Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Procedimentos de Gonadectomia e Amostragem de Sangue no Modelo teleost de pequeno tamanho Japonês Medaka (Oryzias latipes)

Published: December 11, 2020 doi: 10.3791/62006
Automatic Translation
1, 2, 3, 4, 4, 1, 1
1Physiology Unit, Faculty of Veterinary Medicine, Norwegian University of Life Sciences, 2Laboratory of Physiology, Atmosphere and Ocean Research Institute, The University of Tokyo, 3Department of Biological Sciences, Graduate School of Science, The University of Tokyo, 4Centre of Reproduction, Development and Aging (CRDA), Faculty of Health Sciences, University of Macau

Summary

O artigo descreve um protocolo rápido para gonadectomizar e provar sangue do pequeno peixe teleost, usando medaka japonês (Oryzias latipes) como modelo, para investigar o papel dos esteroides sexuais na fisiologia animal.

Abstract

Os esteroides sexuais, produzidos pelas gôndas, desempenham um papel essencial na plasticidade do cérebro e do tecido pituitário e no controle neuroendócrino da reprodução em todos os vertebrados, fornecendo feedback ao cérebro e à hipófise. Os peixes teleost possuem um maior grau de plasticidade tecidual e variação nas estratégias reprodutivas em comparação com os mamíferos e parecem ser modelos úteis para investigar o papel dos esteroides sexuais e os mecanismos pelos quais atuam. A remoção da principal fonte de produção de esteroides sexuais usando gonadectomia juntamente com amostragem de sangue para medir os níveis de esteroides tem sido bem estabelecida e bastante viável em peixes maiores e é uma técnica poderosa para investigar o papel e os efeitos dos esteroides sexuais. No entanto, essas técnicas levantam desafios quando implementadas em modelos teleost de pequeno porte. Aqui, descrevemos os procedimentos passo a passo da gonadectomia em ambos os machos e fêmeas medaka japonesa seguidos de amostragem de sangue. Estes protocolos são mostrados altamente viáveis em medaka indicado por uma alta taxa de sobrevivência, segurança para o tempo de vida e fenótipo do peixe, e reprodutibilidade em termos de liberação de esteroides sexuais. O uso desses procedimentos combinados com as outras vantagens do uso deste pequeno modelo teleost melhorará muito a compreensão dos mecanismos de feedback no controle neuroendócrino da reprodução e plasticidade tecidual proporcionada por esteroides sexuais em vertebrados.

Introduction

Em vertebrados, os esteroides sexuais, que são produzidos principalmente pelas gôndas, desempenham papéis importantes na regulação do eixo Brain-Pituitary-Gonadal (BPG) através de vários mecanismos de feedback1,2,3,4,5. Além disso, os esteroides sexuais afetam a proliferação e a atividade de neurônios no cérebro6,7,8 e células endócrinas, incluindo gonadotropes, na pituitária9,10, e assim servem papéis cruciais na plasticidade cerebral e pituitária. Apesar do conhecimento relativamente bom em mamíferos, o mecanismo de regulação do eixo BPG mediado por esteroides sexuais está longe de ser compreendido em espécies não-mamíferas, levando à má compreensão dos princípios evolutivos conservados11. Ainda há um número limitado de estudos documentando o papel dos esteroides sexuais na plasticidade cerebral e pituitária, aumentando assim a necessidade de investigações adicionais sobre o papel e os efeitos dos esteroides sexuais em diversas espécies de vertebrados.

Entre os vertebrados, as teleostas tornaram-se animais modelo poderosos no enfrentamento de inúmeras questões biológicas e fisiológicas, incluindo resposta ao estresse12,13, crescimento14,15, fisiologia nutricional16,17 e reprodução2. Teleosts, nos quais os esteroides sexuais são representados principalmente por estradiol (E2) em fêmeas e 11-cetosetosterona (11-KT) em machos18,19, têm sido modelos experimentais confiáveis para investigar o princípio geral da reprodução entre espécies. As teleóstas mostram singularidade em sua conexão hipotalâmica-pituitária20,21 e distintas células gonadotrope22, que às vezes são convenientes para a elucidação de mecanismos regulatórios. Além disso, devido à sua comodidade tanto para experimentos de laboratório quanto de campo, os teleosts oferecem muitas vantagens em comparação com outros organismos. Eles são relativamente baratos para comprar e manter23,24. Em particular, pequenos modelos de teleost como o zebrafish (Danio rerio) e o medaka japonês (Oryzias latipes), são espécies com fecundidade muito alta e um ciclo de vida relativamente curto, permitindo a análise rápida da função genética e mecanismos de doença23, proporcionando assim vantagens ainda maiores no enfrentamento de uma infinidade de questões biológicas e fisiológicas, considerando os inúmeros protocolos bem desenvolvidos e kit de ferramentas genéticas disponíveis para essas espécies25.

Em inúmeros estudos, a remoção de gônadas (gonadectomia) juntamente com técnicas de amostragem de sangue têm sido utilizadas como método para investigar muitas questões fisiológicas, incluindo seu impacto na fisiologia reprodutiva de vertebrados nos mamíferos26,27,28, aves29 e anfíbios30. Embora o efeito gonadectomia na fisiologia reprodutiva possa ser imitado alternativamente por antagonistas de esteroides sexuais, como tamoxifen e clomifeno, o efeito das drogas parece ser inconsistente devido aos efeitos bimodais31,32. A exposição crônica a um antagonista de esteroides sexuais pode levar ao alargamento ovariano33,34, que pode desativar a observação de seus efeitos para fins de longo prazo devido a um fenótipo não saudável. Além disso, é impossível realizar um experimento de recuperação após o tratamento antagonista de esteroides sexuais, para justificar o efeito específico de certos esteroides sexuais. Junto com esses pontos acima mencionados, outras trocas de uso de antagonistas de esteroides sexuais foram amplamente revisadas31,32. Portanto, a gonadectomia ainda aparece hoje como uma técnica poderosa para investigar o papel dos esteroides sexuais.

