Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Gonadektomi og blodprøvetagning procedurer i den lille størrelse Teleost Model japanske Medaka (Oryzias latipes)

Published: December 11, 2020 doi: 10.3791/62006
Automatic Translation
1, 2, 3, 4, 4, 1, 1
1Physiology Unit, Faculty of Veterinary Medicine, Norwegian University of Life Sciences, 2Laboratory of Physiology, Atmosphere and Ocean Research Institute, The University of Tokyo, 3Department of Biological Sciences, Graduate School of Science, The University of Tokyo, 4Centre of Reproduction, Development and Aging (CRDA), Faculty of Health Sciences, University of Macau

Summary

Artiklen beskriver en hurtig protokol til gonadectomize og prøve blod fra den lille teleost fisk, ved hjælp af japansk medaka (Oryzias latipes) som en model, at undersøge den rolle, sex steroider i dyr fysiologi.

Abstract

Sex steroider, produceret af gonaderne, spiller en væsentlig rolle i hjernen og hypofysen væv plasticitet og i neuroendokrine kontrol af reproduktion i alle hvirveldyr ved at give feedback til hjernen og hypofysen. Teleost fisk besidder en højere grad af væv plasticitet og variation i reproduktive strategier i forhold til pattedyr og synes at være nyttige modeller til at undersøge den rolle, sex steroider og de mekanismer, som de virker. Fjernelsen af den vigtigste kilde til sex steroid produktion ved hjælp af gonadektomi sammen med blodprøvetagning til at måle steroid niveauer har været veletableret og temmelig muligt i større fisk og er en kraftfuld teknik til at undersøge rolle og virkninger af sex steroider. Men disse teknikker rejser udfordringer, når de gennemføres i små størrelse teleost modeller. Her beskriver vi de trinvise procedurer for gonadektomi hos både mænd og kvindelig japansk medaka efterfulgt af blodprøvetagning. Disse protokoller er vist sig at være meget muligt i medaka angivet ved en høj overlevelsesrate, sikkerhed for levetiden og fænotypen af fisken, og reproducerbarhed i form af sex steroid clearance. Brugen af disse procedurer kombineret med de andre fordele ved at bruge denne lille teleost model vil i høj grad forbedre forståelsen af feedback mekanismer i neuroendokrine kontrol af reproduktion og væv plasticitet fra sex steroider i hvirveldyr.

Introduction

I hvirveldyr, sex steroider, som hovedsagelig produceres af gonaderne, spiller vigtige roller i reguleringen af Brain-Pituitary-Gonadal (BPG) akse gennem forskellige feedback mekanismer1,2,3,4,5. Derudover påvirker sex steroider spredning og aktivitet af neuroner i hjernen6,7,8 og endokrine celler, herunder gonadotropes, i hypofysen9,10, og dermed tjene afgørende roller i hjernen og hypofysen plasticitet. På trods af relativt god viden hos pattedyr er mekanismen i BPG-aksereguleringen, der er medieret af sex steroider, langt fra at blive forstået hos ikke-pattedyrarter, hvilket fører til dårlig forståelse af evolutionære bevarede principper11. Der er stadig et begrænset antal undersøgelser, der dokumenterer den rolle, sex steroider på hjernen og hypofysen plasticitet, hvilket øger behovet for yderligere undersøgelser af rolle og virkninger af sex steroider på forskellige hvirveldyr arter.

Blandt hvirveldyr er teleosts blevet kraftfulde modeldyr til at løse mange biologiske og fysiologiske spørgsmål, herunder stressrespons12,13, vækst14,15, ernæringsmæssig fysiologi16,17 og reproduktion2. Teleosts, hvor sex steroider er for det meste repræsenteret ved estradiol (E2) hos kvinder og 11-ketotestosterone (11-KT) hos mænd18,19, har længe været pålidelige eksperimentelle modeller til undersøgelse af det generelle princip om reproduktion på tværs af arter. Teleosts viser unikhed i deres hypothalamic-hypofyseforbindelse20,21 og forskellige gonadotrope celler22, som undertiden er bekvemme til belyselse af reguleringsmekanismer. Desuden tilbyder teleosts mange fordele i forhold til andre organismer på grund af deres evne til både laboratorie- og feltforsøg. De er relativt billige at købe og vedligeholde23,24. Især små teleostmodeller som zebrafisk (Danio rerio) og den japanske medaka (Oryzias latipes), er arter med meget høj fecundity og en relativt kort livscyklus, der muliggør hurtig analyse af genfunktion og sygdomsmekanismer23,hvilket giver endnu større fordele ved at løse en overflod af biologiske og fysiologiske spørgsmål i betragtning af de mange veludviklede protokoller og genetiske værktøjskasse, der er tilgængelige for disse arter25.

I talrige undersøgelser er fjernelsen af gonader (gonadektomi) sammen med blodprøvetagningsteknikker blevet brugt som en metode til at undersøge mange fysiologiske spørgsmål, herunder dens indvirkning i hvirveldyr reproduktiv fysiologi hos pattedyr26,27,28, fugle29 og amfibier30. Selv om gonadektomi effekt på reproduktiv fysiologi kan alternativt efterlignes af sex steroid antagonister, såsom tamoxifen og clomiphene, effekten af narkotika synes at være inkonsekvent på grund af bimodale virkninger31,32. Kronisk eksponering for en sex steroid antagonist kan føre til ovarie udvidelsen33,34, som kan deaktivere observation af dens virkninger til langsigtede formål på grund af en usund fænotype. Derudover er det umuligt at udføre et opsving eksperiment efter sex steroid antagonistisk behandling, at berettige den specifikke effekt af visse køn steroider. Sammen med disse ovennævnte punkter, andre kompromiser af sex steroid antagonistisk brug er blevet grundigt gennemgået31,32. Derfor, gonadectomy stadig vises i dag som en kraftfuld teknik til at undersøge den rolle, sex steroider.

