Summary
Presentiamo protocolli per tre diversi metodi per l'omogeneizzazione di quattro diversi gruppi muscolari di tessuto muscolare scheletrico di ratto per misurare e confrontare i livelli di nitrati e nitriti. Inoltre, confrontiamo diversi pesi del campione per indagare se la dimensione del campione di tessuto influisce sui risultati dell'omogeneizzazione.
Abstract
Una volta si pensava che gli ioni nitrato (NO3-) fossero prodotti finali inerti del metabolismo dell'ossido nitrico (NO). Tuttavia, studi precedenti hanno dimostrato che gli ioni nitrato possono essere riconvertiti in NO nei mammiferi attraverso un meccanismo di riduzione in due fasi: il nitrato viene ridotto a nitrito (NO2-) principalmente dai batteri commensali orali, quindi il nitrito viene ridotto a NO da diversi meccanismi, tra cui proteine contenenti eme o molibdeno. Questa via riduttiva dei nitrati contribuisce a migliorare le vie di segnalazione NO-mediate, in particolare nel sistema cardiovascolare e durante l'esercizio muscolare. I livelli di nitrato nell'organismo prima di tale utilizzo sono determinati da due diverse fonti: l'ossidazione endogena di NO e l'assunzione di nitrati nella dieta, principalmente dalle piante. Per chiarire il complesso ciclo dell'NO in circostanze fisiologiche, abbiamo esaminato ulteriormente la dinamica dei suoi metaboliti, nitrati e ioni nitriti, che sono relativamente stabili rispetto a NO. In studi precedenti il muscolo scheletrico è stato identificato come un importante organo di stoccaggio per gli ioni nitrato nei mammiferi, nonché una fonte diretta di NO durante l'esercizio. Pertanto, stabilire una metodologia affidabile per misurare i livelli di nitrati e nitriti nel muscolo scheletrico è importante e dovrebbe essere utile per estenderne l'applicazione ad altri campioni di tessuto. Questo articolo spiega in dettaglio la preparazione di campioni di muscolo scheletrico, utilizzando tre diversi metodi di omogeneizzazione, per misure di nitrati e nitriti e discute importanti questioni relative ai processi di omogeneizzazione, compresa la dimensione dei campioni. Le concentrazioni di nitrati e nitriti sono state confrontate anche in quattro diversi gruppi muscolari.
Introduction
L'ossido nitrico (NO), una piccola molecola di segnalazione gassosa, svolge un ruolo critico nei processi fisiologici e fisiopatologici1. L'NO può essere prodotto dalla L-arginina da enzimi endogeni della famiglia delle ossidi nitrici sintasi (NOS) prima di subire una rapida ossidazione a nitrato (NO 3-) e, possibilmente, nitrito (NO 2-) nel sangue e nei tessuti 2,3. Recentemente, questi anioni hanno dimostrato di essere ridotti a NO nei sistemi di mammiferi4. Il nitrato viene convertito in nitrito, principalmente dalle nitrati reduttasi batteriche commensali nella cavità orale che agiscono sugli ioni secreti dalle ghiandole salivari e ingeriti direttamente 5 e, in una certa misura, dagli enzimi dei mammiferi come la xantina ossidoreduttasi 6,7. Il nitrito può essere ulteriormente ridotto a NO da diversi meccanismi tra cui la deossiemoglobina8, la desossimioglobina9, gli enzimi contenenti molibdeno 10 e la riduzione non enzimatica in presenza di protoni11,12.
Questa via nitrato-nitrito-NO è migliorata in condizioni ipossiche in cui l'attività NOS è diminuita perché NOS richiede ossigeno per la generazione di NO4. Molti studi recenti hanno riportato effetti benefici del nitrato alimentare sulla regolazione della pressione sanguigna e sulle prestazioni fisiche, suggerendo che i percorsi di riduzione dei nitrati contribuiscono all'aumento della segnalazione NO13,14,15. Studi precedenti hanno dimostrato che alcuni muscoli scheletrici sono probabilmente i principali luoghi di stoccaggio dei nitrati nel corpo16. Rispetto al sangue o ad altri organi interni come il fegato, il muscolo scheletrico (gluteus maximus) contiene livelli significativamente più elevati di nitrato e ha una massa sostanziale nel corpo dei mammiferi. L'esercizio del tapis roulant ha dimostrato di migliorare la riduzione dei nitrati a nitriti e a NO nei glutei in un modello di ratto7. Questi risultati implicano che alcuni muscoli scheletrici potrebbero essere importanti fonti di NO attraverso percorsi di riduzione dei nitrati in situazioni fisiologiche. Studi più recenti suggeriscono che questi risultati, compresi i cambiamenti nei livelli di nitrati muscolari durante l'esercizio, si verificano anche negli esseri umani17.
Due degli attuali autori avevano precedentemente stabilito un metodo per misurare i livelli di nitrati e nitriti nel sangue e in altri campioni liquidi18. Tuttavia, quando i livelli di questi anioni negli omogenati tissutali sono stati inizialmente analizzati, non erano disponibili protocolli dettagliati. Per comprendere le dinamiche nitrati-nitriti-NO in diversi organi, il nostro obiettivo era quello di sviluppare un metodo accurato ed efficiente per misurare i livelli di nitrati e nitriti nei tessuti dei mammiferi, incluso il muscolo scheletrico. In studi precedenti, i tessuti dei roditori sono stati utilizzati per sviluppare processi di omogeneizzazione affidabili e quindi analizzare il contenuto di nitrati e nitriti in quegli omogenati 7,16,19. L'uso di questo metodo di omogeneizzazione è stato esteso ai campioni di biopsia del muscolo scheletrico umano, per cui i valori sono stati confermati e, soprattutto, i valori osservati per il muscolo rispetto al sangue / plasma erano in intervalli e rapporti simili a quelli osservati nei roditori17. Negli ultimi anni, anche altri gruppi hanno iniziato a misurare i livelli di nitrati e nitriti negli omogenati muscolari scheletrici, riportando valori comparabili a quelli riportati dal nostro gruppo20,21.
Lo scopo di questo documento protocollare è quello di descrivere in dettaglio la preparazione di omogenati muscolari scheletrici utilizzando tre diversi metodi di omogeneizzazione per la successiva misurazione dei livelli di nitrati e nitriti. Inoltre, sono stati esaminati gli effetti del peso tissutale utilizzato per l'omogeneizzazione sui valori di nitrati e nitriti nei campioni di muscolo scheletrico. Crediamo che questi metodi possano essere facilmente applicati ad altri tipi di tessuti di mammiferi. Recentemente, soprattutto nel campo della fisiologia dell'esercizio, è stata prestata attenzione alle possibili differenze nella fisiologia nitrati/nitriti/NO in base ai gruppi muscolari. Riportiamo anche le quantità di nitrati e nitriti in quattro diversi muscoli dei roditori e troviamo una distribuzione non uniforme di entrambi gli ioni tra questi diversi muscoli; un'osservazione che richiede ulteriori studi.
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Protocol
Il protocollo sugli animali è stato approvato dal NIDDK Animal Care and Use Committee (ASP K049-MMB-20). Gli animali sono stati trattati secondo l'attuale Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio disponibile gratuitamente sul sito web AAALAC.
1. Raccolta del muscolo scheletrico del ratto
- Mentre un ratto è in anestesia profonda (isoflurano al 5%, confermato dalla reazione assente al pizzico della coda/gamba), iniziare la perfusione con soluzione salina contenente eparina posizionando un ago da 19 G in un apice del ventricolo sinistro e facendo un nick sull'atrio destro. Lasciare penetrare la soluzione salina con eparina attraverso gli organi interni fino a quando almeno 1,5 litri / kg sono fluiti attraverso il tessuto. A questo punto, gli animali sono morti per dissanguamento e le carcasse sono pronte per essere lavorate per la raccolta dei campioni.
NOTA: Ottenere una buona perfusione è fondamentale, soprattutto per misurazioni accurate del nitrito, perché il nitrito viene ossidato in nitrato da qualsiasi emoglobina residua. - Identificare i tessuti muscolari bersaglio e asportarli dalle zampe posteriori22 utilizzando strumenti chirurgici puliti. Rimuovere quanto più grasso e tessuti connettivi dai tessuti muscolari possibile.
- Posizionare la quantità desiderata di muscolo in un tubo di microcentrifuga e quindi posizionare su ghiaccio secco. Conservare le provette piene di fazzoletto di carta nel congelatore a -80 °C.
NOTA: In caso di campioni di biopsia umana, asciugarli accuratamente immediatamente dopo la raccolta con una garza pulita per rimuovere il sangue in eccesso.
2. Preparazione per l'omogeneizzazione
- Preparazione della soluzione che preserva i nitriti (soluzione di arresto)
- Preparare una soluzione gialla limpida contenente 890 mM di ferricianuro di potassio (K3Fe(CN)6) e 118 mM NEM (N-etilmaleimide) in acqua distillata, assicurandosi che non si formino cristalli. Aggiungere tensioattivi non ionici (detergente) in rapporto 1:9 (v/v, tabella dei materiali) e mescolare delicatamente per evitare la formazione di schiuma.
- Diluire la soluzione di arresto in un rapporto 1:9 con acqua distillata. Posizionare la soluzione di arresto diluita (rapporto 1:5 tra tessuto muscolare e soluzione di arresto diluita) nel tubo di omogeneizzazione.
NOTA: Venti milligrammi di tessuto richiederanno 100 μL di soluzione di arresto e 200 mg di tessuto richiederanno 1000 μL di soluzione di arresto nel tubo. La presenza di detergente nella soluzione aggiunta è fondamentale per la rottura delle membrane cellulari. È possibile utilizzare qualsiasi detergente non ionico, ma è necessario prestare attenzione per verificare che non interferisca con il metodo di chemiluminescenza.
- Preparazione dei tessuti
- Estrarre il fazzoletto dal congelatore a -80 °C e scongelarlo lentamente nel ghiaccio. Rimuovere il grasso rimanente e il tessuto connettivo dal muscolo scheletrico. Tagliare pezzi di muscolo scheletrico e asciugare su una garza per asciugare.
- Pesare la quantità di tessuto (20, 50 e 200 mg). Posizionare il muscolo scheletrico prepesato nella soluzione di arresto nei tubi di omogeneizzazione o posizionare il tessuto prepesato in una provetta di microcentrifuga pulita per un uso successivo.
3. Omogeneizzazione
- Omogeneizzatore rotativo (Figura 1)
- Inserire nella macchina il tubo di tipo M contenente il muscolo scheletrico prepesato e la soluzione di arresto premisurata. Omogeneizzare ogni campione due volte (impostando il ciclo di omogeneizzazione più distruttivo) e posizionare il tubo sul ghiaccio immediatamente dopo ogni omogeneizzazione per 5 minuti per raffreddare.
- Centrifugare brevemente a 2.000 × g e 4 °C per 5 min. Rimettere il tubo pieno sul ghiaccio e aggiungere il volume appropriato di metanolo (≥ 99,9%, 10x del peso del tessuto). Vortice accuratamente per 15 s.
NOTA: Per 20 mg di tessuto, utilizzare 200 μL di metanolo. Il metanolo viene utilizzato per precipitare le proteine dall'omogenato tissutale e non interferisce con il metodo di chemiluminescenza. Se viene utilizzato un altro metodo di precipitazione proteica, verificarne la compatibilità con la chemiluminescenza. - Omogeneizzare ancora una volta e incubare su ghiaccio per 30 minuti. Centrifugare i campioni per 35 minuti a 4 °C e 3.500 × g. Aspirare il surnatante e misurare i livelli di nitriti/nitrati o conservare a -80 °C per un uso successivo.
- Omogeneizzatore di perline (Figura 2)
- Porre il tessuto muscolare scheletrico in un tubo contenente perline (rapporto 1:5 per la soluzione di arresto diluito del tessuto) e omogeneizzare due volte per 45 s alla massima velocità disponibile sullo strumento utilizzato. Posizionare il tubo sul ghiaccio immediatamente dopo ogni omogeneizzazione per 5 minuti per raffreddare.
- Centrifugare brevemente utilizzando una piccola centrifuga da tavolo (2.000 x g) per 5 secondi. Rimettere il tubo sul ghiaccio e aggiungere un volume appropriato di metanolo (purezza ≥ 99,9%, 10x del peso del tessuto). Vortice accuratamente per 15 s.
NOTA 1: Per 20 mg di tessuto, utilizzare 200 μL di metanolo.
NOTA 2: Il metanolo viene utilizzato per precipitare le proteine dall'omogenato tissutale e non interferisce con il metodo della chemiluminescenza. Se viene utilizzato un altro metodo di precipitazione proteica, verificarne la compatibilità con la chemiluminescenza. - Omogeneizzare ancora una volta per 45 s alla massima velocità disponibile sullo strumento utilizzato. Incubare su ghiaccio per 30 min. Centrifugare a 17.000 x g, 4 °C, 30 min. Aspirare il surnatante e misurare i livelli di nitriti/nitrati o conservare a -80 °C per un uso successivo.
- Polverizzatore (Figura 3)
- Preparare provette contenenti soluzione di arresto diluita (5x del peso del tessuto) e pesarle. Registrare il peso (tubo + soluzione di arresto).
- Posizionare lo strumento polverizzatore di azoto liquido su ghiaccio secco e attendere circa 30 minuti affinché raggiunga la temperatura desiderata.
- Utilizzando una pinzetta raffreddata in azoto liquido, trasferire un campione (peso del tessuto già misurato) al polverizzatore. Aggiungere un cucchiaino di azoto liquido per assicurarsi che il tessuto sia alla temperatura dell'azoto liquido.
- Dopo che il 95% dell'azoto liquido si è vaporizzato, posizionare lo strumento di frantumazione sopra il tessuto e premere con fermezza. Dovresti sentire la schiacciata del campione. Usando il mazzuolo, colpire lo strumento di frantumazione 3-5x.
- Controllare il campione per eventuali pezzi rimanenti usando un cucchiaio raffreddato in azoto liquido. Dopo il raffreddamento in azoto liquido, utilizzare un pezzo di carta velina per rimuovere l'acqua congelata prima di toccare il tessuto. Se è presente un pezzo, spostalo al centro e poi colpisci altre 5-6 volte con il mazzuolo.
- Quando l'intero campione è stato polverizzato, utilizzare il cucchiaio liquido raffreddato ad azoto per trasferire direttamente il tessuto frantumato nel tubo prepesato contenente la soluzione di arresto diluita (fase 3.3.1). Assicurati di eseguire rapidamente questo passaggio poiché quando il muscolo scheletrico schiacciato si riscalda, diventa appiccicoso e difficile da trasferire.
- Vortice per 15 s. Controllare che nessun tessuto sia bloccato nella parte superiore del tubo aprendo il tubo. Se c'è, prova a spostarlo e poi vortice di nuovo.
- Centrifugare il campione per 2-3 s utilizzando una piccola centrifuga desktop. Pesare di nuovo il tubo. Calcolare il peso del tessuto deducendo il peso originale del tubo (fase 3.3.1) da questo nuovo peso. Posizionare il tubo sul ghiaccio.
NOTA: I pesi esatti aiuteranno a determinare il peso esatto del tessuto e la quantità di tessuto persa durante la polverizzazione. - Una volta che tutti i campioni sono stati trattati fino alla fase 3.3.8, aggiungere un volume appropriato di metanolo (≥ 99,9 %, 10 volte il peso del tessuto). Vortice accuratamente per 15 s e incubare su ghiaccio per 30 minuti.
NOTA: Per 20 mg di tessuto, utilizzare 200 μL di metanolo. Il metanolo viene utilizzato per precipitare le proteine dall'omogenato tissutale e non interferisce con il metodo di chemiluminescenza. Se viene utilizzato un altro metodo di precipitazione proteica, verificarne la compatibilità con la chemiluminescenza. - Centrifugare a 17.000 × g, 4 °C, 30 min. Aspirare il surnatante e misurare i livelli di nitriti/nitrati o conservare a -80 °C per un uso successivo.
4. Misurazione di nitriti/nitrati con analizzatore di ossido nitrico (NOA)
- Preparare tutti i campioni con uno dei tre diversi metodi di omogeneizzazione sopra descritti e iniettarli in un NOA per la misurazione di nitrati e nitriti.
NOTA: I protocolli dettagliati per l'uso di NOA sono stati pubblicati in precedenza19.
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Representative Results
Per ottenere risultati rappresentativi, sono stati utilizzati tessuti muscolari scheletrici di 8 ratti Wistar (maschi e femmine, peso 250 ± 50 g). Gli omogenati del muscolo scheletrico del ratto (50 mg di muscolo gluteo massimo per ciascun metodo) sono stati preparati da tre diversi strumenti di omogeneizzazione (omogeneizzatore rotante, omogeneizzatore di perline e polverizzatore). Il contenuto di nitrati e nitriti di questi omogenati è stato quindi determinato utilizzando un analizzatore di ossido nitrico (NOA) (Figura 4). I livelli di nitrati (Figura 4A) in questi tre campioni omogenati erano molto simili tra loro, compresi tra 39,6 e 45,2 nmol/g.
È interessante notare che i livelli di nitriti (Figura 4B) in un campione omogenato preparato da un polverizzatore hanno mostrato il valore più alto (0,99 ± 0,15 nmol / g), e questo era statisticamente diverso dagli altri due valori del campione. Per verificare se le dimensioni dei tessuti influenzerebbero l'efficienza di omogeneizzazione e i valori di nitrati e nitriti risultanti, sono state utilizzate tre diverse dimensioni del tessuto muscolare scheletrico (tessuto muscolare gluteo di 20, 50 e 200 mg) per l'omogeneizzazione mediante un omogeneizzatore di perline (Figura 5). Né i livelli di nitrati (Figura 5A) né quelli di nitriti (Figura 5B) erano significativamente diversi tra le dimensioni del campione muscolare. Tuttavia, concentrazioni di nitrati leggermente inferiori sono state osservate quando la dimensione del campione è stata aumentata, in più esperimenti per ragioni che non sono chiare.
Successivamente, sono stati misurati i livelli di nitrati e nitriti in diversi tipi di tessuti muscolari scheletrici delle gambe dei roditori (Figura 6). Oltre al muscolo gluteus maximus, i muscoli tibiale anteriore (TA), estensore digitorum longus (EDL) e gastrocnemio (50 mg ciascuno) sono stati isolati dalle zampe di ratto e omogeneizzati utilizzando un omogeneizzatore di perline. Sorprendentemente, i livelli di nitrati del muscolo gluteo (40,4 nmol / g) erano circa due volte superiori a quelli degli altri tre tessuti muscolari, sebbene in questo particolare esperimento queste differenze non abbiano raggiunto la significatività statistica (Figura 6A). La concentrazione di nitriti nel muscolo gluteo era anche superiore a quella degli altri tre tessuti muscolari ed era significativamente più alta di quella nel campione gastrocnemio (Figura 6B).
Abbiamo determinato il coefficiente di variazione per tutti e tre i metodi utilizzati e i risultati sono riportati nella tabella allegata. Per confronto, la tabella mostra anche i coefficienti di variazione determinati da Troutman et al21.
Figura 1: Omogeneizzatore rotativo. (A) omogeneizzatore; B) tubo contenente tessuto e soluzione di arresto. I campioni di tessuto muscolare scheletrico vengono posti in un tubo con soluzione di arresto diluita e omogeneizzati tre volte. I campioni devono essere immediatamente posti sul ghiaccio dopo ogni fase di omogeneizzazione. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Omogeneizzatore di perline. a) omogeneizzatore; (B) perle contenenti tubo. I campioni di tessuto muscolare scheletrico vengono posti in un tubo contenente perline (5 sfere di ceramica) con soluzione di arresto diluita e omogeneizzati tre volte in totale (45 s alla massima velocità per ogni volta). I campioni devono essere immediatamente posti sul ghiaccio dopo ogni fase di omogeneizzazione. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Polverizzatore. (A) parti del polverizzatore (B) corpo del polverizzatore - mortaio e pestello assemblati. (C) dettaglio dell'assemblaggio di mortai e pestelli. Le parti del polverizzatore vengono raffreddate su ghiaccio secco per 30 minuti. L'azoto liquido viene inserito nella malta e quindi viene aggiunto tessuto muscolare scheletrico pre-pesato. Dopo che il 90 percento dell'azoto liquido è sparito, la parte superiore - il pestello - viene inserita nel bacino. Il pestello viene pestato con un mazzuolo 5-6 volte fino a quando il campione è polveroso. Il tessuto in polvere viene quindi trasferito in un tubo con soluzione di arresto. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: (A) Contenuto di nitrati e (B) nitriti negli omogenati muscolari glutei preparati con tre diversi metodi di omogeneizzazione. Cinquanta milligrammi di muscolo gluteo sono stati omogeneizzati con tre diversi metodi di omogeneizzazione. Il metanolo (500 μL) è stato aggiunto agli omogenati per precipitare le proteine. Un metodo standard di chemiluminescenza con soluzione di cloruro di vanadio o tri-ioduro è stato utilizzato per misurare i livelli di nitrati e nitriti, rispettivamente, nel surnatante chiaro dopo centrifugazione; n=7 (nitrato); n=8 (nitrito); i dati sono presentati come medie ± SD, * p < 0,05 utilizzando ANOVA unidirezionale. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 5: (A) Contenuto di nitrati e (B) nitriti in diverse dimensioni del campione del muscolo gluteo. Tre diverse dimensioni di omogenati muscolari glutei sono stati preparati utilizzando un omogeneizzatore a perline. Un metodo standard di chemiluminescenza con soluzione di cloruro di vanadio o tri-ioduro è stato utilizzato per misurare i livelli di nitrati e nitriti, rispettivamente, nel surnatante chiaro dopo centrifugazione; n=7 (nitrato); n=8 (nitrito); i dati sono presentati come medie ± SD, Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 6: (A) Contenuto di nitrati e (B) nitriti in quattro diversi muscoli. Ogni muscolo (50 mg) è stato omogeneizzato utilizzando un omogeneizzatore di perline e un metodo standard di chemiluminescenza con cloruro di vanadio o soluzione di tri-ioduro è stato utilizzato per misurare rispettivamente i livelli di nitrati e nitriti; n=4-7 (nitrato); n=3-8 (nitrito); i dati sono presentati come medie ± SD, * p < 0,05 utilizzando ANOVA unidirezionale. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
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Discussion
Per monitorare i cambiamenti nei metaboliti di NO, nitrati e nitriti, in funzione degli interventi fisiologici, è imperativo misurare i livelli di questi ioni nei diversi organi che sono critici nel loro metabolismo. Poiché l'emoglobina nel sangue reagisce con NO e i suoi metaboliti, è anche importante rimuovere rapidamente il sangue dai campioni di tessuto il più possibile. Così gli animali sono stati perfusi con soluzione salina prima di raccogliere i tessuti muscolari scheletrici (glutei, TA, EDL, muscolo gastrocnemio) e il tessuto connettivo e il grasso intorno al muscolo bersaglio sono stati immediatamente rimossi. Per la soluzione di omogeneizzazione, è stata appositamente formulata una "soluzione di arresto" con ferricianuro, NEM e tensioattivo non ionico per preservare il nitrito in vari tessuti19. La presenza di detergente non ionico è fondamentale per la completa rottura delle membrane cellulari. Nel caso delle due macchine di omogeneizzazione utilizzate in questo studio, l'omogeneizzatore rotativo e l'omogeneizzatore a perline, il volume della soluzione di arresto richiesto per l'omogeneizzazione era 5 volte il peso del tessuto in modo che l'intero tessuto fosse completamente immerso nella soluzione e trattato in modo omogeneo.
Il processo di omogeneizzazione è stato eseguito tre volte in totale (due volte prima di aggiungere metanolo e un'altra volta dopo aver aggiunto metanolo per precipitare le proteine), ogni volta utilizzando un'impostazione programmata determinata dai produttori di strumenti. È importante posizionare i campioni sul ghiaccio immediatamente dopo ogni omogeneizzazione per evitare il deterioramento del campione dovuto al lieve riscaldamento, che può essere generato durante l'omogeneizzazione. Per il metodo di polverizzazione, i campioni di tessuto sono stati inizialmente frantumati in polvere mantenendoli congelati utilizzando azoto liquido, quindi i campioni sono stati miscelati con soluzione di arresto (5x peso del tessuto). In tutti e tre i metodi, il metanolo (10 volte il peso del tessuto) è stato aggiunto ai campioni e la miscela è stata incubata su ghiaccio per 30 minuti per precipitare le proteine ed estrarre completamente nitrati e nitriti dai tessuti. La presenza di proteine nel campione può causare un'eccessiva formazione di schiuma della soluzione di reazione nella camera quando si utilizza la chemiluminescenza, quindi è necessario precipitare le proteine dai campioni. È possibile utilizzare qualsiasi agente di precipitazione, ma è necessario confermare che tali agenti non interferiscono né con il metodo della chemiluminescenza né causano cambiamenti nelle concentrazioni di nitriti/nitrati reagendo con questi ioni.
I livelli di nitrati in tutti i campioni di glutei preparati con i tre metodi erano molto simili (39,6-45,2 nmol / g, Figura 4A), suggerendo che questi tre metodi di omogeneizzazione sono ugualmente applicabili alla preparazione di campioni muscolari per l'analisi dei nitrati. Sebbene i livelli di nitriti fossero leggermente più alti nei campioni preparati mediante polverizzazione rispetto agli altri due metodi (Figura 4B), tutti i valori misurati erano in un intervallo limitato (0,64-0,99 nmol / g). L'effetto delle dimensioni del campione di tessuto sui valori di nitrati e nitriti nei campioni di muscolo scheletrico è stato esaminato perché i ricercatori spesso si occupano di campioni molto piccoli, in particolare da piccoli animali o biopsie muscolari umane. Né i livelli di nitrati né quelli di nitriti erano significativamente diversi nell'intervallo da 20 a 200 mg di tessuto muscolare scheletrico in questi esperimenti (Figura 5).
Tuttavia, è interessante notare che, sebbene non statisticamente significativi, i livelli di nitrati tendono ad essere leggermente inferiori se misurati in campioni più grandi (Figura 5). Abbiamo notato questo fenomeno nel corso dei nostri studi pubblicati e inediti, ma non ne capiamo le ragioni. Pertanto, è probabilmente importante considerare i pesi del campione e idealmente mantenerli coerenti durante uno studio quando si preparano omogenati da più campioni di tessuto. Un'altra considerazione quando si lavora con campioni più piccoli (20 mg) è che il volume totale finale del campione elaborato è solo ~ 300 μL, il che riduce significativamente la possibilità di misurare lo stesso campione più volte. Tuttavia, soprattutto per gli studi sull'uomo, 20 mg è la solita dimensione accettabile per le biopsie muscolari.
Per esaminare se diversi muscoli nelle zampe di ratto avrebbero diversi contenuti di nitrati / nitriti, le concentrazioni di quegli ioni sono state confrontate in quattro diversi muscoli delle gambe (Figura 6). Sia i livelli di nitrati che di nitriti erano più alti nel muscolo gluteo rispetto ad altri tre tessuti muscolari, sebbene le differenze non abbiano raggiunto la significatività statistica in questo studio, suggerendo che il metabolismo dei nitrati in vari tipi muscolari può essere governato in modo diverso. Questo fenomeno è attualmente oggetto di indagine più dettagliata.
Altri gruppi di ricerca hanno anche riportato concentrazioni di nitrati del muscolo scheletrico, rivelando una significativa variabilità in tali valori. Il gruppo di Coggan ha dimostrato che i livelli di nitrati nel muscolo soleo del ratto Sprague Dawley variano da 62 a 124 nmol / g a seconda dei metodi di preparazione muscolare21. Lo stesso gruppo ha riportato valori di nitrati nel vasto laterale del ratto SD (circa 60 nmol / g) e nel soleo (circa 215 nmol / g) in un altro studio23. Ohtake et al. hanno misurato concentrazioni di nitrati nel muscolo gastrocnemio di topo di >300 nmol / g; Tuttavia, non sono stati descritti metodi precisi per la preparazione dell'omogenato muscolare24. Il gruppo di Verdijk ha riportato contenuti di nitrati nelle biopsie muscolari umane (vastus lateralis) compresi tra 54 e 80 nmol / g a seconda dell'età del partecipantedi 20 anni; in uno studio simile, Wylie et al. riportano 226 nmol / g per lo stesso gruppo muscolare17. Questi risultati suggeriscono che le concentrazioni di nitrati / nitriti nei campioni di muscoli scheletrici riflettono molti fattori - fisiologici (ad esempio, lo stato di esercizio), ambientali (ad esempio, dieta) e tecnici (dettagli del test) - che presumibilmente contribuiscono alla variabilità della misurazione.
Abbiamo determinato il coefficiente di variabilità (CV) per tutti e tre i metodi qui presentati - vedi file supplementare allegato. Anche se i CV sono tutt'altro che ideali e variano tra i metodi utilizzati, i nostri valori CV sono comparabili con quelli pubblicati da Troutman et al. 21 utilizzando metodi simili con un diverso trattamento dei campioni. Sfortunatamente, non esiste ancora una spiegazione chiara del perché persista una variabilità così elevata; Questo documento è l'unico protocollo dettagliato pubblicato che conosciamo per l'elaborazione di campioni muscolari per la determinazione di nitrati e nitriti.
Abbiamo anche misurato la linearità e il grado di recupero dei nitrati da campioni di muscolo a punta di nitrato (vedi file supplementare allegato). Quando abbiamo aggiunto tre diverse concentrazioni di nitrato nei campioni di glutei per l'omogeneizzazione, abbiamo ottenuto una buona risposta lineare in aumento delle concentrazioni di nitrati con ~ 80% di recupero del nitrato aggiunto sia per gli omogeneizzatori a perline che rotanti. Questi risultati dimostrano che entrambi i metodi di omogeneizzazione possono essere utilizzati per determinare con buona sicurezza i livelli di nitrati e nitriti nei campioni biologici. La perdita del 20% di nitrato aggiunto sta probabilmente avvenendo durante la deproteinizzazione e la centrifugazione dell'omogenato del tessuto muscolare quando alcuni ioni potrebbero co-precipitare con proteine cariche o altre parti cellulari.
In generale, speriamo che il nostro metodo proposto di preparazione del campione muscolare per le misurazioni di nitrati e nitriti si riveli utile non solo nel campo della ricerca sull'esercizio, ma anche negli studi clinici. Ci sono disturbi neuromuscolari e / o metabolici che colpiscono grandi popolazioni che potrebbero essere correlati al malfunzionamento del ciclo dell'ossido nitrico e potrebbero beneficiare dell'apporto di nitrati. Tuttavia, bisogna prima stabilire se la carenza di NO, in effetti, esiste e se può essere corretta con un intervento dietetico. Ci auguriamo che il metodo qui descritto consenta di monitorare il destino dei nitrati e di altri metaboliti del ciclo dell'NO nel muscolo scheletrico e in altri organi.
Siamo consapevoli che, a questo punto del suo sviluppo, i metodi di preparazione del muscolo scheletrico per le misurazioni di nitrati e nitriti utilizzando la chemiluminescenza (la più quantitativa di tutte le determinazioni degli ossidi di azoto stessi) hanno ancora variabili sconosciute, alcune delle quali sono discusse sopra. Tuttavia, anche con i suoi limiti, i metodi descritti consentono un confronto ragionevolmente accurato dei livelli di nitrati/nitriti di diversi organi, compresi diversi muscoli scheletrici, e dovrebbero consentire la formulazione di ipotesi che possono essere poi testate con ragionevole accuratezza.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse. Alan N. Schechter è elencato come co-inventore di diversi brevetti rilasciati al National Institutes of Health per l'uso di sali di nitriti per il trattamento delle malattie cardiovascolari. Riceve royalties basate sulla licenza NIH di questi brevetti per lo sviluppo clinico, ma nessun altro compenso. Queste disposizioni non influiscono sulla sua aderenza alle politiche della rivista JoVE.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato dalla sovvenzione intramurale NIH / NIDDK ZIA DK 0251041-14 AD Alan N Schechter, MD.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| gentleMACS dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| gentle MACS M tube | Miltenyi Biotec | 130-093-236 | Length: 87 mm; Diameter: 30 mm |
| Heparin Sodium | Hospira | NDC-0409-7620-13 | |
| Isoflurane | Baxter | NDC-10019-360-60 | |
| Methanol | Sigma | 646377 | |
| Minilys bead homogenizer | Bertin Instruments | P000673-MLYS0-A | |
| NEM; N-ethylmaleimide | Sigma | 4260 | |
| Nitric Oxide analyzer | GE | Sievers NOA 280i | |
| NP-40; 4-Nonylphenylpolyethylene glycol | Sigma | 74385 | |
| Potassium ferricyanide; K3Fe(CN)6 | Sigma | 702587 | |
| Precellys lysing kit | Bertin Instruments | P000911-LYSK0-A | contains 2 mL tubes with 2.8 mm ceramic (zirconium oxide) beads for homogenization |
| Pulverizer kit | Cellcrusher | Cellcrusher kit |
References
- Ignarro, L. J. Nitric oxide as a unique signaling molecule in the vascular system: a historical overview. Journal of Physiology and Pharmacology. 53 (4), Pt 1 503-514 (2002).
- Moncada, S., Higgs, A.
- Thomas, D. D., Liu, X., Kantrow, S. P., Lancaster, J. R. The biological lifetime of nitric oxide: implications for the perivascular dynamics of NO and O2. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (1), 355-360 (2001).
- Lundberg, J. O., Weitzberg, E., Gladwin, M. T. The nitrate-nitrite-nitric oxide pathway in physiology and therapeutics. Nature Reviews Drug Discovery. 7 (2), 156-167 (2008).
- Govoni, M., Jansson, E. A., Weitzberg, E., Lundberg, J. O. The increase in plasma nitrite after a dietary nitrate load is markedly attenuated by an antibacterial mouthwash. Nitric Oxide. 19 (4), 333-337 (2008).
- Jansson, E. A., et al. A mammalian functional nitrate reductase that regulates nitrite and nitric oxide homeostasis. Nature Chemical Biology. 4 (7), 411-417 (2008).
- Piknova, B., Park, J. W., Kwan Jeff Lam, K., Schechter, A. N. Nitrate as a source of nitrite and nitric oxide during exercise hyperemia in rat skeletal muscle. Nitric Oxide. 55-56, 54-61 (2016).
- Cosby, K., et al. Nitrite reduction to nitric oxide by deoxyhemoglobin vasodilates the human circulation. Nature Medicine. 9 (12), 1498-1505 (2003).
- Shiva, S., et al. Deoxymyoglobin is a nitrite reductase that generates nitric oxide and regulates mitochondrial respiration. Circulation Research. 100 (5), 654-661 (2007).
- Millar, T. M., et al. Xanthine oxidoreductase catalyses the reduction of nitrates and nitrite to nitric oxide under hypoxic conditions. FEBS Letter. 427 (2), 225-228 (1998).
- Benjamin, N., et al.
- Lundberg, J. O., Weitzberg, E., Lundberg, J. M., Alving, K. Intragastric nitric oxide production in humans: measurements in expelled air. Gut. 35 (11), 1543-1546 (1994).
- Larsen, F. J., Ekblom, B., Sahlin, K., Lundberg, J. O., Weitzberg, E. Effects of dietary nitrate on blood pressure in healthy volunteers. New England Journal of Medicine. 355 (26), 2792-2793 (2006).
- Kapil, V., et al. Inorganic nitrate supplementation lowers blood pressure in humans: role for nitrite-derived NO. Hypertension. 56 (2), 274-281 (2010).
- Jones, A. M. Dietary nitrate supplementation and exercise performance. Sports Medicine. 44, Suppl 1 35-45 (2014).
- Piknova, B., et al. Skeletal muscle as an endogenous nitrate reservoir. Nitric Oxide. 47, 10-16 (2015).
- Wylie, L. J., et al. Human skeletal muscle nitrate store: influence of dietary nitrate supplementation and exercise. Journal of Physiology. 597 (23), 5565-5576 (2019).
- Piknova, B., Schechter, A. N. Measurement of nitrite in blood samples using the ferricyanide-based hemoglobin oxidation assay. Methods in Molecular Biology. 704, 39-56 (2011).
- Piknova, B., Park, J. W., Cassel, K. S., Gilliard, C. N., Schechter, A. N. Measuring Nitrite and Nitrate, Metabolites in the Nitric Oxide Pathway, in Biological Materials using the Chemiluminescence Method. Journal of Visualized Experiments. (118), e54879 (2016).
- Nyakayiru, J., et al. Sodium nitrate ingestion increases skeletal muscle nitrate content in humans. Journal of Applied Physiology. 123 (3), 637-644 (2017).
- Troutman, A. D., Gallardo, E. J., Brown, M. B., Coggan, A. R. Measurement of nitrate and nitrite in biopsy-sized muscle samples using HPLC. Journal of Applied Physiology. 125 (5), 1475-1481 (2018).
- Shinin, V., Gayraud-Morel, B., Tajbakhsh, S. Template DNA-strand co-segregation and asymmetric cell division in skeletal muscle stem cells. Methods in Molecular Biology. 482, 295-317 (2009).
- Long, G. M., Troutman, A. D., Fisher, A., Brown, M. B., Coggan, A. R. Muscle fiber type differences in nitrate and nitrite storage and nitric oxide signaling in rats. bioRxiv. , (2020).
- Ohtake, K., et al. Dietary nitrite supplementation improves insulin resistance in type 2 diabetic KKA(y) mice. Nitric Oxide. 44, 31-38 (2015).
