Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Gonadectomy og blodprøvetaking prosedyrer i liten størrelse Teleost Modell Japansk Medaka (Oryzias latipes)

Published: December 11, 2020 doi: 10.3791/62006
Automatic Translation
1, 2, 3, 4, 4, 1, 1
1Physiology Unit, Faculty of Veterinary Medicine, Norwegian University of Life Sciences, 2Laboratory of Physiology, Atmosphere and Ocean Research Institute, The University of Tokyo, 3Department of Biological Sciences, Graduate School of Science, The University of Tokyo, 4Centre of Reproduction, Development and Aging (CRDA), Faculty of Health Sciences, University of Macau

Summary

Artikkelen beskriver en rask protokoll for å gonadectomize og prøve blod fra den lille teleostfisken, ved hjelp av japansk medaka (Oryzias latipes) som modell, for å undersøke rollen som sexsteroider i dyrefysiologi.

Abstract

Sex steroider, produsert av gonads, spille en viktig rolle i hjernen og hypofysen vev plastisitet og i nevroendokrine kontroll av reproduksjon i alle vertebrater ved å gi tilbakemelding til hjernen og hypofysen. Teleostfisk har en høyere grad av vev plastisitet og variasjon i reproduktive strategier sammenlignet med pattedyr og synes å være nyttige modeller for å undersøke rollen som sex steroider og mekanismene som de handler. Fjerning av den viktigste kilden til sex steroid produksjon ved hjelp av gonadectomy sammen med blodprøvetaking for å måle steroid nivåer har vært veletablert og ganske gjennomførbart i større fisk og er en kraftig teknikk for å undersøke rollen og effektene av sex steroider. Disse teknikkene reiser imidlertid utfordringer når de implementeres i teleostmodeller i liten størrelse. Her beskriver vi trinnvise prosedyrer for gonadektomi hos både menn og kvinnelige japanske medaka etterfulgt av blodprøvetaking. Disse protokollene er vist å være svært mulig i medaka indikert av en høy overlevelsesrate, sikkerhet for fiskens levetid og fenotype, og reproduserbarhet når det gjelder sex steroid clearance. Bruken av disse prosedyrene kombinert med de andre fordelene ved å bruke denne lille teleost modellen vil i stor grad forbedre forståelsen av feedback mekanismer i nevroendokrine kontroll av reproduksjon og vev plastisitet levert av sex steroider i vertebrater.

Introduction

I vertebrater spiller sex steroider, som hovedsakelig produseres av gonadene, viktige roller i reguleringen av Brain-Pituitary-Gonadal (BPG) -aksen gjennom ulike tilbakemeldingsmekanismer1,2,3,4,5. I tillegg påvirker sex steroider spredning og aktivitet av nevroner i hjernen6,7,8 og endokrine celler, inkludert gonadotropes, i hypofysen9,10, og dermed tjene avgjørende roller i hjernen og hypofysen plastisitet. Til tross for relativt god kunnskap hos pattedyr, er mekanismen for BPG-akseregulering formidlet av sexsteroider langt fra å bli forstått i ikke-pattedyrarter, noe som fører til dårlig forståelse av evolusjonære bevarte prinsipper11. Det er fortsatt et begrenset antall studier som dokumenterer rollen som sex steroider på hjernen og hypofysen plastisitet, og dermed øke behovet for videre undersøkelser av rollen og effektene av sex steroider på ulike virveldyr arter.

Blant vertebrater har teleoster blitt kraftige modelldyr i å adressere mange biologiske og fysiologiske spørsmål, inkludert stressrespons12,13, vekst14,15, ernæringsfysiologi16,17 og reproduksjon2. Teleoster, der kjønnssteroider for det meste er representert av østradiol (E2) hos kvinner og 11-ketotestosteron (11-KT) hos menn18,19, har lenge vært pålitelige eksperimentelle modeller for å undersøke det generelle reproduksjonsprinsippet på tvers av arter. Teleoster viser unikhet i deres hypothalamus-hypofyseforbindelse20,21 og distinkte gonadotrope celler22, som noen ganger er praktiske for belysning av regulatoriske mekanismer. Videre, på grunn av deres manglende evne til både laboratorie- og feltforsøk, tilbyr teleoster mange fordeler sammenlignet med andre organismer. De er relativt billige å kjøpe og vedlikeholde23,24. Spesielt er små teleostmodeller som sebrafisk (Danio rerio) og den japanske medakaen (Oryzias latipes), arter med svært høy fecundity og en relativt kort livssyklus som muliggjør rask analyse av genfunksjon og sykdomsmekanismer23, og gir dermed enda større fordeler med å håndtere en mengde biologiske og fysiologiske spørsmål, med tanke på de mange velutviklede protokollene og genetisk verktøysett som er tilgjengelige for disse artene25.

I mange studier har fjerning av gonader (gonadektomi) sammen med blodprøvetakingsteknikker blitt brukt som en metode for å undersøke mange fysiologiske spørsmål, inkludert dens innvirkning i virveldyr reproduktiv fysiologi hos pattedyr26,27,28, fugler29 og amfibier30. Selv om gonadectomy effekten på reproduktiv fysiologi kan alternativt etterlignes av sex steroid antagonister, som tamoxifen og clomiphene, effekten av stoffene synes å være inkonsekvent på grunn av bimodale effekter31,32. Kronisk eksponering for en sex steroid antagonist kan føre til ovarial utvidelse33,34, som kan deaktivere observasjon av dens effekter for langsiktige formål på grunn av en usunn fenotype. I tillegg er det umulig å utføre en utvinning eksperiment etter sex steroid antagonist behandling, for å garantere den spesifikke effekten av visse sex steroider. Sammen med de nevnte punktene, andre avveininger av sex steroid antagonist bruk har blitt grundig gjennomgått31,32. Derfor, gonadectomy fortsatt vises i dag som en kraftig teknikk for å undersøke rollen som sex steroider.