Mens gonadektomi og blodprøvetagning teknikker er relativt let at udføre i større arter, såsom europæisk havabbor (Dicentrarchus labrax)35, bluehead wrasse (Thalassoma bifasciatum)36, dogfish (Scyliorhinus canicula)37 og havkat (Heteropneustes fossilis og Clarias bathracus)38,39, de rejserudfordringer,når de anvendes i små fisk som medaka. For eksempel er brugen af Fish Anesthesia Delivery System (FADS)40 mindre mulig og synes at være tilbøjelig til overdreven fysisk skade for små fisk. Derudover er en gonadektomiprocedure, der almindeligvis anvendes til større fisk40, ikke egnet til små fisk, der kræver høj præcision for at undgå overdreven skade. Endelig er blodprøvetagning udfordrende på grund af den begrænsede adgang til blodkar og den lille mængde blod i disse dyr. Derfor er en klar protokol, der demonstrerer hvert trin af gonadektomi og blodprøvetagning i en lille teleost, af betydning.

Denne protokol viser de trinvise procedurer for gonadektomi efterfulgt af blodprøvetagning i japansk medaka, en lille ferskvandsfisk hjemmehørende i Østasien. Japansk medaka har et sekventeret genom, flere molekylære og genetiske værktøjer til rådighed25, og en genetisk kønsbestemmelse system giver mulighed for undersøgelse af seksuelle forskelle, før sekundære seksuelle egenskaber eller gonader er veludviklede41. Interessant nok besidder japansk medaka smeltede gonader i modsætning til mange andre teleostarter42. Disse to teknikker tilsammen tager kun 8 minutter i alt og vil fuldføre listen over videoprotokoller, der allerede findes for denne art, der omfattede mærkning af blodkar43, patch-klemme på hypofyse sektioner44 og hjernen neuroner45,og primær celle kultur46. Disse teknikker vil gøre det muligt for forskersamfundet at undersøge og bedre forstå roller sex steroider i feedback mekanismer samt hjerne og hypofyse plasticitet i fremtiden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle forsøg og dyrehåndtering blev udført i overensstemmelse med anbefalingerne om forsøgsdyr på Norges Biovidenskabelige Universitet. Forsøg med gonadektomi blev godkendt af den norske fødevaresikkerhedsautoritet (FOTS ID 24305).

BEMÆRK: Forsøgene blev udført ved hjælp af voksne mænd og kvinder (6-7 måneder gamle, vægt ca. 0,35 g, længde ca. 2,7 cm) japansk medaka. Kønnet blev bestemt ved at skelne mellem de sekundære seksuelle egenskaber, såsom størrelsen og formen af ryg- og analfin, som beskrevet i42,47.

1. Forberedelse af instrumenter og løsninger

  1. Forbered bedøvelsesmiddelopløsning (0,6% Tricain).
    1. Fortynd 0,6 g tricain (MS-222) i 100 mL af 10x fosfat buffer saltvand (PBS).
    2. 1 mL af Tricain-lageropløsningen fordeles i flere 1,5 mL plastrør og opbevares ved -20 °C, indtil den anvendes.
  2. Forbered opsamlingsvand (0,9% NaCl-opløsning) ved at tilsætte 18 g NaCl i 2 L akvarievand. Opbevar opløsningen ved stuetemperatur, indtil den er i brug.
  3. Forbered snitværktøjerne ved at bryde en barbermaskine diagonalt for at få et skarpt punkt (Figur 1A).
  4. Opløsning mod coagulant i blodet (0,05 U/μL natrium heparin) ved fortynding af 25 μL natrium heparin i 500 μL af 1x PBS. Antikoagulantopløsningen opbevares ved 4 °C, indtil den anvendes.
  5. Forbered to glasnåle fra en 90 mm lang glaskapillær ved at trække en glaskapillær med en nåletrækker (Figur 1B) efter fabrikantens anvisninger.
    BEMÆRK: Glasnålens ydre diameter er 1 mm, mens den indvendige diameter er 0,6 mm.
  6. Forbered et 1,5 mL plastrørslåg ved at skære låget og lave et hul, der passer til nålens ydre diameter (Figur 1C). For at gøre hullet, varme den ene ende af 9 mm glas kapillær og stikke den opvarmede glas kapillær gennem låget. Alternativt kan du bruge en nål til at stikke gennem låget, indtil diameteren af hullet passer med 9-mm glas kapillær.

