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Biology

छोटे आकार के टेलीओस्ट मॉडल जापानी मेडका(ओरिज़ियास लैटिप्स)में गोनाडेकॉमी और रक्त नमूना प्रक्रियाएं

Published: December 11, 2020 doi: 10.3791/62006
Automatic Translation
1, 2, 3, 4, 4, 1, 1
1Physiology Unit, Faculty of Veterinary Medicine, Norwegian University of Life Sciences, 2Laboratory of Physiology, Atmosphere and Ocean Research Institute, The University of Tokyo, 3Department of Biological Sciences, Graduate School of Science, The University of Tokyo, 4Centre of Reproduction, Development and Aging (CRDA), Faculty of Health Sciences, University of Macau

Summary

लेख एक त्वरित प्रोटोकॉल का वर्णन करने के लिए gonadectomize और छोटे teleost मछली से रक्त नमूना, जापानी medaka(Oryzias latipes)का उपयोग कर एक मॉडल के रूप में, पशु शरीर विज्ञान में सेक्स स्टेरॉयड की भूमिका की जांच करने के लिए ।

Abstract

सेक्स स्टेरॉयड, gonads द्वारा उत्पादित, मस्तिष्क और पीयूष ऊतक प्लास्टिसिटी में एक आवश्यक भूमिका निभाते हैं और मस्तिष्क और पीयूष को प्रतिक्रिया प्रदान करके सभी कशेरुकी में प्रजनन के न्यूरोएंडोक्राइन नियंत्रण में। टेलीओस्ट मछलियों में स्तनधारियों की तुलना में ऊतक प्लास्टिसिटी और प्रजनन रणनीतियों में भिन्नता की उच्च डिग्री होती है और वे सेक्स स्टेरॉयड की भूमिका और तंत्र की जांच करने के लिए उपयोगी मॉडल दिखाई देते हैं जिसके द्वारा वे कार्य करते हैं। स्टेरॉयड के स्तर को मापने के लिए रक्त नमूने के साथ एक साथ gonadectomy का उपयोग कर सेक्स स्टेरॉयड उत्पादन के मुख्य स्रोत को हटाने के लिए अच्छी तरह से स्थापित किया गया है और बड़ी मछली में काफी संभव है और भूमिका और सेक्स स्टेरॉयड के प्रभाव की जांच करने के लिए एक शक्तिशाली तकनीक है. हालांकि, ये तकनीक छोटे आकार के टेलीओस्ट मॉडल में लागू होने पर चुनौतियां बढ़ाती हैं। यहां, हम पुरुषों और महिला जापानी मेडाका दोनों में गोनाडेकॉमी की कदम-दर-कदम प्रक्रियाओं का वर्णन करते हैं जिसके बाद रक्त नमूनाकरण होता है। इन प्रोटोकॉल ों को एक उच्च जीवित रहने की दर, जीवन काल और मछली के फेनोटाइप के लिए सुरक्षा, और सेक्स स्टेरॉयड निकासी के मामले में प्रजनन क्षमता द्वारा इंगित मेडका में अत्यधिक व्यवहार्य दिखाया गया है। इस छोटे से टेलीओस्ट मॉडल का उपयोग करने के अन्य फायदों के साथ संयुक्त इन प्रक्रियाओं का उपयोग कशेरुकी में सेक्स स्टेरॉयड द्वारा प्रदान किए गए प्रजनन और ऊतक प्लास्टिसिटी के न्यूरोएंडोक्राइन नियंत्रण में प्रतिक्रिया तंत्र की समझ में काफी सुधार करेगा।

Introduction

कशेरुकी में, सेक्स स्टेरॉयड, जो मुख्य रूप से गोनाड द्वारा उत्पादित होते हैं, विभिन्न प्रतिक्रिया तंत्र 1,2,3,4,5के माध्यम से मस्तिष्क-पिट्यूटरी-गोनाडल (बीपीजी) धुरी के नियमन में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। इसके अलावा, सेक्स स्टेरॉयड मस्तिष्क में न्यूरॉन्स के प्रसार और गतिविधि को प्रभावित करते हैं6,7,8 और अंतःस्रावी कोशिकाओं, जिनमें गोंडोट्रोप्स शामिल हैं, पिट्यूटरी9,10में, और इस प्रकार मस्तिष्क और पीयूष प्लास्टिसिटी में महत्वपूर्ण भूमिकाओं को पूरा करते हैं। स्तनधारियों में अपेक्षाकृत अच्छे ज्ञान के बावजूद, सेक्स स्टेरॉयड द्वारा मध्यस्थता बीपीजी एक्सिस विनियमन का तंत्र गैर-स्तनधारी प्रजातियों में समझा जा रहा है, जिससे विकासवादी संरक्षित सिद्धांतों की खराब समझ11है। वहाँ अभी भी मस्तिष्क और पीयूष प्लास्टिसिटी पर सेक्स स्टेरॉयड की भूमिका का दस्तावेजीकरण अध्ययन की एक सीमित संख्या है, इस प्रकार भूमिका और विविध कशेरुकी प्रजातियों पर सेक्स स्टेरॉयड के प्रभाव की आगे की जांच के लिए की जरूरत को बढ़ाने.

