Summary
Makale, hayvan fizyolojisinde seks steroidlerinin rolünü araştırmak için model olarak Japon medaka (Oryzias latipes) kullanarak küçük teleost balıklarından kan gonadectomize ve örnek almak için hızlı bir protokol açıklar.
Abstract
Gonadlar tarafından üretilen seks steroidleri, beyin ve hipofiz doku plastisitesinde ve beyin ve hipofiz geri bildirim sağlayarak tüm omurgalılarda üremenin nöroendokrin kontrolünde önemli bir rol oynar. Teleost balıkları, memeliler ile karşılaştırıldığında üreme stratejilerinde daha yüksek derecede doku plastisitesine ve varyasyona sahiptir ve seks steroidlerinin rolünü ve hareket ettikleri mekanizmaları araştırmak için yararlı modeller gibi görünmektedir. Steroid seviyelerini ölçmek için kan örneklemesi ile birlikte gonadektomi kullanarak seks steroid üretiminin ana kaynağının kaldırılması iyi kurulmuş ve daha büyük balık oldukça uygulanabilir olmuştur ve seks steroidlerin rolünü ve etkilerini araştırmak için güçlü bir tekniktir. Ancak, bu teknikler küçük boyutlu teleost modellerinde uygulandığında zorlukları gündeme getirmektedir. Burada, hem erkeklerde hem de dişi Japon medakasında gonadektomi ve ardından kan örneklemesi gibi adım adım yapılan işlemleri açıklıyoruz. Bu protokoller yüksek hayatta kalma oranı, balıkların yaşam süresi ve fenotip için güvenlik ve seks steroid boşluk açısından tekrarlanabilirlik ile belirtilen medaka son derece uygulanabilir olarak gösterilmiştir. Bu prosedürlerin kullanımı, bu küçük teleost modelini kullanmanın diğer avantajları ile birlikte, omurgalılarda cinsiyet steroidleri tarafından sağlanan üreme ve doku plastisitesinin nöroendokrin kontrolünde geri bildirim mekanizmalarının anlaşılmasını büyük ölçüde geliştirecektir.
Introduction
Omurgalılarda, esas olarak gonadlar tarafından üretilen seks steroidleri, çeşitli geri bildirim mekanizmaları 1 ,2,3,4,5aracılığıyla Beyin-Hipofiz-Gonadal (BPG) ekseninin düzenlenmesinde önemli roller oynar. Ek olarak, seks steroidleri beyin6, 7,8ve endokrin hücrelerde nöronların çoğalmasını ve aktivitesini etkiler, gonadotroplar da dahil olmak üzere, hipofiz9,10ve böylece beyin ve hipofiz plastisitesinde önemli rollere hizmet eder. Memelilerde nispeten iyi bilgiye rağmen, seks steroidlerinin aracılık ettiği BPG ekseni düzenleme mekanizması, memeli olmayan türlerde anlaşılmaktan çok uzaktır ve evrimsel olarak korunan ilkelerin zayıf anlaşılmasına yol açar11. Hala beyin ve hipofiz plastisite üzerinde seks steroidlerin rolünü belgeleyen çalışmaların sınırlı sayıda vardır, böylece cinsiyet steroidlerin çeşitli omurgalı türler üzerindeki rolü ve etkileri hakkında daha fazla araştırma ihtiyacını artırmaktadır.
Omurgalılar arasında, teleostlar stres yanıtı 12 , 13 , büyüme 14 , 15 , beslenmefizyolojisi16,17ve üreme 2 dahil olmak üzere çok sayıda biyolojik ve fizyolojik soruyu ele almada güçlü model hayvanlarhalinegelmiştir. Seks steroidlerinin çoğunlukla kadınlarda estradiol (E2) ve erkeklerde 11-ketotestosteron (11-KT) ile temsil edildiği teleostlar18,19, uzun zamandır türler arasında genel üreme ilkesini araştırmak için güvenilir deneysel modeller olmuştur. Teleostlar hipotalamik-hipofiz bağlantılarında benzersizlik gösterir20,21 ve farklı gonadotrop hücreleri22, bazen düzenleyici mekanizmaların aydınlatıcılığı için uygundur. Ayrıca, hem laboratuvar hem de saha deneylerine karşı saygınlıkları nedeniyle, teleostlar diğer organizmalara kıyasla birçok avantaj sunmaktadır. Satın almak ve korumak için nispetenucuzdurlar 23,24. Özellikle, zebra balığı (Danio rerio) ve Japon medaka (Oryzias latipes) gibi küçük teleost modelleri, çok yüksek doğurganlığa ve gen fonksiyonu ve hastalık mekanizmalarının hızlı analizini sağlayan nispeten kısa bir yaşam döngüsüne sahip türlerdir23, böylece bu türler için mevcut olan çok sayıda iyi gelişmiş protokol ve genetik araç seti göz önüne alındığında, çok sayıda biyolojik ve fizyolojik sorunun ele alınmasında daha da büyük avantajlarsağlar.
Çok sayıda çalışmada, kan örnekleme teknikleri ile birlikte gonadların (gonadektomi) çıkarılması,memelilerdeomurgalı üreme fizyolojislerindeki etkisi de dahil olmak üzere birçok fizyolojik soruyu araştırmak için bir yöntem olarak kullanılmıştır 26 ,27,28, kuşlar29 ve amfibiler30. Üreme fizyolojisi üzerindeki gonadektomi etkisi alternatif olarak tamoksifen ve klomifen gibi seks steroid antagonistleri tarafından taklit edilebilse de, ilaçların etkisi bimodal etkiler nedeniyle tutarsız görünüyor31,32. Bir seks steroid antagonist kronik maruz kalma yumurtalık büyütme yol açabilir33,34, hangi sağlıksız bir fenotip nedeniyle uzun vadeli amaçlar için etkilerinin gözlem devre dışı bırakabilir. Ek olarak, bazı seks steroidlerinin spesifik etkisini garanti etmek için seks steroid antagonist tedavisinden sonra bir kurtarma deneyi yapmak imkansızdır. Yukarıda belirtilen puanlarla birlikte, seks steroid antagonist kullanımının diğer takasları kapsamlı bir şekilde gözden geçirilmiştir31,32. Bu nedenle, gonadektomi bugün hala seks steroidlerinin rolünü araştırmak için güçlü bir teknik olarak ortaya çıkmaktadır.
Gonadektomi ve kan örnekleme tekniklerinin daha büyük türlerde uygulanması nispeten kolay olsa da, Avrupa levreği (Dicentrarchus labrax)35, bluehead wrasse (Thalassoma bifasciatum)36, dogfish (Scyliorhinus canicula)37 ve yayın balığı (Heteropneustes fossilis ve Clarias bathracus)38,39, medaka olarak küçük balıklarda uygulandığında zorlukları gündeme getiriyorlar. Örneğin, Balık Anestezi Doğum Sistemi (FADS)40'ın kullanımı daha az uygulanabilir ve küçük balıklar için aşırı fiziksel hasara eğilimli görünmektedir. Ek olarak, daha büyükbalıklar 40 için yaygın olarak kullanılan bir gonadektomi prosedürü, aşırı hasarı önlemek için yüksek hassasiyet gerektiren küçük balıklar için uygun değildir. Son olarak, kan damarlarına sınırlı erişim ve bu hayvanlardaki az miktarda kan nedeniyle kan örneklemesi zordur. Bu nedenle, küçük bir teleostta gonadektomi ve kan örneklemenin her adımını gösteren açık bir protokol önemlidir.
Bu protokol, Doğu Asya'ya özgü küçük bir tatlı su balığı olan Japon medakasında kan örneklemesi ile takip edilen gonadektomi işlemlerinin adım adım prosedürlerini göstermektedir. Japon medaka sıralı bir genoma, mevcut birkaç moleküler ve genetik alete sahiptir25ve ikincil cinsel özellikler veya gonadlar iyi geliştirilmeden önce cinsel farklılıkların araştırılmasına izin sağlayan genetik bir cinsiyet belirleme sistemi41. İlginçtir ki, Japon medaka diğer birçok teleost türüne aksine kaynaşmış gonadlara sahiptir42. Bu iki teknik bir araya geldiğinde toplamda sadece 8 dakika sürer ve kan damarlarının etiketlenini içeren bu tür için zaten mevcut olan video protokollerinin listesinitamamlayacaktır 43, hipofiz bölümleri44 ve beyin nöronları45ve birincil hücre kültürü46. Bu teknikler araştırma topluluğunun geri bildirim mekanizmalarının yanı sıra gelecekte beyin ve hipofiz plastisitesinde seks steroidlerinin rollerini araştırmasını ve daha iyi anlamasını sağlayacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm deneyler ve hayvan elleçleme, Norveç Yaşam Bilimleri Üniversitesi'ndeki deneysel hayvan refahı konusundaki önerilere uygun olarak gerçekleştirildi. Gonadektomi kullanılarak yapılan deneyler Norveç Gıda Güvenliği Kurumu (FOTS ID 24305) tarafından onaylanmıştır.
NOT: Deneyler yetişkin erkek ve dişi (6-7 aylık, ağırlık yaklaşık 0,35 g, uzunluk yaklaşık 2,7 cm) Japon medaka kullanılarak gerçek gerçekleştirildi. Cinsiyet,42,47'de açıklandığı gibi, dorsal ve anal yüzgecin büyüklüğü ve şekli gibi ikincil cinsel özellikleri ayırt ederek belirlendi.
1. Enstrümanlar ve çözüm hazırlama
- Anestezik stok çözeltisi hazırlayın (%0,6 Trikain).
- 0,6 g Tricaine (MS-222) 10x Fosfat Tampon Salin (PBS) 100 mL seyreltin.
- Tricaine stok çözeltisinin 1 mL'lik kısmını birkaç 1,5 mL plastik boruya dağıtın ve kullanıma kadar -20 °C'de saklayın.
- 2 L akvaryum suyuna 18 g NaCl ekleyerek geri kazanım suyu (%0,9 NaCl çözeltisi) hazırlayın. Çözeltiyi kullanıma kadar oda sıcaklığında saklayın.
- Keskin bir nokta elde etmek için bir jilet çapraz kırarak kesi aletlerini hazırlayın (Şekil 1A).
- 25 μL sodyum heparini 500 μL 1x PBS'ye seyrelterek kan pıhtı önleyici çözelti (0,05 U/μL sodyum heparin) hazırlayın. Pıhtı önleyici çözeltiyi kullanıma kadar 4 °C'de saklayın.
- Üreticinin talimatlarını izleyerek iğne çekerek(Şekil 1B)cam kılcal damar çekerek 90 mm uzunluğundaki cam kılcal damardan iki cam iğne hazırlayın.
NOT: Cam iğnenin dış çapı 1 mm, iç çapı ise 0,6 mm'dir. - Kapağı keserek 1,5 mL plastik boru kapağı hazırlayın ve iğne dış çapına uygun bir delik açın (Şekil 1C). Deliği açmak için, 9 mm'lik cam kılcal damarın bir ucunun ısıtın ve ısıtılmış cam kılcal damarı kapaktan bıçaklayın. Alternatif olarak, deliğin çapı 9 mm'lik cam kılcal damara sığana kadar kapağı saplamak için bir iğne kullanın.
2. Gonadektomi prosedürü
- 30 mL akvaryum suyunda bir tüp Tricaine stoğunu (%0,6) seyrelterek anestezik çözeltinin% 0,02'sini hazırlayın.
- Adım 1.3'te açıklandığı gibi bir ultra ince ve iki ince forseps (biri nispeten geniş uçlu), küçük makas, naylon iplik ve jilet dahil olmak üzere diseksiyon aletleri hazırlayın.
- Balığı 30-60 saniye boyunca% 0.02 anestezik çözeltiye koyarak uyuşturun.
NOT: Anestezi süresi balığın büyüklüğüne ve ağırlığına bağlıdır ve uyarlanmalıdır. Balığın tamamen uyuşturulmasını sağlamak için, balık gövdesi kümesler kullanılarak hafifçe sıkıştırılabilir. Balık tepki vermezse, gonadektomi başlatılabilir. - Balıkları anestezik çözeltiden çıkar ve balığı yatay olarak yan tarafına, sudan diseksiyon mikroskobu altında yerleştirin.
- Kadınlarda ovaerektomi (OVX)
- Varsa yumurtlama yumurtalarını (dişi vücudun dışına sarkan yumurtalar) çıkarın ve kesi alanındaki pulları kazıyın (Şekil 2A).
- Kaburgalar arasında, pelvik ve anal yüzgeçler arasında ( Şekil 2A ), jilet kullanarak yaklaşık2-2,5mm uzunluğunda bir kesi yapın. Daha sonra, geniş uçlu ince tokmakla yumurtalıkları azar azar çıkarırken balık karnını hafifçe çimdikleyin.
- İnce önlük kullanarak yumurtalıkların ucını kesin ve yumurtalıkları bir kenara yerleştirin (Şekil 2B).
NOT: Mümkünse yumurtalık kesesini kırmamaya özenin. Yumurtalık kesesi kırılırsa, yumurtlanmamış yumurta bile bırakmadan gonad izlerini mümkün olduğunca tamamen çıkarın.
- Erkeklerde orkidektomi
- Anüs üzerindeki kaburgalar arasında hafifçe bir kesi yapın (Şekil 2A) ve ince tokmakla kesiği yavaşça açın.
- İnce toksları kullanarak testisleri yavaşça alın ve testisleri yavaşça dışarı alın. Daha sonra testisleri tamamen çıkarmak için testislerin ucunun kesilmesi (Şekil 2B). Erkek orkidektomi için, kesi kısmına kadar tüm preparatlar kadınlarda benzerdir. Testisleri tutarken, bazen testislere benzeyen yağ elde edilir. Bununla birlikte, yağı geri yükledikten sonra testisleri tekrar bulmaya çalışmak mümkündür (Şekil 2B).
NOT: Hem erkekler hem de kadınlar için, mortaliteye yol açabilecek aşırı hasarı önlemek için karındaki kesi boyutunu en aza indirmek önemlidir. Bazen bağırsaklar da gonadlarla birlikte kesiden ortaya çıkabilir, bu nedenle kapanmadan önce kesi içinde düzgün bir şekilde geri döndüklerinden emin olun. Medaka karın bölgesinde yumurtalıklar ve testisler hakkında önceden bilgi sahibi olmak esastır.
- Kesiği erkeklerde ve kadınlarda benzer şekilde dikin (Şekil 3).
- Naylon ipliği kesi alanının yanına yerleştirin ve ince önlüklerle ipliği içeri almak için ultra ince önlük kullanarak derini kesiğin sağ tarafından iç vücut boşluğundan bıçaklayın (Şekil 3; 1-2).
- İpliği çıkarmak için kesiğin sol tarafındaki deriyi dış vücut boşluğundan bıçaklayın ( Şekil 3; 3-4).
- Kesi açıklığını kapatın ve iki düğüm yapın ve aşırı ipliği kesin (Şekil 3; 4-6).
NOT: Dikiş yeterince sıkı olmalı ve balık üzerindeki kalan iplik dikişin gevşemesini önleyecek kadar uzun olmalıdır. Anesteziden dikişe kadar tüm işlem genellikle 6 dakika kadar sürer. Daha uzun süre ölüm oranına yol açabilir. - Balıkları geri kazanım suyuna koyun ve akvaryum sistemine aktarmadan önce en az 24 saat bekletin.
NOT: Gonadektomi balıklar genellikle geri kazanım suyunda 1-2 saat sonra normal davranış gösterir. Bu nedenle, deney amacına bağlı olarak, bu zaman aralığından sonra balıkları örnekleyebilirsiniz.
3. Kan örnekleme prosedürü
- Aletleri hazırlayın: bir cam iğne, silikon kılcal damar, delikli plastik bir tüp, boş bir 1,5 mL plastik tüp, bir minicentrifuge ve bant.
- 2.1. adımda açıklandığı gibi% 0.02 anestezik çözelti kullanarak balığı uyuşturun ve balıkları dikey bir konumda diseksiyon mikroskobu altına yerleştirin (Şekil 4A). Kaudal delinme damarının görselleştirilmesini kolaylaştırmak için balığı parlak bir yüzeye yerleştirin.
- Silikon kılcal damara cam iğne takarak kan çekmecesini takın (Şekil 4B). İğnenin ucunu geniş uçlu forsepslerle kırın ve iğnenin içini emiş ve üfleyerek pıhtı önleyici çözelti ile kaplayın.
NOT: Emme sırasında kanın doğrudan temasını önlemek için güvenlik önlemleri için enayi ve en az 50 cm uzunluğunda silikon kılcal damar kullanılması önerilir. Ek olarak, iğne ucunun açıklığının kanın çizilmesine izin vermek için yeterince büyük olduğundan emin olun. - İğneyi balığın peduncle bölgesine doğru yönlendirin, kaudal peduncle damarını hedefleyin (Şekil 5A) ve iğnenin toplam hacmi en az dörtte biri dolana kadar ağzı kullanarak kanı çekin (Şekil 5B).
NOT: İğneyi balık vücudundan çıkarmadan önce emmeyi durdurmak önemlidir. - İğneyi bırakın ve iğnenin keskin tarafının yakınlık kısmına bir bant parçası koyun. Kapağı bir toplama tüpüne bir delik ile yerleştirin ve iğneyi tüpün içine, iğne ucu dışarıda olacak şekilde delikten geçirin (Şekil 5C).
- Balıkları geri kazanım suyuna koyun ve akvaryum sistemine aktarmadan önce en az 24 saat bekletin.
NOT: Aynı balıktan ikinci bir kan örneği almak için, ilk kan örneklemesi yapıldıktan bir hafta sonra kanı örneklemek. - Flash, tüpteki kanı toplamak için oda sıcaklığında 1.000 x g ile toplanan kanı 1-2 saniye boyunca aşağı çevirin.
- Doğrudan aşağı akış uygulamalarına geçin veya kullanıma kadar kanı -20 °C'de saklayın.
NOT: Tüm kandan seks steroid ekstraksiyonu için önceki çalışmaya bakın48.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu protokol, Japon medaka'sı olan küçük boyutlu bir model teleostunda gonadektomi ve kan örneklemesi yapmak için atılan her adımı açıklar. Kadınlarda ovaerektomi (OVX) sonrası balıkların hayatta kalma oranı %100'dür (10 balıktan 10'u), orkideektomi sonrası erkeklerin %94'ü (18 balıktan 17'si) hayatta kalmıştır. Bu arada, kan örnekleme işlemi yapıldıktan sonra, tüm (38 balık) balık hayatta kaldı.
Sham tarafından işletilen dişiler yumurtlama gösterir (Şekil 6A) ve tüm yumurtalar döllendi ve embriyonik gelişime izin verildi (Şekil 6B). Sham tarafından işletilen erkekler de sadece 1-2 hafta sonra yumurtaları dölleyebildiler. Kısmen gonadektomi edilmiş altı dişiden ikisi, kısmen gonadektomi edilmiş erkeklerle yetiştirilen 2 ay sonra döllenmiş yumurtaların% 100'ü ile yumurtlama gösterdi. Buna karşılık, 4 ay sonra bile tamamen gonadektomi edilmiş balıklarda kadınlarda yumurtlama veya erkekler tarafından döllenme gözlenmedi.
Doğru şekilde gerçekleştirildiğinde, balığın vücut şekli hafifçe değişir (Şekil 7A) ve gonadektomi işleminden sonra hiçbir gonad parçası kalmamalıdır (Şekil 7B). Bu arada, gonadektomi sonrası 4 hafta, kesi ve dikiş tamamen kayboldu (Şekil 8) ve 4 ay sonra, tüm gonadektomi yapılan balıklar hala sağlıklı fenotip gösterdi ve gonadal doku bulunamadı.
Üreticinin talimatlarına uyarak ELISA ile ölçülen kadınlarda E2 kan konsantrasyonları (Tablo 1),OVX balıklarındaki E2 seviyesinin ameliyattan 24 saat sonra(s < 0.00001) sham-operated balıklara göre önemli ölçüde daha düşük olduğunu ortaya koydu. 4 ay sonra, OVX balıklarındaki E2 seviyesi de sham-operated balıklardan önemli ölçüde daha düşüktür(p < 0.00001) ve OVX sonrası balık sonrası 24 saat içinde(p > 0.05) ile karşılaştırıldığında önemli bir fark göstermez. Son olarak, gonadın sadece 1/3 ila 1/2'sinin çıkarıldığı OVX balıkları, sham ile çalışan balıklardan(p = 0.0437) önemli ölçüde daha düşük E2 seviyeleri ve tam OVX balıklarından önemli ölçüde daha yüksek E2 seviyeleri gösterir (s < 0.00001) (Şekil 9A).
Benzer şekilde erkeklerde (Tablo 1), orkidektomi balıklarındaki 11-KT konsantrasyonu ameliyattan 24 saat sonra şem-ameliyat edilen balıklara göre önemli ölçüde daha düşüktür(s < 0.00001). 4 ay sonra orkideektomi balıklarda 11-KT seviyesi de sham-operated balıklara göre önemli ölçüde daha düşüktür(p < 0.00001) ve orkidektomi sonrası 24 saat balıklara kıyasla hiçbir fark göstermez(s > 0.05). Son olarak, kısmen orkidektomi balıklar, sham-operated balıklardan(p = 0.0428) önemli ölçüde daha düşük 11-KT seviyeleri ve tam orkidektomi balıklardan önemli ölçüde daha yüksek 11-KT seviyeleri gösterir(s < 0.00001) (Şekil 9B).
Şekil 1. Alet hazırlama. (A) Gonadektomi için jilet, (B) kan çekimi için cam iğne ve (C) kan toplama için bir delikli bir kapak ile birlikte plastik bir tüp. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2. Kesi alanının yeri. A)Kaburgalar arasında, kadınlarda (sol panel) ve erkeklerde pelvik ve anal yüzgeçler arasında (sağ panel) bulunan kesi alanının çizilmesi; B)kadınlarda (sol panel) ve erkeklerde (sağ panel), eklem kısmını gösteren beyaz daireler, testisleri gösteren beyaz ok ve yağı gösteren siyah ok. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3. Dikiş prosedürü. 1) Kesiğin sağ tarafında ultra ince esinler kullanılarak bir delik açilir. 2) Naylon iplik 1 yapılan delik kullanılarak deriden geçirilir. 3) Kesiğin sol tarafında bir delik açar. 4) Naylon iplik 3'te yapılan delikten geçirilir. 5) Kesiği kapatmak için iki kez el üstü düğüm yapılır. 6) Fazla iplik kesilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4. Kan örneklemesi (A), silikon kılcal damar (B) ile cam iğne montajı sırasında balık pozisyonu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5. Kan örnekleme (A), kan (B) ve kan alma adımlarının (C) emme alanı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6. Sham tarafından işletilen balıklar, beyaz ok (A) ve döllenmiş yumurta (B) ile işaret edilen yumurtaların yumurtlamasını gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 7. Bozulmamış ve gonadektomi olmuş balıkların morfolojik (A) ve anatomik (B) görünümü. Beyaz oklar (üst paneller) gonadektomi balıklarda ameliyat işaretini gösterir. Siyah oklar (alt paneller) bozulmamış balıklarda gonadları gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 8. 4 hafta sonra erkek ve dişi balıklarda ameliyat izleri. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 9. Kadında (A) ve erkekte 11-KT kan düzeyleri (B) Japon medaka, sham operasyonundan 24 saat sonra (kontrol), kısmen gonadektomi veya gonadektomi ve gonadektomiden 4 ay sonra (OVX, kadınlarda ovariektomi; Cas, erkeklerde orkidektomi). İstatistiksel analizler One Way ANOVA ve ardından Tukey Post Hoc testi kullanılarak gerçekleştirildi. Farklı harfler (a-c) önemli farklılıklar gösterir (p-değer < 0.05). Grafikteki veriler ortalama + SD, n = 5 olarak sağlanır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| E2 seviyeleri (Dişiler) | 11-KT seviyeleri (Erkekler) | |
| Sahte işletme | 4,15 ± 0,5 (n = 5) | 10,38 ± 1,32 (n = 5) |
| Kısmen gonadektomi | 3,37 ± 0,6 (n = 5) | 8,37 ± 1,92 (n = 5) |
| 24h sonrası gonadektomi | 0,36 ± 0,2 (n = 5) | 0,4 ± 0,2 (n = 5) |
| 4 ay gonadektomi sonrası | 0,54 ± 0,28 (n = 5) | 0,74 ± 0,22 (n = 5) |
Tablo 1. Sham-operated ve gonadectomized ve kısmen gonadectomized balık kadın ve erkeklerde E2 ve 11-KT düzeyleri (ng/mL).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Önceki literatürde bildirildiği gibi, gonadektomi ve kan örneklemesi uzun zamandır BPG ekseninin düzenlenmesinde seks steroidlerinin rolü ile ilgili soruları araştırmak için diğer model türlerde kullanılmaktadır. Ancak, bu teknikler sadece daha büyük hayvanlar için uygun görünüyor. Yaygın olarak kullanılan teleost modeli Japon medaka'nın küçük boyutunu göz önünde bulundurarak, bu tür için mümkün olan gonadektomi ve kan örneklemesi için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz.
Gonadektomi yapılan balıkların hayatta kalma oranının neredeyse% 100'e ulaşması, gonadektomi prosedürünün medaka üzerinde uygulanmasının mümkün olduğunu göstermektedir. Benzer şekilde, kan örnekleme prosedürü, bu işlemden geçtikten sonra% 100 hayatta kalma oranının gösterdiği gibi balığın hayatta kalmasını etkilemez. Ek olarak, sham tarafından işletilen erkeklerle birlikte yetiştirilen sham-operated dişiler yumurtlama ve% 100 döllenmiş yumurta gösterir, bu da kesi ve dikiş prosedürünün balığın üremesini etkilemediğini gösterir. Başka bir deyişle, yumurtlamak için yeterince sağlıklıydılar. Ayrıca, kısmen gonadektomi edilmiş balıklar, sahte balıklarla karşılaştırılabilir seks steroid konsantrasyonları gösterir ve bazı kadınlarda yumurtlamanın yanı sıra yumurtaların erkekler tarafından döllenmesi kısmen gonadektomi yapılan balıklarda gözlenmiştir. Bu sonuçlar gonadektomi prosedürünün yüksek hassasiyetle yapılması gerektiğini, yani yumurtalıkların veya testislerin tamamen çıkarılması gerektiğini göstermektedir.
Şekil 8'degösterildiği gibi, balıktaki kesi ve dikiş izi gonadektomi sonrası 4 hafta tamamen kayboldu ve balıklar ameliyattan 4 ay sonra hala hayatta ve sağlıklı görünüyor. Bunlar, operasyon prosedürünün balıklar için uzun süreli amaç için güvenli olduğunu ve balığın ömrünü etkilemediğini gösterir. Ek olarak, 4 ay sonra, gonadlar gözlenmedi. Bu, 24 saat sonra gonadektomi balıklarında bulunanlara hala benzeyen düşük E2 ve 11-KT seviyeleri ile doğrulanır.
Gonadektomi yapılan balıklarda E2 ve 11-KT seviyeleri, zaten gonadektomi sonrası 24 saat sonra, sham-operated balıklardan önemli ölçüde daha düşüktür ve gonadektomiden 4 ay sonra örneklenen balıklarda daha düşük kalır. Gonadektomi balıklarda kontrole kıyasla önemli ölçüde daha düşük cinsiyet steroid seviyeleri köpek balığı 37 , yayın balığı39ve medaka48önceki çalışmalarda gözlenmiştir. Bu tutarlı kanıtlar, protokolde açıklanan gonadektomi prosedürünün dolaşımdaki seks steroidlerini temizlemek için güvenilir bir teknik olduğunu göstermektedir.
Bu prosedür FADS'ye dayanmadığından40, gonadektomi ameliyat sırasında mortaliteyi önlemek için mümkün olduğunca hızlı yapılmalıdır. Gerçekten de, FADS kullanımı çalışma ritmini korumayı sağlar, çünkü bu araç havaya maruz kalmalarına rağmen balıklara sürekli anestezik duruma izin verir. Bununla birlikte, medaka olarak küçük teleosttaki daha düşük fizibilitesi nedeniyle, FADS kullanımı bu büyüklükte balıklarla gerçekleştirilemez. Ek olarak, geniş kesiğin gonada ulaşmasını sağlayan daha büyük balıklardaki önceki gonadektomi protokolünün aksine, bu yazıda açıklanan protokol, küçük balıklara aşırı zarar vermemek için geniş kesiye izin vermez. Bu nedenle, balık gövdesi boşluğunun içindeki diğer dokularda hasar görmesini önlemek için tokmak kullanarak gonada erişmeye çalışırken çok dikkatli olunmalıdır.
Protokol hızlı ve temiz bir prosedüre dayanır. Bu nedenle eğitim, gonadektomi sonrası balıkların yüksek hayatta kalma oranının yanı sıra gonadların tamamen çıkarılması ile belirtilen yüksek bir başarı oranına ulaşana kadar şiddetle tavsiye edilir (Şekil 7'debaşarılı gonadektomi öncesi ve sonrası balıkların morfolojik ve anatomik görünümünün farkına bakın). Aslında, anestezi süresi, kesinin genişliği, dikişin doğruluğu ve düzenliliği ve işlem sırasında balık kullanımı dahil olmak üzere işlemin başarı oranını birçok faktör etkileyebilir. Bir diğer önemli nokta, protokolü gerçekleştirmeden önce balığı en iyi şekilde koruyarak sağlıklı balık hazırlaması gerektiğidir.
Kan örnekleme prosedürü ile ilgili olarak, önceki çalışmalar medaka48 ve zebra balığı 49 ,50,51'denkanı örneklemeye çalıştı, ancak işlem aynı balıkta tekrarlanan kan örneklemesine izin vermiyor, çünkü kan balığı ötanaziden sonra alınıyor. Tekrarlanan kan örneklemesi zebra balığı kullanılarak gösterilmiştir52, ancak bu tür bir protokolü ilk kez medaka'da rapor ediyoruz.
Seks steroid konsantrasyonlarının değerlendirilmesi genellikle enzim bağlantılı bir immünosorbent test (ELISA) kiti kullanılarak gerçekleştirilir ve farklı seks steroidleri için ticari olarak mevcut birçok ELISA kiti olmuştur. Kan örneklemesi sırasında toplanan kan miktarının düşüklüğü nedeniyle, aşağı akış tahlilleri tüm kan için tasarlanmıştır. Önceki çalışmalar, tam kan ve plazmadan çıkarılan dolaşımdaki steroid seviyelerinin ölçülen seviyesinde bir fark olduğunu göstermiştir53,54. Bu nedenle, seks steroid düzeyleri tam kan ve plazma farkı protokolü kullanarak gerçek deney yapmadan önce doğrulanması gerekir.
Farklı hayvan modelleriyle yapılan önceki çalışmalarda belgelenen protokol, burada açıklanan protokol, model olarak küçük boyutlu bir teleost kullanarak üreme fizyolojisi ile ilgili soruların araştırılmasına izin verecektir. Aslında, bu teknikler BPG ekseninin düzenlenmesi ve geri bildirim mekanizmaları ile ilgili soruların cevaplanmasına katkıda bulunmuştur, gibi kiss1 (kisspeptin gen tip 1) pozitif geri bildirim döngüleri55nöronları ifade eden, östrojen aracılı düzenleme kiss1 çekirdek ventralis tuberis (NVT) nöronları ifade ve kiss2 (kisspeptin gen tip 2) preoptik alanda nöron ifade (POA)56, 57, östrojen reseptörü β1'in (Esr2a) dişi Japon medaka58'de aşağı düzenleyici fsh ekspresyon seviyesine olası katılımı ve dişi balıklarda E2 sirkadiyen ritminin profili48. Ayrıca, önceki çalışmalar seks steroidleri de teleosit hipofiz gonadotrope hücreleri çoğalmasını etkilediğini göstermiştir59,60, gonadektomi hipofiz plastisitesi sonra seks steroid boşluk etkilerini araştırmak için ilgi çekicidir.
Kan örnekleme tekniği sadece seks steroid analizi için değil, aynı zamanda kan şekeri seviyeleri de dahil olmak üzere diğer kan içeriği analizi için de kullanılabilir. Nitekim, protokol zebra balığı52 ve medaka61'degösterildiği gibi kan şekeri ölçümleri için de uygulanabilir. Bu nedenle, bu teknik fizyolojinin diğer alanlarındaki araştırma sorularını ele alacak şekilde genişletilebilir.
Son olarak, burada açıklanan protokoller yetişkin Japon medaka için tasarlanmış ve optimize edilmiştir ve prosedürler sırasında kullanılan balık ve malzemelerin farklı boyutu nedeniyle sonuçlar değişebilir. Ayrıca, gonadektomi için önemli bir avantaj sağlayabilecek olan medaka sol ve sağ yumurtalıklar / testisler kaynaştığı için, bu protokol zebra balıklarında olduğu gibi böyle olmadığı diğer türlerde kullanılmadan önce birkaç adaptasyona ihtiyaç duyabilir. Bu nedenle, bu protokoller test etmeden önce laboratuvar ekipmanı seçimine ve balık büyüklüğüne göre bir optimizasyon dikkate alınmalıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Yazarlar Bayan Lourdes Carreon G Tan'a balık hayvanlığındaki yardımı için teşekkür ediyor. Bu çalışma NMBU, Japonya Bilimi Teşvik Derneği'nden (JSPS) Hibe-in-Aid (Hibe numarası 18H04881 ve 18K19323) ve Sumitomo Vakfı'ndan S.K.'ye Temel Bilim Araştırma Projeleri için hibe ile finanse edildi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass capilary | GD1 | Glass Capillary with Filament GD-1; Narishige | |
| Heparin sodium salt | H4784-1G | Sigma-aldrich | |
| Needle puller | P97 | Flaming/Brown Micropipette puller Model P-97; Sutter Instrument | |
| Nylon thread | N45VL | Polyamide suture, 0.2 metric; Crownjun | |
| Plastic tube | T9661 | Eppendorf Safe-lock microcentifuge tube 1.5 ml, Sigma-aldrich | |
| Razor blade | - | Astra Superior Platinum Double Edge Razor Blades Green, salonwholesale.com | |
| Silicone capillary | a16090800ux0403 | Uxcell Silicone Tube 1 mm ID x 2 mm OD, amazon.com | |
| Tricaine | WXBC9102V | Aldrich chemistry |
References
- Weltzien, F. -A., Andersson, E., Andersen, Ø, Shalchian-Tabrizi, K., Norberg, B. The brain-pituitary-gonad axis in male teleosts, with special emphasis on flatfish (Pleuronectiformes). Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Molecular & Integrative Physiology. 137 (3), 447-477 (2004).
- Yaron, Z., Levavi-Sivan, B. Encyclopedia of Fish Physiology. Farrell, A. P. 2, Academic Press. 1500-1508 (2011).
- Goldman, B. D. The circadian timing system and reproduction in mammals. Steroids. 64 (9), 679-685 (1999).
- Taranger, G. L., et al.
- Messinis, I. E. Ovarian feedback, mechanism of action and possible clinical implications. Human Reproduction Update. 12 (5), 557-571 (2006).
- Diotel, N., et al. The brain of teleost fish, a source, and a target of sexual steroids. Frontiers in Neuroscience. 5, 137 (2011).
- Diotel, N., et al. Steroid Transport, Local Synthesis, and Signaling within the Brain: Roles in Neurogenesis, Neuroprotection, and Sexual Behaviors. Frontiers in Neuroscience. 12, 84 (2018).
- Larson, T. A. Sex Steroids, Adult Neurogenesis, and Inflammation in CNS Homeostasis, Degeneration, and Repair. Frontiers in Endocrinology. 9, 205 (2018).
- Fontaine, R., et al. Gonadotrope plasticity at cellular, population and structural levels: A comparison between fishes and mammals. General and Comparative Endocrinology. 287, 113344 (2020).
- Fontaine, R., Royan, M. R., von Krogh, K., Weltzien, F. -A., Baker, D. M. Direct and indirect effects of sex steroids on gonadotrope cell plasticity in the teleost fish pituitary. Frontiers in Endocrinology. , (2020).
- Kanda, S. Evolution of the regulatory mechanisms for the hypothalamic-pituitary-gonadal axis in vertebrates-hypothesis from a comparative view. General and Comparative Endocrinology. 284, 113075 (2019).
- Schreck, C. B. Stress and fish reproduction: The roles of allostasis and hormesis. General and Comparative Endocrinology. 165 (3), 549-556 (2010).
- Wendelaar Bonga, S. E.
- Mommsen, T. P.
- Won, E., Borski, R. Endocrine Regulation of Compensatory Growth in Fish. Front. Endocrinol. 4, 74 (2013).
- MacKenzie, D. S., VanPutte, C. M., Leiner, K. A. Nutrient regulation of endocrine function in fish. Aquaculture. 161 (1), 3-25 (1998).
- Rønnestad, I., Thorsen, A., Finn, R. N. Fish larval nutrition: a review of recent advances in the roles of amino acids. Aquaculture. 177 (1), 201-216 (1999).
- Borg, B.
- Rege, J., et al. Circulating 11-oxygenated androgens across species. The Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology. 190, 242-249 (2019).
- Blázquez, M., Bosma, P. T., Fraser, E. J., Van Look, K. J. W., Trudeau, V. L. Fish as models for the neuroendocrine regulation of reproduction and growth. Comparative Biochemistry and Physiology Part C: Pharmacology, Toxicology and Endocrinology. 119 (3), 345-364 (1998).
- Zambrano, D.
- Weltzien, F. -A., Hildahl, J., Hodne, K., Okubo, K., Haug, T. M. Embryonic development of gonadotrope cells and gonadotropic hormones - Lessons from model fish. Molecular and Cellular Endocrinology. 385 (1), 18-27 (2014).
- Harris, M. P., Henke, K., Hawkins, M. B., Witten, P. E. Fish is Fish: the use of experimental model species to reveal causes of skeletal diversity in evolution and disease. Journal of applied ichthyology. 30 (4), 616-629 (2014).
- Powers, D.
- Naruse, K. Medaka: A Model for Organogenesis, Human Disease, and Evolution. Naruse, K., Tanaka, M., Takeda, H. , Springer. Japan. 19-37 (2011).
- Green, P. G., et al. Sex Steroid Regulation of the Inflammatory Response: Sympathoadrenal Dependence in the Female Rat. The Journal of Neuroscience. 19 (10), 4082-4089 (1999).
- Pakarinen, P., Huhtaniemi, I. Gonadal and sex steroid feedback regulation of gonadotrophin mRNA levels and secretion in neonatal male and female rats. Journal of Molecular Endocrinology. 3 (2), 139 (1989).
- Purves-Tyson, T. D., et al. Testosterone regulation of sex steroid-related mRNAs and dopamine-related mRNAs in adolescent male rat substantia nigra. BMC Neuroscience. 13 (1), 95 (2012).
- Adkins-Regan, E., Ascenzi, M. Sexual differentiation of behavior in the zebra finch: Effect of early gonadectomy or androgen treatment. Hormones and Behavior. 24 (1), 114-127 (1990).
- McCreery, B. R., Licht, P. Effects of gonadectomy and sex steroids on pituitary gonadotrophin release and response to gonadotrophin-releasing hormone (GnRH) agonist in the bullfrog, Rana catesbeiana. General and Comparative Endocrinology. 54 (2), 283-296 (1984).
- Clark, J. H., Markaverich, B. M. The agonistic-antagonistic properties of clomiphene: a review. Pharmacology & Therapeutics. 15 (3), 467-519 (1981).
- Mourits, M. J. E., et al. Tamoxifen treatment and gynecologic side effects: a review. Obstetrics & Gynecology. 97 (5), 855-866 (2001).
- Wallach, E., Huppert, L. C. Induction of Ovulation with Clomiphene Citrate. Fertility and Sterility. 31 (1), 1-8 (1979).
- Moradi, B., Kazemi, M. A., Rahamni, M., Gity, M. Ovarian hyperstimulation syndrome followed by ovarian torsion in premenopausal patient using adjuvant tamoxifen treatment for breast cancer. Asian Pacific Journal of Reproduction. 5 (5), 442-444 (2016).
- Alvarado, M. V., et al. Actions of sex steroids on kisspeptin expression and other reproduction-related genes in the brain of the teleost fish European sea bass. The Journal of Experimental Biology. 219 (21), 3353-3365 (2016).
- Godwin, J., Crews, D., Warner, R. R. Behavioural sex change in the absence of gonads in a coral reef fish. Proceedings of the Royal Society of London. Series B: Biological Sciences. 263 (1377), 1683-1688 (1996).
- Jenkins, N., Dodd, J. M. Effects of ovariectomy of the dogfish Scyliorhinus canicula L. on circulating levels of androgen and oestradiol and on pituitary gonadotrophin content. Journal of Fish Biology. 21 (3), 297-303 (1982).
- Manickam, P., Joy, K. P. Changes in hypothalamic catecholamine levels in relation to season, ovariectomy and 17β-estradiol replacement in the catfish, Clarias batrachus (L.). General and Comparative Endocrinology. 80 (2), 167-174 (1990).
- Senthilkumaran, B., Joy, K. P. Effects of ovariectomy and oestradiol replacement on hypothalamic serotonergic and monoamine oxidase activity in the catfish, Heteropneustes fossilis: a study correlating plasma oestradiol and gonadotrophin levels. Journal of Endocrinology. 142 (2), 193-203 (1994).
- Sladky, K. K., Clarke, E. O. Fish Surgery: Presurgical Preparation and Common Surgical Procedures. Veterinary Clinics of North America: Exotic Animal Practice. 19 (1), 55-76 (2016).
- Hori, H. Medaka: A Model for Organogenesis, Human Disease, and Evolution. Naruse, K., Tanaka, M., Takeda, H. , Springer. Japan. 1-16 (2011).
- Murata, K., Kinoshita, M., Naruse, K., Tanaka, M., Kamei, Y. Medaka: Biology, Management, and Experimental Protocols. Murata, K., et al. 2, John Wiley & Sons. 49-95 (2019).
- Fontaine, R., Weltzien, F. -A. Labeling of Blood Vessels in the Teleost Brain and Pituitary Using Cardiac Perfusion with a DiI-fixative. Journal of Visualized Experiments. (148), e59768 (2019).
- Fontaine, R., Hodne, K., Weltzien, F. -A. Healthy Brain-pituitary Slices for Electrophysiological Investigations of Pituitary Cells in Teleost Fish. Journal of Visualized Experiments. (138), e57790 (2018).
- Zhao, Y., Wayne, N. L. Recording Electrical Activity from Identified Neurons in the Intact Brain of Transgenic Fish. Journal of Visualized Experiments. (74), e50312 (2013).
- Ager-Wick, E., et al. Preparation of a High-quality Primary Cell Culture from Fish Pituitaries. Journal of Visualized Experiments. (138), e58159 (2018).
- Wittbrodt, J., Shima, A., Schartl, M. Medaka - model organism from the far east. Nature Reviews Genetics. 3 (1), 53-64 (2002).
- Kayo, D., Oka, Y., Kanda, S. Examination of methods for manipulating serum 17β-Estradiol (E2) levels by analysis of blood E2 concentration in medaka (Oryzias latipes). General and Comparative Endocrinology. 285, 113272 (2020).
- Eames, S. C., Philipson, L. H., Prince, V. E., Kinkel, M. D. Blood sugar measurement in zebrafish reveals dynamics of glucose homeostasis. Zebrafish. 7 (2), 205-213 (2010).
- Velasco-Santamaría, Y. M., Korsgaard, B., Madsen, S. S., Bjerregaard, P. Bezafibrate, a lipid-lowering pharmaceutical, as a potential endocrine disruptor in male zebrafish (Danio rerio). Aquatic Toxicology. 105 (1-2), 107-118 (2011).
- Jagadeeswaran, P., Sheehan, J. P., Craig, F. E., Troyer, D. Identification and characterization of zebrafish thrombocytes. British Journal of Haematology. 107 (4), 731-738 (1999).
- Zang, L., Shimada, Y., Nishimura, Y., Tanaka, T., Nishimura, N. Repeated Blood Collection for Blood Tests in Adult Zebrafish. Journal of Visualized Experiments. (102), e53272 (2015).
- Taves, M. D., et al. Steroid concentrations in plasma, whole blood and brain: effects of saline perfusion to remove blood contamination from brain. PloS one. 5 (12), 15727 (2010).
- Holtkamp, H. C., Verhoef, N. J., Leijnse, B. The difference between the glucose concentrations in plasma and whole blood. Clinica Chimica Acta. 59 (1), 41-49 (1975).
- Kanda, S., et al. Identification of KiSS-1 Product Kisspeptin and Steroid-Sensitive Sexually Dimorphic Kisspeptin Neurons in Medaka (Oryzias latipes). Endocrinology. 149 (5), 2467-2476 (2008).
- Kanda, S., Karigo, T., Oka, Y. Steroid Sensitive kiss2 Neurones in the Goldfish: Evolutionary Insights into the Duplicate Kisspeptin Gene-Expressing Neurones. Journal of Neuroendocrinology. 24 (6), 897-906 (2012).
- Mitani, Y., Kanda, S., Akazome, Y., Zempo, B., Oka, Y. Hypothalamic Kiss1 but Not Kiss2 Neurons Are Involved in Estrogen Feedback in Medaka (Oryzias latipes). Endocrinology. 151 (4), 1751-1759 (2010).
- Kayo, D., Zempo, B., Tomihara, S., Oka, Y., Kanda, S. Gene knockout analysis reveals essentiality of estrogen receptor β1 (Esr2a) for female reproduction in medaka. Scientific Reports. 9 (1), 8868 (2019).
- Fontaine, R., Ager-Wick, E., Hodne, K., Weltzien, F. -A. Plasticity in medaka gonadotropes via cell proliferation and phenotypic conversion. Journal of Endocrinology. 245 (1), 21 (2020).
- Fontaine, R., Ager-Wick, E., Hodne, K., Weltzien, F. -A. Plasticity of Lh cells caused by cell proliferation and recruitment of existing cells. Journal of Endocrinology. 240 (2), 361 (2019).
- Hasebe, M., Kanda, S., Oka, Y. Female-Specific Glucose Sensitivity of GnRH1 Neurons Leads to Sexually Dimorphic Inhibition of Reproduction in Medaka. Endocrinology. 157 (11), 4318-4329 (2016).