2. Gonadektomi procedure

  1. Forbered 0,02% af bedøvelsesopløsningen ved at fortynde et rør tricainlager (0,6%) i 30 mL akvarievand.
  2. Forbered dissektionsværktøjer, herunder en ultrafin og to fine sammenkævne (en med relativt bred spids), lille saks, nylontråd og barbermaskine som beskrevet i trin 1.3.
  3. Bedøve fisken ved at sætte den i 0,02% bedøvelsesopløsning i 30-60 sekunder.
    BEMÆRK: Anæstesiens varighed afhænger af fiskens størrelse og vægt og skal tilpasses. For at sikre, at fisken er fuldt bedøvet, kan fiskekroppen klemmes forsigtigt ved hjælp af sammenkæd. Hvis fisken ikke reagerer, kan gonadektomien startes.
  4. Tag fisken ud af bedøvelsesopløsningen og placer fisken vandret på siden, ud af vandet under et dissektionsmikroskop.
  5. Ovariektomi (OVX) hos kvinder
    1. Fjern eventuelt ovipositerede æg (æg, der hænger uden for kvindekroppen), og skrab vægten i snitområdet (figur 2A).
    2. Lav forsigtigt et snit, der er ca. 2-2,5 mm langt mellem ribbenene, mellem bækkenet og analfinnerne (Figur 2A), ved hjælp af barberbladet. Derefter klemme forsigtigt fisken maven, mens du tager æggestokkene ud lidt efter lidt ved hjælp af fine sammenkædninger med bred spids.
    3. Skær slutningen af æggestokkene ved hjælp af fine sammenkædninger og læg æggestokkene til side (figur 2B).
      BEMÆRK: Pas på ikke at bryde æggestokkene sækken, hvis det er muligt. Hvis æggestokkene sæk er brudt, fjerne eventuelle gonad spor så helt som muligt uden at forlade selv nogen ikke-ægløsning æg.
  6. Orchidectomy hos mænd
    1. Lav forsigtigt et snit mellem ribbenene over anus (Figur 2A), og åbn snittet langsomt ved hjælp af fine sammentrækninger.
    2. Tag forsigtigt testiklerne ved hjælp af de fine sammentak og tag langsomt testiklerne ud. Derefter skæres enden af testiklerne for helt at fjerne testiklerne (Figur 2B). For mandlig orkidéektomi ligner alle præparater hos kvinder indtil snitdelen. Når du griber testiklerne, opnås nogle gange fedtet, der ligner testiklerne. Men efter at have genoprettet fedtet er det muligt at forsøge at finde testiklerne igen (Figur 2B).
      BEMÆRK: For både mænd og kvinder er det vigtigt at minimere snitstørrelsen i maven for at forhindre for store skader, der kan føre til dødelighed. Nogle gange kan tarmene også forekomme gennem snittet sammen med gonaderne, så sørg for, at de returneres korrekt inde i snittet før lukning. Forudgående viden om æggestokke og testikler placering i medaka mave er afgørende.
  7. Sy indsnitt på samme måde hos mænd og kvinder (Figur 3).
    1. Anbring nylontråden ved siden af snitområdet, og stik huden fra højre side af snittet gennem det indre kropshulrum ved hjælp af ultrafine sammentrækninger til at tage tråden ind med fine sammentrækninger (figur 3; 1-2).
    2. Stik huden fra venstre side af snittet gennem det ydre kropshulrum for at fjerne tråden ( Figur 3; 3-4).
    3. Snittet lukkes, og der laves to knob, og skær den overdrevne tråd over (figur 3; 4-6).
      BEMÆRK: Suturen skal være tilstrækkelig stram, og den resterende tråd på fisken skal være lang nok til at forhindre lempelse af suturen. Hele proceduren fra anæstesi til suturing tager normalt op til 6 minutter. Længere tid kan føre til dødelighed.
    4. Sæt fisken i genopretningsvandet og lad dem stå i mindst 24 timer, før du overfører dem til akvariesystemet.
      BEMÆRK: Gonadectomiseret fisk viser normalt normal adfærd efter 1-2 timer i opsamlingsvandet. Afhængigt af eksperimentets formål kan man derfor prøve fisken efter dette tidsinterval.

3. Blodprøvetagningsprocedure

  1. Forbered værktøjerne: en glasnål, en silikone kapillær, et plastikrør med et hul, et tomt 1,5 mL plastrør, en minicentrifuge og tape.
  2. Bedøve fisken ved hjælp af 0,02% bedøvelsesmiddelopløsning som beskrevet i trin 2.1 og placere fisken under et dissektionsmikroskop i lodret position (Figur 4A). Placer fisken på en lys overflade for at lette visualiseringen af den kaukasiske punkteringsåre.
  3. Installer blodskuffen ved at fastgøre en glasnål til silikonekapillæren (Figur 4B). Bryd spidsen af nålen med brede spidstr frem og bedæk indersiden af nålen med anti-koagulant opløsning ved at suge og blæse.
    BEMÆRK: Det anbefales at bruge en sucker og en silikone kapillær med en længde på mindst 50 cm til sikkerhedsforanstaltninger for at undgå direkte kontakt med blodet ved sugning. Derudover skal du sørge for, at åbningen af nålespidsen er tilstrækkelig stor til, at blodet kan trækkes.
  4. Ret nålen mod fiskens peduncle-område, sigte mod den kausale peduncle vene (Figur 5A) og tegn blodet ved hjælp af munden, indtil mindst en fjerdedel af nålens samlede volumen er fyldt (Figur 5B).
    BEMÆRK: Det er vigtigt at holde op med at suge, før nålen fjernes fra fiskekroppen.
  5. Slip nålen og læg et stykke tape i nærheden af den skarpe side af nålen. Læg låget med et hul på et opsamlingsrør, og sæt nålen inde i røret gennem hullet med nålespidsen på ydersiden (Figur 5C).
  6. Sæt fisken i genopretningsvandet og lad dem stå i mindst 24 timer, før du overfører dem til akvariesystemet.
    BEMÆRK: Hvis du vil udføre endnu en blodprøve fra den samme fisk, skal du prøve blodet en uge efter den første blodprøvetagning.
  7. Flash spin ned det indsamlede blod i 1-2 sekunder med 1.000 x g ved stuetemperatur for at samle blodet i røret.
  8. Fortsæt direkte til downstream-applikationer, eller opbevar blodet ved -20 °C, indtil det er taget i brug.
    BEMÆRK: Der henvises til den tidligere undersøgelse for sex steroid ekstraktion fra fuldblod48.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Denne protokol beskriver hvert skridt for at udføre gonadektomi og blodprøvetagning i en lille størrelse model teleost, den japanske medaka. Overlevelsesraten for fisken efter ovariektomi (OVX) hos kvinder er 100% (10 ud af 10 fisk), mens 94% (17 ud af 18 fisk) af mændene overlevede efter orkidéektomi. I mellemtiden, efter blodprøvetagningsproceduren blev udført, overlevede alle (38 fisk) fisk.

Sham-opererede hunner viser oviposition (figur 6A), og alle æggene blev befrugtet og tilladt til embryonal udvikling (figur 6B). Sham-opererede mænd var også i stand til at befrugte æg efter kun 1-2 uger. To ud af seks delvist gonadectomiserede hunner opdrættet med delvist gonadectomiserede mænd viste også oviposition med 100% af befrugtede æg efter 2 måneder. I modsætning hertil blev der ikke observeret nogen oviposition hos kvinder eller befrugtning af mænd i fuldt gonadectomiseret fisk, selv efter 4 måneder.

Når fiskens kropsform udføres korrekt, ændres den en smule (figur 7A), og der må ikke være noget stykke gonad tilbage efter gonadektomiproceduren (figur 7B). I mellemtiden forsvandt 4 uger efter gonadektomi, indsnit og sutur helt (Figur 8), og efter 4 måneder viste alle gonadectomiserede fisk stadig sund fænotype, og der blev ikke fundet gonadalvæv.

E2-blodkoncentrationer hos kvinder (tabel 1), målt med ELISA efter fabrikantens anvisninger, viste, at E2-niveauet hos OVX-fisk er betydeligt lavere end hos falske fisk 24 timer efter operationen (p < 0,00001). Efter 4 måneder er E2-niveauet i OVX-fisk også betydeligt lavere end i falsk-opereret fisk (p < 0,00001) og viser ingen signifikant forskel i forhold til den i 24 timer efter OVX fisk (p > 0,05). Endelig viser delvis OVX-fisk, hvor kun 1/3 til 1/2 af gonad blev fjernet, betydeligt lavere E2-niveauer end falsk-opereret fisk (p = 0,0437) og betydeligt højere E2-niveauer end fuldt OVX-fisk (p < 0,00001) (figur 9A).

Tilsvarende hos mænd (tabel 1) er 11-KT-koncentrationen i orkidéektomiiseret fisk betydeligt lavere end hos falske fisk 24 timer efter operationen (p < 0,00001). Niveauet af 11-KT i orchidectomized fisk efter 4 måneder er også betydeligt lavere end i falske-opererede fisk(p < 0,00001) og viser ingen forskel i forhold til 24 timer post-orchidectomized fisk (p > 0,05). Endelig viser delvis orkidéektomierede fisk betydeligt lavere niveauer på 11-KT end sham-opereret fisk (p = 0,0428) og betydeligt højere niveauer på 11-KT end fuldt orchidectomiseret fisk (p < 0,00001) (figur 9B).

Figure 1
Figur 1. Instrument forberedelse. (A) Barberblad til gonadektomi, (B) glasnål til blodudvinding og (C) et plastikrør sammen med et låg med et hul til blodopsamling. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2. Placering af snitområdet. A) Tegning af snitområdet mellem ribbenene, mellem bækken- og analfinnerne hos hunner (venstre panel) og hanner (højre panel); B) gonad fjernelse hos kvinder (venstre panel) og mænd (højre panel), hvide cirkler, der viser den fælles del, hvid pil, der viser testis og sort pil, der viser fedt. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3. Suturproceduren. 1) Et hul er lavet på højre side af snittet ved hjælp af ultra-fine sammentrækninger. 2) Nylontråden føres gennem huden ved hjælp af hullet lavet i 1. 3) Et hul er lavet i venstre side af snittet. 4) Nylontråden føres gennem hullet lavet i 3. 5) En overhåndsknude laves to gange for at lukke snittet. 6) Overskydende tråd er skåret. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4. Fiskeposition under blodprøvetagning (A), installation af glasnål med silikone kapillær (B). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5. Sugeområdet for blodprøvetagning (A), trukket blod (B) og blodindsamling trin (C). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6. Sham-opereret fisk viser oviposition af æg peget med hvid pil (A) og befrugtede æg (B). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 7
Figur 7. Morfologisk (A) og anatomisk (B) udseende af intakt og gonadectomiseret fisk. Hvide pile (toppaneler) viser kirurgimærket på gonadectomiseret fisk. Sorte pile (bundpaneler) viser gonader i intakt fisk. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 8
Figur 8. Kirurgi mærker i mandlige og kvindelige fisk efter 4 uger. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 9
Figur 9. Blodets indhold af E2 hos kvinder (A) og 11-KT hos mænd (B) japansk medaka, 24 timer efter falsk operation (kontrol), delvis gonadektomi eller gonadektomi og 4 måneder efter gonadektomi (OVX, ovariektomi hos kvinder; Cas, orkidéektomi hos mænd). De statistiske analyser blev udført ved hjælp af One Way ANOVA efterfulgt af Tukey Post Hoc-test. Forskellige bogstaver (a-c) viser betydelige forskelle (p-værdi < 0,05). Data i grafen angives som middel + SD, n = 5. Klik her for at se en større version af dette tal.

E2 niveauer (kvinder) 11-KT niveauer (Mænd)
Sham-opereret 4.15 ± 0,5 (n = 5) 10,38 ± 1,32 (n = 5)
Delvist gonadectomiseret 3.37 ± 0,6 (n = 5) 8,37 ± 1,92 (n = 5)
24h post-gonadectomy 0,36 ± 0,2 (n = 5) 0,4 ± 0,2 (n = 5)
4 måneder efter gonadectomy 0,54 ± 0,28 (n = 5) 0,74 ± 0,22 (n = 5)

Tabel 1. E2- og 11-KT-niveauer (ng/mL) hos kvinder og hanner af sham-opereret og gonadectomiseret og delvis gonadectomiseret fisk.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Som rapporteret i tidligere litteratur, gonadektomi og blodprøvetagning har længe været brugt i andre model arter til at undersøge spørgsmål i forbindelse med den rolle, sex steroider i regulering af BPG akse. Men disse teknikker synes at være modtagelige kun for større dyr. I betragtning af den lille størrelse af den almindeligt anvendte teleostmodel, japansk medaka, leverer vi en detaljeret protokol for gonadektomi og blodprøvetagning, der er mulig for denne art.

Det faktum, at overlevelsesraten for gonadectomiseret fisk nåede næsten 100%, indikerer, at gonadektomiproceduren er mulig at anvende på medaka. På samme måde påvirker proceduren for blodprøvetagning ikke fiskens overlevelsesevne som vist ved 100% overlevelsesraten efter at have gennemgået denne procedure. Derudover viser falske hunner opdrættet sammen med falske hanner oviposition og 100% befrugtede æg, hvilket indikerer, at snit- og suturproceduren ikke påvirker fiskens reproduktion. Med andre ord var de sunde nok til at gyde. Desuden, delvis gonadectomized fisk viser sammenlignelige koncentrationer af sex steroider til falsk-opereret fisk, og oviposition i nogle hunner samt befrugtning af æg af mænd blev observeret i disse delvis gonadectomized fisk. Disse resultater tyder på, at proceduren for gonadectomi skal udføres med høj præcision, hvilket betyder, at æggestokkene eller testiklerne skal fjernes helt.

Som vist i figur 8forsvandt indsnit og suturmærket på fisken helt 4 uger efter gonadectomien, og fisken er stadig i live og ser sund ud 4 måneder efter operationen. Disse indikerer, at driftsproceduren er sikker for fisken til langsigtede formål og påvirker ikke fiskens levetid. Derudover blev der efter 4 måneder ikke observeret gonader. Dette bekræftes af de lave niveauer af E2 og 11-KT, der stadig ligner dem, der findes i gonadectomiseret fisk efter 24 timer.

Niveauet af E2 og 11-KT i gonadectomiseret fisk er betydeligt lavere end falsk-opereret fisk, allerede efter 24 timer efter gonadectomi og forbliver lavere i fisk udtaget 4 måneder efter gonadectomi. De betydeligt lavere køn steroid niveauer i gonadectomized fisk i forhold til kontrol er blevet observeret i tidligere undersøgelser i dogfish37, havkat39 og medaka48. Disse konsekvente beviser tyder på, at gonadektomi procedure beskrevet i protokollen er en pålidelig teknik til at rydde cirkulerende sex steroider.

Da denne procedure ikke er afhængig af MODELS som påvist i40, bør gonadektomien udføres så hurtigt som muligt for at forhindre dødelighed under operationen. Faktisk gør brugen af FADS det muligt at opretholde driftsrytmen, da dette værktøj tillader kontinuerlig bedøvelsestilstand for fisken, selv om de udsættes for luften. På grund af dens lavere gennemførlighed i den lille teleost som medaka kan brugen af FADS ikke udføres med denne størrelse fisk. I modsætning til den tidligere gonadektomiprotokol i større fisk, der gør det muligt for bredt snit at nå gonaden, tillader protokollen, der er beskrevet i dette manuskript, ikke bredt snit for at undgå overdreven skade på de små fisk. Derfor bør man være meget forsigtig, når man forsøger at få adgang til gonad ved hjælp af sammenkæd for at forhindre skader i andre væv inde i fiskekroppen hulrum.

Protokollen er afhængig af en hurtig og ren procedure. Træning anbefales således stærkt, indtil der opnås en høj succesrate, angivet ved en høj overlevelsesrate for fisken efter gonadektomi samt fuldstændig fjernelse af gonaderne (se forskellen på morfologisk og anatomisk udseende af fisken før og efter vellykket gonadektomi i figur 7). Faktisk kan mange faktorer påvirke succesraten for proceduren, herunder anæstesiperioden, snittets udvidelse, nøjagtigheden og ryddeligheden af suturen og fiskehåndtering under proceduren. Et andet vigtigt punkt er, at man skal forberede sunde fisk ved at opretholde fisken optimalt, før man udfører protokollen.

Med hensyn til blodprøvetagning procedure, de tidligere undersøgelser har forsøgt at prøve blodet fra medaka48 og zebrafisk49,50,51, men proceduren tillader ikke gentagne blodprøvetagning i den samme fisk, da blodet er taget efter aflivning af fisk. Gentagen blodprøvetagning er blevet påvist ved hjælp af zebrafisk i en anden undersøgelse52, men vi rapporterer denne type protokol for første gang i medaka.

Evalueringen af sex steroid koncentrationer er almindeligt udført ved hjælp af en enzym-forbundet immunosorbent assay (ELISA) kit, og der har været mange ELISA kits kommercielt tilgængelige for forskellige typer af sex steroider. På grund af den lave mængde blod indsamlet under blodprøvetagning, downstream assays er beregnet til fuldblod. Tidligere undersøgelser har vist, at der er en forskel i det målte niveau af cirkulerende steroid niveauer udvundet af fuldblod og plasma53,54. Derfor, forskellen i sex steroid niveauer fra fuldblod og plasma skal valideres forud for udførelsen af den virkelige eksperiment ved hjælp af protokollen.

Som dokumenteret i tidligere undersøgelser med forskellige dyremodeller, vil den protokol, der er beskrevet her, gøre det muligt at undersøge spørgsmål relateret til reproduktiv fysiologi ved hjælp af en lille størrelse teleost som model. Faktisk har disse teknikker allerede bidraget til at besvare spørgsmål vedrørende reguleringen af BPG-aksen og dens feedbackmekanismer, såsom inddragelse af kiss1 (kisspeptin gentype 1) udtrykker neuroner i positive feedback loops55, østrogen-medieret regulering af kiss1 udtrykke neuroner i nucleus ventralis tuberis (NVT), og kiss2 (kisspeptin gentype 2) udtrykker neuroner i præoptisk område (POA)56, 57, den mulige inddragelse af østrogenreceptor β1 (Esr2a) i nedregulerende fsh ekspressionsniveau i kvindelig japansk medaka58 samt profilen af døgnrytmen af E2 i kvindelige fisk48. Desuden, da tidligere undersøgelser viste, at sex steroider også påvirke spredningen af gonadotrope celler i hypofysen af teleoste59,60, Det er spændende at undersøge virkningerne af sex steroid clearance efter gonadectomy på hypofyse plasticitet.

Blod prøveudtagning teknik ikke kun kan bruges til sex steroid analyse, men også for andre blodindhold analyse, herunder blodsukkerniveauer. Faktisk kan protokollen også anvendes til blodsukkermålinger som påvist i zebrafisk52 og medaka61. Derfor kan denne teknik udvides til at behandle forskningsspørgsmål inden for andre områder af fysiologi.

Endelig er de protokoller, der er beskrevet her, beregnet og optimeret til voksen japansk medaka, og resultaterne på grund af forskellige størrelser af fisk og materialer, der anvendes under procedurerne, kan variere. Da medaka til venstre og højre æggestokke/ testikler er smeltet sammen, hvilket kan give gonadektomi en vigtig fordel, kan denne protokol have brug for flere tilpasninger, før den anvendes i andre arter, hvor dette ikke er tilfældet, f.eks. i zebrafisk. Der bør således tages hensyn til en optimering i henhold til valget af laboratorieudstyr og fiskestørrelse, inden disse protokoller testes.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Forfatterne takker Fru Lourdes Carreon G Tan for hendes hjælp i fiskeopdræt. Dette arbejde blev finansieret af NMBU, Grants-in-Aid fra Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) (Grant nummer 18H04881 og 18K19323), og tilskud til Grundforskning Forskningsprojekter fra Sumitomo Foundation til S.K.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Glass capilary GD1 Glass Capillary with Filament GD-1; Narishige
Heparin sodium salt H4784-1G Sigma-aldrich
Needle puller P97 Flaming/Brown Micropipette puller Model P-97; Sutter Instrument
Nylon thread N45VL Polyamide suture, 0.2 metric; Crownjun
Plastic tube T9661 Eppendorf Safe-lock microcentifuge tube 1.5 ml, Sigma-aldrich
Razor blade - Astra Superior Platinum Double Edge Razor Blades Green, salonwholesale.com
Silicone capillary a16090800ux0403 Uxcell Silicone Tube 1 mm ID x 2 mm OD, amazon.com 
Tricaine WXBC9102V Aldrich chemistry

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Weltzien, F. -A., Andersson, E., Andersen, Ø, Shalchian-Tabrizi, K., Norberg, B. The brain-pituitary-gonad axis in male teleosts, with special emphasis on flatfish (Pleuronectiformes). Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Molecular & Integrative Physiology. 137 (3), 447-477 (2004).
  2. Yaron, Z., Levavi-Sivan, B. Encyclopedia of Fish Physiology. Farrell, A. P. 2, Academic Press. 1500-1508 (2011).
  3. Goldman, B. D. The circadian timing system and reproduction in mammals. Steroids. 64 (9), 679-685 (1999).
  4. Taranger, G. L., et al. Control of puberty in farmed fish. General and Comparative Endocrinology. 165 (3), 483-515 (2010).
  5. Messinis, I. E. Ovarian feedback, mechanism of action and possible clinical implications. Human Reproduction Update. 12 (5), 557-571 (2006).
  6. Diotel, N., et al. The brain of teleost fish, a source, and a target of sexual steroids. Frontiers in Neuroscience. 5, 137 (2011).
  7. Diotel, N., et al. Steroid Transport, Local Synthesis, and Signaling within the Brain: Roles in Neurogenesis, Neuroprotection, and Sexual Behaviors. Frontiers in Neuroscience. 12, 84 (2018).
  8. Larson, T. A. Sex Steroids, Adult Neurogenesis, and Inflammation in CNS Homeostasis, Degeneration, and Repair. Frontiers in Endocrinology. 9, 205 (2018).
  9. Fontaine, R., et al. Gonadotrope plasticity at cellular, population and structural levels: A comparison between fishes and mammals. General and Comparative Endocrinology. 287, 113344 (2020).
  10. Fontaine, R., Royan, M. R., von Krogh, K., Weltzien, F. -A., Baker, D. M. Direct and indirect effects of sex steroids on gonadotrope cell plasticity in the teleost fish pituitary. Frontiers in Endocrinology. , (2020).
  11. Kanda, S. Evolution of the regulatory mechanisms for the hypothalamic-pituitary-gonadal axis in vertebrates-hypothesis from a comparative view. General and Comparative Endocrinology. 284, 113075 (2019).
  12. Schreck, C. B. Stress and fish reproduction: The roles of allostasis and hormesis. General and Comparative Endocrinology. 165 (3), 549-556 (2010).
  13. Wendelaar Bonga, S. E. The stress response in fish. Physiological Reviews. 77 (3), 591-625 (1997).
  14. Mommsen, T. P. Paradigms of growth in fish. Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Biochemistry and Molecular Biology. 129 (2), 207-219 (2001).
  15. Won, E., Borski, R. Endocrine Regulation of Compensatory Growth in Fish. Front. Endocrinol. 4, 74 (2013).
  16. MacKenzie, D. S., VanPutte, C. M., Leiner, K. A. Nutrient regulation of endocrine function in fish. Aquaculture. 161 (1), 3-25 (1998).
  17. Rønnestad, I., Thorsen, A., Finn, R. N. Fish larval nutrition: a review of recent advances in the roles of amino acids. Aquaculture. 177 (1), 201-216 (1999).
  18. Borg, B. Androgens in teleost fishes. Comparative Biochemistry and Physiology Part C: Pharmacology, Toxicology and Endocrinology. 109 (3), 219-245 (1994).
  19. Rege, J., et al. Circulating 11-oxygenated androgens across species. The Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology. 190, 242-249 (2019).
  20. Blázquez, M., Bosma, P. T., Fraser, E. J., Van Look, K. J. W., Trudeau, V. L. Fish as models for the neuroendocrine regulation of reproduction and growth. Comparative Biochemistry and Physiology Part C: Pharmacology, Toxicology and Endocrinology. 119 (3), 345-364 (1998).
  21. Zambrano, D. Innervation of the teleost pituitary. General and Comparative Endocrinology. 3, 22-31 (1972).
  22. Weltzien, F. -A., Hildahl, J., Hodne, K., Okubo, K., Haug, T. M. Embryonic development of gonadotrope cells and gonadotropic hormones - Lessons from model fish. Molecular and Cellular Endocrinology. 385 (1), 18-27 (2014).
  23. Harris, M. P., Henke, K., Hawkins, M. B., Witten, P. E. Fish is Fish: the use of experimental model species to reveal causes of skeletal diversity in evolution and disease. Journal of applied ichthyology. 30 (4), 616-629 (2014).
  24. Powers, D. Fish as model systems. Science. 246 (4928), 352-358 (1989).
  25. Naruse, K. Medaka: A Model for Organogenesis, Human Disease, and Evolution. Naruse, K., Tanaka, M., Takeda, H. , Springer. Japan. 19-37 (2011).
  26. Green, P. G., et al. Sex Steroid Regulation of the Inflammatory Response: Sympathoadrenal Dependence in the Female Rat. The Journal of Neuroscience. 19 (10), 4082-4089 (1999).
  27. Pakarinen, P., Huhtaniemi, I. Gonadal and sex steroid feedback regulation of gonadotrophin mRNA levels and secretion in neonatal male and female rats. Journal of Molecular Endocrinology. 3 (2), 139 (1989).
  28. Purves-Tyson, T. D., et al. Testosterone regulation of sex steroid-related mRNAs and dopamine-related mRNAs in adolescent male rat substantia nigra. BMC Neuroscience. 13 (1), 95 (2012).
  29. Adkins-Regan, E., Ascenzi, M. Sexual differentiation of behavior in the zebra finch: Effect of early gonadectomy or androgen treatment. Hormones and Behavior. 24 (1), 114-127 (1990).
  30. McCreery, B. R., Licht, P. Effects of gonadectomy and sex steroids on pituitary gonadotrophin release and response to gonadotrophin-releasing hormone (GnRH) agonist in the bullfrog, Rana catesbeiana. General and Comparative Endocrinology. 54 (2), 283-296 (1984).
  31. Clark, J. H., Markaverich, B. M. The agonistic-antagonistic properties of clomiphene: a review. Pharmacology & Therapeutics. 15 (3), 467-519 (1981).
  32. Mourits, M. J. E., et al. Tamoxifen treatment and gynecologic side effects: a review. Obstetrics & Gynecology. 97 (5), 855-866 (2001).
  33. Wallach, E., Huppert, L. C. Induction of Ovulation with Clomiphene Citrate. Fertility and Sterility. 31 (1), 1-8 (1979).
  34. Moradi, B., Kazemi, M. A., Rahamni, M., Gity, M. Ovarian hyperstimulation syndrome followed by ovarian torsion in premenopausal patient using adjuvant tamoxifen treatment for breast cancer. Asian Pacific Journal of Reproduction. 5 (5), 442-444 (2016).
  35. Alvarado, M. V., et al. Actions of sex steroids on kisspeptin expression and other reproduction-related genes in the brain of the teleost fish European sea bass. The Journal of Experimental Biology. 219 (21), 3353-3365 (2016).
  36. Godwin, J., Crews, D., Warner, R. R. Behavioural sex change in the absence of gonads in a coral reef fish. Proceedings of the Royal Society of London. Series B: Biological Sciences. 263 (1377), 1683-1688 (1996).
  37. Jenkins, N., Dodd, J. M. Effects of ovariectomy of the dogfish Scyliorhinus canicula L. on circulating levels of androgen and oestradiol and on pituitary gonadotrophin content. Journal of Fish Biology. 21 (3), 297-303 (1982).
  38. Manickam, P., Joy, K. P. Changes in hypothalamic catecholamine levels in relation to season, ovariectomy and 17β-estradiol replacement in the catfish, Clarias batrachus (L.). General and Comparative Endocrinology. 80 (2), 167-174 (1990).
  39. Senthilkumaran, B., Joy, K. P. Effects of ovariectomy and oestradiol replacement on hypothalamic serotonergic and monoamine oxidase activity in the catfish, Heteropneustes fossilis: a study correlating plasma oestradiol and gonadotrophin levels. Journal of Endocrinology. 142 (2), 193-203 (1994).
  40. Sladky, K. K., Clarke, E. O. Fish Surgery: Presurgical Preparation and Common Surgical Procedures. Veterinary Clinics of North America: Exotic Animal Practice. 19 (1), 55-76 (2016).
  41. Hori, H. Medaka: A Model for Organogenesis, Human Disease, and Evolution. Naruse, K., Tanaka, M., Takeda, H. , Springer. Japan. 1-16 (2011).
  42. Murata, K., Kinoshita, M., Naruse, K., Tanaka, M., Kamei, Y. Medaka: Biology, Management, and Experimental Protocols. Murata, K., et al. 2, John Wiley & Sons. 49-95 (2019).
  43. Fontaine, R., Weltzien, F. -A. Labeling of Blood Vessels in the Teleost Brain and Pituitary Using Cardiac Perfusion with a DiI-fixative. Journal of Visualized Experiments. (148), e59768 (2019).
  44. Fontaine, R., Hodne, K., Weltzien, F. -A. Healthy Brain-pituitary Slices for Electrophysiological Investigations of Pituitary Cells in Teleost Fish. Journal of Visualized Experiments. (138), e57790 (2018).
  45. Zhao, Y., Wayne, N. L. Recording Electrical Activity from Identified Neurons in the Intact Brain of Transgenic Fish. Journal of Visualized Experiments. (74), e50312 (2013).
  46. Ager-Wick, E., et al. Preparation of a High-quality Primary Cell Culture from Fish Pituitaries. Journal of Visualized Experiments. (138), e58159 (2018).
  47. Wittbrodt, J., Shima, A., Schartl, M. Medaka - model organism from the far east. Nature Reviews Genetics. 3 (1), 53-64 (2002).
  48. Kayo, D., Oka, Y., Kanda, S. Examination of methods for manipulating serum 17β-Estradiol (E2) levels by analysis of blood E2 concentration in medaka (Oryzias latipes). General and Comparative Endocrinology. 285, 113272 (2020).
  49. Eames, S. C., Philipson, L. H., Prince, V. E., Kinkel, M. D. Blood sugar measurement in zebrafish reveals dynamics of glucose homeostasis. Zebrafish. 7 (2), 205-213 (2010).
  50. Velasco-Santamaría, Y. M., Korsgaard, B., Madsen, S. S., Bjerregaard, P. Bezafibrate, a lipid-lowering pharmaceutical, as a potential endocrine disruptor in male zebrafish (Danio rerio). Aquatic Toxicology. 105 (1-2), 107-118 (2011).
  51. Jagadeeswaran, P., Sheehan, J. P., Craig, F. E., Troyer, D. Identification and characterization of zebrafish thrombocytes. British Journal of Haematology. 107 (4), 731-738 (1999).
  52. Zang, L., Shimada, Y., Nishimura, Y., Tanaka, T., Nishimura, N. Repeated Blood Collection for Blood Tests in Adult Zebrafish. Journal of Visualized Experiments. (102), e53272 (2015).
  53. Taves, M. D., et al. Steroid concentrations in plasma, whole blood and brain: effects of saline perfusion to remove blood contamination from brain. PloS one. 5 (12), 15727 (2010).
  54. Holtkamp, H. C., Verhoef, N. J., Leijnse, B. The difference between the glucose concentrations in plasma and whole blood. Clinica Chimica Acta. 59 (1), 41-49 (1975).
  55. Kanda, S., et al. Identification of KiSS-1 Product Kisspeptin and Steroid-Sensitive Sexually Dimorphic Kisspeptin Neurons in Medaka (Oryzias latipes). Endocrinology. 149 (5), 2467-2476 (2008).
  56. Kanda, S., Karigo, T., Oka, Y. Steroid Sensitive kiss2 Neurones in the Goldfish: Evolutionary Insights into the Duplicate Kisspeptin Gene-Expressing Neurones. Journal of Neuroendocrinology. 24 (6), 897-906 (2012).
  57. Mitani, Y., Kanda, S., Akazome, Y., Zempo, B., Oka, Y. Hypothalamic Kiss1 but Not Kiss2 Neurons Are Involved in Estrogen Feedback in Medaka (Oryzias latipes). Endocrinology. 151 (4), 1751-1759 (2010).
  58. Kayo, D., Zempo, B., Tomihara, S., Oka, Y., Kanda, S. Gene knockout analysis reveals essentiality of estrogen receptor β1 (Esr2a) for female reproduction in medaka. Scientific Reports. 9 (1), 8868 (2019).
  59. Fontaine, R., Ager-Wick, E., Hodne, K., Weltzien, F. -A. Plasticity in medaka gonadotropes via cell proliferation and phenotypic conversion. Journal of Endocrinology. 245 (1), 21 (2020).
  60. Fontaine, R., Ager-Wick, E., Hodne, K., Weltzien, F. -A. Plasticity of Lh cells caused by cell proliferation and recruitment of existing cells. Journal of Endocrinology. 240 (2), 361 (2019).
  61. Hasebe, M., Kanda, S., Oka, Y. Female-Specific Glucose Sensitivity of GnRH1 Neurons Leads to Sexually Dimorphic Inhibition of Reproduction in Medaka. Endocrinology. 157 (11), 4318-4329 (2016).

Tags

Biologi Udgave 166 Gonadectomy ovariektomi orkidéektomi kastration medaka blod steroider fisk reproduktion plasticitet estradiol 11-ketotestosterone
Gonadektomi og blodprøvetagning procedurer i den lille størrelse Teleost Model japanske Medaka (<em>Oryzias latipes)</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Royan, M. R., Kanda, S., Kayo, D.,… More

Royan, M. R., Kanda, S., Kayo, D., Song, W., Ge, W., Weltzien, F. A., Fontaine, R. Gonadectomy and Blood Sampling Procedures in the Small Size Teleost Model Japanese Medaka (Oryzias latipes). J. Vis. Exp. (166), e62006, doi:10.3791/62006 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter