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Procedimientos de gonadectomía y muestreo de sangre en el modelo de teleósto de tamaño pequeño japonés Medaka (Oryzias latipes)

Published: December 11, 2020 doi: 10.3791/62006
Automatic Translation
1, 2, 3, 4, 4, 1, 1
1Physiology Unit, Faculty of Veterinary Medicine, Norwegian University of Life Sciences, 2Laboratory of Physiology, Atmosphere and Ocean Research Institute, The University of Tokyo, 3Department of Biological Sciences, Graduate School of Science, The University of Tokyo, 4Centre of Reproduction, Development and Aging (CRDA), Faculty of Health Sciences, University of Macau

Summary

El artículo describe un protocolo rápido para gonadectomizar y tomar muestras de sangre de los pequeños peces teleóseos, utilizando medaka japonés(Oryzias latipes)como modelo, para investigar el papel de los esteroides sexuales en la fisiología animal.

Abstract

Los esteroides sexuales, producidos por las gónadas, juegan un papel esencial en la plasticidad del cerebro y el tejido pituitario y en el control neuroendocrino de la reproducción en todos los vertebrados al proporcionar retroalimentación al cerebro y la hipófisis. Los peces teleóstos poseen un mayor grado de plasticidad tisular y variación en las estrategias reproductivas en comparación con los mamíferos y parecen ser modelos útiles para investigar el papel de los esteroides sexuales y los mecanismos por los que actúan. La eliminación de la principal fuente de producción de esteroides sexuales mediante gonadectomía junto con el muestreo de sangre para medir los niveles de esteroides ha sido bien establecida y bastante factible en peces más grandes y es una técnica poderosa para investigar el papel y los efectos de los esteroides sexuales. Sin embargo, estas técnicas plantean desafíos cuando se implementan en modelos de teleósto de tamaño pequeño. Aquí, describimos los procedimientos paso a paso de la gonadectomía en medaka japonés masculino y femenino seguido de un muestreo de sangre. Estos protocolos han demostrado ser altamente factibles en medaka indicados por una alta tasa de supervivencia, seguridad para la vida útil y el fenotipo de los peces, y reproducibilidad en términos de eliminación de esteroides sexuales. El uso de estos procedimientos combinado con las otras ventajas de usar este pequeño modelo de teleósto mejorará en gran medida la comprensión de los mecanismos de retroalimentación en el control neuroendocrino de la reproducción y la plasticidad tisular proporcionada por los esteroides sexuales en vertebrados.

Introduction

En los vertebrados, los esteroides sexuales, que son producidos principalmente por las gónadas, juegan un papel importante en la regulación del eje Cerebro-Hipófisis-Gonadal (BPG) a través de varios mecanismos de retroalimentación1,2,3,4,5. Además, los esteroides sexuales afectan la proliferación y la actividad de las neuronas en el cerebro6,7,8 y las células endocrinas, incluidos los gonadotropos, en la hipófisis9,10,y por lo tanto cumplen funciones cruciales en el cerebro y la plasticidad pituitaria. A pesar de un conocimiento relativamente bueno en mamíferos, el mecanismo de regulación del eje BPG mediado por esteroides sexuales está lejos de ser entendido en especies no mamíferas, lo que lleva a una comprensión deficiente de los principios conservados evolutivamente11. Todavía hay un número limitado de estudios que documentan el papel de los esteroides sexuales en el cerebro y la plasticidad pituitaria, lo que plantea la necesidad de más investigaciones sobre el papel y los efectos de los esteroides sexuales en diversas especies de vertebrados.

Entre los vertebrados, los teleóstos se han convertido en poderosos animales modelo para abordar numerosas preguntas biológicas y fisiológicas, incluida la respuesta al estrés12,13,el crecimiento14,15,la fisiología nutricional16,17 y la reproducción2. Los teleóstomos, en los que los esteroides sexuales están representados principalmente por estradiol (E2) en las hembras y 11-cetotestosterona (11-KT) en los machos18,19,han sido durante mucho tiempo modelos experimentales confiables para investigar el principio general de reproducción en todas las especies. Los teleóstomos muestran singularidad en su conexión hipotalámico-hipofisaria20,21 y distintas células gonadotropas22,que a veces son convenientes para la elucidación de los mecanismos reguladores. Además, debido a su capacidad para experimentos de laboratorio y de campo, los teleóstodos ofrecen muchas ventajas en comparación con otros organismos. Son relativamente baratos de comprar y mantener23,24. En particular, los pequeños modelos de teleósto como el pez cebra(Danio rerio)y el medaka japonés(Oryzias latipes),son especies con una fecundidad muy alta y un ciclo de vida relativamente corto que permite un análisis rápido de la función génica y los mecanismos de la enfermedad23,proporcionando así ventajas aún mayores al abordar una gran cantidad de preguntas biológicas y fisiológicas, teniendo en cuenta los numerosos protocolos bien desarrollados y el conjunto de herramientas genéticas disponibles para estas especies25.

En numerosos estudios, la eliminación de gónadas (gonadectomía) junto con técnicas de muestreo de sangre se han utilizado como método para investigar muchas cuestiones fisiológicas, incluido su impacto en la fisiología reproductiva de vertebrados en mamíferos26,27,28,aves29 y anfibios30. Aunque el efecto de la gonadectomía sobre la fisiología reproductiva puede ser imitado alternativamente por antagonistas de esteroides sexuales, como el tamoxifeno y el clomifeno, el efecto de los fármacos parece ser inconsistente debido a los efectos bimodales31,32. La exposición crónica a un antagonista de esteroides sexuales puede conducir a un agrandamiento ovárico33,34, lo que puede deshabilitar la observación de sus efectos para fines a largo plazo debido a un fenotipo poco saludable. Además, es imposible realizar un experimento de recuperación después del tratamiento con antagonistas de esteroides sexuales, para garantizar el efecto específico de ciertos esteroides sexuales. Junto con esos puntos antes mencionados, otras compensaciones del uso de antagonistas de esteroides sexuales han sido ampliamente revisadas31,32. Por lo tanto, la gonadectomía todavía aparece hoy en día como una técnica poderosa para investigar el papel de los esteroides sexuales.

Si bien las técnicas de gonadectomía y muestreo de sangre son relativamente fáciles de realizar en especies más grandes, como la lubina europea(Dicentrarchus labrax)35,el pez cabeza azul(Thalassoma bifasciatum)36,el cazón(Scyliorhinus canicula)37 y el bagre(Heteropneustes fossilis y Clarias bathracus)38,39,plantean desafíos cuando se aplican en peces pequeños como medaka. Por ejemplo, el uso del Sistema de Administración de Anestesia de Peces (FADS)40 es menos factible y parece ser propenso a daños físicos excesivos para los peces pequeños. Además, un procedimiento de gonadectomía que se usa comúnmente para peces más grandes40 no es adecuado para peces pequeños que requieren alta precisión para evitar daños excesivos. Finalmente, el muestreo de sangre es un desafío debido al acceso limitado a los vasos sanguíneos y la pequeña cantidad de sangre en esos animales. Por lo tanto, es importante un protocolo claro que demuestre cada paso de la gonadectomía y el muestreo de sangre en un pequeño teleósto.

Este protocolo demuestra los procedimientos paso a paso de la gonadectomía seguidos de la toma de muestras de sangre en la medaka japonesa, un pequeño pez de agua dulce nativo del este de Asia. Los medaka japoneses tienen un genoma secuenciado, varias herramientas moleculares y genéticas disponibles25,y un sistema genético de determinación del sexo que permite la investigación de las diferencias sexuales antes de que las características sexuales secundarias o gónadas estén bien desarrolladas41. Curiosamente, los medaka japoneses poseen gónadas fusionadas contrariamente a muchas otras especies de teleóstos42. Estas dos técnicas combinadas toman solo 8 minutos en total y completarán la lista de protocolos de video ya existentes para esta especie que incluyeron el etiquetado de los vasos sanguíneos43,patch-clamp en las secciones hipofisarias44 y neuronas cerebrales45,y el cultivo celular primario46. Estas técnicas permitirán a la comunidad de investigación investigar y comprender mejor los roles de los esteroides sexuales en los mecanismos de retroalimentación, así como la plasticidad cerebral y pituitaria en el futuro.

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Protocol

Todas las experimentaciones y el manejo de animales se llevaron a cabo de acuerdo con las recomendaciones sobre el bienestar animal experimental en la Universidad Noruega de Ciencias de la Vida. Los experimentos con gonadectomía fueron aprobados por la Autoridad Noruega de Seguridad Alimentaria (FOTS ID 24305).

NOTA: Los experimentos se realizaron utilizando machos y hembras adultos (6-7 meses de edad, peso aprox. 0,35 g, longitud aprox. 2,7 cm) medaka japonés. El sexo se determinó distinguiendo las características sexuales secundarias, como el tamaño y la forma de la aleta dorsal y anal, como se describe en42,47.

1. Preparación de instrumentos y soluciones

  1. Preparar solución anestésica stock (0,6% Tricaine).
    1. Diluir 0,6 g de Tricaína (MS-222) en 100 ml de solución salina tampón de fosfato 10x (PBS).
    2. Distribuya 1 ml de la solución de material de tricaína en varios tubos de plástico de 1,5 ml y guárdelo a -20 °C hasta su uso.
  2. Prepare agua de recuperación (solución de NaCl al 0,9%) agregando 18 g de NaCl en 2 L de agua de acuario. Guarde la solución a temperatura ambiente hasta su uso.
  3. Prepare las herramientas de incisión rompiendo una maquinilla de afeitar en diagonal para obtener un punto afilado(Figura 1A).
  4. Preparar la solución anticoagulante en sangre (0,05 U/μL de heparina sódica) diluyendo 25 μL de heparina sódica en 500 μL de 1x PBS. Conservar la solución anticoagulante a 4 °C hasta su uso.
  5. Prepare dos agujas de vidrio de un capilar de vidrio de 90 mm de largo tirando de un capilar de vidrio con un arrancador de agujas(Figura 1B)siguiendo las instrucciones del fabricante.
    NOTA: El diámetro exterior de la aguja de vidrio es de 1 mm, mientras que el diámetro interior es de 0,6 mm.
  6. Prepare una tapa de tubo de plástico de 1,5 ml cortando la tapa y haga un orificio que encaje con el diámetro exterior de la aguja(Figura 1C). Para hacer el agujero, caliente un extremo del capilar de vidrio de 9 mm y apuñale el capilar de vidrio calentado a través de la tapa. Alternativamente, use una aguja para atravesar la tapa hasta que el diámetro del orificio encaje con el capilar de vidrio de 9 mm.

2. Procedimiento de gonadectomía

  1. Prepare el 0,02% de la solución anestésica diluyendo un tubo de caldo de Tricaína (0,6%) en 30 ml de agua de acuario.
  2. Prepare herramientas de disección que incluyan una ultrafina y dos fórceps finas (una con punta relativamente ancha), tijeras pequeñas, hilo de nylon y maquinilla de afeitar como se describe en el paso 1.3.
  3. Anestesiar el pescado poniéndolo en la solución anestésica al 0,02% durante 30-60 segundos.
    NOTA: La duración de la anestesia depende del tamaño y peso del pez y debe adaptarse. Para asegurarse de que el pez esté completamente anestesiado, el cuerpo del pez se puede pellizcar suavemente con pinzas. Si el pez no reacciona, se puede iniciar la gonadectomía.
  4. Saque el pez de la solución anestésica y colóquelo horizontalmente de lado, fuera del agua bajo un microscopio de disección.
  5. Ovariectomía (OVX) en mujeres
    1. Retire los huevos ovipositados (huevos que cuelgan fuera del cuerpo femenino) si los hay y raspe las escamas en el área de la incisión(Figura 2A).
    2. Haga suavemente una incisión de aproximadamente 2-2.5 mm de largo entre las costillas, entre las aletas pélvica y anal(Figura 2A),usando la hoja de afeitar. Luego, pellizca suavemente el abdomen del pez mientras saca los ovarios poco a poco usando pinzas finas con punta ancha.
    3. Cortar el extremo de los ovarios con fórceps finos y colocar los ovarios a un lado (Figura 2B).
      NOTA: Tenga cuidado de no romper el saco ovárico si es posible. Si el saco ovárico está roto, elimine cualquier rastro de gónada lo más completamente posible sin dejar incluso óvulos no ovulados.
  6. Orquidectomía en varones
    1. Haga suavemente una incisión entre las costillas por encima del ano(Figura 2A)y abra la incisión lentamente con fórceps finos.
    2. Agarre suavemente los testículos con las pórceps finos y saque lentamente los testículos. Posteriormente, corte el extremo de los testículos para eliminar completamente los testículos (Figura 2B). Para la orquidectomía masculina, todas las preparaciones son similares a las de las hembras hasta la parte de la incisión. Al agarrar los testículos, a veces se obtiene la grasa que se asemeja a los testículos. Sin embargo, después de restaurar la grasa, es posible tratar de encontrar los testículos nuevamente (Figura 2B).
      NOTA: Tanto para hombres como para mujeres, es importante minimizar el tamaño de la incisión en el abdomen para evitar daños excesivos que pueden conducir a la mortalidad. A veces, los intestinos también pueden aparecer a través de la incisión junto con las gónadas, así que asegúrese de que se devuelvan correctamente dentro de la incisión antes del cierre. El conocimiento previo sobre la ubicación de los ovarios y los testículos en el abdomen medaka es esencial.
  7. Suturar la incisión de manera similar en hombres y mujeres(Figura 3).
    1. Coloque el hilo de nylon al lado del área de la incisión y apuñale la piel desde el lado derecho de la incisión a través de la cavidad interna del cuerpo usando fórceps ultrafinas para tomar el hilo con fórceps finos (Figura 3; 1-2).
    2. Apuñalar la piel desde el lado izquierdo de la incisión a través de la cavidad externa del cuerpo para sacar el hilo ( Figura 3; 3-4).
    3. Cierre la abertura de la incisión y haga dos nudos y corte el hilo excesivo (Figura 3; 4-6).
      NOTA: La sutura debe estar adecuadamente apretada, y el hilo restante en el pez debe ser lo suficientemente largo como para evitar el aflojamiento de la sutura. Todo el procedimiento desde la anestesia hasta la sutura comúnmente toma hasta 6 minutos. Más tiempo puede conducir a la mortalidad.
    4. Coloque los peces en el agua de recuperación y déjelos durante al menos 24 horas antes de transferirlos al sistema de acuario.
      NOTA: Los peces gonadectomizados generalmente muestran un comportamiento normal después de 1-2 horas en el agua de recuperación. Por lo tanto, dependiendo del propósito del experimento, se puede tomar muestras de los peces después de este intervalo de tiempo.

3. Procedimiento de muestreo de sangre

  1. Prepare las herramientas: una aguja de vidrio, un capilar de silicona, un tubo de plástico con un orificio, un tubo de plástico vacío de 1,5 ml, una minicentrífuga y cinta.
  2. Anestesiar el pescado usando una solución anestésica al 0,02% como se describe en el paso 2.1 y colocar el pez bajo un microscopio de disección en posición vertical(Figura 4A). Coloque el pez sobre una superficie brillante para facilitar la visualización de la vena de punción caudal.
  3. Instale el cajón de sangre conectando una aguja de vidrio al capilar de silicona (Figura 4B). Rompa la punta de la aguja con pórceps de punta ancha y cubra el interior de la aguja con solución anticoagulante mediante succión y soplado.
    NOTA: Se recomienda el uso de una ventosa y un capilar de silicona con al menos 50 cm de longitud para medidas de seguridad para evitar cualquier contacto directo de la sangre al succionar. Además, asegúrese de que la abertura de la punta de la aguja sea lo suficientemente grande como para permitir la extracción de sangre.
  4. Dirija la aguja hacia el área del pedúnculo del pez, apunte a la vena del pedúnculo caudal(Figura 5A)y extraiga la sangre con la boca hasta que se llene al menos una cuarta parte del volumen total de la aguja(Figura 5B).
    NOTA: Es importante dejar de succiones antes de retirar la aguja del cuerpo del pez.
  5. Suelte la aguja y coloque un trozo de cinta adhesiva en la proximidad del lado afilado de la aguja. Coloque la tapa con un orificio en un tubo de recolección y coloque la aguja dentro del tubo a través del orificio con la punta de la aguja en el exterior (Figura 5C).
  6. Coloque los peces en el agua de recuperación y déjelos durante al menos 24 horas antes de transferirlos al sistema de acuario.
    NOTA: Para realizar una segunda muestra de sangre del mismo pez, tome muestras de sangre una semana después de la primera muestra de sangre.
  7. Flash gire hacia abajo la sangre recolectada durante 1-2 segundos con 1,000 x g a temperatura ambiente para recolectar la sangre en el tubo.
  8. Proceda directamente a las aplicaciones posteriores o almacene la sangre a -20 ° C hasta su uso.
    NOTA: Consulte el estudio anterior para la extracción de esteroides sexuales de la sangre total48.

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Representative Results

Este protocolo describe cada paso para realizar gonadectomía y muestreo de sangre en un teleósto modelo de tamaño pequeño, el medaka japonés. La tasa de supervivencia de los peces después de la ovariectomía (OVX) en las hembras es del 100% (10 de cada 10 peces), mientras que el 94% (17 de 18 peces) de los machos sobrevivieron después de la orquidectomía. Mientras tanto, después de que se realizó el procedimiento de muestreo de sangre, todos los peces (38 peces) sobrevivieron.

Las hembras operadas simuladamente muestran oviposición(Figura 6A)y todos los óvulos fueron fertilizados y permitidos para el desarrollo embrionario(Figura 6B). Los machos operados simuladamente también pudieron fertilizar los huevos después de solo 1-2 semanas. Dos de cada seis hembras parcialmente gonadectomizadas criadas con machos parcialmente gonadectomizados también mostraron oviposición con el 100% de los óvulos fertilizados después de 2 meses. Por el contrario, no se observó oviposición en las hembras ni fertilización por parte de los machos en peces completamente gonadectomizados, incluso después de 4 meses.

Cuando se realiza correctamente, la forma del cuerpo del pez cambia ligeramente(Figura 7A),y no debe quedar ningún trozo de gónada después del procedimiento de gonadectomía(Figura 7B). Mientras tanto, 4 semanas después de la gonadectomía, la incisión y la sutura desaparecieron por completo(Figura 8),y después de 4 meses, todos los peces gonadectomizados todavía mostraban un fenotipo saludable, y no se encontró tejido gonadal.

Las concentraciones sanguíneas de E2 en hembras (Tabla 1), medidas con ELISA siguiendo las instrucciones del fabricante, revelaron que el nivel de E2 en peces OVX es significativamente menor que en peces operados simuladamente 24 horas después de la cirugía (p < 0.00001). Después de 4 meses, el nivel de E2 en peces OVX también es significativamente más bajo que en peces operados simuladamente(p < 0.00001) y no muestra diferencias significativas en comparación con el de los peces post-OVX de 24 horas(p > 0.05). Finalmente, en parte los peces OVX, donde solo se eliminó de 1/3 a 1/2 de la gónada, muestran niveles de E2 significativamente más bajos que los peces operados simuladamente(p = 0.0437) y niveles de E2 significativamente más altos que los peces completamente OVX(p < 0.00001) (Figura 9A).

De manera similar en los machos (Tabla 1), la concentración de 11-KT en peces orquidectomía es significativamente menor que en peces operados simuladamente 24 horas después de la cirugía (p < 0.00001). El nivel de 11-KT en peces orquidectomizados después de 4 meses también es significativamente menor que en peces operados simuladamente(p < 0.00001) y no muestra diferencias en comparación con los peces post-orquidectomía de 24 horas(p > 0.05). Finalmente, los peces parcialmente orquidectomía muestran niveles significativamente más bajos de 11-KT que los peces operados simuladamente(p = 0.0428) y niveles significativamente más altos de 11-KT que los peces completamente orquidectomía(p < 0.00001) (Figura 9B).

Figure 1
Figura 1. Preparación de instrumentos. (A) Cuchilla de afeitar para gonadectomía, (B) aguja de vidrio para extracción de sangre, y (C) un tubo de plástico junto con una tapa con un orificio para la extracción de sangre. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2. Ubicación del área de la incisión. A)Dibujo del área de incisión ubicada entre las costillas, entre las aletas pélvica y anal en hembras (panel izquierdo) y machos (panel derecho); B)eliminación de gónada en hembras (panel izquierdo) y machos (panel derecho), círculos blancos que muestran la parte articular, flecha blanca que muestra el testículo y flecha negra que muestra la grasa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3. El procedimiento de sutura. 1) Se hace un agujero en el lado derecho de la incisión usando forrórceps ultrafinas. 2) El hilo de nylon se pasa a través de la piel utilizando el orificio hecho en 1. 3) Se hace un agujero en el lado izquierdo de la incisión. 4) El hilo de nylon se pasa a través del orificio hecho en 3. 5) Se hace un nudo por encima dos veces para cerrar la incisión. 6) Se corta el exceso de hilo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4. Posición del pez durante la toma de muestras de sangre (A), la instalación de una aguja de vidrio con el capilar de silicona (B). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5. El área de succión de la toma de muestras de sangre (A), la extracción de sangre (B) y los pasos de recolección de sangre (C). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6. Los peces operados simulados muestran oviposición de huevos apuntados por flecha blanca (A) y huevos fertilizados (B). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 7
Figura 7. Aspecto morfológico (A) y anatómico (B) de peces intactos y gonadectomizados. Las flechas blancas (paneles superiores) muestran la marca de la cirugía en los peces gonadectomizados. Las flechas negras (paneles inferiores) muestran gónadas en peces intactos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 8
Figura 8. Marcas de cirugía en peces machos y hembras después de 4 semanas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 9
Figura 9. Niveles sanguíneos de E2 en mujeres (A) y 11-KT en medaka japonés masculino (B), 24 horas después de una operación simulada (control), parcialmente gonadectomía o gonadectomía, y 4 meses después de la gonadectomía (OVX, ovariectomía en mujeres; Cas, orquidectomía en varones). Los análisis estadísticos se realizaron utilizando One Way ANOVA seguido de la prueba Tukey Post Hoc. Las diferentes letras (a-c) muestran diferencias significativas(p-valor< 0,05). Los datos en el gráfico se proporcionan como media + SD, n = 5. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Niveles E2 (Mujeres) Niveles 11-KT (Hombres)
Operado por simulación 4,15 ± 0,5 (n = 5) 10,38 ± 1,32 (n = 5)
Parcialmente gonadectomizado 3,37 ± 0,6 (n = 5) 8,37 ± 1,92 (n = 5)
24h post-gonadectomía 0,36 ± 0,2 (n = 5) 0,4 ± 0,2 (n = 5)
4 meses después de la gonadectomía 0,54 ± 0,28 (n = 5) 0,74 ± 0,22 (n = 5)

Tabla 1. Niveles de E2 y 11-KT (ng/mL) en hembras y machos de peces operados simuladamente y gonadectomizados y parcialmente gonadectomizados.

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Discussion

Como se informó en la literatura anterior, la gonadectomía y el muestreo de sangre se han utilizado durante mucho tiempo en otras especies modelo para investigar cuestiones relacionadas con el papel de los esteroides sexuales en la regulación del eje BPG. Sin embargo, estas técnicas parecen ser susceptibles sólo para animales más grandes. Teniendo en cuenta el pequeño tamaño del modelo de teleósto comúnmente utilizado, el medaka japonés, proporcionamos un protocolo detallado para la gonadectomía y el muestreo de sangre que es factible para esta especie.

El hecho de que la tasa de supervivencia de los peces gonadectomizados alcanzara casi el 100% indica que el procedimiento de gonadectomía es factible de aplicar en medaka. Del mismo modo, el procedimiento de muestreo de sangre no afecta la capacidad de supervivencia de los peces, como lo demuestra la tasa de supervivencia del 100% después de someterse a este procedimiento. Además, las hembras operadas simuladamente criadas junto con machos operados simuladamente muestran oviposición y huevos 100% fertilizados, lo que indica que la incisión y el procedimiento de sutura no afectan la reproducción de los peces. En otras palabras, estaban lo suficientemente sanos como para desovar. Además, los peces parcialmente gonadectomizados muestran concentraciones comparables de esteroides sexuales a los peces operados simuladamente, y la oviposición en algunas hembras, así como la fertilización de los huevos por los machos se observaron en aquellos peces parcialmente gonadectomizados. Estos resultados sugieren que el procedimiento de gonadectomía debe realizarse con alta precisión, lo que significa que los ovarios o testículos deben extirparse por completo.

Como se muestra en la Figura 8,la incisión y la marca de sutura en el pez desaparecieron por completo 4 semanas después de la gonadectomía, y los peces todavía están vivos y se ven sanos 4 meses después de la cirugía. Estos indican que el procedimiento de operación es seguro para los peces para fines a largo plazo y no afecta la vida útil de los peces. Además, después de 4 meses, no se observaron gónadas. Esto se confirma por los bajos niveles de E2 y 11-KT que siguen siendo similares a los que se encuentran en los peces gonadectomizados después de 24 horas.

Los niveles de E2 y 11-KT en peces gonadectomizados son significativamente más bajos que los peces operados simuladamente, ya después de 24 horas después de la gonadectomía y permanecen más bajos en los peces muestreados 4 meses después de la gonadectomía. Los niveles significativamente más bajos de esteroides sexuales en peces gonadectomizados en comparación con el control se han observado en estudios previos en cazón37,bagre39 y medaka48. Estas evidencias consistentes sugieren que el procedimiento de gonadectomía descrito en el protocolo es una técnica confiable para eliminar los esteroides sexuales circulantes.

Dado que este procedimiento no se basa en FADS como se demostró en40,la gonadectomía debe llevarse a cabo lo más rápido posible para prevenir la mortalidad durante la cirugía. De hecho, el uso de FADS permite mantener el ritmo de operación, ya que esta herramienta permite una condición anestésica continua a los peces a pesar de estar expuestos al aire. Sin embargo, debido a su menor viabilidad en el teleósteo pequeño como medaka, el uso de FADS no se puede realizar con ese tamaño de peces. Además, a diferencia del protocolo de gonadectomía anterior en peces más grandes que permite que la incisión ancha llegue a la gónada, el protocolo descrito en este manuscrito no permite una incisión amplia para evitar un daño excesivo a los peces pequeños. Por lo tanto, uno debe tener mucho cuidado al tratar de acceder a la gónada usando forrceps para evitar daños en otros tejidos dentro de la cavidad del cuerpo del pez.

El protocolo se basa en un procedimiento rápido y limpio. Por lo tanto, el entrenamiento es muy recomendable hasta alcanzar una alta tasa de éxito, indicada por una alta tasa de supervivencia de los peces después de la gonadectomía, así como la eliminación completa de las gónadas (ver la diferencia de apariencia morfológica y anatómica de los peces antes y después de la gonadectomía exitosa en la Figura 7). De hecho, muchos factores pueden afectar la tasa de éxito del procedimiento, incluido el período de anestesia, la amplitud de la incisión, la precisión y el orden de la sutura y el manejo de los peces durante el procedimiento. Otro punto importante es que uno debe preparar pescado sano manteniendo el pescado de manera óptima antes de realizar el protocolo.

Con respecto al procedimiento de muestreo de sangre, los estudios previos han intentado tomar muestras de la sangre de medaka48 y pez cebra49,50,51,pero el procedimiento no permite repetir el muestreo de sangre en el mismo pez ya que la sangre se toma después de la eutanasia del pez. Se ha demostrado la toma repetida de muestras de sangre utilizando pez cebra en otro estudio52,pero informamos de este tipo de protocolo por primera vez en medaka.

La evaluación de las concentraciones de esteroides sexuales se lleva a cabo comúnmente utilizando un kit de ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA), y ha habido muchos kits de ELISA disponibles comercialmente para diferentes tipos de esteroides sexuales. Debido a la baja cantidad de sangre recolectada durante el muestreo de sangre, los ensayos aguas abajo están destinados a la sangre entera. Estudios previos han demostrado que hay una diferencia en el nivel medido de los niveles circulantes de esteroides extraídos de la sangre total y el plasma53,54. Por lo tanto, la diferencia en los niveles de esteroides sexuales de la sangre total y el plasma debe validarse antes de realizar el experimento real utilizando el protocolo.

Como se documentó en estudios previos con diferentes modelos animales, el protocolo aquí descrito permitirá investigar cuestiones relacionadas con la fisiología reproductiva utilizando como modelo un teleósto de pequeño tamaño. De hecho, estas técnicas ya han contribuido a responder a preguntas relativas a la regulación del eje BPG y sus mecanismos de retroalimentación, como la implicación de kiss1 (kisspeptina gen tipo 1) que expresa las neuronas en bucles de retroalimentación positiva55,la regulación mediada por estrógenos de las neuronas que expresan kiss1 en el núcleo ventralis tuberis (NVT), y kiss2 (kisspeptina gen tipo 2) que expresa las neuronas en el área preóptica (POA)56, 57, la posible implicación del receptor de estrógenos β1 (Esr2a) en la regulación a la baja del nivel de expresión de fsh en la medakajaponesa hembra 58 así como el perfil del ritmo circadiano de E2 en peces hembra48. Además, dado que estudios previos demostraron que los esteroides sexuales también afectan la proliferación de células gonadotropas en la hipófisis de los teleóstomos59,60, es intrigante investigar los efectos del aclaramiento de esteroides sexuales después de la gonadectomía en la plasticidad pituitaria.

La técnica de muestreo de sangre no solo se puede utilizar para el análisis de esteroides sexuales, sino también para otros análisis de contenido sanguíneo, incluidos los niveles de glucosa en sangre. De hecho, el protocolo también se puede aplicar para mediciones de glucosa en sangre como se demostró en el pez cebra52 y medaka61. Por lo tanto, esta técnica puede ampliarse para abordar preguntas de investigación en otros campos de la fisiología.

Finalmente, los protocolos descritos aquí están destinados y optimizados para medaka japonés adulto, y los resultados debido al diferente tamaño de peces y materiales utilizados durante los procedimientos pueden variar. Además, como los ovarios / testículos izquierdo y derecho medaka están fusionados, lo que podría proporcionar una ventaja importante para la gonadectomía, este protocolo podría necesitar varias adaptaciones antes de ser utilizado en otras especies donde este no es el caso, como en el pez cebra. Por lo tanto, se debe tener en cuenta una optimización de acuerdo con la elección del equipo de laboratorio y el tamaño de los peces antes de probar estos protocolos.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Los autores agradecen a la Sra. Lourdes Carreon G Tan su ayuda en la cría de peces. Este trabajo fue financiado por NMBU, Grants-in-Aid de la Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia (JSPS) (número de subvención 18H04881 y 18K19323), y subvención para Proyectos de Investigación en Ciencias Básicas de la Fundación Sumitomo a S.K.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Glass capilary GD1 Glass Capillary with Filament GD-1; Narishige
Heparin sodium salt H4784-1G Sigma-aldrich
Needle puller P97 Flaming/Brown Micropipette puller Model P-97; Sutter Instrument
Nylon thread N45VL Polyamide suture, 0.2 metric; Crownjun
Plastic tube T9661 Eppendorf Safe-lock microcentifuge tube 1.5 ml, Sigma-aldrich
Razor blade - Astra Superior Platinum Double Edge Razor Blades Green, salonwholesale.com
Silicone capillary a16090800ux0403 Uxcell Silicone Tube 1 mm ID x 2 mm OD, amazon.com 
Tricaine WXBC9102V Aldrich chemistry

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References

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Biología Número 166 Gonadectomía ovariectomía orquidectomía castración medaka sangre esteroides peces reproducción plasticidad estradiol 11-cetotestosterona
Procedimientos de gonadectomía y muestreo de sangre en el modelo de teleósto de tamaño pequeño japonés Medaka (<em>Oryzias latipes</em>)
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Royan, M. R., Kanda, S., Kayo, D., Song, W., Ge, W., Weltzien, F. A., Fontaine, R. Gonadectomy and Blood Sampling Procedures in the Small Size Teleost Model Japanese Medaka (Oryzias latipes). J. Vis. Exp. (166), e62006, doi:10.3791/62006 (2020).

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