Enquanto as técnicas de gonadectomia e amostragem de sangue são relativamente fáceis de executar em espécies maiores, como o robalo europeu (Dicentrarchus labrax)35, o tálamo azul(Thalassoma bifasciatum)36, o dogfish(Scyliorhinus canicula)37 e o bagre(Heteropneustes fossilis e Clarias bathracus)38,39, eles levantam desafios quando aplicados em peixes pequenos como medaka. Por exemplo, o uso do Fish Anesthesia Delivery System (FADS)40 é menos viável e parece ser propenso a danos físicos excessivos para peixes pequenos. Além disso, um procedimento de gonadectomia que é comumente usado para peixes maiores40 não é adequado para peixes pequenos que requer alta precisão para evitar danos excessivos. Finalmente, a amostragem de sangue é desafiadora devido ao acesso limitado aos vasos sanguíneos e à pequena quantidade de sangue nesses animais. Portanto, um protocolo claro demonstrando cada passo de gonadectomia e amostragem de sangue em um pequeno teleost é importante.

Este protocolo demonstra os procedimentos passo a passo da gonadectomia seguidos pela amostragem de sangue em medaka japonesa, um pequeno peixe de água doce nativo do leste da Ásia. Medaka japonesa tem um genoma sequenciado, várias ferramentas moleculares e genéticas disponíveis25, e um sistema de determinação genética de sexo que permite a investigação de diferenças sexuais antes que características sexuais secundárias ou gônadas sejam bem desenvolvidas41. Curiosamente, medaka japonesa possui gônadas fundidas contrárias a muitas outras espécies de teleost42. Essas duas técnicas combinadas levam apenas 8 minutos no total e completarão a lista de protocolos de vídeo já existentes para esta espécie que incluía rotulagem de vasos sanguíneos43,grampo de remendo nas seções pituitárias44 e neurônios cerebrais45, e cultura celular primária46. Essas técnicas permitirão que a comunidade de pesquisa investigue e entenda melhor os papéis dos esteroides sexuais em mecanismos de feedback, bem como na plasticidade cerebral e pituitária no futuro.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Todas as experimentações e manejo animal foram conduzidas de acordo com as recomendações sobre o bem-estar animal experimental na Universidade Norueguesa de Ciências da Vida. Os experimentos com a gonadectomia foram aprovados pela Autoridade Norueguesa de Segurança Alimentar (FOTS ID 24305).

NOTA: Os experimentos foram realizados utilizando-se medaka adulto masculino e feminino (6-7 meses de idade, peso de 0,35 g, comprimento de 2,7 cm) medaka japonês. O sexo foi determinado por distinguir as características sexuais secundárias, como o tamanho e a forma da barbatana dorsal e anal, conforme descrito em42,47.

1. Preparação de instrumentos e soluções

  1. Prepare a solução de estoque anestésico (0,6% Tricaine).
    1. Diluir 0,6 g de Tricaine (MS-222) em 100 mL de 10x Phosphate Buffer Saline (PBS).
    2. Distribua 1 mL da solução de estoque tricaine em vários tubos plásticos de 1,5 mL e armazene a -20 °C até usar.
  2. Prepare a água de recuperação (solução nacl de 0,9%) adicionando 18 g de NaCl em 2 L de água de aquário. Armazene a solução em temperatura ambiente até o uso.
  3. Prepare as ferramentas de incisão quebrando uma navalha na diagonal para obter um ponto afiado(Figura 1A).
  4. Prepare a solução anticogulante sanguínea (0,05 U/μL de heparina de sódio) diluindo 25 μL de heparina de sódio em 500 μL de 1x PBS. Armazene a solução anticopante a 4 °C até usar.
  5. Prepare duas agulhas de vidro de um capilar de vidro de 90 mm de comprimento puxando um capilar de vidro com um puxador de agulha(Figura 1B) seguindo as instruções do fabricante.
    NOTA: O diâmetro externo da agulha de vidro é de 1 mm, enquanto o diâmetro interno é de 0,6 mm.
  6. Prepare uma tampa de tubo plástico de 1,5 mL cortando a tampa e faça um orifício que se encaixe com o diâmetro externo da agulha(Figura 1C). Para fazer o orifício, aqueça uma extremidade do capilar de vidro de 9 mm e esfaqueie o capilar de vidro aquecido através da tampa. Alternativamente, use uma agulha para furar a tampa até que o diâmetro do orifício se encaixe com o capilar de vidro de 9 mm.

2. Procedimento de gonadectomia

  1. Prepare 0,02% da solução anestésico diluindo um tubo de estoque tricaine (0,6%) em 30 mL de água do aquário.
  2. Prepare ferramentas de dissecção, incluindo um ultra-fino e dois fórceps finos (um com ponta relativamente larga), tesoura pequena, fio de nylon e navalha como descrito na etapa 1.3.
  3. Anestesiar o peixe colocando-o na solução anestésico de 0,02% por 30-60 segundos.
    NOTA: A duração da anestesia depende do tamanho e peso do peixe e deve ser adaptada. Para garantir que o peixe esteja totalmente anestesiado, o corpo do peixe pode ser perfeitamente beliscado usando fórceps. Se o peixe não reagir, a gonadectomia pode ser iniciada.
  4. Retire o peixe da solução anestésico e coloque o peixe horizontalmente de lado, fora d'água sob um microscópio de dissecção.
  5. Ovaectomia (OVX) em fêmeas
    1. Remova os ovos ovipositados (ovos pendurados fora do corpo feminino) se houver e raspe as escamas na área de incisão(Figura 2A).
    2. Faça delicadamente uma incisão de cerca de 2-2,5 mm de comprimento entre as costelas, entre as aletas pélvicas e anais(Figura 2A),utilizando a lâmina de barbear. Em seguida, belisque suavemente o abdômen do peixe enquanto tira os ovários pouco a pouco usando fórceps finos com ponta larga.
    3. Corte a extremidade dos ovários usando fórceps finos e coloque os ovários de lado(Figura 2B).
      NOTA: Tome cuidado para não quebrar o saco ovariano, se possível. Se o saco ovariano estiver quebrado, remova qualquer traço de gônada o mais completamente possível sem deixar nenhum óvulo não ovulado.
  6. Orquídea em machos
    1. Faça suavemente uma incisão entre as costelas acima do ânus(Figura 2A),e abra a incisão lentamente usando fórceps finos.
    2. Pegue suavemente os testículos usando os fórceps finos e lentamente retire os testículos. Depois, corte a extremidade dos testículos para remover completamente os testículos(Figura 2B). Para orquídeas machos, todas as preparações são semelhantes às das fêmeas até a parte da incisão. Ao pegar os testículos, às vezes a gordura que se assemelha aos testículos é obtida. No entanto, após a restauração da gordura, é possível tentar encontrar os testículos novamente(Figura 2B).
      NOTA: Tanto para homens quanto para fêmeas, é importante minimizar o tamanho da incisão no abdômen para evitar danos excessivos que possam levar à mortalidade. Às vezes, os intestinos também podem aparecer através da incisão junto com as gônadas, por isso certifique-se de que elas sejam devidamente devolvidas dentro da incisão antes do fechamento. O conhecimento prévio sobre ovários e localização de testículos no abdômen medaka é essencial.
  7. Sutura a incisão da mesma forma em machos e fêmeas(Figura 3).
    1. Coloque a linha de nylon ao lado da área de incisão e esfaqueie a pele do lado direito da incisão através da cavidade interna do corpo usando fórceps ultrafinas para levar o fio com fórceps finos(Figura 3; 1-2).
    2. Apunhale a pele do lado esquerdo da incisão através da cavidade externa do corpo para tirar a rosca ( Figura 3; 3-4).
    3. Feche a abertura da incisão e faça dois nós e corte a rosca excessiva(Figura 3; 4-6).
      NOTA: A sutura deve estar adequadamente apertada, e o restante do fio do peixe deve ser longo o suficiente para evitar o afrouxamento da sutura. Todo o procedimento desde anestesia até a sutura geralmente leva até 6 minutos. Tempo mais longo pode levar à mortalidade.
    4. Coloque os peixes na água de recuperação e deixe-os por pelo menos 24 horas antes de transferi-los para o sistema de aquário.
      NOTA: Peixes gonadectomizados geralmente apresentam comportamento normal após 1-2 horas na água de recuperação. Portanto, dependendo do propósito do experimento, pode-se provar o peixe após esse intervalo de tempo.

3. Procedimento de amostragem de sangue

  1. Prepare as ferramentas: uma agulha de vidro, um capilar de silicone, um tubo de plástico com um orifício, um tubo plástico vazio de 1,5 mL, uma minicentrifuagem e fita.
  2. Anestesiar o peixe utilizando solução anestésico de 0,02%, conforme descrito na etapa 2.1 e colocar o peixe sob um microscópio de dissecção em posição vertical(Figura 4A). Coloque o peixe em uma superfície brilhante para facilitar a visualização da veia de punção caudal.
  3. Instale a gaveta de sangue anexando uma agulha de vidro ao capilar de silicone(Figura 4B). Quebre a ponta da agulha com adoçam de ponta larga e cubra o interior da agulha com solução anticogulante por sucção e sopro.
    NOTA: Recomenda-se o uso de um e um capilar de silicone com pelo menos 50 cm de comprimento para medidas de segurança para evitar qualquer contato direto do sangue ao sucumbir. Além disso, certifique-se de que a abertura da ponta da agulha é suficientemente grande para permitir o desenho do sangue.
  4. Direcione a agulha em direção à área do pedículo do peixe, aponte para a veia peduncle caudal(Figura 5A) e tire o sangue usando a boca até pelo menos um quarto o volume total da agulha é preenchido(Figura 5B).
    NOTA: É importante parar de aspirar antes de remover a agulha do corpo do peixe.
  5. Solte a agulha e coloque um pedaço de fita na proximidade do lado afiado da agulha. Coloque a tampa com um orifício em um tubo de coleta e coloque a agulha dentro do tubo através do orifício com a ponta da agulha por fora(Figura 5C).
  6. Coloque os peixes na água de recuperação e deixe-os por pelo menos 24 horas antes de transferi-los para o sistema de aquário.
    NOTA: Para realizar uma segunda amostragem de sangue do mesmo peixe, prove o sangue uma semana após a primeira amostragem de sangue.
  7. Gire o sangue coletado por 1-2 segundos com 1.000 x g à temperatura ambiente para coletar o sangue no tubo.
  8. Proceda diretamente para aplicações a jusante ou armazene o sangue a -20 °C até o uso.
    NOTA: Consulte o estudo anterior para extração de esteroides sexuais de todo o sangue48.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Este protocolo descreve cada passo para a realização de gândectomia e amostragem de sangue em um teleost modelo de pequeno tamanho, o medaka japonês. A taxa de sobrevivência dos peixes após a ovariectomia (OVX) nas fêmeas é de 100% (10 em cada 10 peixes), enquanto 94% (17 dos 18 peixes) dos machos sobreviveram após orquídea. Enquanto isso, após a realização do procedimento de amostragem de sangue, todos os peixes (38 peixes) sobreviveram.

