Summary
이 기사는 동물 생리학에서 성 스테로이드의 역할을 조사하기 위해 일본 메다카(Oryzias latipes)를모델로 사용하여 작은 텔레오스트 물고기에서 혈액을 고나데톰화하고 샘플링하는 빠른 프로토콜을 설명합니다.
Abstract
성 스테로이드, 생식선에 의해 생산, 뇌와 뇌 하 수 체 조직 가소성및 뇌와 뇌 하 수 체에 피드백을 제공 하 여 모든 척추 동물에서 재생의 신경 내 분 비 제어에 필수적인 역할을. Teleost 물고기는 포유동물에 비해 생식 전략의 조직 가소성과 변화의 높은 수준을 가지고 있으며 섹스 스테로이드의 역할과 그들이 행동하는 메커니즘을 조사하는 유용한 모델로 나타납니다. 스테로이드 레벨을 측정 하기 위해 혈액 샘플링함께 gonadectomy를 사용 하 여 섹스 스테로이드 생산의 주요 소스의 제거 는 잘 설립 하 고 더 큰 물고기에서 상당히 실현 하 고 역할 및 섹스 스테로이드의 효과 조사 하는 강력한 기술. 그러나 이러한 기술은 소규모 텔레오스트 모델에서 구현될 때 문제를 제기합니다. 여기에서는 남성과 여성 일본 메다카 모두에서 고나데토미의 단계별 절차를 설명하고 혈액 샘플링을 진행합니다. 이러한 프로토콜은 높은 생존율, 물고기의 수명 및 표현형에 대한 안전, 성 스테로이드 클리어런스의 관점에서 재현성이 높은 메다카에서 매우 실현 가능한 것으로 나타났다. 이 작은 teleost 모델을 사용 하 여의 다른 장점과 결합 된 이러한 절차의 사용은 크게 척추 동물에서 섹스 스테로이드에 의해 제공 된 생식 및 조직 가소성의 신경 내 분 비 제어에 피드백 메커니즘의 이해를 향상 시킬 것 이다.
Introduction
척추 동물에서, 성 스테로이드, 주로 생식선에 의해 생산 되는, 다양 한 피드백메커니즘을통해 뇌-뇌 뇌-Gonadal (BPG) 축의 규제에 중요 한 역할을1,2,3,4,5. 또한, 성 스테로이드는 뇌에서 뉴런의 증식 및 활동에 영향을 미치는6,7,8 및 내분비 세포, gonadotropes를 포함 하 여, 뇌 하 수 체9,10,따라서 뇌와 뇌 하 수 체 가소성에서 중요 한 역할을 제공. 포유류에 상대적으로 좋은 지식에도 불구 하 고, 성 스테로이드에 의해 중재 BPG 축 조절의 메커니즘은 비 포유류 종에서 이해 되 고에서 멀리, 진화 보존 원리의 가난한 이해로 이어지는11. 뇌와 뇌 하 수 체 가소성에 섹스 스테로이드의 역할을 문서화 하는 연구의 여전히 제한 된 수가 있다, 따라서 다양 한 척추 동물 종에 섹스 스테로이드의 역할 및 효과의 추가 조사에 대 한 필요성을 제기.
척추동물 중, 텔레오스트는 스트레스 반응12,13,성장14,15,영양 생리학16,17 및 재생2를포함하여 수많은 생물학적 및 생리학적 질문을 해결하는 강력한 모델 동물이되었다. 텔레오스트, 있는 섹스 스테로이드는 주로 에스트라디올에 의해 표현된다 (E2) 여성과 11 케토 테스토스테론 (11-KT)남성에서 18,19,종에 걸쳐 재생의 일반적인 원리를 조사하기위한 신뢰할 수있는 실험 모델이었다. 텔레오스트는 시상 하 부-뇌 하 수 체 연결에 있는 고유성을 보여줍니다20,21 및 뚜렷한 염소도트로프 세포(22),이는 때때로 규제 메커니즘의 해명에 대 한 편리. 또한, 실험실과 현장 실험 모두에 그들의 편의성으로 인해, teleosts는 다른 유기체에 비해 많은 장점을 제공합니다. 그들은23,24를구입하고 유지하는 것이 상대적으로 저렴합니다. 특히, 제브라피쉬(Daniorerio)와일본 메다카(Oryziaslatipes)와같은 작은 텔레오스트 모델은 매우 높은 fecundity와 상대적으로 짧은 수명 주기가 있는 종으로 유전자 기능 및 질병메커니즘(23)의신속한 분석을 가능하게 하며, 따라서 많은 잘 발달된 프로토콜과 유전적 질병을 고려하여 생물학적 및 생리학적 문제의 과다를 해결하는 데 더 큰 이점을제공한다.
수많은 연구에서, 혈액샘플링 기술과 함께 생식선(gonadectomy)을 제거하는 것은 포유류26,27,28,조류29 및 양서류30에서척추동물 생식 생리학에 미치는 영향을 포함하여 많은 생리적 질문을 조사하는 방법으로 사용되어 왔다. 생식 생리학에 대한 생식 세포절제술 효과는 타목시펜과 클로미펜과 같은 성 스테로이드 길항제에 의해 대안적으로 모방될 수 있지만, 약물의 효과는양성효과(31,32)로인해 일관성이 없는 것으로 보인다. 성 스테로이드 길항제에 만성 노출 난 소 확대로 이어질 수 있습니다33,34,건강에 해로운 표현형으로 인해 장기 목적을 위한 그것의 효과의 관찰을 비활성화할 수 있습니다. 또한, 특정 성 스테로이드의 특정 효과를 보증하기 위해, 성 스테로이드 길항제 치료 후 복구 실험을 수행하는 것은 불가능하다. 그 앞서 언급 한 포인트와 함께, 섹스 스테로이드 길항제 사용의 다른 트레이드 오프 광범위 하 게 검토 되었습니다31,32. 따라서, gonadectomy 여전히 섹스 스테로이드의 역할을 조사 하는 강력한 기술로 오늘 나타납니다.
고나데절과 혈액 샘플링 기술은 상대적으로 더 큰 종에서 수행하기 쉽지만, 유럽 농어(디센트라쿠스 라브릭스)35,블루 헤드 wrasse(탈라소마 비파시아툼)36,도그피쉬(실리오리누스 캐니쿨라)37 및 메기(헤테롭네스 화석 과 클라리아스 목욕 라쿠스)38,39,그들은 작은 물고기에 적용 할 때 도전을 제기한다. 예를 들어, 물고기 마취 전달 시스템 (FADS)40의 사용은 덜 실현 가능하고 작은 물고기에 대한 과도한 물리적 손상경향이있는 것으로 보인다. 또한, 일반적으로 더 큰 물고기(40)에 사용되는 gonadectomy 절차는 과도한 손상을 피하기 위해 높은 정밀도를 필요로하는 작은 물고기에 적합하지 않습니다. 마지막으로, 혈액 샘플링은 혈관에 대한 제한된 접근과 그 동물에 있는 혈액의 소량 때문에 도전적입니다. 따라서, 작은 텔레오스트에서 gonadectomy 및 혈액 샘플링의 모든 단계를 보여주는 명확한 프로토콜은 중요합니다.
이 프로토콜은 동아시아가 원산지인 작은 민물고기인 일본 메다카에서 혈액 샘플링을 거쳐 고나데스토미의 단계별 절차를 보여줍니다. 일본 메다카는 서열게놈, 여러 분자 및 유전적 도구25개,이차성 특성 또는 생식선 이전에 성적 차이에 대한 조사를 허용하는 유전적 성결정 시스템이41로잘 개발된다. 흥미롭게도, 일본 메다카는 다른 많은 텔레오스트 종에 반하는 융합 된 조나(42)를가지고 있습니다. 이 두 가지 기술을 결합한 이 두 가지 기술은 총 8분밖에 걸리지 않으며혈관(43)의라벨링, 뇌하수체섹션(44) 및 뇌뉴런(45)의 패치 클램프, 1차 세포배양(46)을포함하는 이 종에 대해 이미 존재하는 비디오 프로토콜 목록을 완성할 것이다. 이러한 기술은 연구 커뮤니티가 미래에 뇌와 뇌 하 수 체 가소성뿐만 아니라 피드백 메커니즘에서 섹스 스테로이드의 역할을 조사하고 더 잘 이해할 수 있게 해 줄 것입니다.
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Protocol
모든 실험과 동물 취급은 노르웨이 생명 과학 대학의 실험 동물 복지에 대한 권고에 따라 수행되었습니다. 고나데토미를 사용한 실험은 노르웨이 식품 안전 당국(FOTS ID 24305)에 의해 승인되었습니다.
참고: 실험은 성인 남성과 여성(생후 6~7개월, 체중 0.35g, 길이 2.7cm)을 사용하여 수행하였다. 상기 성은42,47에기재된 바와 같이 등쪽 및 항문 지느러미의 크기 및 모양과 같은 이차성 특성을 구별함으로써 결정되었다.
1. 기기 및 솔루션 준비
- 마취 주식 솔루션 (0.6 % 트리카인)을 준비합니다.
- 10x 인산염 완충식살린(PBS)의 100mL에서 트리카인(MS-222)을 0.6g 희석한다.
- 트리카인 스톡 용액 1mL을 여러 1.5mL 플라스틱 튜브에 분배하고 사용할 때까지 -20°C에 보관하십시오.
- 수족관 용수 2L에 NaCl 18g을 추가하여 회수수(0.9% NaCl 솔루션)를 준비합니다. 사용 전까지 실온에 용액을 보관하십시오.
- 날카로운 점을 얻기 위해 대각선으로 면도기를 파괴하여 절개 도구를 준비(도 1A).
- 혈액 항응고제 용액(0.05 U/μL 의 나트륨 헤파린)을 1x PBS의 500 μL로 나트륨 헤파린 25 μL을 희석하여 준비합니다. 사용 전까지 항응고제 용액을 4°C에 저장합니다.
- 제조업체의 지시에 따라 바늘풀러(도 1B)로유리 모세관을 당겨 90mm 길이의 유리 모세관에서 2개의 유리 바늘을 준비한다.
참고: 유리 바늘의 외경은 1mm이고 내부 직경은 0.6 mm입니다. - 뚜껑을 절단하여 1.5mL 플라스틱 튜브 뚜껑을 준비하고 바늘 외부직경(도 1C)에맞는 구멍을 만듭니다. 구멍을 만들기 위해 9mm 유리 모세관의 한쪽 끝을 가열하고 뚜껑을 통해 가열 된 유리 모세관을 찌르십시오. 또는 바늘을 사용하여 구멍의 직경이 9mm 유리 모세관에 맞을 때까지 뚜껑을 찌르게하십시오.
2. 고나데토미 시술
- 수족관 수의 30mL에 트리카인 재고(0.6%)의 튜브 1개(0.6%)를 희석하여 마취용액의 0.02%를 준비한다.
- 1.3 단계에서 설명된 초미세 및 2개의 미세한 집게(비교적 넓은 팁이 있는 분수), 작은 가위, 나일론 실 및 면도기 등 해부 도구를 준비합니다.
- 물고기를 30-60초 동안 0.02% 마취용액에 넣어 생선을 마취합니다.
참고: 마취 의 지속 시간은 물고기의 크기와 무게에 따라 달라 지며 적응해야합니다. 물고기가 완전히 마취되도록 하기 위해 물고기 몸은 집게를 사용하여 부드럽게 꼬집을 수 있습니다. 물고기가 반응하지 않으면 고나데스토미를 시작할 수 있습니다. - 마취 용액에서 물고기를 꺼내 어처 현미경으로 물 밖으로 물고기를 측면에 수평으로 놓습니다.
- 암컷의 오바리절제술(OVX)
- 난수성 계란(암컷 몸 바깥에 매달려 있는 계란)을 제거하고 절개부위(도 2A)에서비늘을 긁어낸 경우.
- 면도날을 사용하여 골반과 항문 지느러미(그림2A)사이에 갈비뼈 사이에 약 2-2.5mm 길이의 절개를 부드럽게 만듭니다. 그런 다음 넓은 팁으로 미세 한 포셉을 사용하여 난소를 조금씩 꺼내면서 생선 복부를 부드럽게 꼬집습니다.
- 미세 포셉을 사용하여 난소의 끝을 잘라 내분(도 2B)을제쳐 놓습니다.
참고 : 가능하면 난소 주머니를 부러 뜨리지 않도록주의하십시오. 난소 낭이 깨진 경우, 심지어 비 배란 계란을 떠나지 않고 가능한 한 완전히 모든 gonad 흔적을 제거합니다.
- 남성의 낙초 절제술
- 항문 위의갈비뼈(그림 2A)를부드럽게 절개하고 미세한 집게를 사용하여 절개를 천천히 엽니다.
- 미세 한 집게를 사용하여 부드럽게 고환을 잡고 천천히 고환을 꺼냅니다. 그 후, 고환의 끝을 완전히 제거하기 위해 고환의 끝을 잘라(도 2B). 남성 치열 절제술의 경우, 모든 제제는 절개 부위까지 여성에서 유사합니다. 고환을 잡을 때, 때때로 고환을 닮은 지방이 얻어집니다. 그러나 지방을 복원한 후 고환을 다시 찾아볼 수있다(도 2B).
참고: 남성과 여성 모두, 사망률로 이어질 수 있는 과도 한 손상을 방지 하기 위해 복부에 절개 크기를 최소화 하는 것이 중요 하다. 때때로 내장은 또한 곤드와 함께 절개를 통해 나타날 수 있습니다, 그래서 그들은 제대로 닫기 전에 절개 내부에 반환 되어 있는지 확인. 난소와 메다카 복부의 고환 위치에 대한 사전 지식이 필수적입니다.
- 남성과 여성에서 유사하게 절개를 봉합(그림 3).
- 절개 부위 옆에 나일론 실을 놓고 초미세 포셉을 사용하여 내체 캐비티를 통해 절개 오른쪽으로부터 피부를 찌르고 미세한 집게로 실을 채운다(도3;1-2).
- 실을 꺼내기 위해 외부 바디 캐비티를 통해 절개 왼쪽에서 피부를 찌르십시오 (도 3;3-4).
- 절개 개구부를 닫고 두 개의 매듭을 만들고 과도한 스레드를 잘라냅니다(그림 3; 4-6).
참고: 봉합사는 적절히 단단해야 하며, 물고기의 나머지 실은 봉합사의 느슨해지는 것을 막을 수 있을 만큼 충분히 길어야 합니다. 마취에서 봉합까지의 전체 절차는 일반적으로 최대 6 분이 걸립니다. 시간이 길어지면 필멸의 삶이 될 수 있습니다. - 물고기를 복구 물에 넣고 수족관 시스템으로 옮기기 전에 적어도 24 시간 동안 물고기를 둡니다.
참고: 고나절제생선은 보통 회복수에서 1-2시간 후에 정상적인 행동을 보여줍니다. 따라서 실험 목적에 따라 이 시간 간격 이후에 물고기를 샘플링할 수 있습니다.
3. 혈액 샘플링 절차
- 유리 바늘, 실리콘 모세관, 구멍이있는 플라스틱 튜브, 빈 1.5 mL 플라스틱 튜브, 소형 심립분리기 및 테이프 : 도구를 준비합니다.
- 2.1단계에서 설명된 바와 같이 0.02% 마취용액을 사용하여 물고기를 마취시키고, 물고기를 수직위치(도 4A)에해부 현미경아래에 놓는다. 소달 펑크 정맥의 시각화를 용이하게하기 위해 밝은 표면에 물고기를 놓습니다.
- 실리콘 모세관(도4B)에유리 바늘을 부착하여 혈액 서랍을 설치합니다. 넓은 팁 집게로 바늘의 끝을 깨고 흡입 및 불면 항 응고용으로 바늘 내부를 코팅하십시오.
참고: 흡입 시 혈액의 직접적인 접촉을 피하기 위해 최소 50cm 길이의 빨판과 실리콘 모세관을 사용하는 것이 좋습니다. 또한 바늘 끝의 개구부가 충분히 커서 혈액을 그릴 수 있는지 확인하십시오. - 바늘을 물고기의 페더클 영역쪽으로 직접, caudal peduncle 정맥을 목표로(도 5A)바늘의 총 부피가 채워질 때까지 적어도 4 분의 1까지 입을 사용하여 혈액을 그립니다(도 5B).
참고 : 물고기 몸에서 바늘을 제거하기 전에 흡입을 중지하는 것이 중요합니다. - 바늘을 풀어 바늘의 날카로운 면의 근접에 테이프 조각을 넣어. 수거 튜브에 구멍이 있는 뚜껑을 놓고 바늘을 외부에 바늘 끝으로 구멍을 통해 튜브 내부에 놓습니다(도5C).
- 물고기를 복구 물에 넣고 수족관 시스템으로 옮기기 전에 적어도 24 시간 동안 물고기를 둡니다.
참고: 동일한 물고기에서 두 번째 혈액 샘플링을 수행하려면 첫 번째 혈액 샘플링 후 1 주일 후에 혈액을 샘플링하십시오. - 채취한 혈액을 1-2초 동안 실온에서 1,000xg로 스핀다운하여 튜브의 혈액을 채취합니다.
- 다운스트림 응용 프로그램으로 직접 진행하거나 사용전까지 -20°C에 혈액을 저장하십시오.
참고: 전체 혈액에서 섹스 스테로이드 추출에 대 한 이전 연구를 참조48.
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Representative Results
이 프로토콜은 작은 크기의 모델 텔레오스트, 일본 메다카에서 gonadectomy 및 혈액 샘플링을 수행하기위한 모든 단계를 설명합니다. 암컷의 오방 절제술(OVX) 후 물고기의 생존율은 100%(물고기 10마리 중 10개)이며, 수컷의 94%(물고기 18마리 중 17마리)는 난초 절제술 후 살아남았다. 한편, 혈액 샘플링 절차가 수행 된 후, 모든 (38 물고기) 물고기가 살아남았다.
샴-조작 된 여성은 oviposition(도 6A)를나타내고 모든 계란은 수정되어 배아 발달을 허용하였다(도 6B). 샴 으로 작동하는 수컷은 1-2 주 후에 계란을 비옥하게 할 수 있었습니다. 부분적으로 고나데브로 자란 6명의 부분적으로 고나데톰화된 암컷 중 2명은 2개월 후 수정란의 100%를 가진 외투를 보였습니다. 대조적으로, 암컷에 있는 oviposition 또는 남성에 의한 풍부하게 함은 4 달 후에조차 완전히 gonadectomized 물고기에서 관찰되지 않았습니다.
올바르게 수행하면 물고기의 체형이 약간 변경되어(그림 7A)및 gonadectomy 절차(그림 7B)후에고나드 의 조각이 남아 있어야합니다. 한편, 4주 후 고나데절절제술, 절개와 봉합이 완전히 사라졌고(그림8)4개월 후에도 모든 고나데절화 된 물고기는 여전히 건강한 표현형을 보였으며, 고나달 조직은 발견되지 않았다.
제조업체의 지시에 따라 ELISA로 측정된 여성의 E2 혈중농도(표 1)는OVX 어류의 E2 수준이 수술 후 24시간(p < 0.00001)보다 현저히 낮다고 밝혔다. 4개월 후 OVX 어류의 E2 레벨도 샴 가공생선(p < 0.00001)보다 현저히 낮으며, OVX 이후 24시간 동안 의외로 큰 차이를 보이지>.>. 마지막으로, 부분적으로 OVX 물고기는 고나드의 1/3 ~ 1/2만 제거된 경우, 가짜 작동생선(p = 0.0437)보다 E2 수준이 현저히 낮고 완전히 OVX물고기(p < 0.00001)보다 훨씬 높은 E2 수준을 나타내었다(그림9A).
유사하게 수컷(표1)에서,난기포식생선의 11-KT 농도는 수술 후 24시간 동안 sham-operated 물고기(p < 0.00001)보다 현저히 낮습니다. 4개월 후 난기식어111-KT의 수준도가짜어(p< 0.00001)보다 현저히 낮으며, 난초 후 어류(p> 0.05)에 비해 차이가 없음을 보여준다. 마지막으로, 부분적으로 난기식 생선은 sham-조작 생선(p=0.0428)보다 11-KT의 수준이 현저히 낮고, 완전히 난초된 물고기(p< 0.00001)보다 11-KT의 수치가 현저히높다.
그림 1. 악기 준비. (A)혈액 추출용 고나데절제술용 면도날,(B)유리 바늘,(C)혈액 채취를 위한 구멍이 있는 뚜껑과 함께 플라스틱 튜브. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. 절개 영역의 위치입니다. A)갈비뼈 사이에 위치한 절개 부위의 그리기, 골반과 항문 지느러미 사이의 여성(왼쪽 패널)과 남성(오른쪽 패널); B)여성(왼쪽 패널)과 남성(오른쪽 패널)에서 의 고나드 제거, 관절 부분을 보여주는 흰색 원, 지방을 나타내는 고환및 검은 화살을 보여주는 흰색 화살표. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3. 봉합사의 절차. 1) 초미세 집게를 사용하여 절개 오른쪽에 구멍이 만들어집니다. 2) 나일론 실은 1에서 만든 구멍을 사용하여 피부를 통과한다. 3) 절개 왼쪽에 구멍이 만들어집니다. 4) 나일론 실은 3에서 만든 구멍을 통과한다. 5) 절개를 닫기 위해 오버핸드 매듭이 두 번 만들어집니다. 6) 초과 스레드가 절단됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4. 혈액 샘플링(A) 동안 물고기 위치, 실리콘 모세관 (B)와 유리 바늘의 설치. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5. 혈액 샘플링 (A), 그려진 혈액 (B) 및 혈액 수집 단계 (C)의 흡입 영역. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6. 샴 으로 작동하는 생선은 흰 화살표 (A)와 수정 란 (B)으로 지적 된 계란의 oviposition을 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7. 형태학적 (A) 및 해부학 (B) 그대로 및 gonadectomized 물고기의 모양. 흰색 화살표 (상단 패널) gonadectomized 물고기에 수술 마크를 보여줍니다. 검은 화살표(하단 패널)는 그대로 물고기에 조나드를 표시합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 8. 4 주 후 남성과 여성 물고기에 수술 표시. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 9. 여성(A)과 11-KT 의 혈중 농도는 남성(B) 일본 메다카에서, 가짜 조작(대조군), 부분적으로 고나데절또는 고나데절절제술 후 24시간, 고나데토미(OVX, 여성의 혈관 절제술) 4개월 후; Cas, 남성의 내장 절제술). 통계 분석은 한 가지 방법 ANOVA를 사용하여 수행되었으며 투키 포스트 호크 테스트가 뒤따랐습니다. 다른 문자(a-c)는 상당한차이(p-값< 0.05)를 보여 준다. 그래프의 데이터는 평균 + SD, n = 5로 제공됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| E2 레벨 (여성) | 11-KT 레벨 (남성) | |
| 샴 운영 | 4.15 ± 0.5 (n = 5) | 10.38 ± 1.32 (n = 5) |
| 부분적으로 고나데절화 | 3.37 ± 0.6 (n = 5) | 8.37 ± 1.92 (n = 5) |
| 24시간 고나데토미 이후 | 0.36 ± 0.2 (n = 5) | 0.4 ± 0.2 (n = 5) |
| 4 개월 후 gonadectomy | 0.54 ± 0.28 (n = 5) | 0.74 ± 0.22 (n = 5) |
표 1. E2 및 11-KT 수준 (ng/mL) 여성과 남성의 sham 조작 및 고나데톰화 및 부분적으로 고나데톰화 된 물고기.
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Discussion
이전 문헌에서 보고 된 바와 같이, gonadectomy 및 혈액 샘플링 은 BPG 축의 조절에 섹스 스테로이드의 역할과 관련된 질문을 조사하기 위해 오랫동안 다른 모델 종에서 사용되었습니다. 그러나 이러한 기술은 더 큰 동물에게만 가능할 것으로 보입니다. 일반적으로 사용되는 텔레오스트 모델인 일본 메다카의 작은 크기를 고려하여, 이 종에 대해 가능한 고나데토미및 혈액 샘플링을 위한 상세한 프로토콜을 제공합니다.
고나데톰화된 물고기의 생존율이 거의 100%에 이르렀다는 사실은 고나데절절제술 절차가 메다카에 적용될 수 있음을 나타낸다. 유사하게, 혈액 샘플링의 절차는 이 절차를 겪은 후에 100% 생존율에 의해 도시된 바와 같이 물고기의 생존도에 영향을 미치지 않습니다. 또한, 가짜 조작 된 수컷과 함께 양육 된 sham-조작 된 여성은 oviposition 및 100 % 수정 된 계란을 나타내며 절개와 봉합 절차는 물고기의 번식에 영향을 미치지 않는다는 것을 나타냅니다. 즉, 그들은 생성 할 만큼 건강했다. 또한, 부분적으로 gonadectomized 물고기 는 가짜 작동 물고기에 섹스 스테로이드의 비교 농도 표시, 그리고 일부 여성의 oviposition 뿐만 아니라 남성에 의해 계란의 수정 그 부분적으로 gonadectomized 물고기에서 관찰 되었다. 이러한 결과는 gonadectomy의 절차가 고정밀하게 수행되어야 한다는 것을 건의합니다, 난소 또는 고환이 완전히 제거되어야 한다는 것을 의미합니다.
그림 8에나타난 바와 같이, 물고기의 절개와 봉합 마크는 완전히 사라졌고 4 주 후 gonadectomy, 물고기는 여전히 살아 있고 수술 후 4 개월 건강 해 보입니다. 이는 수술 절차가 장기간 어류에 안전하며 물고기의 수명에 영향을 미치지 않는다는 것을 나타냅니다. 또한 4개월 후에는 조나드가 관찰되지 않았습니다. 이는 24시간 후에도 고나데톰화된 생선에서 발견되는 것과 여전히 유사한 E2 와 11-KT의 낮은 수준에 의해 확인됩니다.
고나데톰화생선의 E2와 11-KT 수준은 이미 고나데절 절제술 후 24시간 후, 고나데절절제술 후 4개월 만에 생선 샘플이 낮은 어류보다 현저히 낮습니다. 대조군에 비해 고나데톰화 생선에서 상당히 낮은 성 스테로이드 수준은 도그피쉬37,메기39, 메다카48의이전 연구에서 관찰되었다. 이러한 일관된 증거는 프로토콜에 설명 된 gonadectomy 절차는 순환 섹스 스테로이드를 취소 하는 신뢰할 수 있는 기술 제안.
이 절차는40에서입증 된 바와 같이 FADS에 의존하지 않기 때문에, gonadectomy는 수술 중 사망을 방지하기 위해 가능한 한 빨리 수행되어야한다. 실제로, FADS의 사용은이 도구는 공기에 노출에도 불구하고 물고기에 지속적인 마취 상태를 허용하기 때문에 작동의 리듬을 유지할 수 있습니다. 그럼에도 불구하고, 메다카로 작은 텔레오스트의 낮은 타당성으로 인해, FADS의 사용은 물고기의 크기로 수행 할 수 없습니다. 또한, 넓은 절개를 가능하게 하는 더 큰 물고기의 이전 고나데절제 프로토콜과 달리, 이 원고에 기재된 프로토콜은 작은 물고기에 과도한 손상을 피하기 위해 넓은 절개를 허용하지 않는다. 따라서, 물고기 체 구멍 내부의 다른 조직에 손상을 방지하기 위해 집게를 사용하여 gonad에 액세스하려고 할 때 매우조심해야합니다.
프로토콜은 빠르고 깨끗한 절차에 의존합니다. 따라서 훈련은 고나데토미술 후 물고기의 높은 생존율과 생식선의 완전한 제거로 표시된 높은 성공률에 도달할 때까지 매우 권장됩니다(그림 7에서성공적인 염소 절제술 전후의 물고기의 형태학적 및 해부학적 외관의 차이를 참조). 사실, 많은 요인이 마취 기간, 절개 의 폭성, 시술 중 봉합및 물고기 취급의 정확성과 요정을 포함하여 절차의 성공률에 영향을 미칠 수 있습니다. 또 다른 중요한 점은 프로토콜을 수행하기 전에 물고기를 최적으로 유지하여 건강한 물고기를 준비해야한다는 것입니다.
혈액 샘플링 절차와 관련하여, 이전 연구는 메다카(48)와 제브라피쉬(49,50,51)로부터혈액을 샘플링하려고 시도했지만, 절차는 물고기를 안락사 한 후 혈액을 채취한 이후 동일한 물고기에서 반복혈액 샘플링을 허용하지 않습니다. 반복된 혈액 샘플링은 다른 연구52에서제브라피쉬를 사용하여 입증되었지만, 우리는 메다카에서 처음으로 이러한 유형의 프로토콜을 보고합니다.
성 스테로이드 농도의 평가는 일반적으로 효소 연결 면역 sorbent 분석 (ELISA) 키트를 사용 하 여 수행, 그리고 많은 ELISA 키트 성 스테로이드의 다른 종류에 대 한 시판 되 게 사용할 수 있다. 혈액 샘플링 중에 수집 된 혈액의 낮은 양으로 인해 다운 스트림 에세이는 전체 혈액을 위한 것입니다. 이전 연구는 전체 혈액과 플라즈마에서 추출 순환 스테로이드 수준의 측정 수준에 차이가 있음을 보여 주었다53,54. 따라서, 전체 혈액 및 플라즈마에서 섹스 스테로이드 수준에 차이 프로토콜을 사용 하 여 실제 실험을 수행 하기 전에 유효성을 검사 할 필요가.
다른 동물 모형을 가진 이전 연구 결과에서 설명된 것과 같이, 여기에서 기술된 프로토콜은 모형으로 작은 크기 teleost를 사용하여 생식 생리학과 관련있는 질문을 조사할 수 있습니다. 사실, 이러한 기술은 이미 양성 피드백 루프55에서뉴런을 표현하는 kiss1 (키스펩틴 유전자 유형 1)의 개입, 핵 복부 성구 결핵 (NVT) 및 kiss2 (키스 펩틴 유전자 유형 POA) preoptics (KISSpeptin 유전자 유형 POA) 발현 부위의 신경세포를 표현하는 키스1의 개입과 같은 BPG 축 및 피드백 메커니즘의 조절에 관한 질문에 이미 기여했습니다. 도 57,에스트로겐 수용체 β1(Esr2a)의 개입 가능하여 여성 용 메다카(58)의 하향 조절 fsh 발현 수준뿐만 아니라 여성물고기(48)에서E2의 일주기 리듬의 프로파일을 조절할 수 있다. 또한, 이전 연구는 섹스 스테로이드는 또한 텔레오스트의 뇌 하 수 체에서 gonadotrope 세포의 확산에 영향을 미치는 입증 이후59,60,그것은 뇌 하 수 체 가소성에 gonadectomy 후 섹스 스테로이드 통관의 효과 조사 하는 흥미로운.
혈액 샘플링 기술은 성 스테로이드 분석에 사용할 뿐만 아니라 혈액 포도당 수준을 포함한 다른 혈중 함량 분석에도 사용할 수 있습니다. 실제로, 프로토콜은 또한제브라피시(52)와 메다카(61)에서 입증된 바와 같이 혈당 측정을 위해 적용될 수 있다. 따라서, 이 기술은 생리학의 그밖 필드에 있는 연구 질문을 해결하기 위하여 확장될 수 있습니다.
마지막으로, 여기에 설명된 프로토콜은 성인 일본 메다카를 위한 것으로 최적화되며, 시술 중에 사용되는 물고기와 재료의 크기가 다르기 때문에 결과가 달라질 수 있습니다. 또한, 메다카 좌우 난소/고환이 융합되어 고나데토미에 중요한 이점을 제공할 수 있기 때문에, 이 프로토콜은 제브라피시와 같은 다른 종에서 사용되기 전에 몇 가지 적응이 필요할 수 있습니다. 따라서 이러한 프로토콜을 테스트하기 전에 실험실 장비 및 어류 크기의 선택에 따라 최적화를 고려해야 합니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
저자는 생선 축산에 그녀의 도움을 주셔서 미스 루르드 카레온 G 탄에게 감사드립니다. 이 사업은 일본과학진흥회(JSPS)의 NMBU,보조금 지원(교부번호 18H04881 및 18K19323)에 의해 지원되었으며, 스미토모 재단에서 SK에 기초과학 연구 프로젝트를 지원했습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass capilary | GD1 | Glass Capillary with Filament GD-1; Narishige | |
| Heparin sodium salt | H4784-1G | Sigma-aldrich | |
| Needle puller | P97 | Flaming/Brown Micropipette puller Model P-97; Sutter Instrument | |
| Nylon thread | N45VL | Polyamide suture, 0.2 metric; Crownjun | |
| Plastic tube | T9661 | Eppendorf Safe-lock microcentifuge tube 1.5 ml, Sigma-aldrich | |
| Razor blade | - | Astra Superior Platinum Double Edge Razor Blades Green, salonwholesale.com | |
| Silicone capillary | a16090800ux0403 | Uxcell Silicone Tube 1 mm ID x 2 mm OD, amazon.com | |
| Tricaine | WXBC9102V | Aldrich chemistry |
References
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