgröße im Bauch zu minimieren, um übermäßige Schäden zu vermeiden, die zur Mortalität führen können. Manchmal kann der Darm auch durch den Schnitt zusammen mit den Gonaden erscheinen, also stellen Sie sicher, dass sie vor dem Verschluss ordnungsgemäß in den Schnitt zurückgeführt werden. Vorkenntnisse über die Lage der Eierstöcke und Hoden im Medaka-Abdomen sind unerlässlich.
- Nähen Sie den Schnitt ähnlich bei Männchen und Weibchen (Abbildung 3).
- Legen Sie den Nylonfaden neben den Schnittbereich und stechen Sie die Haut von der rechten Seite des Schnitts durch die innere Körperhöhle mit einer ultrafeinen Zette, um den Faden mit einer feinen Zette aufzunehmen (Abbildung 3; 1-2).
- Stechen Sie die Haut von der linken Seite des Schnitts durch die äußere Körperhöhle, um den Faden herauszunehmen ( Abbildung 3; 3-4).
- Schließen Sie die Schnittöffnung und machen Sie zwei Knoten und schneiden Sie den überschüssigen Faden (Abbildung 3; 4-6).
HINWEIS: Die Naht muss ausreichend dicht sein, und der verbleibende Faden am Fisch muss lang genug sein, um eine Lockerung der Naht zu verhindern. Der gesamte Vorgang von der Anästhesie bis zum Nähen dauert in der Regel bis zu 6 Minuten. Längere Zeit kann zur Sterblichkeit führen. - Legen Sie die Fische in das Erholungswasser und lassen Sie sie mindestens 24 Stunden stehen, bevor Sie sie in das Aquariensystem überführten.
HINWEIS: Gonadectomisierte Fische zeigen normalerweise nach 1-2 Stunden im Erholungswasser ein normales Verhalten. Daher kann man je nach Versuchszweck den Fisch nach diesem Zeitintervall beproben.
3. Blutentnahmeverfahren
- Bereiten Sie die Werkzeuge vor: eine Glasnadel, eine Silikonkapillare, ein Kunststoffröhrchen mit einem Loch, ein leeres 1,5-ml-Kunststoffrohr, eine Minizentrifuge und Klebeband.
- Betäuben Sie den Fisch mit einer 0,02%igen Anästhesielösung wie in Schritt 2.1 beschrieben und legen Sie den Fisch unter ein Dissektionsmikroskop in vertikaler Position (Abbildung 4A). Legen Sie den Fisch auf eine helle Oberfläche, um die Visualisierung der kaudalen Punktionsvene zu erleichtern.
- Installieren Sie das Blutentnahmeband, indem Sie eine Glasnadel an der Silikonkapillare befestigen (Abbildung 4B). Brechen Sie die Nadelspitze mit einer breiten Spitzenzette und beschichten Sie die Innenseite der Nadel mit gerinnungshemmender Lösung durch Absaugen und Blasen.
HINWEIS: Die Verwendung eines Saugers und einer Silikonkapillare mit einer Länge von mindestens 50 cm wird für Sicherheitsmaßnahmen empfohlen, um einen direkten Kontakt des Blutes beim Absaugen zu vermeiden. Stellen Sie außerdem sicher, dass die Öffnung der Nadelspitze ausreichend groß ist, um das Blut zu ziehen. - Richten Sie die Nadel auf den Stielbereich des Fisches, zielen Sie auf die Schwanzstielvene (Abbildung 5A) und ziehen Sie das Blut mit dem Mund, bis mindestens ein Viertel des Gesamtvolumens der Nadel gefüllt ist (Abbildung 5B).
HINWEIS: Es ist wichtig, das Absaugen zu stoppen, bevor Sie die Nadel aus dem Fischkörper entfernen. - Lassen Sie die Nadel los und legen Sie ein Stück Klebeband in die Nähe der scharfen Seite der Nadel. Setzen Sie den Deckel mit einem Loch auf ein Auffangrohr und stecken Sie die Nadel in das Rohr durch das Loch mit der Nadelspitze an der Außenseite (Abbildung 5C).
- Legen Sie die Fische in das Erholungswasser und lassen Sie sie mindestens 24 Stunden stehen, bevor Sie sie in das Aquariensystem überführten.
HINWEIS: Um eine zweite Blutentnahme von demselben Fisch durchzuführen, entnehmen Sie das Blut eine Woche nach der ersten Blutentnahme. - Flash Spin das gesammelte Blut für 1-2 Sekunden mit 1.000 x g bei Raumtemperatur, um das Blut in der Röhre zu sammeln.
- Fahren Sie direkt mit den nachgeschalteten Anwendungen fort oder lagern Sie das Blut bis zur Verwendung bei -20 °C.
HINWEIS: Beziehen Sie sich auf die vorherige Studie für die Extraktion von Sexualsteroiden aus dem Vollblut48.
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Representative Results
Dieses Protokoll beschreibt jeden Schritt zur Durchführung von Gonadeektomie und Blutentnahme in einem kleinen Modellteletost, dem japanischen Medaka. Die Überlebensrate der Fische nach Ovariektomie (OVX) bei Weibchen beträgt 100% (10 von 10 Fischen), während 94% (17 von 18 Fischen) der Männchen nach orchidektomie überlebten. In der Zwischenzeit, nachdem die Blutentnahme durchgeführt wurde, überlebten alle (38 Fische) Fische.
Schein-betriebene Weibchen zeigen Eiablage (Abbildung 6A) und alle Eier wurden befruchtet und für die Embryonalentwicklung zugelassen (Abbildung 6B). Schein-operierte Männchen waren auch in der Lage, Eier nach nur 1-2 Wochen zu befruchten. Zwei von sechs teilweise gonadectomisierten Weibchen, die mit teilweise gonadectomisierten Männchen aufgezogen wurden, zeigten nach 2 Monaten auch eine Eiablage mit 100% befruchteten Eiern. Im Gegensatz dazu wurde bei vollständig gonadectomisierten Fischen auch nach 4 Monaten keine Eiablage bei Weibchen oder Befruchtung durch Männchen beobachtet.
Bei korrekter Durchführung ändert sich die Körperform des Fisches leicht (Abbildung 7A), und nach der Gonadeektomie sollte kein Stück Gonade übrig bleiben (Abbildung 7B). Währenddessen, 4 Wochen nach der Gonadektomie, verschwanden der Schnitt und die Naht vollständig (Abbildung 8), und nach 4 Monaten zeigten alle gonadectomisierten Fische immer noch einen gesunden Phänotyp, und es wurde kein Gonadengewebe gefunden.
E2-Blutkonzentrationen bei Frauen (Tabelle 1), gemessen mit ELISA nach den Anweisungen des Herstellers, zeigten, dass der E2-Spiegel bei OVX-Fischen 24 Stunden nach der Operation signifikant niedriger ist als bei scheinoperierten Fischen (P. < 0,00001). Nach 4 Monaten ist der E2-Spiegel bei OVX-Fischen ebenfalls signifikant niedriger als bei scheinbetriebenen Fischen (p < 0,00001) und zeigt keinen signifikanten Unterschied im Vergleich zu dem in 24 Stunden nach OVX-Fischen (p > 0,05). Schließlich zeigen teilweise OVX-Fische, bei denen nur 1/3 bis 1/2 der Gonade entfernt wurden, signifikant niedrigere E2-Werte als scheinbetriebene Fische (p = 0,0437) und signifikant höhere E2-Werte als vollständig OVX-Fische (p < 0,00001) (Abbildung 9A).
Ähnlich ist bei Männchen (Tabelle 1) die 11-KT-Konzentration bei orchidektomierten Fischen 24 Stunden nach der Operation signifikant niedriger als bei scheinoperierten Fischen (p < 0,00001). Der 11-KT-Spiegel bei orchidektomierten Fischen nach 4 Monaten ist ebenfalls signifikant niedriger als bei scheinbetriebenen Fischen (p < 0,00001) und zeigt keinen Unterschied im Vergleich zu 24 Stunden nach orchidektomierten Fischen (p > 0,05). Schließlich zeigen teilweise orchidektomierte Fische signifikant niedrigere 11-KT-Spiegel als scheinbetriebene Fische (p = 0,0428) und signifikant höhere Konzentrationen von 11-KT als vollständig orchidektomierte Fische (p < 0,00001) (Abbildung 9B).
Abbildung 1. Instrumentenvorbereitung. (A) Rasierklinge für Gonadectomie, (B) Glasnadel für die Blutentnahme und (C) ein Kunststoffröhrchen zusammen mit einem Deckel mit einem Loch für die Blutentnahme. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2. Lage des Schnittbereichs. A) Zeichnung des Schnittbereichs zwischen den Rippen, zwischen Becken- und Afterflossen bei Frauen (linke Tafel) und Männchen (rechte Tafel); B) Gonadenentfernung bei Weibchen (linkes Feld) und Männchen (rechtes Feld), weiße Kreise mit dem Gelenkteil, weißer Pfeil mit dem Hoden und schwarzer Pfeil mit dem Fett. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3. Das Verfahren der Naht. 1) Ein Loch wird auf der rechten Seite des Schnitts mit einer ultrafeinen Zette gemacht. 2) Der Nylonfaden wird mit dem in 1 hergestellten Loch durch die Haut geleitet. 3) Ein Loch wird in der linken Seite des Schnitts gemacht. 4) Der Nylonfaden wird durch das Loch in 3 geleitet. 5) Ein Überhandknoten wird zweimal gemacht, um den Schnitt zu schließen. 6) Überschüssiges Gewinde wird geschnitten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4. Fischposition während der Blutentnahme (A), die Installation der Glasnadel mit der Silikonkapillare (B). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5. Der Absaugbereich der Blutentnahme (A), der entnommenen Blut (B) und der Blutentnahmeschritte (C). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 6. Scheinfische zeigen eiablage von Eiern, die mit weißem Pfeil (A) und befruchteten Eiern (B) gezeigt werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 7. Morphologisches (A) und anatomisches (B) Aussehen von intakten und gonadectomisierten Fischen. Weiße Pfeile (obere Tafeln) zeigen die Operationsmarkierung auf gonadectomisierten Fischen. Schwarze Pfeile (untere Tafeln) zeigen Gonaden in intakten Fischen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 8. Operationsmarkierungen bei männlichen und weiblichen Fischen nach 4 Wochen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 9. Blutspiegel von E2 bei weiblichen (A) und 11-KT bei männlichen (B) japanischen Medaka, 24 Stunden nach Scheinoperation (Kontrolle), teilweise Gonadeektomie oder Gonadeektomie und 4 Monate nach Gonadeektomie (OVX, Ovariektomie bei Frauen; Cas, Orchidektomie bei Männchen). Die statistischen Analysen wurden mit One Way ANOVA durchgeführt, gefolgt von Tukey Post Hoc Test. Verschiedene Buchstaben (a-c) zeigen signifikante Unterschiede (p-Wert< 0,05). Die Daten im Diagramm werden als Mittelwert + SD, n = 5 angegeben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| E2-Stufen (Frauen) | 11-KT-Stufen (Männer) | |
| Schein-betrieben | 4,15 ± 0,5 (n = 5) | 10,38 ± 1,32 (n = 5) |
| Teilweise gonadetomisiert | 3,37 ± 0,6 (n = 5) | 8,37 ± 1,92 (n = 5) |
| 24h Post-Gonadeektomie | 0,36 ± 0,2 (n = 5) | 0,4 ± 0,2 (n = 5) |
| 4 Monate nach Gonadeektomie | 0,54 ± 0,28 (n = 5) | 0,74 ± 0,22 (n = 5) |
Tabelle 1. E2- und 11-KT-Spiegel (ng/ml) bei Weibchen und Männchen von schein-operierten und gonadectomisierten und teilweise gonadectomisierten Fischen.
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Discussion
Wie in früheren Literaturliteratur berichtet, werden Gonadektomie und Blutentnahme seit langem in anderen Modellarten verwendet, um Fragen im Zusammenhang mit der Rolle von Sexualsteroiden bei der Regulierung der BPG-Achse zu untersuchen. Diese Techniken scheinen jedoch nur für größere Tiere geeignet zu sein. In Anbetracht der geringen Größe des häufig verwendeten Teleostmodells, der japanischen Medaka, bieten wir ein detailliertes Protokoll für Gonadektomie und Blutentnahme, das für diese Spezies machbar ist.
Die Tatsache, dass die Überlebensrate von gonadectomisierten Fischen fast 100% erreichte, deutet darauf hin, dass das Gonadektomieverfahren auf Medaka angewendet werden kann. Ebenso hat das Verfahren der Blutentnahme keinen Einfluss auf die Überlebensfähigkeit der Fische, wie die 100% ige Überlebensrate nach diesem Verfahren zeigt. Darüber hinaus zeigen scheinbetriebene Weibchen, die zusammen mit scheinbetriebenen Männchen aufgezogen werden, Eiablage und 100% befruchtete Eier, was darauf hindeutet, dass das Schnitt- und Nahtverfahren die Fortpflanzung der Fische nicht beeinträchtigt. Mit anderen Worten, sie waren gesund genug, um zu laichen. Darüber hinaus zeigen teilweise gonadectomisierte Fische vergleichbare Konzentrationen von Sexualsteroiden wie scheinbetriebene Fische, und bei einigen Weibchen wurden eiablage sowie Befruchtung von Eiern durch Männchen bei diesen teilweise gonadectomisierten Fischen beobachtet. Diese Ergebnisse legen nahe, dass das Verfahren der Gonadektomie mit hoher Präzision durchgeführt werden sollte, was bedeutet, dass die Eierstöcke oder Hoden vollständig entfernt werden sollten.
Wie in Abbildung 8gezeigt, verschwanden die Schnitt- und Nahtmarkierungen auf den Fischen 4 Wochen nach der Gonadektomie vollständig, und die Fische sind noch am Leben und sehen 4 Monate nach der Operation gesund aus. Diese weisen darauf hin, dass der Betrieb für den Fisch für einen langfristigen Zweck sicher ist und die Lebensdauer des Fisches nicht beeinträchtigt. Darüber hinaus wurden nach 4 Monaten keine Gonaden beobachtet. Dies wird durch die niedrigen Konzentrationen von E2 und 11-KT bestätigt, die nach 24 Stunden immer noch denen ähneln, die bei gonadectomisierten Fischen gefunden werden.
Die E2- und 11-KT-Spiegel bei gonadectomisierten Fischen sind bereits nach 24 Stunden nach der Gonadektomie signifikant niedriger als bei scheinbetriebenen Fischen und bleiben bei Fischen, die 4 Monate nach der Gonadeektomie beprobt wurden, niedriger. Die signifikant niedrigeren Sexualsteroidspiegel bei gonadectomisierten Fischen im Vergleich zur Kontrolle wurden in früheren Studien bei Dornhai37, Wels39 und Medaka48beobachtet. Diese konsistenten Beweise deuten darauf hin, dass das im Protokoll beschriebene Gonadektomieverfahren eine zuverlässige Technik ist, um zirkulierende Sexualsteroide zu beseitigen.
Da dieses Verfahren nicht auf FADS angewiesen ist, wie in40gezeigt, sollte die Gonadektomie so schnell wie möglich durchgeführt werden, um die Mortalität während der Operation zu verhindern. In der Tat ermöglicht die Verwendung von FADS, den Betriebsrhythmus aufrechtzuerhalten, da dieses Werkzeug den Fischen eine kontinuierliche Betäubung ermöglicht, obwohl sie der Luft ausgesetzt sind. Aufgrund seiner geringeren Machbarkeit im kleinen Teleost als Medaka kann der Einsatz von FADS jedoch nicht mit dieser Fischgröße durchgeführt werden. Darüber hinaus erlaubt das in diesem Manuskript beschriebene Protokoll im Gegensatz zum vorherigen Gonadektomieprotokoll bei größeren Fischen, das einen breiten Schnitt ermöglicht, um eine breite Schädigung der kleinen Fische zu vermeiden. Daher sollte man sehr vorsichtig sein, wenn man versucht, mit einer Zette auf die Gonade zuzugreifen, um Schäden in anderen Geweben in der Fischkörperhöhle zu verhindern.
Das Protokoll beruht auf einem schnellen und sauberen Verfahren. Ein Training bis zum Erreichen einer hohen Erfolgsrate, die durch eine hohe Überlebensrate der Fische nach Gonadektomie sowie die vollständige Entfernung der Gonaden angezeigt wird, ist daher sehr zu empfehlen (siehe den Unterschied des morphologischen und anatomischen Aussehens der Fische vor und nach erfolgreicher Gonadeektomie in Abbildung 7). In der Tat können viele Faktoren die Erfolgsrate des Verfahrens beeinflussen, einschließlich der Anästhesiezeit, der Breite des Schnitts, der Genauigkeit und Ordnung der Naht und der Fischhandhabung während des Eingriffs. Ein weiterer wichtiger Punkt ist, dass man gesunden Fisch vorbereiten sollte, indem man den Fisch vor der Durchführung des Protokolls optimal pflegt.
In Bezug auf das Blutentnahmeverfahren haben die vorherigen Studien versucht, das Blut von Medaka48 und Zebrafisch49,50,51zu entnehmen, aber das Verfahren erlaubt keine wiederholte Blutentnahme bei demselben Fisch, da das Blut nach dem Einschläfern des Fisches entnommen wird. Wiederholte Blutentnahmen mit Zebrafischen wurden in einer anderen Studie52nachgewiesen, aber wir berichten zum ersten Mal über diese Art von Protokoll in Medaka.
Die Bewertung der Konzentrationen von Sexualsteroiden wird üblicherweise mit einem ELISA-Kit (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) durchgeführt, und es gibt viele ELISA-Kits, die für verschiedene Arten von Sexualsteroiden kommerziell erhältlich sind. Aufgrund der geringen Blutmenge, die während der Blutentnahme gesammelt wird, sind die nachgelagerten Assays für das Vollblut bestimmt. Frühere Studien haben gezeigt, dass es einen Unterschied in der gemessenen Menge der zirkulierenden Steroidspiegel aus Vollblut und Plasma gibt53,54. Daher muss der Unterschied in den Sexualsteroidspiegeln von Vollblut und Plasma validiert werden, bevor das eigentliche Experiment mit dem Protokoll durchführt wird.
Wie in früheren Studien mit verschiedenen Tiermodellen dokumentiert, wird das hier beschriebene Protokoll es ermöglichen, Fragen der Fortpflanzungsphysiologie mit einem kleinen Teleost als Modell zu untersuchen. Tatsächlich haben diese Techniken bereits dazu beigetragen, Fragen zur Regulation der BPG-Achse und ihrer Rückkopplungsmechanismen zu beantworten, wie z. B. die Beteiligung von Kiss1 (Kisspeptin-Gen Typ 1), die Neuronen in positiven Rückkopplungsschleifenexprimieren 55,östrogenvermittelte Regulation von Kiss1-exprimierenden Neuronen im Nucleus ventralis tuberis (NVT) und Kiss2 (Kisspeptin-Gen Typ 2), das Neuronen im präoptischen Bereich (POA) exprimiert56. 57, die mögliche Beteiligung des Östrogenrezeptors β1 (Esr2a) an der herunterregulierenden fsh-Expression in der weiblichen japanischen Medaka58 sowie das Profil des circadianen Rhythmus von E2 bei weiblichen Fischen48. Da frühere Studien gezeigt haben, dass Sexualsteroide auch die Proliferation von Gonadotropzellen in der Hypophyse der Teleoste59,60beeinflussen,ist es faszinierend, die Auswirkungen der Sexsteroid-Clearance nach Gonadectomie auf die Hypophysenplastizität zu untersuchen.
Die Blutentnahmetechnik kann nicht nur für die Analyse von Sexualsteroiden verwendet werden, sondern auch für andere Blutgehaltsanalysen, einschließlich des Blutzuckerspiegels. Tatsächlich kann das Protokoll auch für Blutzuckermessungen angewendet werden, wie in Zebrafisch52 und Medaka61gezeigt. Daher kann diese Technik erweitert werden, um Forschungsfragen in anderen Bereichen der Physiologie zu beantworten.
Schließlich sind die hier beschriebenen Protokolle für erwachsene japanische Medaka gedacht und optimiert, und die Ergebnisse aufgrund der unterschiedlichen Größe der Fische und materialien, die während der Verfahren verwendet werden, können variieren. Da Medaka linke und rechte Eierstöcke / Hoden verschmolzen sind, was einen wichtigen Vorteil für die Gonadektomie darstellen könnte, kann dieses Protokoll mehrere Anpassungen erfordern, bevor es bei anderen Arten verwendet wird, bei denen dies nicht der Fall ist, wie z. B. bei Zebrafischen. Daher sollte eine Optimierung entsprechend der Wahl der Laborausrüstung und Fischgröße berücksichtigt werden, bevor diese Protokolle getestet werden.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preiszugeben.
Acknowledgments
Die Autoren danken Frau Lourdes Carreon G Tan für ihre Unterstützung bei der Fischzucht. Diese Arbeit wurde von NMBU, Grants-in-Aid der Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) (Grant-Nummer 18H04881 und 18K19323) und Zuschüssen für Grundlagenforschungsprojekte von der Sumitomo Foundation an S.K.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass capilary | GD1 | Glass Capillary with Filament GD-1; Narishige | |
| Heparin sodium salt | H4784-1G | Sigma-aldrich | |
| Needle puller | P97 | Flaming/Brown Micropipette puller Model P-97; Sutter Instrument | |
| Nylon thread | N45VL | Polyamide suture, 0.2 metric; Crownjun | |
| Plastic tube | T9661 | Eppendorf Safe-lock microcentifuge tube 1.5 ml, Sigma-aldrich | |
| Razor blade | - | Astra Superior Platinum Double Edge Razor Blades Green, salonwholesale.com | |
| Silicone capillary | a16090800ux0403 | Uxcell Silicone Tube 1 mm ID x 2 mm OD, amazon.com | |
| Tricaine | WXBC9102V | Aldrich chemistry |
References
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