As fêmeas operadas por sham apresentam oviposição(Figura 6A)e todos os óvulos foram fertilizados e permitidos para o desenvolvimento embrionário(Figura 6B). Os machos operados por sham também foram capazes de fertilizar ovos após apenas 1-2 semanas. Duas das seis fêmeas em parte gonadectomizadas criadas com machos parcialmente gonadectomizados também apresentaram oviposição com 100% dos óvulos fertilizados após 2 meses. Em contrapartida, não foi observada oviposição em fêmeas ou fertilização por machos em peixes totalmente gonadectomizados, mesmo após 4 meses.

Quando realizada corretamente, a forma corporal do peixe muda ligeiramente(Figura 7A), e nenhum pedaço de gônada deve permanecer após o procedimento de gonadectomia(Figura 7B). Enquanto isso, 4 semanas após a gonadectomia, a incisão e a sutura desapareceram completamente(Figura 8), e após 4 meses, todos os peixes gonadectomizados ainda apresentavam fenótipo saudável, e nenhum tecido gonadal foi encontrado.

Concentrações sanguíneas E2 em fêmeas(Tabela 1),medida com ELISA seguindo as instruções do fabricante, revelaram que o nível E2 em peixes OVX é significativamente menor do que em peixes operados por vergonha 24 horas após a cirurgia (p < 0,00001). Após 4 meses, o nível E2 em peixes OVX também é significativamente menor do que em peixes operados por vergonha (p < 0,00001) e não mostra diferença significativa em relação ao peixe pós-OVX de 24 horas(p > 0,05). Finalmente, parcialmente o peixe OVX, onde apenas 1/3 a 1/2 da gônia foi removido, apresentam níveis E2 significativamente mais baixos do que os peixes operados por sham(p = 0,0437) e níveis de E2 significativamente mais altos do que o peixe totalmente OVX(p < 0,00001)(Figura 9A).

Da mesma forma em machos(Tabela 1), a concentração de 11-KT em peixes orquídeas é significativamente menor do que em peixes operados por vergonha 24 horas após a cirurgia (p < 0,00001). O nível de 11-KT em peixes orquídeasectomizados após 4 meses também é significativamente menor do que em peixes operados por vergonha(p < 0,00001) e não mostra diferença em relação a 24 horas de peixe pós-orquídea(p > 0,05). Finalmente, peixes em parte orquídeasectomizados apresentam níveis significativamente mais baixos de 11-KT do que peixes operados por vergonha (p = 0,0428) e níveis significativamente mais altos de 11-KT do que peixes totalmente orquitomizados(p < 0,00001)(Figura 9B).

Figure 1
Figura 1. Preparação de instrumentos. (A) Lâmina de barbear para gonadectomia, (B) agulha de vidro para extração de sangue, e (C) um tubo de plástico juntamente com uma tampa com um orifício para coleta de sangue. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2. Localização da área de incisão. A) Desenho da área de incisão localizada entre as costelas, entre as aletas pélvicas e anais em fêmeas (painel esquerdo) e machos (painel direito); B) remoção de gônada em fêmeas (painel esquerdo) e machos (painel direito), círculos brancos mostrando a parte articular, seta branca mostrando o testis e a seta preta mostrando a gordura. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3. O procedimento da sutura. 1) É feito um orifício no lado direito da incisão usando fórceps ultrafinas. 2) A linha de nylon é passada através da pele usando o orifício feito em 1. 3) É feito um orifício no lado esquerdo da incisão. 4) A linha de nylon é passada através do orifício feito em 3. 5) Um nó de mão excessiva é feito duas vezes para fechar a incisão. 6) O excesso de rosca é cortado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4. Posição do peixe durante a amostragem de sangue (A), a instalação de agulha de vidro com o capilar de silicone (B). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5. A área de sucção da amostragem de sangue (A), o sangue extraído (B) e as etapas de coleta de sangue (C). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 6
Figura 6. Peixes operados por sham mostram oviposição de ovos apontados por seta branca (A) e ovos fertilizados (B). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 7
Figura 7. Aparência morfológica (A) e anatômica (B) de peixes intactos e gonadectomizados. Setas brancas (painéis superiores) mostram a marca da cirurgia em peixes gonadectomizados. Setas pretas (painéis inferiores) mostram gôndas em peixes intactos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 8
Figura 8. Marcas de cirurgia em peixes machos e fêmeas após 4 semanas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 9
Figura 9. Níveis sanguíneos de E2 no feminino (A) e 11-KT em medaka japonês (B) masculino (B), 24 horas após a operação falsa (controle), em parte gonadectomia ou gonadectomia, e 4 meses após a gonadectomia (OVX, ovariectomia em fêmeas; Cas, orquídea em machos). As análises estatísticas foram realizadas utilizando-se o teste One Way ANOVA seguido do teste Tukey Post Hoc. Letras diferentes (a-c) apresentam diferenças significativas(p-valor < 0,05). Os dados no gráfico são fornecidos como média + SD, n = 5. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Níveis de E2 (Feminino) Níveis de 11-KT (Masculino)
Operado por Sham 4,15 ± 0,5 (n = 5) 10,38 ± 1,32 (n = 5)
Parcialmente gonadectomizado 3,37 ± 0,6 (n = 5) 8,37 ± 1,92 (n = 5)
24h pós-gonadectomia 0,36 ± 0,2 (n = 5) 0,4 ± 0,2 (n = 5)
4 meses após a gonadectomia 0,54 ± 0,28 (n = 5) 0,74 ± 0,22 (n = 5)

Mesa 1. Níveis de E2 e 11-KT (ng/mL) em fêmeas e machos de peixes operados por vergonha e gonadectomizados e parcialmente gonadectomizados.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Como relatado na literatura anterior, a gonadectomia e a amostragem de sangue têm sido utilizadas há muito tempo em outras espécies modelo para investigar questões relacionadas ao papel dos esteroides sexuais na regulação do eixo BPG. No entanto, essas técnicas parecem ser favoráveis apenas para animais maiores. Considerando o pequeno tamanho do modelo teleost comumente usado, medaka japonês, fornecemos um protocolo detalhado para gonadectomia e amostragem de sangue que é viável para esta espécie.