कशेरुकी में, टेओस्ट कई जैविक और शारीरिक प्रश्नों को संबोधित करने में शक्तिशाली आदर्श जानवर बन गए हैं, जिनमें तनाव प्रतिक्रिया12,13,विकास14,15,पोषण शरीर विज्ञान16,17 और प्रजनन2शामिल हैं। टेलीओस्ट्स, जिसमें सेक्स स्टेरॉयड ज्यादातर महिलाओं में एस्ट्राडिओल (E2) और पुरुषों में 11-कीटोटेस्टोस्टेरोन (11-केटी) द्वारा प्रतिनिधित्व किया जाता है18,19,प्रजातियों में प्रजनन के सामान्य सिद्धांत की जांच के लिए लंबे समय से विश्वसनीय प्रयोगात्मक मॉडल रहे हैं। टेलीओस्ट अपने हाइपोथैलेमिक-पिट्यूटरी कनेक्शन20,21 और अलग गोंडोट्रोप कोशिकाओं22में विशिष्टता दिखाते हैं, जो कभी-कभी नियामक तंत्र के स्पष्टीकरण के लिए सुविधाजनक होते हैं। इसके अलावा, प्रयोगशाला और क्षेत्र दोनों प्रयोगों के लिए उनकी उत्तरदायीता के कारण, टेलीओस्ट अन्य जीवों की तुलना में कई फायदे प्रदान करते हैं। वे23 , 24की खरीद और रखरखाव के लिए अपेक्षाकृत सस्ती हैं । विशेष रूप से, जेब्राफिश(डैनियो रेरियो)और जापानी मेडाका(ओरिज़ियस लैटिप्स)जैसे छोटे टेलीओस्ट मॉडल, बहुत अधिक मलखंभ और अपेक्षाकृत कम जीवन चक्र वाली प्रजातियां हैं जो जीन फ़ंक्शन और रोग तंत्र23के तेजी से विश्लेषण को सक्षम करती हैं, इस प्रकार जैविक और शारीरिक प्रश्नों की अधिकता को संबोधित करने में और भी अधिक लाभ प्रदान करतीहैं,इन प्रजातियों के लिए उपलब्ध कई अच्छी तरह से विकसित प्रोटोकॉल और आनुवंशिक उपकरण किट को ध्यान में रखते हुए।

कई अध्ययनों में, रक्त नमूना तकनीकों के साथ गोनाड (गोनाडेक्टोमी) को हटाने का उपयोग कई शारीरिक प्रश्नों की जांच के लिए एक विधि के रूप में किया गया है, जिसमें स्तनधारियों में कशेरुकी प्रजनन शरीर विज्ञान में इसका प्रभाव26,27,28,पक्षी29 और उभयचर30शामिल हैं। यद्यपि प्रजनन शरीर विज्ञान पर गोनाडेकॉमी प्रभाव को वैकल्पिक रूप से सेक्स स्टेरॉयड विरोधी, जैसे टैमोक्सिफेन और क्लोमिफेन द्वारा नकल की जा सकती है, दवाओं का प्रभाव बिमोडल प्रभाव31,32के कारण असंगत प्रतीत होता है। सेक्स स्टेरॉयड विरोधी के लिए पुराने जोखिम अंडाशय वृद्धि33,34,जो एक अस्वस्थ फेनोटाइप के कारण दीर्घकालिक प्रयोजनों के लिए इसके प्रभाव के अवलोकन को अक्षम कर सकते हैं करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं। इसके अलावा, कुछ सेक्स स्टेरॉयड के विशिष्ट प्रभाव को वारंट करने के लिए सेक्स स्टेरॉयड विरोधी उपचार के बाद एक वसूली प्रयोग करना असंभव है। उन उपरोक्त बिंदुओं के साथ, सेक्स स्टेरॉयड विरोधी उपयोग के अन्य व्यापार-नापसंद की बड़े पैमाने पर समीक्षा की गई है31,32। इसलिए, गोनाडेकॉमी आज भी सेक्स स्टेरॉयड की भूमिका की जांच करने के लिए एक शक्तिशाली तकनीक के रूप में प्रकट होता है।

जबकि गोनाडेकटॉमी और रक्त नमूना तकनीक बड़ी प्रजातियों में प्रदर्शन करने के लिए अपेक्षाकृत आसान हैं, जैसे यूरोपीय समुद्री बास(डिसेंट्रारकस लैब्राक्स)35,ब्लूहेड रैस(थैलेसोमा बिफसियाटम)36,डॉगफिश(स्किलोहिनस कैनिकुला)37 और कैटफ़िश(हेट्रोपेनियस फॉसिलिस और क्लेरिस बाथराकस)38,39,वे छोटी मछलियों में मेडका के रूप में लागू होने पर चुनौतियां बढ़ाते हैं। उदाहरण के लिए, मछली संज्ञाहरण वितरण प्रणाली (FADS)४० का उपयोग कम संभव है और छोटी मछली के लिए अत्यधिक शारीरिक क्षति का खतरा प्रतीत होता है । इसके अलावा, एक गोनाडेक्टोमी प्रक्रिया जो आमतौर पर बड़ी मछली40 के लिए उपयोग की जाती है, छोटी मछली के लिए उपयुक्त नहीं है जिसके लिए अत्यधिक क्षति से बचने के लिए उच्च परिशुद्धता की आवश्यकता होती है। अंत में, रक्त वाहिकाओं तक सीमित पहुंच और उन जानवरों में रक्त की थोड़ी मात्रा के कारण रक्त नमूना चुनौतीपूर्ण है। इसलिए, एक छोटे से टेलीओस्ट में गोनाडेकॉमी और रक्त नमूने के हर कदम का प्रदर्शन करने वाला एक स्पष्ट प्रोटोकॉल महत्वपूर्ण है।