Mens gonadektomi og blodprøvetakingsteknikker er relativt enkle å utføre i større arter, som europeisk havabbor (Dicentrarchus labrax)35, bluehead wrasse (Thalassoma bifasciatum)36, dogfish (Scyliorhinus canicula)37 og steinbit (Heteropneustes fossilis og Clarias bathracus)38,39, de reiser utfordringer når de brukes i liten fisk som medaka. For eksempel er bruken av Fish Anesthesia Delivery System (FADS)40 mindre mulig og ser ut til å være utsatt for overdreven fysisk skade for liten fisk. I tillegg er en gonadektomiprosedyre som ofte brukes til større fisk40 ikke egnet for liten fisk som krever høy presisjon for å unngå overdreven skade. Til slutt er blodprøvetaking utfordrende på grunn av begrenset tilgang til blodkar og den lille mengden blod i disse dyrene. Derfor er en klar protokoll som demonstrerer hvert trinn i gonadektomi og blodprøvetaking i en liten teleost av betydning.

Denne protokollen demonstrerer trinnvise prosedyrer for gonadektomi etterfulgt av blodprøvetaking i japansk medaka, en liten ferskvannsfisk innfødt til Øst-Asia. Japansk medaka har et sekvensert genom, flere molekylære og genetiske verktøy tilgjengelig25, og et genetisk kjønnsbestemmelsessystem som muliggjør undersøkelse av seksuelle forskjeller før sekundære seksuelle egenskaper eller gonader er godt utviklet41. Interessant nok har japansk medaka smeltet gonader i motsetning til mange andre teleostarter42. Disse to teknikkene til sammen tar bare 8 minutter totalt og vil fullføre listen over videoprotokoller som allerede eksisterer for denne arten som inkluderte merking av blodkar43, patch-clamp på hypofyse seksjoner44 og hjerne nevroner45, og primærcellekultur46. Disse teknikkene vil tillate forskningssamfunnet å undersøke og bedre forstå rollene til sex steroider i feedback mekanismer samt hjernen og hypofysen plastisitet i fremtiden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle eksperimenter og dyrehåndtering ble gjennomført i henhold til anbefalingene om eksperimentell dyrevelferd ved Norges biovitenskapelige universitet. Forsøk med gonadektomi ble godkjent av Mattilsynet (FOTS ID 24305).

MERK: Forsøkene ble utført med voksen mann og kvinne (6-7 måneder gammel, vekt ca. 0,35 g, lengde ca. 2,7 cm) japansk medaka. Kjønnet ble bestemt ved å skille de sekundære seksuelle egenskapene, for eksempel størrelsen og formen på dorsal og analfin, som beskrevet i42,47.

1. Forberedelse av instrumenter og løsninger

  1. Forbered bedøvelsesmiddelløsning (0,6% trikain).
    1. Fortynn 0,6 g trikain (MS-222) i 100 ml 10x fosfatbuffer saltvann (PBS).
    2. Fordel 1 ml trikainbestandsløsning i flere 1,5 ml plastrør og oppbevar ved -20 °C til bruk.
  2. Forbered utvinning vann (0,9% NaCl løsning) ved å legge 18 g NaCl i 2 L akvariumvann. Oppbevar oppløsningen ved romtemperatur til bruk.
  3. Forbered snittverktøyene ved å bryte en barberhøvel diagonalt for å få et skarpt punkt (Figur 1A).
  4. Forbered blod antikoagulant oppløsning (0,05 U / μL natrium heparin) ved å fortynne 25 μL natrium heparin i 500 μL 1x PBS. Oppbevar den antikoagulerende oppløsningen ved 4 °C til bruk.
  5. Forbered to glassnåler fra en 90 mm lang glasskapillær ved å trekke en glasskapillær med en nåletrekker (figur 1B) i henhold til produsentens anvisninger.
    MERK: Glassnålens ytre diameter er 1 mm, mens den indre diameteren er 0,6 mm.
  6. Forbered et 1,5 ml plastrørlokk ved å kutte lokket og lage et hull som passer med nålens ytre diameter (Figur 1C). For å lage hullet, varme den ene enden av 9 mm glasskapillæren og stikke den oppvarmede glasskapillæren gjennom lokket. Alternativt kan du bruke en nål til å stikke gjennom lokket til diameteren på hullet passer med 9 mm glasskapillæren.

2. Gonadectomy prosedyre

  1. Forbered 0,02% av bedøvelsesoppløsningen ved å fortynne ett rør trikainbestand (0,6%) i 30 ml akvariumvann.
  2. Forbered disseksjonsverktøyene, inkludert en ultrafin og to fine tang (en med relativt bred spiss), liten saks, nylontråd og barberhøvel som beskrevet i trinn 1.3.
  3. Bedøv fisken ved å sette den inn i den 0,02% bedøvelsesløsningen i 30-60 sekunder.
    MERK: Anestesiens varighet avhenger av fiskens størrelse og vekt og må tilpasses. For å sikre at fisken er fullstendig bedøvet, kan fiskekroppen klemmes forsiktig ved hjelp av tang. Hvis fisken ikke reagerer, kan gonadektomi startes.
  4. Ta ut fisken fra bedøvelsesløsningen og plasser fisken horisontalt på sin side, ut av vann under et disseksjonsmikroskop.
  5. Ovariectomy (OVX) hos kvinner
    1. Fjern oviposited egg (egg som henger utenfor den kvinnelige kroppen) hvis noen og skrap skalaene i snittområdet (Figur 2A).
    2. Lag forsiktig et snitt som er ca. 2-2,5 mm langt mellom ribbenene, mellom bekkenet og analfinner (figur 2A), ved hjelp av barberbladet. Klem deretter forsiktig fiskelivet mens du tar ut eggstokkene litt etter litt ved hjelp av fine tang med bred spiss.
    3. Klipp enden av eggstokkene ved hjelp av fine tang og legg eggstokkene til side (Figur 2B).
      MERK: Pass på at du ikke bryter eggstokksekken hvis det er mulig. Hvis eggstokksekken er ødelagt, fjern eventuelle gonadspor så fullstendig som mulig uten å forlate selv ikke-eggløsning.
  6. Orkidektomi hos menn
    1. Lag forsiktig et snitt mellom ribbeina over anusen (Figur 2A), og åpne snittet sakte ved hjelp av fine tang.
    2. Ta forsiktig tak i testiklene ved hjelp av de fine tangene og ta sakte ut testiklene. Deretter kutter du enden av testiklene for å fjerne testiklene helt (Figur 2B). For mannlig orkidektomi er alle preparater lik hos kvinner til snittdelen. Når du tar tak i testiklene, oppnås noen ganger fettet som ligner testiklene. Etter å ha gjenopprettet fettet, er det imidlertid mulig å prøve å finne testiklene igjen (Figur 2B).
      MERK: For både menn og kvinner er det viktig å minimere snittstørrelsen i magen for å forhindre overdreven skade som kan føre til dødelighet. Noen ganger kan tarmene også vises gjennom snittet sammen med gonadene, så sørg for at de er riktig returnert inne i snittet før lukking. Forkunnskaper om eggstokkene og testikler plassering i medaka abdomen er viktig.
  7. Suturer snittet på samme måte hos menn og kvinner (Figur 3).
    1. Plasser nylontråden ved siden av snittområdet og stikk huden fra høyre side av snittet gjennom det indre kroppshulen ved hjelp av ultrafine tang for å ta tråden inn med fine tang (Figur 3; 1-2).
    2. Stikk huden fra venstre side av snittet gjennom det ytre kroppshulen for å ta ut tråden ( Figur 3; 3-4).
    3. Lukk snittåpningen og lag to knuter og klipp den overdrevne tråden (Figur 3; 4-6).
      MERK: Suturen må være tilstrekkelig stram, og den gjenværende tråden på fisken må være lang nok til å forhindre at suturen løsnes. Hele prosedyren fra anestesi til suturing tar vanligvis opptil 6 minutter. Lengre tid kan føre til dødelighet.
    4. Sett fisken i utvinningsvannet og la dem stå i minst 24 timer før du overfører dem til akvariet.
      MERK: Gonadectomisert fisk viser vanligvis normal oppførsel etter 1-2 timer i utvinningsvannet. Derfor, avhengig av eksperimentformålet, kan man prøve fisken etter dette tidsintervallet.

3. Blodprøvetaking prosedyre

  1. Forbered verktøyene: en glassnål, en silikonkapillær, et plastrør med hull, et tomt 1,5 ml plastrør, en minicentrifuge og tape.
  2. Bedøv fisken med 0,02 % bedøvelsesoppløsning som beskrevet i trinn 2.1 og plasser fisken under et disseksjonsmikroskop i vertikal stilling (Figur 4A). Plasser fisken på en lys overflate for å lette visualiseringen av kaudal punkteringsvenen.
  3. Monter blodskuffen ved å feste en glassnål til silikonkapillæren (Figur 4B). Bryt spissen av nålen med brede spiss tang og belegge innsiden av nålen med antikoagulant løsning ved suging og blåsing.
    MERK: Bruk av en sucker og en silikon kapillær med minst 50 cm lengde anbefales for sikkerhetstiltak for å unngå direkte kontakt av blodet ved suging. I tillegg må du sørge for at åpningen av nålespissen er tilstrekkelig stor til å tillate å tegne blodet.
  4. Rett nålen mot fiskens peduncle-område, sikt på kaudal peduncle vene (Figur 5A) og trekk blodet med munnen til minst en fjerdedel av det totale volumet av nålen er fylt (Figur 5B).
    MERK: Det er viktig å slutte å suge før du fjerner nålen fra fiskekroppen.
  5. Slipp nålen og legg et stykke tape i nærheten av den skarpe siden av nålen. Plasser lokket med et hull på et oppsamlingsrør og sett nålen inne i røret gjennom hullet med nålespissen på utsiden (Figur 5C).
  6. Sett fisken i utvinningsvannet og la dem stå i minst 24 timer før du overfører dem til akvariet.
    MERK: For å utføre en ny blodprøvetaking fra samme fisk, prøv blodet en uke etter den første blodprøvetakingen.
  7. Flash spinn ned det oppsamlede blodet i 1-2 sekunder med 1000 x g ved romtemperatur for å samle blodet i røret.
  8. Fortsett direkte til nedstrømsapplikasjoner eller oppbevar blodet ved -20 °C til bruk.
    MERK: Se forrige studie for sex steroid utvinning fra hele blodet48.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Denne protokollen beskriver hvert trinn for å utføre gonadektomi og blodprøvetaking i en liten størrelse modell teleost, den japanske medaka. Fiskens overlevelsesrate etter ovariektomi (OVX) hos kvinner er 100% (10 av 10 fisk) mens 94% (17 av 18 fisk) av hannene overlevde etter orkidéektomi. I mellomtiden, etter at blodprøvetakingsprosedyren ble utført, overlevde all (38 fisk) fisk.

Sham-opererte kvinner viser oviposisjon (Figur 6A) og alle eggene ble befruktet og tillatt for embryonal utvikling (Figur 6B). Sham-opererte menn var også i stand til å gjødsle egg etter bare 1-2 uker. To av seks delvis gonadectomiserte kvinner oppdrettet med delvis gonadektomiserte hanner viste også oviposisjon med 100% befruktede egg etter 2 måneder. I motsetning ble det ikke observert oviposisjon hos kvinner eller befruktning av menn i fullt gonadektomisert fisk, selv etter 4 måneder.

Når det utføres riktig, endres fiskens kroppsform litt (Figur 7A), og ingen gonad skal forbli etter gonadektomiprosedyren (Figur 7B). I mellomtiden forsvant 4 uker etter gonadektomi, snittet og suturen helt (figur 8), og etter 4 måneder viste all gonadektomisert fisk fortsatt sunn fenotype, og det ble ikke funnet noe gonadalt vev.

E2 blodkonsentrasjoner hos kvinner (Tabell 1), målt med ELISA etter produsentens instruksjoner, viste at E2-nivået i OVX fisk er betydelig lavere enn i sham-operert fisk 24 timer etter operasjonen (p < 0,00001). Etter 4 måneder er E2-nivået i OVX fisk også betydelig lavere enn i sham-operert fisk(p < 0,00001) og viser ingen signifikant forskjell sammenlignet med det i 24 timer etter OVX fisk (p > 0,05). Til slutt, delvis OVX fisk, hvor bare 1/3 til 1/2 av gonad ble fjernet, viser betydelig lavere E2 nivåer enn sham-operert fisk (p = 0.0437) og betydelig høyere E2 nivåer enn fullt OVX fisk (p < 0.00001) (Figur 9A).

Tilsvarende hos menn (Tabell 1), er 11-KT-konsentrasjonen i orkidektomisert fisk betydelig lavere enn i sham-operert fisk 24 timer etter operasjonen (p < 0,00001). Nivået på 11-KT i orkidektomisert fisk etter 4 måneder er også betydelig lavere enn i sham-operert fisk(p < 0,00001) og viser ingen forskjell sammenlignet med 24 timer post-orkidektomisert fisk (p > 0,05). Til slutt viser delvis orkidektomisert fisk betydelig lavere nivåer av 11-KT enn sham-operert fisk (p = 0,0428) og betydelig høyere nivåer på 11-KT enn fullt orkidektomisert fisk (p < 0,00001) (Figur 9B).

Figure 1
Figur 1. Instrument forberedelse. (A) Barberblad for gonadektomi, (B) glassnål for blodutvinning, og (C) et plastrør sammen med et lokk med hull for blodoppsamling. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2. Plassering av snittområdet. A) Tegning av snittområdet som ligger mellom ribbenene, mellom bekkenet og analfinner hos kvinner (venstre panel) og menn (høyre panel); B) gonad fjerning hos kvinner (venstre panel) og menn (høyre panel), hvite sirkler som viser fellesdelen, hvit pil som viser testis og svart pil som viser fettet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3. Prosedyren for sutur. 1) Et hull er laget på høyre side av snittet ved hjelp av ultrafine tang. 2) Nylontråden føres gjennom huden ved hjelp av hullet som er laget i 1. 3) Et hull er laget på venstre side av snittet. 4) Nylontråden føres gjennom hullet som er laget i 3. 5) En overhåndsknute er laget to ganger for å lukke snittet. 6) Overflødig tråd er kuttet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4. Fiskeposisjon under blodprøvetaking (A), installasjon av glassnål med silikonkapillæren (B). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5. Sugeområdet for blodprøvetaking (A), trukket blod (B) og blodinnsamlingstrinn (C). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 6
Figur 6. Sham-operert fisk viser oviposisjon av egg spiss av hvit pil (A) og befruktede egg (B). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 7
Figur 7. Morfologisk (A) og anatomisk (B) utseende av intakt og gonadektomisert fisk. Hvite piler (topppaneler) viser operasjonsmerket på gonadektomisert fisk. Svarte piler (bunnpaneler) viser gonader i intakt fisk. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 8
Figur 8. Kirurgi merker i mannlig og kvinnelig fisk etter 4 uker. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 9
Figur 9. Blodnivåer av E2 hos kvinner (A) og 11-KT hos mannlige (B) japanske medaka, 24 timer etter sham operasjon (kontroll), delvis gonadectomy eller gonadectomy, og 4 måneder etter gonadectomy (OVX, ovariectomy hos kvinner; Cas, orkidektomi hos menn). De statistiske analysene ble utført ved hjelp av One Way ANOVA etterfulgt av Tukey Post Hoc-test. Ulike bokstaver (a-c) viser signifikante forskjeller (p-verdi < 0,05). Data i grafen leveres som gjennomsnitt + SD, n = 5. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

E2 nivåer (Kvinner) 11-KT nivåer (Menn)
Sham-operert 4,15 ± 0,5 (n = 5) 10,38 ± 1,32 (n = 5)
Delvis gonadektomisert 3,37 ± 0,6 (n = 5) 8,37 ± 1,92 (n = 5)
24h post-gonadectomy 0,36 ± 0,2 (n = 5) 0,4 ± 0,2 (n = 5)
4 måneder etter gonadektomi 0,54 ± 0,28 (n = 5) 0,74 ± 0,22 (n = 5)

Tabell 1. E2 og 11-KT nivåer (ng / ml) hos kvinner og menn av sham-operert og gonadectomized og delvis gonadectomized fisk.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Som rapportert i tidligere litteratur, gonadectomy og blodprøvetaking har lenge vært brukt i andre modellarter for å undersøke spørsmål knyttet til rollen som sex steroider i regulering av BPG-aksen. Imidlertid ser disse teknikkene ut til å være mottagelige bare for større dyr. Tatt i betraktning den lille størrelsen på den ofte brukte teleostmodellen, japansk medaka, gir vi en detaljert protokoll for gonadektomi og blodprøvetaking som er mulig for denne arten.

Det faktum at overlevelsesraten for gonadektomisert fisk nådde nesten 100% indikerer at gonadektomiprosedyren er mulig å påføre på medaka. På samme måte påvirker prosedyren for blodprøvetaking ikke fiskens overlevelse som vist ved 100% overlevelsesrate etter å ha gjennomgått denne prosedyren. I tillegg viser sham-opererte kvinner oppdrettet sammen med sham-opererte menn oviposisjon og 100% befruktede egg, noe som indikerer at snitt- og suturprosedyren ikke påvirker reproduksjonen av fisken. Med andre ord var de sunne nok til å gyte. Videre viser delvis gonadektomisert fisk sammenlignbare konsentrasjoner av kjønnssteroider til sham-operert fisk, og oviposisjon hos noen kvinner samt befruktning av egg av menn ble observert hos de delvis gonadectomiserte fiskene. Disse resultatene antyder at prosedyren for gonadektomi bør utføres med høy presisjon, noe som betyr at eggstokkene eller testiklene skal fjernes helt.

Som vist i figur 8, forsvant snitt- og suturmerket på fisken helt 4 uker etter gonadektomi, og fisken er fortsatt i live og ser sunn ut 4 måneder etter operasjonen. Disse indikerer at operasjonsprosedyren er trygg for fisken for langsiktig formål og påvirker ikke fiskens levetid. I tillegg, etter 4 måneder, ble det ikke observert noen gonader. Dette bekreftes av de lave nivåene av E2 og 11-KT som fortsatt ligner de som finnes i gonadektomisert fisk etter 24 timer.

Nivåene av E2 og 11-KT i gonadektomisert fisk er betydelig lavere enn sham-operert fisk, allerede etter 24 timer etter gonadektomi og forblir lavere i fisk samplet 4 måneder etter gonadectomy. De signifikant lavere kjønnssteroider nivåer i gonadectomized fisk sammenlignet med kontroll har blitt observert i tidligere studier i dogfish37, steinbit39 og medaka48. Disse konsistente bevis tyder på at gonadectomy prosedyren beskrevet i protokollen er en pålitelig teknikk for å fjerne sirkulerende sex steroider.

Siden denne prosedyren ikke er avhengig av FADS som vist i40, bør gonadektomi utføres så raskt som mulig for å forhindre dødelighet under operasjonen. Faktisk gjør bruken av FADS det mulig å opprettholde driftsrytmen siden dette verktøyet tillater kontinuerlig bedøvelsestilstand for fisken til tross for at den er utsatt for luften. Likevel, på grunn av sin lavere gjennomførbarhet i den lille teleosten som medaka, kan ikke bruken av FADS utføres med den størrelsen på fisken. I tillegg, i motsetning til den forrige gonadektomiprotokollen i større fisk som gjør det mulig for bredt snitt å nå gonaden, tillater protokollen beskrevet i dette manuskriptet ikke bredt snitt for å unngå overdreven skade på den lille fisken. Derfor bør man være veldig forsiktig når man prøver å få tilgang til gonad ved hjelp av tang for å forhindre skade i andre vev inne i fiskekroppshulen.

Protokollen er avhengig av en rask og ren prosedyre. Trening anbefales derfor sterkt til å nå en høy suksessrate, indikert av en høy overlevelsesrate for fisken etter gonadektomi samt fullstendig fjerning av gonadene (se forskjellen på morfologisk og anatomisk utseende av fisken før og etter vellykket gonadektomi i figur 7). Faktisk kan mange faktorer påvirke prosedyrens suksessrate, inkludert anestesiperioden, bredden av snitt, nøyaktigheten og ryddigheten til suturen og fiskehåndteringen under prosedyren. Et annet viktig poeng er at man bør tilberede sunn fisk ved å opprettholde fisken optimalt før man utfører protokollen.

Med hensyn til blodprøvetakingsprosedyre har de tidligere studiene forsøkt å prøve blodet fra medaka48 og sebrafisk49,50,51, men prosedyren tillater ikke gjentatt blodprøvetaking i samme fisk siden blodet er tatt etter euthanizing fisken. Gjentatt blodprøvetaking har blitt demonstrert ved hjelp av sebrafisk i en annen studie52, men vi rapporterer denne typen protokoll for første gang i medaka.

Evalueringen av sex steroid konsentrasjoner utføres ofte ved hjelp av en enzym-bundet immunosorbent analyse (ELISA) kit, og det har vært mange ELISA kits kommersielt tilgjengelig for ulike typer sex steroider. På grunn av den lave mengden blod som samles inn under blodprøvetaking, er nedstrømsanalysene beregnet på hele blodet. Tidligere studier har vist at det er en forskjell i målt nivå av sirkulerende steroid nivåer ekstrahert fra fullblod og plasma53,54. Derfor, forskjellen i sex steroid nivåer fra fullblod og plasma må valideres før du utfører det virkelige eksperimentet ved hjelp av protokollen.

Som dokumentert i tidligere studier med forskjellige dyremodeller, vil protokollen beskrevet her tillate å undersøke spørsmål knyttet til reproduktiv fysiologi ved hjelp av en liten størrelse teleost som modell. Faktisk har disse teknikkene allerede bidratt til å svare på spørsmål om reguleringen av BPG-aksen og dens tilbakemeldingsmekanismer, som involvering av kiss1 (kisspeptin gen type 1) som uttrykker nevroner i positive tilbakemeldingssløyfer55, østrogenmediert regulering av kiss1 som uttrykker nevroner i kjernen ventralis tuberis (NVT), og kiss2 (kisspeptin gen type 2) som uttrykker nevroner i preoptisk område (POA)56, 57, mulig involvering av østrogenreseptor β1 (Esr2a) i nedregulerende fsh uttrykksnivå i kvinnelig japansk medaka58 samt profilen til døgnrytmen til E2 i kvinnelig fisk48. Videre, siden tidligere studier viste at sex steroider også påvirker spredning av gonadotrope celler i hypofysen av teleoster59,60, det er spennende å undersøke effekten av sex steroid clearance etter gonadectomy på hypofysen plastisitet.

Blodprøvetakingsteknikken kan ikke bare brukes til sex steroidanalyse, men også for andre blodinnholdsanalyser, inkludert blodsukkernivåer. Faktisk kan protokollen også brukes til blodsukkermålinger som vist i sebrafisk52 og medaka61. Derfor kan denne teknikken utvides for å adressere forskningsspørsmål innen andre fysiologiområder.

Til slutt er protokollene beskrevet her ment og optimalisert for voksne japanske medaka, og resultatene på grunn av forskjellig størrelse på fisk og materialer som brukes under prosedyrene kan variere. Videre, som medaka venstre og høyre eggstokkene / testikler er smeltet sammen, noe som kan gi en viktig fordel for gonadectomy, kan denne protokollen trenge flere tilpasninger før den brukes i andre arter der dette ikke er tilfelle som i sebrafisk. Dermed bør det tas hensyn til en optimalisering i henhold til valg av laboratorieutstyr og fiskestørrelse før du tester disse protokollene.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Forfatterne takker Fru Lourdes Carreon G Tan for hennes hjelp i fiskeholdet. Dette arbeidet ble finansiert av NMBU, Grants-in-Aid fra Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) (Tilskuddsnummer 18H04881 og 18K19323), og tilskudd til grunnvitenskapelige forskningsprosjekter fra Sumitomo Foundation til S.K.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Glass capilary GD1 Glass Capillary with Filament GD-1; Narishige
Heparin sodium salt H4784-1G Sigma-aldrich
Needle puller P97 Flaming/Brown Micropipette puller Model P-97; Sutter Instrument
Nylon thread N45VL Polyamide suture, 0.2 metric; Crownjun
Plastic tube T9661 Eppendorf Safe-lock microcentifuge tube 1.5 ml, Sigma-aldrich
Razor blade - Astra Superior Platinum Double Edge Razor Blades Green, salonwholesale.com
Silicone capillary a16090800ux0403 Uxcell Silicone Tube 1 mm ID x 2 mm OD, amazon.com 
Tricaine WXBC9102V Aldrich chemistry

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Weltzien, F. -A., Andersson, E., Andersen, Ø, Shalchian-Tabrizi, K., Norberg, B. The brain-pituitary-gonad axis in male teleosts, with special emphasis on flatfish (Pleuronectiformes). Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Molecular & Integrative Physiology. 137 (3), 447-477 (2004).
  2. Yaron, Z., Levavi-Sivan, B. Encyclopedia of Fish Physiology. Farrell, A. P. 2, Academic Press. 1500-1508 (2011).
  3. Goldman, B. D. The circadian timing system and reproduction in mammals. Steroids. 64 (9), 679-685 (1999).
  4. Taranger, G. L., et al. Control of puberty in farmed fish. General and Comparative Endocrinology. 165 (3), 483-515 (2010).
  5. Messinis, I. E. Ovarian feedback, mechanism of action and possible clinical implications. Human Reproduction Update. 12 (5), 557-571 (2006).
  6. Diotel, N., et al. The brain of teleost fish, a source, and a target of sexual steroids. Frontiers in Neuroscience. 5, 137 (2011).
  7. Diotel, N., et al. Steroid Transport, Local Synthesis, and Signaling within the Brain: Roles in Neurogenesis, Neuroprotection, and Sexual Behaviors. Frontiers in Neuroscience. 12, 84 (2018).
  8. Larson, T. A. Sex Steroids, Adult Neurogenesis, and Inflammation in CNS Homeostasis, Degeneration, and Repair. Frontiers in Endocrinology. 9, 205 (2018).
  9. Fontaine, R., et al. Gonadotrope plasticity at cellular, population and structural levels: A comparison between fishes and mammals. General and Comparative Endocrinology. 287, 113344 (2020).
  10. Fontaine, R., Royan, M. R., von Krogh, K., Weltzien, F. -A., Baker, D. M. Direct and indirect effects of sex steroids on gonadotrope cell plasticity in the teleost fish pituitary. Frontiers in Endocrinology. , (2020).
  11. Kanda, S. Evolution of the regulatory mechanisms for the hypothalamic-pituitary-gonadal axis in vertebrates-hypothesis from a comparative view. General and Comparative Endocrinology. 284, 113075 (2019).
  12. Schreck, C. B. Stress and fish reproduction: The roles of allostasis and hormesis. General and Comparative Endocrinology. 165 (3), 549-556 (2010).
  13. Wendelaar Bonga, S. E. The stress response in fish. Physiological Reviews. 77 (3), 591-625 (1997).
  14. Mommsen, T. P. Paradigms of growth in fish. Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Biochemistry and Molecular Biology. 129 (2), 207-219 (2001).
  15. Won, E., Borski, R. Endocrine Regulation of Compensatory Growth in Fish. Front. Endocrinol. 4, 74 (2013).
  16. MacKenzie, D. S., VanPutte, C. M., Leiner, K. A. Nutrient regulation of endocrine function in fish. Aquaculture. 161 (1), 3-25 (1998).
  17. Rønnestad, I., Thorsen, A., Finn, R. N. Fish larval nutrition: a review of recent advances in the roles of amino acids. Aquaculture. 177 (1), 201-216 (1999).
  18. Borg, B. Androgens in teleost fishes. Comparative Biochemistry and Physiology Part C: Pharmacology, Toxicology and Endocrinology. 109 (3), 219-245 (1994).
  19. Rege, J., et al. Circulating 11-oxygenated androgens across species. The Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology. 190, 242-249 (2019).
  20. Blázquez, M., Bosma, P. T., Fraser, E. J., Van Look, K. J. W., Trudeau, V. L. Fish as models for the neuroendocrine regulation of reproduction and growth. Comparative Biochemistry and Physiology Part C: Pharmacology, Toxicology and Endocrinology. 119 (3), 345-364 (1998).
  21. Zambrano, D. Innervation of the teleost pituitary. General and Comparative Endocrinology. 3, 22-31 (1972).
  22. Weltzien, F. -A., Hildahl, J., Hodne, K., Okubo, K., Haug, T. M. Embryonic development of gonadotrope cells and gonadotropic hormones - Lessons from model fish. Molecular and Cellular Endocrinology. 385 (1), 18-27 (2014).
  23. Harris, M. P., Henke, K., Hawkins, M. B., Witten, P. E. Fish is Fish: the use of experimental model species to reveal causes of skeletal diversity in evolution and disease. Journal of applied ichthyology. 30 (4), 616-629 (2014).
  24. Powers, D. Fish as model systems. Science. 246 (4928), 352-358 (1989).
  25. Naruse, K. Medaka: A Model for Organogenesis, Human Disease, and Evolution. Naruse, K., Tanaka, M., Takeda, H. , Springer. Japan. 19-37 (2011).
  26. Green, P. G., et al. Sex Steroid Regulation of the Inflammatory Response: Sympathoadrenal Dependence in the Female Rat. The Journal of Neuroscience. 19 (10), 4082-4089 (1999).
  27. Pakarinen, P., Huhtaniemi, I. Gonadal and sex steroid feedback regulation of gonadotrophin mRNA levels and secretion in neonatal male and female rats. Journal of Molecular Endocrinology. 3 (2), 139 (1989).
  28. Purves-Tyson, T. D., et al. Testosterone regulation of sex steroid-related mRNAs and dopamine-related mRNAs in adolescent male rat substantia nigra. BMC Neuroscience. 13 (1), 95 (2012).
  29. Adkins-Regan, E., Ascenzi, M. Sexual differentiation of behavior in the zebra finch: Effect of early gonadectomy or androgen treatment. Hormones and Behavior. 24 (1), 114-127 (1990).
  30. McCreery, B. R., Licht, P. Effects of gonadectomy and sex steroids on pituitary gonadotrophin release and response to gonadotrophin-releasing hormone (GnRH) agonist in the bullfrog, Rana catesbeiana. General and Comparative Endocrinology. 54 (2), 283-296 (1984).
  31. Clark, J. H., Markaverich, B. M. The agonistic-antagonistic properties of clomiphene: a review. Pharmacology & Therapeutics. 15 (3), 467-519 (1981).
  32. Mourits, M. J. E., et al. Tamoxifen treatment and gynecologic side effects: a review. Obstetrics & Gynecology. 97 (5), 855-866 (2001).
  33. Wallach, E., Huppert, L. C. Induction of Ovulation with Clomiphene Citrate. Fertility and Sterility. 31 (1), 1-8 (1979).
  34. Moradi, B., Kazemi, M. A., Rahamni, M., Gity, M. Ovarian hyperstimulation syndrome followed by ovarian torsion in premenopausal patient using adjuvant tamoxifen treatment for breast cancer. Asian Pacific Journal of Reproduction. 5 (5), 442-444 (2016).
  35. Alvarado, M. V., et al. Actions of sex steroids on kisspeptin expression and other reproduction-related genes in the brain of the teleost fish European sea bass. The Journal of Experimental Biology. 219 (21), 3353-3365 (2016).
  36. Godwin, J., Crews, D., Warner, R. R. Behavioural sex change in the absence of gonads in a coral reef fish. Proceedings of the Royal Society of London. Series B: Biological Sciences. 263 (1377), 1683-1688 (1996).
  37. Jenkins, N., Dodd, J. M. Effects of ovariectomy of the dogfish Scyliorhinus canicula L. on circulating levels of androgen and oestradiol and on pituitary gonadotrophin content. Journal of Fish Biology. 21 (3), 297-303 (1982).
  38. Manickam, P., Joy, K. P. Changes in hypothalamic catecholamine levels in relation to season, ovariectomy and 17β-estradiol replacement in the catfish, Clarias batrachus (L.). General and Comparative Endocrinology. 80 (2), 167-174 (1990).
  39. Senthilkumaran, B., Joy, K. P. Effects of ovariectomy and oestradiol replacement on hypothalamic serotonergic and monoamine oxidase activity in the catfish, Heteropneustes fossilis: a study correlating plasma oestradiol and gonadotrophin levels. Journal of Endocrinology. 142 (2), 193-203 (1994).
  40. Sladky, K. K., Clarke, E. O. Fish Surgery: Presurgical Preparation and Common Surgical Procedures. Veterinary Clinics of North America: Exotic Animal Practice. 19 (1), 55-76 (2016).
  41. Hori, H. Medaka: A Model for Organogenesis, Human Disease, and Evolution. Naruse, K., Tanaka, M., Takeda, H. , Springer. Japan. 1-16 (2011).
  42. Murata, K., Kinoshita, M., Naruse, K., Tanaka, M., Kamei, Y. Medaka: Biology, Management, and Experimental Protocols. Murata, K., et al. 2, John Wiley & Sons. 49-95 (2019).
  43. Fontaine, R., Weltzien, F. -A. Labeling of Blood Vessels in the Teleost Brain and Pituitary Using Cardiac Perfusion with a DiI-fixative. Journal of Visualized Experiments. (148), e59768 (2019).
  44. Fontaine, R., Hodne, K., Weltzien, F. -A. Healthy Brain-pituitary Slices for Electrophysiological Investigations of Pituitary Cells in Teleost Fish. Journal of Visualized Experiments. (138), e57790 (2018).
  45. Zhao, Y., Wayne, N. L. Recording Electrical Activity from Identified Neurons in the Intact Brain of Transgenic Fish. Journal of Visualized Experiments. (74), e50312 (2013).
  46. Ager-Wick, E., et al. Preparation of a High-quality Primary Cell Culture from Fish Pituitaries. Journal of Visualized Experiments. (138), e58159 (2018).
  47. Wittbrodt, J., Shima, A., Schartl, M. Medaka - model organism from the far east. Nature Reviews Genetics. 3 (1), 53-64 (2002).
  48. Kayo, D., Oka, Y., Kanda, S. Examination of methods for manipulating serum 17β-Estradiol (E2) levels by analysis of blood E2 concentration in medaka (Oryzias latipes). General and Comparative Endocrinology. 285, 113272 (2020).
  49. Eames, S. C., Philipson, L. H., Prince, V. E., Kinkel, M. D. Blood sugar measurement in zebrafish reveals dynamics of glucose homeostasis. Zebrafish. 7 (2), 205-213 (2010).
  50. Velasco-Santamaría, Y. M., Korsgaard, B., Madsen, S. S., Bjerregaard, P. Bezafibrate, a lipid-lowering pharmaceutical, as a potential endocrine disruptor in male zebrafish (Danio rerio). Aquatic Toxicology. 105 (1-2), 107-118 (2011).
  51. Jagadeeswaran, P., Sheehan, J. P., Craig, F. E., Troyer, D. Identification and characterization of zebrafish thrombocytes. British Journal of Haematology. 107 (4), 731-738 (1999).
  52. Zang, L., Shimada, Y., Nishimura, Y., Tanaka, T., Nishimura, N. Repeated Blood Collection for Blood Tests in Adult Zebrafish. Journal of Visualized Experiments. (102), e53272 (2015).
  53. Taves, M. D., et al. Steroid concentrations in plasma, whole blood and brain: effects of saline perfusion to remove blood contamination from brain. PloS one. 5 (12), 15727 (2010).
  54. Holtkamp, H. C., Verhoef, N. J., Leijnse, B. The difference between the glucose concentrations in plasma and whole blood. Clinica Chimica Acta. 59 (1), 41-49 (1975).
  55. Kanda, S., et al. Identification of KiSS-1 Product Kisspeptin and Steroid-Sensitive Sexually Dimorphic Kisspeptin Neurons in Medaka (Oryzias latipes). Endocrinology. 149 (5), 2467-2476 (2008).
  56. Kanda, S., Karigo, T., Oka, Y. Steroid Sensitive kiss2 Neurones in the Goldfish: Evolutionary Insights into the Duplicate Kisspeptin Gene-Expressing Neurones. Journal of Neuroendocrinology. 24 (6), 897-906 (2012).
  57. Mitani, Y., Kanda, S., Akazome, Y., Zempo, B., Oka, Y. Hypothalamic Kiss1 but Not Kiss2 Neurons Are Involved in Estrogen Feedback in Medaka (Oryzias latipes). Endocrinology. 151 (4), 1751-1759 (2010).
  58. Kayo, D., Zempo, B., Tomihara, S., Oka, Y., Kanda, S. Gene knockout analysis reveals essentiality of estrogen receptor β1 (Esr2a) for female reproduction in medaka. Scientific Reports. 9 (1), 8868 (2019).
  59. Fontaine, R., Ager-Wick, E., Hodne, K., Weltzien, F. -A. Plasticity in medaka gonadotropes via cell proliferation and phenotypic conversion. Journal of Endocrinology. 245 (1), 21 (2020).
  60. Fontaine, R., Ager-Wick, E., Hodne, K., Weltzien, F. -A. Plasticity of Lh cells caused by cell proliferation and recruitment of existing cells. Journal of Endocrinology. 240 (2), 361 (2019).
  61. Hasebe, M., Kanda, S., Oka, Y. Female-Specific Glucose Sensitivity of GnRH1 Neurons Leads to Sexually Dimorphic Inhibition of Reproduction in Medaka. Endocrinology. 157 (11), 4318-4329 (2016).

Tags

Biologi Utgave 166 Gonadectomy ovariectomy orchidectomy kastrering medaka blod steroider fisk reproduksjon plastisitet østradiol 11-ketotestosteron
Gonadectomy og blodprøvetaking prosedyrer i liten størrelse Teleost Modell Japansk Medaka (<em>Oryzias latipes</em>)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Royan, M. R., Kanda, S., Kayo, D.,… More

Royan, M. R., Kanda, S., Kayo, D., Song, W., Ge, W., Weltzien, F. A., Fontaine, R. Gonadectomy and Blood Sampling Procedures in the Small Size Teleost Model Japanese Medaka (Oryzias latipes). J. Vis. Exp. (166), e62006, doi:10.3791/62006 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter