Summary
異重症性腹部マウス心臓移植モデルにおける血液回路再建の新しい技術が実証されている。
Abstract
マウスにおける異所性腹部心臓移植の外科技術は、移植免疫学の研究のための標準的なモデルである。ここでは、異所性腹部心臓移植モデルにおける修飾血液回路再構成のための確立された技術が提示される。この方法では、レシピエントの下の大静脈に対する吻鼻的なドナー心臓の肺動脈の代わりに胸部内の下静脈(IIVC)を使用する。これは、マウスの腹部心臓移植の成功率を促進し、改善しています.
Introduction
マウスにおける異所性腹部心臓移植の外科技術は、移植免疫学1、2、3の研究のための標準的なモデルを表す。しかし、実行することは非常に困難であり、これはこのモデル4、5の広範な使用に対する制限を意味します。
従来のマウス心臓移植(THTx)では、ドナー大動脈およびレシピエント腹部大動脈は、肺動脈がレシピエントの下の静脈6、7、8に吻眼されている間に吻眼される。
この改変マウス心臓移植技術において、ドナー大動脈はレシピエント腹部大動脈に吻合され、ドナーIIVCは、レシピエントの下のカバに吻合される(図2および図3)。
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Protocol
すべての動物実験は、科学的目的のために使用される動物の保護に関する欧州議会の指令2010/63/EUのガイドラインに従って行われました(倫理委員会承認、#G1071/09)。
注: 予備準備、麻酔、術後のケアおよびモニタリング作業は、従来の外科方法1、2、4で行われるのと同じです。BALB/cマウスは心臓ドナーとして、C57BL/6Jは移植レシピエントとして働いた。マウスは8〜12週齢、移植時の体重は30g〜および標準的な条件下で収容された。
1. 準備手順
- 麻酔の場合、マウスに吸入イオブルラン(2%)眠りに落ちるまで、ケタミン(100mg/kg)+キシラジン(10mg/kg)+アセプロマジン(2mg/kg)の腹腔内注射が続く。術後鎮痛の場合は、メタミゾール(200mg/kg)p.o.およびカルプロフェン(5mg/kg)s.cを適用します。
注:抗生物質の適用は、これらの物質が免疫学的応答に影響を与える可能性があるため、意図的に棄権した。 - 手術には、マイクロシザー、マイクロ鉗子、針ホルダー、マイクロ止血クランプなどの顕微鏡器具を使用してください。電気外科用ペンも必要です。7/0er、10/0er、4/0erナイロンタイプを使用して縫合を行います。
- イオブルラン吸入用のボックスにマウスを置く(2%)40〜60秒間。ピンセットで足を絞って麻酔の深さを決定します。この刺激に対する応答が完全に不足している場合は、次のステップに進みます。
- マウスが眠りに落ちたら、マウスの重量を量る。
- 麻酔薬にケタミン(100mg/kg)+キシラジン(10mg/kg)+アセプロマジン(2mg/kg)の腹腔内注射を適用します。
- 腹部の毛皮をクリップし、操作テーブルの上にマウスを置きます。ポビドネヨウ化物を使用して3回消毒を行い、フェネレートされた外科タオルを使用してマウスを適切にドレープする。
2. ドナーの操作手順
- はさみを使って首から下腹部まで皮膚を切り取り、両腋窩の中線まで皮膚の完全な層を剥がします。
- はさみを使って腹壁の筋肉を切り、内臓を左にそっと動かします(オペレーターの視界から)。内臓を生理食前のインビドガーゼで包み込み、下の大静脈を安全に露出させます。
- 1 mL の注射器を使用して、0.4 mL のヘパリン溶液 (500 U ヘパリンを含む) を下の大静脈にゆっくりと注入し、針を引き抜く前に 1 分間待ちます。
- 針を引き出し、マイクロハサミを使用して、下の大動脈と腹部大動脈の両方を切断して排泄を促進します。
- はさみを使用して、U字型のカットを行うことによって胸腔を開きます。完全に心臓、肺とすべての胸の血管を露出します。
- 胸部大動脈を露出し、内腔の1/2を切断し、その後、灌漑と排水を容易にするために肺静脈を切断します。
- 乾性大動脈の開口部に灌漑チューブを挿入し、肺静脈流出が完全にクリアされ、心臓の鼓動が完全に停止するまで、4°C冷たいヒスチジン-トリプトファン-ケトグルタル酸心プレジア溶液(Custodiol HTK溶液)9 の少なくとも2 mLを注入する。
- 灌漑チューブを引き出し、胸骨を取り外します。
- 胸腺を取り除き、大動脈弓の周りの脂肪をわずかに取り除くためにマイクロハサミを使用してください。
- 直線および湾曲した鉗子を使用して、10/0縫合糸で動脈プルモナリス(大動脈弓の右側)の幹を露出させ、リゲートします。
- IIVCに取り付けられた脂肪と結合組織を分離するためにマイクロ鉗子を使用し、7/0縫合糸で優れた静脈(大動脈アーチの左側)を露出させ、ライゲーションの背後でカットするためにマイクロハサミを使用します。
- 大動脈弓、IIVC、および両方の耳の下の心臓の基部の周りに7/0縫合を作ります。次に、肺動脈の枝と静脈肺の血管をリゲートします。
- マイクロハサミを使用して大動脈弓を可能な限り遠位に、合字の下の肺血管と横隔膜近くのIIVCをトランセクトします。胸から心臓を取り出します。
- 4 °Cの冷たいHTK心筋プレギア溶液に植えられたドナーの心臓を置き、一時的に保存します。
3. 受信者の操作手順
注:最初の操作手順は、麻酔や消毒を含むドナーマウスに対して以前に示されたものと同様です。
- 腹部の皮膚を横方向に切り取り、生理液を用いて濡れたガーゼで腹部の器官を覆う。
- 微小鉗子を使用して、下の大静脈と腹部大動脈を露出させ、周囲の脂肪組織からそれらを解放する。
- マイクロ鉗子を使用して、腎血管の下(側面または静脈/大負の下)側枝血管をリゲートまたはエレクトロカテーズします。
- クリップアプリケーター鉗子を使用して、右から来る静脈/大動脈の腹部に2つのマイクロ止血クランプを配置し、両方の大動脈/静脈の距離を1cm以上残し、その間に吻合の構築のためのスペースを確保します。
- マイクロハサミを使用して、大オータへの切開を上部クランプよりも低いクランプに少し近くします。あるいは、30Gの針を使って小さな穴を開け、マイクロハサミで開きます。
- 大介が反対側の静脈を持つオペレータに向かるように、受取人のマウスを置きます。その後、腹腔に心臓を配置し、小さなぬれたガーゼパッドでそれをカバーします。
- 10/0縫合糸を使用して、ドナー大仏を受け知り受取人大オルタに適応させ、縫い合わせ、結び目を作り、切開の上部(約4〜5針)に縫合を進めます。次に、(被写体の視界から)心臓を右にひっくり返し、もう一度カバーし、尾端に達するまで左側の縫合糸を続けて結び付けます。
- 灌漑チューブを使用して、少なくとも0.5 mLの4°C HTK心プレギア溶液を注入し、ドナーのIIVCを洗い流します。
- マイクロハサミを使用して、ドナーIIVCルーメンの同じサイズを持つはずのレシピエントの腹部下の大静脈に丸い穴を切断します。切開は大動脈性解剖学的開口部の上に配置する必要があります。静脈切開を大動脈切開よりも大きくする。
- 10/0縫合糸を使用して、ドナーIIVCをレシピエント・カバに縫い付けます。結び目を結び、切開の上部に達するまで縫合を実行します。5針を使用し、左側の縫合糸を続けます。最後に、尾角で結び目を結び、慎重に締めます(引っ張りすぎないように注意してください)。
- 血帯性スポンジの小さな部分を静脈と大動脈性の大動脈の周りに置きます。
- クリップアプリケーター鉗子を使用して、最初に下部を取り除き、次に上部のマイクロヘモースタティッククランプを取り除き、38.0°Cの焼戻し0.9%塩化ナトリウムで腹腔をすすきます。
- マイクロ鉗子を使用して、止血スポンジを取り除く。
- 移植された心臓の鼓動を観察する。
- 鉗子を使用して腸を腹腔に戻し、2層縫合(腹筋に続いて皮膚)を使用して腹部の創傷を4/0縫合で閉じます。
- マウスを酸素および温度制御ワークステーションチャンバー(例えば、INVIVO2-400)に入れて、移植されたマウスが回復するための温かい酸素リッチな環境を提供し、マウスが目を覚ますのを待つ。
- 術後鎮痛の場合は、術後に直接Metamizolを与える 200 mg/kg / os あたり.手術後4時間と16時間は、metamizolに200mg / kgのos+ Carprofen(5mg/kg)s.cを与える。さらにフォローアップでは、手術後3日間連続して24時間ごとに移植されたマウスにカルプロフェン(5mg/kg.c)を与える。
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Representative Results
ここでは、これまで研究室で開発され、過去16年間に有用であることが証明されているマウスにおける異所性腹部心臓移植の改変技術が提示される。以前は、静脈からカバ(V-V群)に対する静脈カバの40例の全体的な40例において、従来の肺動脈からカバ(P-V群)の吻合手順4(表1)に比べて、V-V群では20.8±1.3分を要することが報告されていた。 これはP-V群(27.5±1.3分、p<0.01)よりも有意に短かった。 温かい虚血時間、総レシピエント手術時間、術後心臓繰り返し時間(25.5±1.2分、42.0±1.5分、1.1±0.2分)も、従来のP-V群で観察されたよりも有意に短縮された(<図1)。このモデル10,11では長年の生存率に違いはないが、改変技術はマウスにおける腹部心臓移植を促進し、暖かい虚血と移植された心臓の拍動時間の両方を生じた。
これらの以前に公開されたデータと過去16年以内のこのモデルの経験に関して、主要な操作手順は、成功率を保証するために限られた時間を取ることを推奨>。したがって、ドナー心臓の収穫が60分以下で、冷たい虚血時間が最大で40分に制限されるべきであり、IIVCの吻合の構築は、直接的に低下した暖かい虚血時間に直接関連しているので、15分以上かかるべき場合に最適な結果が得られる。
図 1.2つの操作テクニック(n =40、平均+SE)の間のプロシージャ時間の比較は、この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 2.従来の(a、左上)および修飾されたマウス(b、左下)マウス心臓移植モデルを用いたドナー心臓製剤。 パネルaとbの写真は、大動脈(A)、肺動脈(PA)、右心房(RA)、左心房(LA)およびドナー心臓の胸部下静脈(IIVC)を示しています。IIVCと比較して、PAの船舶長の差に注意してください。パネルcは、異所性腹部HTXのために準備されたレシピエント腹座を示す。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 3.改変モデルの血管吻合: 大動脈(A)、胸部内下大静脈(IIVC)、腹部下静脈(aivc)、腹部大動脈(aa)。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 4.肺動脈(PA)および胸部下静脈(IIVC)の血管長の実証。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 5.胸部内部の下の大静脈の端にある生理的トランペットの形状。 大オルタ(A)、胸部内下大静脈(IIVC)、右心房(RA)、左心房(LA)。左の赤い二重矢印は、直径をハイライトし、右の赤い円はトランペットの形の構造を強調します。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| ヴェナカヴァとヴェナカバ(新しい方法) | 肺Aから静脈(伝統的な方法) | |
| ドナー調達(分) | 12.8 + 0.3 | 11.4 + 0.4 |
| 受信者の操作 (分) | 42.0 + 1.5 | 48.6 + 1.4** |
| 血管吻当 (分) | 20.8 + 1.3 | 27.5 + 1.3** |
| 冷たい虚血(分) | 32.8 + 0.6 | 34.2 + 0.7 |
| 温かい虚血(分) | 25.5 + 1.2 | 32.6 + 1.3** |
| リビートポストオペレーション(分) | 1.1 + 0.2 | 2.1 + 0.4* |
| 成功率 | 92.50% | 90.00% |
| *P < 0.05 | ||
| **P < 0.01. |
表 1.2つの操作における時間分布と初期結果の比較(n - 40、平均+ SE)
マウス心臓移植モデルにおける血液回路再建のための新しい技術であるWu,K.,張,J.,Fu,J.,呉,S,フィリップ,T.,ウーウェ,H.,クリベン,A.とウィツケ,マウス心臓移植モデルにおける血液回路再建のための新しい技術を復刻。マイクロサージェリー。26, 594-598 (2006).
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Discussion
マウスにおける異所性腹部心臓移植の外科技術は非常に困難であり、これはこのモデルの広範な使用に対する制限を意味する。
従来の技術の欠点の1つは、ドナーの肺動脈(PA)の制限長である。通常は約2mmの長さですが、私たちのモデルで使用されるドナー心臓のIIVCの長さは一般的に約1cmです(図2)。つまり、改変モデルにおいて、IIVC吻合は、手術場座のより明確な視力を提供し、解剖学会の改善された手術を可能にし、あまりにも厳格な縫合糸または血管の損傷の損傷の望ましくない発達を防ぐ(図4)。PAの構造およびIIVCの吻合は経験豊富なオペレータにとっても挑戦的である。PAは非常に繊細で薄い壁であり、IIVCはさらに薄く、潜在的にマウスでより脆弱です。したがって、オペレーターはこの制約を認識する必要があり、IIVC を縫合する際には注意を払う必要があります。しかし、この時点で、IIVC血管壁は非常に薄いが、血管の長さが血管接続への張力と関連付けられていないという大きな利点を有し、それによって正確な縫合の適用が容易になり、損傷を受けにくくすることを強調することが重要である。船の縫合線の慎重で安全な適用は成功した操作の結果のために非常に重要であるので、10から20倍の座の拡大が推薦される。
また、IIVCの胸部セグメントの結末は、典型的なトランペット形の構造を形成する(図5)。その大きい開口の直径はIIVCが選ばれる重大で有益な理由の1つを表す。その使用は、十分な吻当の適用を容易にする。これにより、操作の難易度と操作時間の両方が軽減されます。
移植手順の結果を損なう可能性のある事象は、しばしば狭窄によって促進される血管吻合の血栓症を表す。我々のモデルでは、船の長さはわざと増加するが、これは血栓の形成と関連していなかった。IIVCのトランペット形吻合は、解剖学的狭窄の発生を大幅に減少させながらもプラスの効果を発揮し得る。従って、この手順では移植後ヘパリン化は必要ない。
IVC-aivc 吻当法の以前の分析は、従来の技術10と比較した場合にいくつかの利点と改善を明らかにした。これらの結果に関して、そして我々の長年の経験4、10、12、13の回顧的な観点から、この技術は、移植された心臓の減少した暖かい虚血および拍動時間の両方をもたらす。このモデル10の長年の生存率に違いはありませんが、ここで提示される修飾技術は、マウスにおける腹部心臓移植の難しさを減らす解剖学的血管再建を促進しています。したがって、このモデルのトレーニングと応用は、免疫学的および心臓研究の目的のためにマウスにおける腹部心臓移植のアクセシビリティおよび広範な適用を改善する可能性がある。
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Disclosures
何一つ。
Acknowledgments
声優としての彼女の助け、ビデオ編集の助けを借りて建華ペン博士、そしてアニカ・クッカン博士のコメントとサポートに感謝します。この研究は、ドイツ研究財団(DFG)が国際的な協力(HO2581/4-1からAH)、中国国立科学財団(NSFC;FJ #81760291)によって支援されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 30G-needles | Braun | 456300 | |
| acepromazine | CP Pharma | Tranquisol P | |
| BALB/c AnNCrl mice | Charles River. Germany | no catalog number | |
| Bepanthen eye ointment | Haus-Apotheke | PZN 01578675 | |
| Bonn Micro Forceps | FST | 11083-07 | |
| Box for insulation and oxygen supply device | RUSKINN | INVIV | |
| C57BL/6J mice | Charles River. Germany | no catalog number | |
| Carprofen | Zoetis | Rimadyl 50 mg/ml | |
| CATHETER-FEP 26G | TERUMO | Surflo-W | |
| Clip Applicator Forceps Style | FST | 18057-14 | |
| Curved forceps | WPI | 14114-G | |
| custodiol/HTK | Dr. Franz Köhler Chemie | no catalog numer | |
| Cutasept skin disinfection | VWR | BODL980365 | |
| electrosurgical pen | Bovie | CHANGE-A-TIP | |
| gauze pads, cotton swabs | Lohmann-Rauscher | 13353 | |
| Heating mat | THERMO MAT PRO 30W | HTP-30 | |
| Hemostatic sponge | CuraSpon | J1276A | |
| heparine-solution | Haus-Apotheke | PZN 03029820 | |
| Ice box | PETZ | No Catalog Number available | |
| Inhalation anesthesia device | GROPPLER | BKGM 0616 | |
| insulation and oxygen supply device | RUSKINN | INVIV | |
| isoflurane | CP Pharma | Isofluran CP 1 ml/ml | |
| ketamine | Zoetis | no catalog numer | |
| metamizole | WDT | no catalog numer | |
| Micro scissors | FST | 15000-00,15000-10 | |
| Micro Serrefine ( Clamp ) Angled / 16 mm | FST | 18055-06 | |
| Microscope | Leica | LEICAMZ6 | |
| Microscope light | SCHOTT | KL2500LED | |
| Saline solution (NaCl 0.9%) | Haus-Apotheke | PZN 06178437 | |
| Scissors | Peha Instruments | 991083/4 | |
| small Petri dish | Sarstedt | 833900 | |
| Straight forceps | WPI | 14113-G | |
| surgical tape | BSN | 4120 | |
| Suture Tying Forceps - 10 cm | FST | 18025-10 | |
| Sutures(10-0) | Medtronic | N2540 | |
| Sutures(4-0) | ETHILON | V4940H | |
| Sutures(7-0) | ETHILON | 1647H | |
| Syringe (0.3 mL) | BD | 324826 | |
| Syringe (1 mL) | BD | 320801 | |
| xylazine | Bayer | Rompun |
References
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