यह प्रोटोकॉल जापानी मेडाका में रक्त नमूने के बाद गोनाडेकॉमी की कदम-दर-कदम प्रक्रियाओं को दर्शाता है, जो पूर्वी एशिया के मूल निवासी एक छोटे मीठे पानी की मछली है। जापानी मेडका में एक अनुक्रमित जीनोम, कई आणविक और आनुवंशिक उपकरण उपलब्धहैं,और एक आनुवंशिक लिंग निर्धारण प्रणाली है जो माध्यमिक यौन विशेषताओं या गोनाडों को अच्छीतरहसे विकसित करने से पहले यौन मतभेदों की जांच के लिए अनुमति देती है। दिलचस्प बात यह है कि जापानी मेडका के पास कई अन्य टेलीओस्ट प्रजातियों के विपरीत फ्यूज्ड गोनाडहैं। इन दो तकनीकों को संयुक्त रूप से कुल मिलाकर केवल 8 मिनट का समय लगेगा और इस प्रजाति के लिए पहले से मौजूद वीडियो प्रोटोकॉल की सूची पूरी हो जाएगी जिसमें रक्त वाहिकाओं43की लेबलिंग, पिट्यूटरी सेक्शन44 और ब्रेन न्यूरॉन्स45पर पैच-क्लैंप और प्राथमिक सेल कल्चर46शामिल हैं। इन तकनीकों अनुसंधान समुदाय की जांच करने के लिए और बेहतर प्रतिक्रिया तंत्र में सेक्स स्टेरॉयड की भूमिकाओं के रूप में के रूप में अच्छी तरह से मस्तिष्क और पीयूष प्लास्टिसिटी भविष्य में समझने की अनुमति होगी.

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Protocol

नार्वे के जीवन विज्ञान विश्वविद्यालय में प्रायोगिक पशु कल्याण पर सिफारिशों के अनुसार सभी प्रयोग और पशु हैंडलिंग आयोजित किए गए थे । नार्वे खाद्य सुरक्षा प्राधिकरण (FOTS ID 24305) द्वारा गोनाडेकॉमी का उपयोग करने वाले प्रयोगों को मंजूरी दी गई थी।

नोट: प्रयोग वयस्क पुरुष और महिला (6-7 महीने पुराने, वजन सीए 0.35 ग्राम, लंबाई सीए 2.7 सेमी) जापानी मेडाका का उपयोग करके किए गए थे। सेक्स42, 47में वर्णित पृष्ठीय और गुदा पंख के आकार और आकार जैसे माध्यमिक यौन विशेषताओं को अलग करके निर्धारित किया गया था।

1. उपकरण और समाधान तैयारी

  1. एनेस्थेटिक स्टॉक सॉल्यूशन (0.6% ट्राइकेन) तैयार करें।
    1. 10x फॉस्फेट बफर नमकीन (पीबीएस) के 100 एमएल में ट्राइकेन (एमएस-222) का पतला 0.6 ग्राम।
    2. कई 1.5 एमएल प्लास्टिक ट्यूब में ट्राइकेन स्टॉक समाधान के 1 एमएल वितरित करें और उपयोग होने तक -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  2. एक्वेरियम के पानी के 2 एल में एनएसीएल के 18 ग्राम जोड़कर रिकवरी वाटर (0.9% एनएसीएल सॉल्यूशन) तैयार करें। उपयोग होने तक कमरे के तापमान पर समाधान स्टोर करें।
  3. एक तेज बिंदु(चित्रा 1A)प्राप्त करने के लिए तिरछे एक उस्तरा तोड़कर चीरा उपकरण तैयार करें।
  4. 1x पीबीएस के 500 माइक्रोन में सोडियम हेपरिन के 25 माइक्रोन को कमजोर करके रक्त विरोधी स्कंद समाधान (सोडियम हेपरिन का 0.05 यू/माइक्रोन) तैयार करें। उपयोग होने तक एंटी-स्कंदमित समाधान को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  5. निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए सुई खींचने वाले(चित्रा 1B)के साथ ग्लास केशिका खींचकर 90 मिमी लंबी ग्लास केशिका से दो ग्लास सुई तैयार करें।
    नोट: कांच की सुई का बाहरी व्यास 1 मिमी है, जबकि आंतरिक व्यास 0.6 मिमी है।
  6. ढक्कन को काटकर 1.5 एमएल प्लास्टिक ट्यूब का ढक्कन तैयार करें और एक छेद बनाएं जो सुई बाहरी व्यास(चित्रा 1C)के साथ फिट बैठता है। छेद बनाने के लिए, 9 मिमी ग्लास केशिका के एक छोर को गर्म करें और ढक्कन के माध्यम से गर्म ग्लास केशिका पर वार करें। वैकल्पिक रूप से, ढक्कन के माध्यम से वार करने के लिए एक सुई का उपयोग करें जब तक कि छेद का व्यास 9-मिमी ग्लास केशिका के साथ फिट न हो।

2. गोनाडेकॉमी प्रक्रिया

  1. एक्वेरियम के पानी के 30 एमएल में ट्राइकेन स्टॉक (0.6%) की एक ट्यूब को पतला करके एनेस्थेटिक समाधान का 0.02% तैयार करें।
  2. एक अल्ट्रा-फाइन और दो ठीक संदंश (अपेक्षाकृत व्यापक टिप के साथ एक), छोटी कैंची, नायलॉन धागा और उस्तरा सहित विच्छेदन उपकरण तैयार करें जैसा कि चरण 1.3 में वर्णित है।
  3. मछली को 30-60 सेकंड के लिए 0.02% एनेस्थेटिक समाधान में डालकर एनेस्थेटाइज करें।
    नोट: संज्ञाहरण की अवधि मछली के आकार और वजन पर निर्भर करती है और इसे अनुकूलित किया जाना चाहिए। यह सुनिश्चित करने के लिए कि मछली पूरी तरह से एनेस्थेटाइज्ड है, मछली के शरीर को धीरे से संदंश का उपयोग करके चुटकी ली जा सकती है। अगर मछली प्रतिक्रिया नहीं देती है तो गोनाडेकॉमी शुरू की जा सकती है।
  4. एनेस्थेटिक समाधान से मछली को बाहर निकालें और मछली को क्षैतिज रूप से अपनी तरफ रखें, एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के नीचे पानी से बाहर रखें।
  5. महिलाओं में ओवेरेक्टॉमी (ओवेक्स)
    1. ओविपोसिटेड अंडे (मादा शरीर के बाहर लटके अंडे) को हटा दें यदि कोई हो और चीरा क्षेत्र(चित्रा 2 ए)में तराजू को कुरेदें।
    2. धीरे-धीरे रेज़र ब्लेड का उपयोग करके पेल्विक और गुदा पंख (चित्रा 2 ए) के बीच पसलियों के बीच2-2.5 मिमी लंबा चीराबनाएं। फिर, धीरे से मछली के पेट चुटकी जबकि अंडाशय बाहर ले थोड़ा चौड़ा टिप के साथ ठीक संदंश का उपयोग कर के द्वारा ।
    3. अंडाशय के अंत को ठीक संदंश का उपयोग करके काटें और अंडाशय को एक तरफ रखें(चित्रा 2B)।
      नोट: यदि संभव हो तो अंडाशय की थैली को न तोड़ें, इसका ध्यान रखें। यदि अंडाशय की थैली टूट जाती है, तो किसी भी गैर-अंडों को छोड़े बिना किसी भी गोनाड निशान को पूरी तरह से हटा दें।
  6. पुरुषों में ऑर्किडेकेक्टॉमी
    1. धीरे-धीरे गुदा(चित्रा 2A)के ऊपर पसलियों के बीच एक चीरा बनाएं, और ठीक संदंश का उपयोग करके चीरा धीरे-धीरे खोलें।
    2. धीरे-धीरे ठीक संदंश का उपयोग करके टेस्ट को पकड़ें और धीरे-धीरे टेस्ट को बाहर निकालें। बाद में, टेस्ट(चित्रा 2B)को पूरी तरह से हटाने के लिए टेस्ट के अंत में कटौती करें। पुरुष ऑर्किडेकॉमी के लिए, सभी तैयारी चीरा भाग तक महिलाओं में समान हैं। टेस्ट हथियाने पर, कभी-कभी टेस्ट्स जैसी वसा प्राप्त होती है। हालांकि, वसा को बहाल करने के बाद, टेस्ट्स को फिर से खोजने की कोशिश करना संभव है(चित्रा 2B)।
      नोट: पुरुषों और महिलाओं दोनों के लिए, अत्यधिक क्षति को रोकने के लिए पेट में चीरा आकार को कम करना महत्वपूर्ण है जो मृत्यु दर का कारण बन सकता है। कभी-कभी आंतों को गोनाड के साथ चीरा के माध्यम से भी दिखाई दे सकता है, इसलिए सुनिश्चित करें कि वे बंद होने से पहले चीरा के अंदर ठीक से लौट ें। मेडका पेट में अंडाशय और वृषण स्थान पर पूर्व ज्ञान आवश्यक है।
  7. सीवन चीरा इसी तरह पुरुषों और महिलाओं में(चित्र 3)।
    1. चीरा क्षेत्र के बगल में नायलॉन धागा रखें और अल्ट्रा-फाइन संदंश का उपयोग करके चीरा के दाईं ओर से त्वचा पर वार करें ताकि धागे को ठीक संदंश(चित्र 3,1-2)के साथ लिया जा सके ।
    2. धागे (चित्र 3, 3-4)को बाहर निकालने के लिए बाहरी शरीर गुहा के माध्यम से चीरा के बाईं ओर से त्वचा परवार करें।
    3. चीरा खोलने को बंद करें और दो समुद्री मील बनाएं और अत्यधिक धागे(चित्र 3,4-6)को काट लें।
      नोट: सीवन पर्याप्त रूप से तंग होना चाहिए, और मछली पर शेष धागा सीवन के ढीला को रोकने के लिए काफी लंबा होना चाहिए । संज्ञाहरण से पूरी प्रक्रिया जब तक टांका आमतौर पर 6 मिनट तक लगते हैं । अधिक समय से मृत्यु दर हो सकती है।
    4. मछली को रिकवरी के पानी में रखें और उन्हें एक्वेरियम सिस्टम में स्थानांतरित करने से पहले कम से कम 24 घंटे के लिए छोड़ दें।
      नोट: गोनाडेक्टोमाइज्ड मछली आमतौर पर रिकवरी पानी में 1-2 घंटे के बाद सामान्य व्यवहार दिखाती है। इसलिए, प्रयोग उद्देश्य के आधार पर, कोई भी इस समय अंतराल के बाद मछली का नमूना ले सकता है।

3. रक्त नमूना प्रक्रिया

  1. उपकरण तैयार करें: एक ग्लास सुई, एक सिलिकॉन केशिका, एक छेद के साथ एक प्लास्टिक ट्यूब, एक खाली 1.5 एमएल प्लास्टिक ट्यूब, एक लघुकेंद्री और टेप।
  2. चरण 2.1 में वर्णित 0.02% एनेस्थेटिक समाधान का उपयोग करके मछली को एनेस्थेटाइज करें और मछली को एक ऊर्ध्वाधर स्थिति(चित्रा 4A)में विच्छेदन माइक्रोस्कोप के नीचे रखें। कौडल पंचर नस के दृश्य को कम करने के लिए मछली को एक उज्ज्वल सतह पर रखें।
  3. सिलिकॉन केशिका(चित्रा 4B)के लिए एक गिलास सुई संलग्न करके रक्त दराज स्थापित करें । सुई की नोक को व्यापक टिप संदंश के साथ तोड़ें और सुई के अंदर को सक्शन और उड़ाने के द्वारा एंटी-स्कंदपार्थ समाधान के साथ कोट करें।
    नोट: चूसने वाले और कम से कम 50 सेमी लंबाई वाले सिलिकॉन केशिका के उपयोग की सिफारिश सुरक्षा उपायों के लिए की जाती है ताकि सक्शन करते समय रक्त के किसी भी सीधे संपर्क से बचा जा सके। इसके अलावा, सुनिश्चित करें कि सुई टिप का उद्घाटन रक्त खींचने की अनुमति देने के लिए पर्याप्त रूप से बड़ा है।
  4. मछली के पेडकल क्षेत्र की ओर सुई को निर्देशित करें, कौडल पेडकल नस(चित्रा 5A) पर निशाना साधेंऔर मुंह का उपयोग करके रक्त को तब तक आकर्षित करें जब तक कि सुई की कुल मात्रा कम से कम एक हो जाती है(चित्रा 5B)।
    नोट: मछली के शरीर से सुई हटाने से पहले सक्शन को रोकना महत्वपूर्ण है।
  5. सुई छोड़ें और सुई के तेज पक्ष की निकटता पर टेप का एक टुकड़ा डाल दिया। एक संग्रह ट्यूब पर एक छेद के साथ ढक्कन रखें और बाहर(चित्रा 5C)पर सुई टिप के साथ छेद के माध्यम से ट्यूब के अंदर सुई डाल दिया ।
  6. मछली को रिकवरी के पानी में रखें और उन्हें एक्वेरियम सिस्टम में स्थानांतरित करने से पहले कम से कम 24 घंटे के लिए छोड़ दें।
    नोट: एक ही मछली से एक दूसरे रक्त नमूना प्रदर्शन करने के लिए, पहले रक्त नमूने के बाद एक सप्ताह रक्त का नमूना ।
  7. फ्लैश ट्यूब में रक्त एकत्र करने के लिए कमरे के तापमान पर 1,000 x ग्राम के साथ 1-2 सेकंड के लिए एकत्र रक्त को नीचे स्पिन करें।
  8. सीधे डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों पर आगे बढ़ें या उपयोग होने तक -20 डिग्री सेल्सियस पर रक्त स्टोर करें।
    नोट: पूरे रक्त48से सेक्स स्टेरॉयड निष्कर्षण के लिए पिछले अध्ययन का उल्लेख है.

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Representative Results

यह प्रोटोकॉल एक छोटे आकार के मॉडल टेलीओस्ट, जापानी मेडका में गोनाडेकॉमी और रक्त नमूने के प्रदर्शन के लिए हर कदम का वर्णन करता है। महिलाओं में ओवेरेक्टॉमी (ओवेक्स) के बाद मछली की जीवित रहने की दर 100% (10 में से 10 मछली) है जबकि पुरुषों के 94% (17 मछली में से 17) ऑर्किडेक्टोमी के बाद बच गए। इस बीच, रक्त नमूना प्रक्रिया के बाद प्रदर्शन किया गया था, सभी (३८ मछली) मछली बच गया ।

नकली संचालित महिलाओं को ओविपोशन(चित्रा 6A) दिखातेहैं और सभी अंडों को निषेचित किया गया था और भ्रूणीय विकास(चित्रा 6B)के लिए अनुमति दी गई थी। शाम संचालित पुरुष भी केवल 1-2 सप्ताह के बाद अंडे को उपजाऊ बनाने में सक्षम थे। आंशिक रूप से गोनाडेकोमीकृत पुरुषों के साथ पाला छह में से दो महिलाओं ने भी 2 महीने के बाद निषेचित अंडों के 100% के साथ अंडाशय दिखाया। इसके विपरीत, 4 महीने के बाद भी, पूरी तरह से गोनाडेक्टोमाइज्ड मछली में पुरुषों द्वारा महिलाओं या निषेचन में कोई अंडाशय नहीं देखा गया था।

जब सही ढंग से प्रदर्शन किया, मछली के शरीर के आकारथोड़ा बदलता है (चित्रा 7A),और गोनाड का कोई टुकड़ा gonadectomy प्रक्रिया(चित्रा 7B) केबाद रहना चाहिए । इस बीच, 4 सप्ताह के बाद gonadectomy, चीरा और सीवन पूरी तरह से गायब हो गया(चित्रा 8),और 4 महीने के बाद, सभी gonadectomized मछली अभी भी स्वस्थ फेनोटाइप दिखाया, और कोई गोंडल ऊतक पाया गया था ।

महिलाओं में E2 रक्त सांद्रता(तालिका 1),निर्माता के निर्देशों के बाद एलिसा के साथ मापा, पता चला कि OVX मछली में E2 स्तर काफी नकली संचालित मछली की तुलना में कम है 24 घंटे सर्जरी के बाद(पी < ०.००१) । 4 महीने के बाद, OVX मछली में E2 स्तर भी नकली संचालित मछली(पी < ०.०१) की तुलना में काफी कम है और 24 घंटे के बाद OVX मछली(पी > ०.०५) में है कि तुलना में कोई महत्वपूर्ण अंतर दिखाता है । अंत में, आंशिक रूप से OVX मछली, जहां केवल 1/3 से 1/2 गोंड़ को हटा दिया गया था, नकली संचालित मछली(पी = ०.०४३७) और पूरी तरह से OVX मछली(पी < ०.००००१)(चित्रा 9A)की तुलना में काफी कम E2 स्तर दिखाते हैं ।

इसी तरह पुरुषों(तालिका 1)में, ऑर्किडेक्टोमाइज्ड मछली में 11-केटी एकाग्रता सर्जरी के 24 घंटे बाद नकली-संचालित मछली की तुलना में काफी कम है(पी < 0.00001)। 4 महीने के बाद ऑर्किडेक्टोमाइज्ड मछली में 11-केटी का स्तर भी नकली-संचालित मछली(पी < 0.00001) की तुलना में काफी कम है और 24 घंटे के बाद ऑर्किडेक्टोमाइज्ड मछली(पी > 0.05) की तुलना में कोई अंतर नहीं दिखाता है। अंत में, आंशिक रूप से ऑर्किडेक्टोमाइज्ड मछली नकली-संचालित मछली(पी = 0.0428) की तुलना में 11-केटी के काफी निचले स्तर और पूरी तरह से ऑर्किडेक्टोमाइज्ड मछली(पी < 0.00001)(चित्रा 9B)की तुलना में 11-केटी का काफी उच्च स्तर दिखाती है।

Figure 1
चित्रा 1। साधन की तैयारी। (एक)गोनाडेकटॉमी के लिए रेजर ब्लेड, रक्त निकालने के लिएकांचकी सुई, और(ग)रक्त संग्रह के लिए एक छेद के साथ ढक्कन के साथ एक प्लास्टिक ट्यूब । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2। चीरा क्षेत्र का स्थान। A)पसलियों के बीच स्थित चीरा क्षेत्र की ड्राइंग, महिलाओं (बाएं पैनल) और पुरुषों (दाएं पैनल) में पेल्विक और गुदा पंख के बीच; B)महिलाओं में गोनाड हटाने (बाएं पैनल) और पुरुषों (दाएं पैनल), संयुक्त भाग दिखा सफेद हलकों, सफेद तीर टेस्टिस और काले तीर वसा दिखा दिखा । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3। सीवन की प्रक्रिया। 1) अल्ट्रा-फाइन संदंश का उपयोग करके चीरा के दाईं ओर एक छेद किया जाता है। 2) नायलॉन धागा 1 में बने छेद का उपयोग कर त्वचा के माध्यम से पारित किया जाता है। 3) चीरा के बाईं ओर एक छेद किया जाता है। 4) नायलॉन धागा 3 में बने छेद के माध्यम से पारित किया जाता है। 5) चीरा बंद करने के लिए दो बार एक ओवरहैंड गाँठ बनाई जाती है। 6) अतिरिक्त धागा काटा जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4। रक्त नमूना (ए) के दौरान मछली की स्थिति, सिलिकॉन केशिका (बी) के साथ कांच की सुई की स्थापना। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5। रक्त नमूना (ए), खींचा रक्त (बी) और रक्त संग्रह कदम (सी) के सक्शन क्षेत्र। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 6
चित्रा 6। नकली संचालित मछली सफेद तीर (ए) और निषेचित अंडे (बी) द्वारा इंगित अंडे के अंडाशय से पता चलता है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 7
चित्रा 7। रूपात्मक (ए) और शारीरिक (बी) अक्षुण्ण और गोनाडेक्टोमाइज्ड मछली की उपस्थिति। सफेद तीर (शीर्ष पैनल) गोनाडेकॉमाइज्ड मछली पर सर्जरी का निशान दिखाते हैं। काले तीर (नीचे पैनल) बरकरार मछली में गोनाड दिखाते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 8
चित्रा 8। 4 सप्ताह के बाद पुरुष और मादा मछली में सर्जरी के निशान। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 9
चित्रा 9। महिला (ए) में E2 का रक्त स्तर और पुरुष (बी) जापानी मेडका में 11-केटी, नकली ऑपरेशन (नियंत्रण), आंशिक रूप से गोनाडेकॉमी या गोनाडेकॉमी के 24 घंटे बाद, और गोनाडेकॉमी (ओवेक्स, महिलाओं में ओविएरेक्टॉमी) के 4 महीने बाद; पुरुषों में कैस, ऑर्किडेटोमी)। सांख्यिकीय विश्लेषण एक तरह से ANOVA का उपयोग कर प्रदर्शन किया गया Tukey पोस्ट हॉक परीक्षण के बाद । विभिन्न पत्र (ए-सी) महत्वपूर्ण अंतर(पी-वैल्यू< 0.05) दिखाते हैं। ग्राफ में डेटा मतलब + एसडी, एन = 5 के रूप में प्रदान की जाती हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

E2 स्तर (महिलाएं) 11-KT स्तर (पुरुष)
शाम संचालित 4.15 ± 0.5 (n = 5) 10.38 ± 1.32 (n = 5)
आंशिक रूप से गोनाडेकॉमाइज्ड 3.37 ± 0.6 (n = 5) 8.37 ± 1.92 (n = 5)
24h के बाद गोनाडेक्टॉमी 0.36 ± 0.2 (n = 5) 0.4 ± 0.2 (n = 5)
4 महीने के बाद गोनाडेक्टॉमी 0.54 ± 0.28 (n = 5) 0.74 ± 0.22 (n = 5)

तालिका 1. महिलाओं और पुरुषों में ई 2 और 11-केटी स्तर (एनजी/एमएल) नकली संचालित और गोनाडेकटोमाइज्ड और आंशिक रूप से गोनाडेक्टोमाइज्ड मछली ।

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Discussion

जैसा कि पिछले साहित्य में बताया गया है, बीपीजी धुरी के नियमन में सेक्स स्टेरॉयड की भूमिका से संबंधित सवालों की जांच करने के लिए अन्य मॉडल प्रजातियों में गोनाडेकॉमी और रक्त नमूना का उपयोग किया जाता रहा है। हालांकि, ये तकनीक केवल बड़े जानवरों के लिए उत्तरदायी प्रतीत होती है। आमतौर पर इस्तेमाल किए जाने वाले टेलीओस्ट मॉडल, जापानी मेडका के छोटे आकार को ध्यान में रखते हुए, हम इस प्रजाति के लिए व्यवहार्य गोनाडेकॉमी और रक्त नमूने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं।

तथ्य यह है कि गोनाडेकोमाइज्ड मछली की जीवित रहने की दर लगभग 100% तक पहुंच गई है, इंगित करता है कि मेडिका पर लागू होने वाली गोनाडेक्टोमी प्रक्रिया संभव है। इसी प्रकार, रक्त नमूने की प्रक्रिया इस प्रक्रिया से गुजरने के बाद 100% जीवित रहने की दर से दिखाई गई मछली की जीवित रहने की जीवितता को प्रभावित नहीं करती है। इसके अलावा, नकली संचालित महिलाओं को नकली संचालित पुरुषों के साथ एक साथ पाला अंडाशय और 100% निषेचित अंडे दिखाते हैं, यह दर्शाता है कि चीरा और सीवन प्रक्रिया मछली के प्रजनन को प्रभावित नहीं करती है। दूसरे शब्दों में, वे अंडे के लिए काफी स्वस्थ थे । इसके अलावा, आंशिक रूप से गोनाडेकॉमाइज्ड मछली सेक्स स्टेरॉयड की तुलनीय सांद्रता को नकली-संचालित मछली में दिखाती है, और कुछ महिलाओं में अंडाशय के साथ-साथ पुरुषों द्वारा अंडों के निषेचन को आंशिक रूप से गोनाडेक्टोमाइज्ड मछली में देखा गया था। इन परिणामों से पता चलता है कि गोनाडेकॉमी की प्रक्रिया को उच्च परिशुद्धता के साथ किया जाना चाहिए, जिसका अर्थ है कि अंडाशय या टेस्ट को पूरी तरह से हटा दिया जाना चाहिए।

जैसा कि चित्रा 8में दिखाया गया है, मछली पर चीरा और सीवन का निशान पूरी तरह से 4 सप्ताह के बाद गायब हो गया, और मछली अभी भी जीवित हैं और सर्जरी के 4 महीने बाद स्वस्थ दिखते हैं। ये इंगित करते हैं कि ऑपरेशन प्रक्रिया दीर्घकालिक उद्देश्य के लिए मछली के लिए सुरक्षित है और मछली के जीवन काल को प्रभावित नहीं करती है। इसके अलावा, 4 महीने के बाद, कोई गोंड़ नहीं देखा गया। यह E2 और 11-KT के निम्न स्तर से पुष्टि की जाती है जो अभी भी 24 घंटे के बाद गोनाडेकॉमाइज्ड मछली में पाए जाने वाले लोगों के समान हैं।

गोनाडेक्टोमाइज्ड मछली में E2 और 11-केटी का स्तर नकली-संचालित मछली की तुलना में काफी कम है, पहले से ही 24 घंटे के बाद गोनाडेकॉमी और गोनाडेक्टोमी के बाद 4 महीने नमूना मछली में कम रहते हैं । नियंत्रण की तुलना में गोनाडेक्टोमाइज्ड मछली में सेक्स स्टेरॉयड का स्तर काफी कम पाया गया है , जो पिछले अध्ययनों में डॉगफिश37, कैटफ़िश39 और मेडाका48में देखा गया है . इन लगातार सबूतों से पता चलता है कि प्रोटोकॉल में वर्णित गोनाडेक्टोमी प्रक्रिया परिसंचारी सेक्स स्टेरॉयड को स्पष्ट करने के लिए एक विश्वसनीय तकनीक है।

चूंकि यह प्रक्रिया40में प्रदर्शित FADS पर निर्भर नहीं करती है, इसलिए सर्जरी के दौरान मृत्यु दर को रोकने के लिए जितनी जल्दी हो सके गोनाडेक्टोमी किया जाना चाहिए। दरअसल, FADS का उपयोग ऑपरेशन की लय को बनाए रखने में सक्षम बनाता है क्योंकि यह उपकरण हवा के संपर्क में आने के बावजूद मछली को निरंतर संवेदनाहारी स्थिति की अनुमति देता है। फिर भी, मेडाका के रूप में छोटे टेलीओस्ट में इसकी कम व्यवहार्यता के कारण, FADS का उपयोग मछली के उस आकार के साथ नहीं किया जा सकता है। इसके अलावा, बड़ी मछली में पिछले गोनाडेक्टॉमी प्रोटोकॉल के विपरीत जो गोनाड तक पहुंचने के लिए व्यापक चीरा लगाने में सक्षम बनाता है, इस पांडुलिपि में वर्णित प्रोटोकॉल छोटी मछली को अत्यधिक क्षति से बचने के लिए व्यापक चीरा की अनुमति नहीं देता है। इसलिए, मछली के शरीर गुहा के अंदर अन्य ऊतकों में नुकसान को रोकने के लिए संदंश का उपयोग करते समय गोनाड तक पहुंचने की कोशिश करते समय बहुत सावधान रहना चाहिए।

प्रोटोकॉल एक त्वरित और स्वच्छ प्रक्रिया पर निर्भर करता है। इस प्रकार उच्च सफलता दर तक पहुंचने तक प्रशिक्षण की अत्यधिक सिफारिश की जाती है, जो गोनाडॉमी के बाद मछली की उच्च जीवित रहने की दर के साथ-साथ गोनाडों को पूरी तरह से हटाने के लिए संकेत दिया जाता है (चित्रा 7में सफल गोनाडेक्टोमी से पहले और बाद में मछली की रूपात्मक और शारीरिक उपस्थिति का अंतर देखें)। वास्तव में, कई कारक प्रक्रिया की सफलता दर को प्रभावित कर सकते हैं, जिसमें संज्ञाहरण अवधि, चीरा की व्यापकता, प्रक्रिया के दौरान सीवन और मछली हैंडलिंग की सटीकता और tidiness शामिल है। एक और महत्वपूर्ण बात यह है कि किसी को प्रोटोकॉल करने से पहले मछली को बेहतर ढंग से बनाए रखकर स्वस्थ मछली तैयार करनी चाहिए ।

रक्त नमूना प्रक्रिया के संबंध में, पिछले अध्ययनों ने मेडाका 48 और जेब्राफिश49, 50, 51से रक्त का नमूना लेने का प्रयास किया है, लेकिन प्रक्रिया एक ही मछली में बार-बार रक्त नमूने की अनुमति नहीं देती है क्योंकि मछली को इच्छामृत्यु के बाद रक्त लियाजाताहै। एक अन्य अध्ययन52में जेब्राफिश का उपयोग करके बार-बार रक्त नमूने का प्रदर्शन किया गया है, लेकिन हम मेडका में पहली बार इस प्रकार के प्रोटोकॉल की रिपोर्ट करते हैं।

सेक्स स्टेरॉयड सांद्रता का मूल्यांकन आमतौर पर एंजाइम से जुड़े इम्यूनोसोर्बेंट परख (एलिसा) किट का उपयोग करके किया जाता है, और विभिन्न प्रकार के सेक्स स्टेरॉयड के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध कई एलिसा किट हैं। रक्त नमूने के दौरान एकत्र रक्त की कम मात्रा के कारण, डाउनस्ट्रीम परख पूरे रक्त के लिए होती है। पिछले अध्ययनों से पता चला है कि पूरे रक्त और प्लाज्मा53,54से निकाले गए स्टेरॉयड के स्तर को प्रसारित करने के मापा स्तर में अंतर है। इसलिए, पूरे रक्त और प्लाज्मा से सेक्स स्टेरॉयड के स्तर में अंतर प्रोटोकॉल का उपयोग कर वास्तविक प्रयोग करने से पहले मान्य करने की जरूरत है।

जैसा कि विभिन्न पशु मॉडलों के साथ पिछले अध्ययनों में प्रलेखित किया गया है, यहां वर्णित प्रोटोकॉल एक मॉडल के रूप में एक छोटे आकार के टेलीओस्ट का उपयोग करके प्रजनन शरीर विज्ञान से संबंधित प्रश्नों की जांच करने की अनुमति देगा। वास्तव में, इन तकनीकों ने पहले ही बीपीजी धुरी और उसके फीडबैक तंत्र के नियमन से संबंधित सवालों के जवाब देने में योगदान दिया है, जैसे kiss1 (kisspeptin जीन प्रकार 1) की भागीदारी सकारात्मक प्रतिक्रिया छोरों में न्यूरॉन्स व्यक्त५५,एस्ट्रोजन-नाभिक वेंट्रालिस ट्यूबरिस (NVT) में न्यूरॉन्स व्यक्त kiss1 के मध्यस्थता विनियमन, और kiss2 (kisspeptin जीन प्रकार 2) प्रीओप्टिक क्षेत्र (POA)५६,में न्यूरॉन्स व्यक्त 57,महिला जापानी मेडका58 में डाउन-रेस्ट्रंट एफएसएच अभिव्यक्ति स्तर में एस्ट्रोजन रिसेप्टर 1 (Esr2a) की संभावित भागीदारी के साथ-साथ महिला मछली48में ई 2 की सर्कैडियन लय की प्रोफ़ाइल। इसके अलावा, चूंकि पिछले अध्ययनों से पता चला है कि सेक्स स्टेरॉयड भी टेलीओस्ट59,60के पीयूष में गोंडोट्रोप कोशिकाओं के प्रसार को प्रभावित करते हैं, यह पीयूष प्लास्टिसिटी पर गोनेडेक्टॉमी के बाद सेक्स स्टेरॉयड क्लीयरेंस के प्रभावों की जांच करने के लिए पेचीदा है।

रक्त नमूना तकनीक न केवल सेक्स स्टेरॉयड विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन यह भी रक्त शर्करा के स्तर सहित अन्य रक्त सामग्री विश्लेषण के लिए. दरअसल, प्रोटोकॉल को रक्त ग्लूकोज मापन के लिए भी लागू किया जा सकता है जैसा कि जेब्राफिश52 और मेडाका61में प्रदर्शित किया गया था। इसलिए, फिजियोलॉजी के अन्य क्षेत्रों में शोध प्रश्नों को संबोधित करने के लिए इस तकनीक का विस्तार किया जा सकता है।

अंत में, यहां वर्णित प्रोटोकॉल वयस्क जापानी मेडका के लिए इरादा और अनुकूलित हैं, और प्रक्रियाओं के दौरान उपयोग की जाने वाली मछली और सामग्रियों के विभिन्न आकार के कारण परिणाम भिन्न हो सकते हैं। इसके अलावा, जैसा कि मेडाका लेफ्ट और राइट अंडाशय/टेस्ट को फ्यूज किया जाता है, जो गोनाडेक्टोमी के लिए एक महत्वपूर्ण लाभ प्रदान कर सकता है, इस प्रोटोकॉल को अन्य प्रजातियों में इस्तेमाल किए जाने से पहले कई रूपांतरों की आवश्यकता हो सकती है जहां यह ज़ेब्राफिश में ऐसा नहीं है । इस प्रकार, प्रयोगशाला उपकरणों और मछली के आकार की पसंद के अनुसार एक अनुकूलन इन प्रोटोकॉल का परीक्षण करने से पहले ध्यान में रखा जाना चाहिए ।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

लेखक मछली पालन में उसकी सहायता के लिए सुश्री लूर्डेस कैरेऑन जी टैन का शुक्रिया अदा करते हैं । इस काम को एनएमबीयू द्वारा वित्त पोषित किया गया था, जापान सोसायटी फॉर द प्रमोशन ऑफ साइंस (जेएसपीएस) (ग्रांट नंबर 18H04881 और 18K19323) से अनुदान-सहायता, और सुमितोमो फाउंडेशन से एसके के लिए बुनियादी विज्ञान अनुसंधान परियोजनाओं के लिए अनुदान

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Glass capilary GD1 Glass Capillary with Filament GD-1; Narishige
Heparin sodium salt H4784-1G Sigma-aldrich
Needle puller P97 Flaming/Brown Micropipette puller Model P-97; Sutter Instrument
Nylon thread N45VL Polyamide suture, 0.2 metric; Crownjun
Plastic tube T9661 Eppendorf Safe-lock microcentifuge tube 1.5 ml, Sigma-aldrich
Razor blade - Astra Superior Platinum Double Edge Razor Blades Green, salonwholesale.com
Silicone capillary a16090800ux0403 Uxcell Silicone Tube 1 mm ID x 2 mm OD, amazon.com 
Tricaine WXBC9102V Aldrich chemistry

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छोटे आकार के टेलीओस्ट मॉडल जापानी मेडका<em>(ओरिज़ियास लैटिप्स)</em>में गोनाडेकॉमी और रक्त नमूना प्रक्रियाएं
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