O fato de que a taxa de sobrevivência dos peixes gonadectomizados atingiu quase 100% indica que o procedimento de gonadectomia é viável para ser aplicado em medaka. Da mesma forma, o procedimento de amostragem sanguínea não afeta a sobrevivência do peixe, como mostra a taxa de sobrevivência de 100% após se submeter a este procedimento. Além disso, fêmeas operadas por vergonha criadas juntamente com machos operados por vergonha mostram oviposição e ovos 100% fertilizados, indicando que o procedimento de incisão e sutura não afetam a reprodução do peixe. Em outras palavras, eles eram saudáveis o suficiente para desovar. Além disso, peixes em parte gonadectomizados mostram concentrações comparáveis de esteroides sexuais para peixes operados por vergonha, e a oviposição em algumas fêmeas, bem como a fertilização de ovos por machos foram observadas naqueles peixes parcialmente gonadectomizados. Esses resultados sugerem que o procedimento da gonadectomia deve ser realizado com alta precisão, o que significa que os ovários ou testículos devem ser completamente removidos.

Como mostrado na Figura 8,a marca de incisão e sutura no peixe desapareceu completamente 4 semanas após a gnadectomia, e os peixes ainda estão vivos e parecem saudáveis 4 meses após a cirurgia. Estes indicam que o procedimento de operação é seguro para o peixe para fins de longo prazo e não afeta a vida útil do peixe. Além disso, após 4 meses, não foram observadas gôndas. Isso é confirmado pelos baixos níveis de E2 e 11-KT que ainda são semelhantes aos encontrados em peixes gonadectomizados após 24 horas.

Os níveis de E2 e 11-KT em peixes gonadectomizados são significativamente inferiores aos peixes operados por vergonha, já após 24 horas após a gonadectomia e permanecem mais baixos em peixes amostrados 4 meses após a gonadectomia. Os níveis significativamente mais baixos de esteroides sexuais em peixes gonadectomizados em comparação com o controle foram observados em estudos anteriores empeixes-cães 37, bagre39 e medaka48. Essas evidências consistentes sugerem que o procedimento de gonadectomia descrito no protocolo é uma técnica confiável para limpar esteroides sexuais circulantes.

Uma vez que este procedimento não conta com a FADS como demonstrado em40, a gonadectomia deve ser realizada o mais rápido possível para prevenir a mortalidade durante a cirurgia. De fato, o uso de FADS permite manter o ritmo de operação, uma vez que esta ferramenta permite condição anestésica contínua ao peixe, apesar de estar exposta ao ar. No entanto, devido à sua menor viabilidade no pequeno teleost como medaka, o uso de FADS não pode ser realizado com esse tamanho de peixe. Além disso, ao contrário do protocolo anterior de gonadectomia em peixes maiores que permite que a incisão ampla chegue à gôndaca, o protocolo descrito neste manuscrito não permite que a incisão ampla evite danos excessivos aos peixes pequenos. Portanto, deve-se ter muito cuidado ao tentar acessar a gônspado usando fórceps para evitar danos em outros tecidos dentro da cavidade corporal do peixe.

O protocolo conta com um procedimento rápido e limpo. Assim, o treinamento é altamente recomendado até atingir uma alta taxa de sucesso, indicada por uma alta taxa de sobrevivência do peixe após a gonadectomia, bem como a remoção completa das gônadas (ver a diferença de aparência morfológica e anatômica do peixe antes e depois da gonadectomia bem sucedida na Figura 7). De fato, muitos fatores podem afetar a taxa de sucesso do procedimento, incluindo o período de anestesia, a wideidade da incisão, a precisão e arrumação da sutura e manuseio de peixes durante o procedimento. Outro ponto importante é que deve-se preparar peixes saudáveis mantendo o peixe de forma ideal antes de realizar o protocolo.

Com relação ao procedimento de amostragem sanguínea, os estudos anteriores tentaram colher o sangue de medaka48 e zebrafish49,50,51, mas o procedimento não permite a amostragem repetida de sangue no mesmo peixe, uma vez que o sangue é retirado após eutanásia do peixe. A amostragem repetida de sangue foi demonstrada usando zebrafish em outro estudo52,mas relatamos este tipo de protocolo pela primeira vez em medaka.

A avaliação das concentrações de esteroides sexuais é comumente realizada usando um kit de ensaio imunossorbente ligado à enzima (ELISA), e houve muitos kits ELISA comercialmente disponíveis para diferentes tipos de esteroides sexuais. Devido à baixa quantidade de sangue coletada durante a amostragem sanguínea, os ensaios a jusante são destinados a todo o sangue. Estudos anteriores mostraram que há uma diferença no nível medido dos níveis de esteroides circulantes extraídos de sangue inteiro e plasma53,54. Portanto, a diferença nos níveis de esteroides sexuais de todo o sangue e plasma precisa ser validada antes de realizar o experimento real usando o protocolo.

Como documentado em estudos anteriores com diferentes modelos animais, o protocolo aqui descrito permitirá investigar questões relacionadas à fisiologia reprodutiva usando um teleost de pequeno porte como modelo. Na verdade, essas técnicas já contribuíram para responder a perguntas relativas à regulação do eixo BPG e seus mecanismos de feedback, como o envolvimento do kiss1 (gene kisspeptin tipo 1) expressando neurônios em loops de feedback positivo55, regulação mediada por estrogênio do kiss1 expressando neurônios no núcleo ventralis tuberis (NVT) e kiss2 (gene kisspeptin tipo 2) expressando neurônios na área preopítica (POA)56, 57, o possível envolvimento do receptor de estrogênio β1 (Esr2a) no nível de expressão fsh de baixa regulação no medaka58 japonês feminino, bem como o perfil do ritmo circadiano de E2 no peixe fêmea48. Além disso, uma vez que estudos anteriores demonstraram que esteroides sexuais também afetam a proliferação de células gonadotrope na pituitária de teleosts59,60, é intrigante investigar os efeitos da liberação de esteroides sexuais após a gonadectomia na plasticidade pituitária.

A técnica de amostragem de sangue não só pode ser usada para análise de esteroides sexuais, mas também para outras análises de conteúdo sanguíneo, incluindo níveis de glicemia. De fato, o protocolo também pode ser aplicado para medidas de glicemia, como demonstrado em zebrafish52 e medaka61. Portanto, essa técnica pode ser expandida para abordar questões de pesquisa em outros campos da fisiologia.

Finalmente, os protocolos descritos aqui são destinados e otimizados para medaka japonês adulto, e os resultados devido ao tamanho diferente de peixes e materiais utilizados durante os procedimentos podem variar. Além disso, à medida que os ovários/testículos medaka esquerdo e direito são fundidos, o que pode fornecer uma vantagem importante para a gonadectomia, este protocolo pode precisar de várias adaptações antes de ser usado em outras espécies onde este não é o caso, como em zebrafish. Assim, uma otimização de acordo com a escolha de equipamentos de laboratório e tamanho do peixe deve ser levada em conta antes de testar esses protocolos.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgments

Os autores agradecem à Sra. Lourdes Carreon G Tan por sua ajuda na criação de peixes. Este trabalho foi financiado pela NMBU, Grants-in-Aid da Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) (Grant number 18H04881 e 18K19323), e bolsa para Projetos básicos de Pesquisa científica da Fundação Sumitomo para S.K.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Glass capilary GD1 Glass Capillary with Filament GD-1; Narishige
Heparin sodium salt H4784-1G Sigma-aldrich
Needle puller P97 Flaming/Brown Micropipette puller Model P-97; Sutter Instrument
Nylon thread N45VL Polyamide suture, 0.2 metric; Crownjun
Plastic tube T9661 Eppendorf Safe-lock microcentifuge tube 1.5 ml, Sigma-aldrich
Razor blade - Astra Superior Platinum Double Edge Razor Blades Green, salonwholesale.com
Silicone capillary a16090800ux0403 Uxcell Silicone Tube 1 mm ID x 2 mm OD, amazon.com 
Tricaine WXBC9102V Aldrich chemistry

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Weltzien, F. -A., Andersson, E., Andersen, Ø, Shalchian-Tabrizi, K., Norberg, B. The brain-pituitary-gonad axis in male teleosts, with special emphasis on flatfish (Pleuronectiformes). Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Molecular & Integrative Physiology. 137 (3), 447-477 (2004).
  2. Yaron, Z., Levavi-Sivan, B. Encyclopedia of Fish Physiology. Farrell, A. P. 2, Academic Press. 1500-1508 (2011).
  3. Goldman, B. D. The circadian timing system and reproduction in mammals. Steroids. 64 (9), 679-685 (1999).
  4. Taranger, G. L., et al. Control of puberty in farmed fish. General and Comparative Endocrinology. 165 (3), 483-515 (2010).
  5. Messinis, I. E. Ovarian feedback, mechanism of action and possible clinical implications. Human Reproduction Update. 12 (5), 557-571 (2006).
  6. Diotel, N., et al. The brain of teleost fish, a source, and a target of sexual steroids. Frontiers in Neuroscience. 5, 137 (2011).
  7. Diotel, N., et al. Steroid Transport, Local Synthesis, and Signaling within the Brain: Roles in Neurogenesis, Neuroprotection, and Sexual Behaviors. Frontiers in Neuroscience. 12, 84 (2018).
  8. Larson, T. A. Sex Steroids, Adult Neurogenesis, and Inflammation in CNS Homeostasis, Degeneration, and Repair. Frontiers in Endocrinology. 9, 205 (2018).
  9. Fontaine, R., et al. Gonadotrope plasticity at cellular, population and structural levels: A comparison between fishes and mammals. General and Comparative Endocrinology. 287, 113344 (2020).
  10. Fontaine, R., Royan, M. R., von Krogh, K., Weltzien, F. -A., Baker, D. M. Direct and indirect effects of sex steroids on gonadotrope cell plasticity in the teleost fish pituitary. Frontiers in Endocrinology. , (2020).
  11. Kanda, S. Evolution of the regulatory mechanisms for the hypothalamic-pituitary-gonadal axis in vertebrates-hypothesis from a comparative view. General and Comparative Endocrinology. 284, 113075 (2019).
  12. Schreck, C. B. Stress and fish reproduction: The roles of allostasis and hormesis. General and Comparative Endocrinology. 165 (3), 549-556 (2010).
  13. Wendelaar Bonga, S. E. The stress response in fish. Physiological Reviews. 77 (3), 591-625 (1997).
  14. Mommsen, T. P. Paradigms of growth in fish. Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Biochemistry and Molecular Biology. 129 (2), 207-219 (2001).
  15. Won, E., Borski, R. Endocrine Regulation of Compensatory Growth in Fish. Front. Endocrinol. 4, 74 (2013).
  16. MacKenzie, D. S., VanPutte, C. M., Leiner, K. A. Nutrient regulation of endocrine function in fish. Aquaculture. 161 (1), 3-25 (1998).
  17. Rønnestad, I., Thorsen, A., Finn, R. N. Fish larval nutrition: a review of recent advances in the roles of amino acids. Aquaculture. 177 (1), 201-216 (1999).
  18. Borg, B. Androgens in teleost fishes. Comparative Biochemistry and Physiology Part C: Pharmacology, Toxicology and Endocrinology. 109 (3), 219-245 (1994).
  19. Rege, J., et al. Circulating 11-oxygenated androgens across species. The Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology. 190, 242-249 (2019).
  20. Blázquez, M., Bosma, P. T., Fraser, E. J., Van Look, K. J. W., Trudeau, V. L. Fish as models for the neuroendocrine regulation of reproduction and growth. Comparative Biochemistry and Physiology Part C: Pharmacology, Toxicology and Endocrinology. 119 (3), 345-364 (1998).
  21. Zambrano, D. Innervation of the teleost pituitary. General and Comparative Endocrinology. 3, 22-31 (1972).
  22. Weltzien, F. -A., Hildahl, J., Hodne, K., Okubo, K., Haug, T. M. Embryonic development of gonadotrope cells and gonadotropic hormones - Lessons from model fish. Molecular and Cellular Endocrinology. 385 (1), 18-27 (2014).
  23. Harris, M. P., Henke, K., Hawkins, M. B., Witten, P. E. Fish is Fish: the use of experimental model species to reveal causes of skeletal diversity in evolution and disease. Journal of applied ichthyology. 30 (4), 616-629 (2014).
  24. Powers, D. Fish as model systems. Science. 246 (4928), 352-358 (1989).
  25. Naruse, K. Medaka: A Model for Organogenesis, Human Disease, and Evolution. Naruse, K., Tanaka, M., Takeda, H. , Springer. Japan. 19-37 (2011).
  26. Green, P. G., et al. Sex Steroid Regulation of the Inflammatory Response: Sympathoadrenal Dependence in the Female Rat. The Journal of Neuroscience. 19 (10), 4082-4089 (1999).
  27. Pakarinen, P., Huhtaniemi, I. Gonadal and sex steroid feedback regulation of gonadotrophin mRNA levels and secretion in neonatal male and female rats. Journal of Molecular Endocrinology. 3 (2), 139 (1989).
  28. Purves-Tyson, T. D., et al. Testosterone regulation of sex steroid-related mRNAs and dopamine-related mRNAs in adolescent male rat substantia nigra. BMC Neuroscience. 13 (1), 95 (2012).
  29. Adkins-Regan, E., Ascenzi, M. Sexual differentiation of behavior in the zebra finch: Effect of early gonadectomy or androgen treatment. Hormones and Behavior. 24 (1), 114-127 (1990).
  30. McCreery, B. R., Licht, P. Effects of gonadectomy and sex steroids on pituitary gonadotrophin release and response to gonadotrophin-releasing hormone (GnRH) agonist in the bullfrog, Rana catesbeiana. General and Comparative Endocrinology. 54 (2), 283-296 (1984).
  31. Clark, J. H., Markaverich, B. M. The agonistic-antagonistic properties of clomiphene: a review. Pharmacology & Therapeutics. 15 (3), 467-519 (1981).
  32. Mourits, M. J. E., et al. Tamoxifen treatment and gynecologic side effects: a review. Obstetrics & Gynecology. 97 (5), 855-866 (2001).
  33. Wallach, E., Huppert, L. C. Induction of Ovulation with Clomiphene Citrate. Fertility and Sterility. 31 (1), 1-8 (1979).
  34. Moradi, B., Kazemi, M. A., Rahamni, M., Gity, M. Ovarian hyperstimulation syndrome followed by ovarian torsion in premenopausal patient using adjuvant tamoxifen treatment for breast cancer. Asian Pacific Journal of Reproduction. 5 (5), 442-444 (2016).
  35. Alvarado, M. V., et al. Actions of sex steroids on kisspeptin expression and other reproduction-related genes in the brain of the teleost fish European sea bass. The Journal of Experimental Biology. 219 (21), 3353-3365 (2016).
  36. Godwin, J., Crews, D., Warner, R. R. Behavioural sex change in the absence of gonads in a coral reef fish. Proceedings of the Royal Society of London. Series B: Biological Sciences. 263 (1377), 1683-1688 (1996).
  37. Jenkins, N., Dodd, J. M. Effects of ovariectomy of the dogfish Scyliorhinus canicula L. on circulating levels of androgen and oestradiol and on pituitary gonadotrophin content. Journal of Fish Biology. 21 (3), 297-303 (1982).
  38. Manickam, P., Joy, K. P. Changes in hypothalamic catecholamine levels in relation to season, ovariectomy and 17β-estradiol replacement in the catfish, Clarias batrachus (L.). General and Comparative Endocrinology. 80 (2), 167-174 (1990).
  39. Senthilkumaran, B., Joy, K. P. Effects of ovariectomy and oestradiol replacement on hypothalamic serotonergic and monoamine oxidase activity in the catfish, Heteropneustes fossilis: a study correlating plasma oestradiol and gonadotrophin levels. Journal of Endocrinology. 142 (2), 193-203 (1994).
  40. Sladky, K. K., Clarke, E. O. Fish Surgery: Presurgical Preparation and Common Surgical Procedures. Veterinary Clinics of North America: Exotic Animal Practice. 19 (1), 55-76 (2016).
  41. Hori, H. Medaka: A Model for Organogenesis, Human Disease, and Evolution. Naruse, K., Tanaka, M., Takeda, H. , Springer. Japan. 1-16 (2011).
  42. Murata, K., Kinoshita, M., Naruse, K., Tanaka, M., Kamei, Y. Medaka: Biology, Management, and Experimental Protocols. Murata, K., et al. 2, John Wiley & Sons. 49-95 (2019).
  43. Fontaine, R., Weltzien, F. -A. Labeling of Blood Vessels in the Teleost Brain and Pituitary Using Cardiac Perfusion with a DiI-fixative. Journal of Visualized Experiments. (148), e59768 (2019).
  44. Fontaine, R., Hodne, K., Weltzien, F. -A. Healthy Brain-pituitary Slices for Electrophysiological Investigations of Pituitary Cells in Teleost Fish. Journal of Visualized Experiments. (138), e57790 (2018).
  45. Zhao, Y., Wayne, N. L. Recording Electrical Activity from Identified Neurons in the Intact Brain of Transgenic Fish. Journal of Visualized Experiments. (74), e50312 (2013).
  46. Ager-Wick, E., et al. Preparation of a High-quality Primary Cell Culture from Fish Pituitaries. Journal of Visualized Experiments. (138), e58159 (2018).
  47. Wittbrodt, J., Shima, A., Schartl, M. Medaka - model organism from the far east. Nature Reviews Genetics. 3 (1), 53-64 (2002).
  48. Kayo, D., Oka, Y., Kanda, S. Examination of methods for manipulating serum 17β-Estradiol (E2) levels by analysis of blood E2 concentration in medaka (Oryzias latipes). General and Comparative Endocrinology. 285, 113272 (2020).
  49. Eames, S. C., Philipson, L. H., Prince, V. E., Kinkel, M. D. Blood sugar measurement in zebrafish reveals dynamics of glucose homeostasis. Zebrafish. 7 (2), 205-213 (2010).
  50. Velasco-Santamaría, Y. M., Korsgaard, B., Madsen, S. S., Bjerregaard, P. Bezafibrate, a lipid-lowering pharmaceutical, as a potential endocrine disruptor in male zebrafish (Danio rerio). Aquatic Toxicology. 105 (1-2), 107-118 (2011).
  51. Jagadeeswaran, P., Sheehan, J. P., Craig, F. E., Troyer, D. Identification and characterization of zebrafish thrombocytes. British Journal of Haematology. 107 (4), 731-738 (1999).
  52. Zang, L., Shimada, Y., Nishimura, Y., Tanaka, T., Nishimura, N. Repeated Blood Collection for Blood Tests in Adult Zebrafish. Journal of Visualized Experiments. (102), e53272 (2015).
  53. Taves, M. D., et al. Steroid concentrations in plasma, whole blood and brain: effects of saline perfusion to remove blood contamination from brain. PloS one. 5 (12), 15727 (2010).
  54. Holtkamp, H. C., Verhoef, N. J., Leijnse, B. The difference between the glucose concentrations in plasma and whole blood. Clinica Chimica Acta. 59 (1), 41-49 (1975).
  55. Kanda, S., et al. Identification of KiSS-1 Product Kisspeptin and Steroid-Sensitive Sexually Dimorphic Kisspeptin Neurons in Medaka (Oryzias latipes). Endocrinology. 149 (5), 2467-2476 (2008).
  56. Kanda, S., Karigo, T., Oka, Y. Steroid Sensitive kiss2 Neurones in the Goldfish: Evolutionary Insights into the Duplicate Kisspeptin Gene-Expressing Neurones. Journal of Neuroendocrinology. 24 (6), 897-906 (2012).
  57. Mitani, Y., Kanda, S., Akazome, Y., Zempo, B., Oka, Y. Hypothalamic Kiss1 but Not Kiss2 Neurons Are Involved in Estrogen Feedback in Medaka (Oryzias latipes). Endocrinology. 151 (4), 1751-1759 (2010).
  58. Kayo, D., Zempo, B., Tomihara, S., Oka, Y., Kanda, S. Gene knockout analysis reveals essentiality of estrogen receptor β1 (Esr2a) for female reproduction in medaka. Scientific Reports. 9 (1), 8868 (2019).
  59. Fontaine, R., Ager-Wick, E., Hodne, K., Weltzien, F. -A. Plasticity in medaka gonadotropes via cell proliferation and phenotypic conversion. Journal of Endocrinology. 245 (1), 21 (2020).
  60. Fontaine, R., Ager-Wick, E., Hodne, K., Weltzien, F. -A. Plasticity of Lh cells caused by cell proliferation and recruitment of existing cells. Journal of Endocrinology. 240 (2), 361 (2019).
  61. Hasebe, M., Kanda, S., Oka, Y. Female-Specific Glucose Sensitivity of GnRH1 Neurons Leads to Sexually Dimorphic Inhibition of Reproduction in Medaka. Endocrinology. 157 (11), 4318-4329 (2016).

Tags

Biologia Edição 166 Gonadectomia ovariectomia orquídea castração medaka sangue esteroides peixes reprodução plasticidade estradiol 11-cetosetosterona
Procedimentos de Gonadectomia e Amostragem de Sangue no Modelo teleost de pequeno tamanho Japonês Medaka (<em>Oryzias latipes</em>)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Royan, M. R., Kanda, S., Kayo, D.,… More

Royan, M. R., Kanda, S., Kayo, D., Song, W., Ge, W., Weltzien, F. A., Fontaine, R. Gonadectomy and Blood Sampling Procedures in the Small Size Teleost Model Japanese Medaka (Oryzias latipes). J. Vis. Exp. (166), e62006, doi:10.3791/62006 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter